Summary
As experiências tradicionais de eletroforese em gel de laje (SGE) requerem um aparelho complicado e alto consumo químico. Este trabalho apresenta um protocolo que descreve um método de baixo custo para separar fragmentos de DNA dentro de um prazo curto.
Abstract
A eletroforese em gel de laje (SGE) é o método mais comum para a separação de fragmentos de DNA; Portanto, é amplamente aplicado ao campo da biologia e outros. No entanto, o protocolo SGE tradicional é bastante tedioso, e o experimento leva muito tempo. Além disso, o consumo químico em experimentos SGE é muito alto. Este trabalho propõe um método simples para a separação de fragmentos de DNA com base em um chip SGE. O chip é feito por uma máquina de gravura. São utilizadas duas folhas de plástico para os comprimentos de onda de excitação e emissão do sinal óptico. O sinal de fluorescência das bandas de DNA é coletado por smartphone. Para validar este método, as escadas de DNA de 50, 100 e 1000 pb foram separadas. Os resultados demonstram que uma escala de DNA menor que 5.000 pb pode ser resolvida dentro de 12 min e com alta resolução ao usar este método, indicando que é um substituto ideal para o método SGE tradicional.
Introduction
A eletroforese em gel de laje (SGE) é o método mais eficaz para a separação dos fragmentos de DNA 1 , 2 , 3 , 4 , 5 e, portanto, é considerada uma ferramenta versátil nas análises bioquímicas e biológicas 6 , 7 , 8 . No entanto, muitas experiências indicam que o SGE é restrito pelos seguintes quatro problemas: (1) as separações demoram muitas horas e até dias; (2) o consumo químico é muito alto; (3) requer um aparelho complicado ( por exemplo, célula de eletroforese 2D, fonte de energia de eletroforese e sistema de imagem em gel); (4) o sistema de imagem em gel só pode observar os fragmentos de DNA separados quando a experiência terminar. Além disso, o brometo de etídio (EtBr), que é comumente usado no SGE 9 ,Ass = "xref"> 10, é mutagênico e cancerígeno 11 , 12 . Assim, sempre devem ser usadas luvas ao entregar géis contendo EtBr.
A eletroforese capilar (CE) tem inúmeras vantagens 13 , 14 , 15 , 16 , 17 em comparação com SGE, como operação automática, tempo de separação curto e menor consumo. No entanto, o instrumento CE é bastante caro. Portanto, para superar essas limitações, um sistema foi desenvolvido ( Figura 1 ) para a separação do DNA. Tal sistema não só pode reduzir muito o consumo de produtos químicos e economizar no tempo de experiência de SGE (<8 min), mas também pode realizar rastreamento em tempo real do processo de separação de DNA no gel de agarose pelo smartphone. Seguindo os procedimentos descritos neste protocolo, os estudantes shouPoderia projetar e fabricar o chip SGE, preparar o gel de agarose no chip, configurar um sistema SGE simples com um smartphone e registrar o processo de migração do DNA no gel de agarose.
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Protocol
1. Projeto básico do chip SGE
- Use qualquer plástico transparente, como polimetilmetacrilato (PMMA) ou policarbonato.
Nota: O chip SGE está demonstrado na Figura 1B . O chip SGE consiste em furos cilíndricos para o tampão TBE, canais para separação de DNA e duas pistas incorporadas ao longo dos orifícios para o eletrodo. - Fabricação de matrizes de canais SGE no bloco PMMA usando uma máquina de gravura a laser.
Nota: Os parâmetros geométricos do chip dependem do tamanho do DNA a ser separado. Por exemplo, os parâmetros de canal ótimos para o chip SGE são de 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (largura x profundidade x comprimento) se o fragmento de DNA for menor que 1.000 pb. - Com base no design SGE, fabrica pentes para criar os poços no chip para carregar a amostra de DNA.
2. Preparação do Gel de Agarose
- Prepare 0,5 × TBE misturando 10 × TBE (1 × TBE =Tris 89 mM, ácido bórico 89 mM e EDTA 2 mM; PH 8,4) e água destilada numa proporção 1:19.
- Preparar 1,0% de gel de agarose para a separação de escadas de DNA de 100 pb.
Nota: A concentração de agarose em tampão TBE 0,5x depende dos tamanhos dos fragmentos de DNA a serem separados. - Colocar 0,1 g de agarose num balão e adicionar 10 mL de tampão TBE 0,5x.
Nota: O volume da solução preparada deve ser inferior a 1/3 da capacidade do balão. - Selar o balão com película conservante e depois aquecer a mistura de agarose / tampão em um microondas (meio, 1,0 min). Antes de colocar o balão no microondas, faça alguns orifícios no filme de conservação em caso de explosão.
- Despeje 2,7 mL de solução de agarose derretida em 4 canais do chip SGE. Coloque o pente na solução de agarose para criar os poços.
