Summary
Qui, presentiamo un protocollo raffinato per rivelare efficacemente biotinilati ammina di destrano (BDA) etichettatura con una colorazione metodo attraverso un reciproco percorso neurale fluorescente. È adatto per analizzare la struttura fine del BDA etichettatura e distinguerlo da altri elementi neurali sotto un microscopio a scansione confocale del laser.
Abstract
Ammina di alto peso molecolare biotinilati destrano (BDA) è stato utilizzato come tracciante neuroanatomical altamente sensibile per molti decenni. Poiché la qualità della relativa etichettatura è stata influenzata da vari fattori, qui, forniamo un protocollo raffinato per l'applicazione ad alto peso molecolare BDA per studiare ottimale etichettatura neurale nel sistema nervoso centrale. Dopo l'iniezione stereotactic del BDA nel nucleo posteromedial ventrale (VPM) del talamo nel ratto mediante una pipetta di vetro delicato, BDA era macchiata con fluorescente streptavidina-Alexa (AF) 594 e controcolorato con fluorescente di Nissl AF500/525. Sullo sfondo di colorazione di Nissl verde, il rosso BDA etichettatura, tra cui corpi delle cellule neuronali e assonali terminali, è stata dimostrata più distintamente nella corteccia somatosensoriale. Inoltre, doppia colorazione fluorescente per BDA e la parvalbumina di proteine leganti il calcio (PV) è stato effettuato per osservare la correlazione di etichettatura BDA e interneuroni PV-positivi nella destinazione corticale, fornendo l'opportunità di studiare il locale neurale circuiti e le loro caratteristiche chimiche. Così, questo metodo raffinato non è solo adatto per la visualizzazione di alta qualità neurali etichettatura con l'alto peso molecolare BDA attraverso percorsi neurali reciproci tra il talamo e la corteccia cerebrale, ma anche permetterà la dimostrazione simultanea di altri marcatori neurali con istochimica fluorescente o immunochimica.
Introduction
Ad alto peso molecolare BDA (10.000 peso molecolare), un tracciante altamente sensibile, è stato utilizzato per tracciare i percorsi neurali nel sistema nervoso centrale per oltre 20 anni1. Anche se l'uso del BDA è un comune delle vie neurali, analisi tecnica, la qualità del BDA etichettatura può risentire in animali vari fattori1,2,3. Il nostro studio recente ha indicato che la struttura ottima del BDA etichettatura è non solo connesso con un tempo di sopravvivenza post-iniezione corretta, ma anche correlata con la colorazione metodo4. Fino ad ora, convenzionale complesso avidina-biotina-perossidasi (ABC), streptavidina-isotiocianato di fluoresceina e streptavidina-AF594 sono stati utilizzati metodi di colorazione per rivelare l'etichettatura BDA in precedenti studi2,3, 4,5. In confronto, colorazione fluorescente per BDA può essere facilmente eseguita.
Al fine di estendere l'applicazione ad alto peso molecolare BDA, è stato introdotto un protocollo raffinato nello studio presente. Dopo l'iniezione del BDA in VPM del talamo nel cervello del ratto, BDA etichettatura è stata rivelata dal regolare metodo di macchiatura di ABC standard così come dalla macchiatura fluorescente doppio, che è stato effettuato per osservare la correlazione di etichettatura BDA e base gli elementi neurali o interneuroni nella destinazione corticale con streptavidina-AF594 e fluorescente Nissl istochimica o PV-immunochimica, rispettivamente. Attraverso i percorsi neurali reciproci tra VPM e la corteccia somatosensoriale primaria (S1)6,7,8, abbiamo focalizzato la nostra osservazione il BDA etichettatura negli assoni thalamocortical proiettata e corticothalamic somas proiettata cellula S1. Da questo processo, ci aspettavamo di fornire non solo un protocollo dettagliato per ottenere l'alta qualità di etichettatura neurali ad alto peso molecolare BDA, ma anche un raffinato protocollo sulla combinazione di contrassegno fluorescente BDA e altri marcatori fluorescenti neurali con l'istochimica o immunochimica. Questo approccio è preferibile per studiare i circuiti neurali locali e le loro caratteristiche chimiche sotto un laser confocale microscopia a scansione.
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Protocol
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico presso la Cina cinese medico Accademia (numero di riferimento 20160014). Tutte le procedure sono state condotte in conformità della istituti nazionali di salute Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). In questo studio sono stati utilizzati quattro ratti del maschio adulto (250-280 g di peso). Tutti gli animali erano alloggiati in un ciclo luce/buio di 12 h con temperatura e umidità controllate e consentiti il libero accesso al cibo e acqua. Gli strumenti e i materiali utilizzati nel presente studio sono stati ha mostrati nella Figura 1. Prima della chirurgia, tutti gli strumenti, come cornice stereotassica e pipetta di vetro, sono stati puliti con etanolo al 70%.
1. interventi chirurgici
- Determinare l'area delle coordinate di interesse in VPM usando un Atlante stereotassiche9 (Figura 2A).
- Preparare una 1 µ l micro-siringa con una micropipetta di vetro (con un diametro di punta di circa 10-20 µm) (Figura 1) e testarlo con paraffina liquida.
- Anestetizzare i ratti con 7% cloralio idrato (0,7 mL/100 g) tramite l'iniezione intraperitoneale.
- Una volta confermata l'anestesia profonda con coda pizzicare e riflesso di ritiro del pedale, radere la parte superiore della testa dell'animale con un rasoio elettrico e strofinare il sito chirurgico 3 volte con iodio povidone 10% seguito da etanolo al 70%, rispettivamente.
- Inserire il ratto nel dispositivo stereotassica inserendo Barre smussate orecchio nelle orecchie e inserire gli incisivi superiori del ratto nel supporto della bocca (Figura 1E) e quindi applicare unguento oftalmico sugli occhi.
- Pulire la pelle di testa del sito chirurgico utilizzando etanolo al 70%. Utilizzare guanti chirurgici sterili e asciugamani per mantenere la chirurgia in condizioni sterili.
- Fare un'incisione sagittale nella pelle con un bisturi lungo la sutura sagittale (Figura 1F).
- Raschiare il muscolo e il periostio dal cranio con applicatori di cotone con punta sterile durante l'intervento chirurgico per controllare lo spurgo (Figura 1F).
- Utilizzando le coordinate predefinite da un Atlante (Figura 2A), determinare la posizione (punto di Bregma-3,30 mm, 2.6 mm destra alla linea mediana) del craniotomy (Figura 1).
- Eseguire una craniotomia con un trapano di bava con un po' di turno-punta (#106) (Figura 1 H) e continuare ad esplorare a circa una profondità di 1 mm in pochi minuti fino a raggiungere le meningi (Figura 1I).
- Asportare il mater di dura utilizzando Micropinze per esporre la corteccia cerebrale sul sito di iniezione (Figura 1I).
- Cambiare la paraffina liquida nella micro-siringa con soluzione al 10% BDA (10.000 peso molecolare, in acqua distillata) (Figura 1J).
- Montare la siringa nell'apparecchio microiniezione e connettersi con micro-pompa (Figura 1 K).
Nota: Il volume iniettato è dipenda dalla velocità della micro-pompa. Qui è stato registrato a 30 nL/min (Figura 1 L). - Sotto un microscopio stereoscopico, inserire una micropipetta di vetro manualmente con l'apparato di microiniezione VPM attraverso la superficie corticale del cervello alla profondità di 5,8 mm (Figura 1 M).
- Pressione-iniettare un 100 nL 10% BDA in VPM per un periodo di 3 minuti (35 nL/min) con micro-pompa (Figura 1 L, M).
- Dopo l'iniezione, tenere la pipetta in luogo per altri 5 minuti e poi ritirarsi lentamente.
- Suturare la ferita con filo sterile (Figura 1N). Seguire le vostre linee guida comitato locale cura degli animali per analgesia pre- e post-chirurgica.