Nota: A solução de agarose derretida arrefecerá para o estado de gel à temperatura ambiente 3 minutos depois. - Remova o pente do gE adicionar 0,9 mL de tampão TBE 0,5x para cobrir o gel.
3. Correndo a eletroforese no chip SGE
- Ligue a fonte de luz LED e coloque um filtro de passagem de banda de 425 a 505 nm acima da fonte de luz.
- Misture 14,4 μL de uma escala de DNA de 100 pb e 1,6 μL de SYBR Green usando um vortexer.
- Carregar 4 μL de mistura em cada poço do gel de agarose no chip SGE ( Figura 2 ).
- Coloque o eletrodo nas duas faixas do chip SGE.
- Coloque um filtro de passagem de banda de 550 a 700 nm acima do chip SGE.
- Ligue a fonte de alimentação. Ajuste a tensão elétrica para 180 V (20 V / cm). Ligue o smartphone para gravar o processo de separação de fragmentos de DNA ( Figura 3 ).
- Quando a eletroforese terminar 10 minutos depois, desligue a fonte de energia e a luz LED.
- Limpe o chip SGE.
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Representative Results
A Figura 4 , Figura 5 , e a Figura 6 representam um resultado típico após a eletroforese em gel de 50, 100 e 1.000 pb de escadas de DNA. Após o experimento, os fragmentos de DNA estavam bem separados. Além disso, as mesmas amostras foram separadas nos 4 canais do chip SGE, mostrando que fragmentos de DNA do mesmo tamanho movem a mesma distância em cada experimento.
O desempenho de separação da escala de DNA pode ser avaliado através da análise da relação da distância de migração e do logaritmo do tamanho do DNA; Assim, o SGE pode ser aplicado para calcular o tamanho de fragmentos de DNA desconhecidos. Na Figura 3 , verificou-se que a distância de migração está linearmente relacionada ao logaritmo do tamanho do DNA quando o tamanho do DNA é menor que 700 pb.
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Figura 1 : Esquema e imagens. ( A ) Um diagrama esquemático do sistema de separação de DNA de rastreamento em tempo real. Inclui o conjunto de LEDs como a fonte de luz, o filtro óptico e o chip CGE. O smartphone pode registrar o processo de migração do DNA. ( B ) O chip SGE. ( C ) O dispositivo montado para eletroforese. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Um estudante carregando o gel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3 : Um estudante que grava a migração em um smartphone. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Separação de escadas de DNA de 50 pb no chip SGE. Os parâmetros geométricos para o canal no chip SGE são de 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (largura x profundidade x comprimento). A tensão de separação é de 120 V. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Separação de escadas de DNA de 100 pb no chip SGE. O gParâmetros eométricos para o canal no chip SGE são 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (largura x profundidade x comprimento). A tensão de separação é de 120 V. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Separação de escadas de DNA de 1000 pb no chip SGE. Os parâmetros geométricos para o canal no chip SGE são de 3,6 mm x 4,0 mm x 90 mm (largura x profundidade x comprimento). A tensão de separação é de 180 V. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
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Discussion
A eletroforese em gel de agarose é amplamente empregada para a separação de DNA, ARN e proteína. Este trabalho propõe um novo método para substituir o protocolo tradicional de eletroforese em gel. Os resultados demonstram que as escadas de DNA de 50, 100 e 1000 pb podem ser separadas bem em um dispositivo tão pequeno montado. A grande vantagem deste método é que não só pode separar os ácidos nucleicos com pouco consumo químico, mas também pode registrar o processo de separação. Embora os fragmentos de DNA sejam amplos na Figura 2 , os resultados podem ser melhorados ao otimizar os parâmetros do chip SGE e a concentração do gel de agarose. Além disso, o processo SGE total não leva mais de 10 min se os géis pré-fabricados forem usados no chip.
O desempenho de separação da escada de DNA é bastante diferente se a largura do canal no chip for alterada. Por exemplo, quando uma escada de DNA de 1000 pb é separada, a banda de DNA parece mais ampla seA largura do canal é pequena. Isto é possivelmente porque o aquecimento de joule no gel de agarose é muito alto 18 , o que afeta o desempenho de separação.
O método SGE aqui proposto é muito simples. Um dispositivo mini-SGE portátil pode ser desenvolvido se o sistema estiver otimizado. Esse dispositivo pode ser aplicado a testes de laboratório de ponto de atendimento.
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Disclosures
Não são declarados conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos o apoio da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 21205078) e do Fundo de Pesquisa para o Programa de Doutorado em Educação Superior da China (No.20123120110002). Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Chave da China (2016YFB1102303), o Programa Nacional de Pesquisa Básica da China (973Program, 2015CB352001) e a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (61378060).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
50 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A | |
100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
1 kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A | |
SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A | |
Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
References
- Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
- McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
- Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
- Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
- Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J.
Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975). - Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
- Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
- Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
- Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
- Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
- Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
- Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
- Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
- Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).