- Posizionare il ratto in un'area di recupero caldo finché riprende conoscenza ed è completamente recuperato.
- Riportare il ratto recuperato alla sua gabbia.
2. le aspersioni e sezioni
- Dopo un tempo di sopravvivenza di in genere 10 giorni, iniettare l'animale con una overdose di uretano 10% (2 mL/100 g) tramite l'iniezione intraperitoneale per indurre l'eutanasia.
- Irrorare i ratti sperimentali nella cappa (Figura 1O).
- Una volta che il respiro si ferma, con delle forbici, pinze, aprire la cavità toracica del ratto per accedere al cuore. Inserire un catetere endovenoso nel ventricolo sinistro verso l'aorta e quindi aprire il auricle di destra.
- In primo luogo irrorare con 0,9% tampone fosfato salino (PBS) alla temperatura fisiologica (37 ° C) circa 1-2 minuti fino a quando il sangue esce dal cuore è chiaro e poi continuare con paraformaldeide al 4% di 250-300 mL in tampone fosfato 0,1 M (PB, pH 7.4).
- Dopo la perfusione, incise la pelle testa e apre il cranio e poi sezionare il cervello del ratto. Post-fissare il cervello sezionato in paraformaldeide al 4% per 2 h a temperatura ambiente (26 ° C), poi cryoprotect nel 30% di saccarosio in 0.1 M PBS (pH 7.4) per 3 giorni a 4 ° C fino a quando il cervello è immerso nella soluzione (Figura 1 P).
- Una volta che il cervello è immerso nella soluzione, è possibile dividere il cervello in tre isolati in direzione corona sulle matrici del cervello (Figura 1Q). Il blocco centrale contiene il VPM e S1.
- Tagliare il blocco centrale del cervello a 40 µm su una fase di congelamento microtomo scorrevoli in direzione corona. Raccogliere queste sezioni ordinate in un piatto 6-pozzetti con PBS 0.1 M (pH 7.4) (figure 1R, S).
3. standard ABC macchiatura
Nota: Sezioni galleggiante libera da ogni terza sezione coronale del cervello sono state utilizzate per la visualizzazione l'etichettatura BDA con standard ABC procedura10.
- Risciacquare le sezioni in 0.1 M PBS per circa 1 min.
- Incubare le sezioni in 1% soluzione di ABC in PB 0.1 M (pH 7.4) contenente 0,3% Triton X-100 per 1 h a temperatura ambiente.
- Lavare le sezioni tre volte in tampone Tris 50 mM (pH 7.4).
- Macchia le sezioni in una soluzione contenente 0,02% 3, tetrahydrochloride 3'-diaminobenzidina (DAB) e 0,01% H2O2 in tampone Tris 50 mM per circa 2-5 min a temperatura ambiente.
- Lavare le sezioni tre volte in tampone Tris 50 mM (pH 7.4).
- Montare le sezioni su vetrini da microscopio utilizzando tecniche istochimiche standard (Figura 1T; Vedi Supplemental Video File III, perfusione e sezioni).
- Asciugare le sezioni nell'aria durante la notte a temperatura ambiente.
- Disidratare le sezioni brevemente in una serie di soluzioni alcoliche (50%, 70%, 95%, 100%). Immergere i vetrini in ogni soluzione per circa 15 s. Non lasciare i vetrini ad asciugare tra ogni fase.
- Deselezionare le sezioni in xilene tre volte, circa 20 min.
- Mettere 2 o 3 gocce di balsamo sulle fette quindi posizionare i vetrini coprioggetti sulle sezioni.
4. doppia colorazione fluorescente per BDA ed elementi base neurali nella corteccia cerebrale
Nota: al contrario, doppia colorazione fluorescente è stato effettuato per osservare la correlazione di etichettatura BDA ed elementi base neurali su sezioni adiacenti al precedente utilizzato con streptavidina-AF594 e controcolorati con fluorescente di Nissl AF500/525.
- Risciacquare le sezioni in 0.1 M PBS per circa 1 min.
- Incubare le sezioni in una soluzione mista di streptavidina-AF594 (1: 500) e AF500/525 verde fluorescente di Nissl (1:1, 000) in PBS 0.1 M (pH 7.4) contenente 0,3% Triton X-100 per 2 h a temperatura ambiente.
- Lavare le sezioni tre volte in PB 0.1 M (pH 7.4).
- Montare le sezioni su vetrini da microscopio utilizzando tecniche istochimiche standard. Asciugare le sezioni in aria per circa 1 h.
- Applicare coprioggetti alle sezioni fluorescenti con glicerina 50% in acqua distillata prima dell'osservazione.
5. doppia colorazione fluorescente per BDA e interneuroni nella corteccia cerebrale
Nota: Doppia colorazione fluorescente è stato effettuato per osservare la correlazione di etichettatura BDA e interneuroni sulle sezioni rappresentative nella destinazione corticale con streptavidina-AF594 e PV-immunochimica.
- Risciacquare le sezioni rappresentative in 0.1 M PBS (pH 7.4) per circa 1 min.
- Incubare le sezioni in una blocco soluzione contenente siero di capra normale del 3% e lo 0,3% Triton X-100 in 0.1 M PBS per 30 min.
- Trasferire le sezioni in una soluzione di mouse monoclonale anti-PV IgG (1:1, 000) in 0.1 M PBS (pH 7.4) contenente 1% di capra normale siero e 0,3% Triton X-100 per una notte a 4 ° C.
- Il giorno seguente, lavare le sezioni tre volte in PBS 0.1 M (pH 7.4).
- Esporre le sezioni per una soluzione mista di anticorpo di capra anti-mouse-AF488 secondario (1: 500), streptavidina-AF594 (1: 500) e 4', 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI, 01:40, 000) in siero di capra normale contenente 1% di 0.1 M PBS (pH 7,4) e 0,3% Triton X-100 per 1 h.
- Ripetere i passaggi da 4.3 a 4.5.
6. osservazione
- Prendere le immagini del VPM, thalamocortical assoni e i neuroni corticothalamic.
- Osservare i campioni fluorescenti con un sistema di imaging confocale dotato di lenti obiettivi (4x, NA: 0.13; 10 x, NA: 0.40; e 40 x, NA: 0.95). Utilizzare lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione di 405 (blu), 488 (verde) e 559 nm (rosso).
Nota: Qui, il foro stenopeico confocale è 152 µm (4x, 10x) e 105 µm (40x). La risoluzione spaziale di acquisizione dell'immagine è di 1024 × 1024 pixel (4x, 10x) e 640 × 640 pixel (40x). - Prendere venti immagini in fotogrammi successivi di 2 µm da ogni sezione allo spessore di 40 µm (serie Z).
- Integrare le immagini in una singola immagine di messa a fuoco con l'immagine confocale elaborazione sistema software per l'analisi tridimensionale come segue: impostare inizio piano focale → fine set piano focale → istruzione imposta dimensione → scegliere profondità modello → immagine cattura → Z series.
- Osservare i campioni fluorescenti con un sistema di imaging confocale dotato di lenti obiettivi (4x, NA: 0.13; 10 x, NA: 0.40; e 40 x, NA: 0.95). Utilizzare lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione di 405 (blu), 488 (verde) e 559 nm (rosso).
- Prendere immagini campo chiaro di un microscopio ottico dotato di una fotocamera digitale (4x, NA: 0.13; 10 x, NA: 0.40; e 40 x, NA: 0,95 lenti). Per regolare la luminosità e il contrasto delle immagini e per aggiungere etichette, utilizzare un tempo di esposizione del software di fotoritocco in uso di 500 ms.
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Representative Results
Sopravvivenza di 10 giorni dopo l'iniezione del BDA nel VPM era sufficiente per la produzione di intenso neurale etichettatura sulle aree corticali corrispondenti ipsilateral al lato di iniezione (Figura 2). ABC sia procedure di colorazione per BDA fluorescenti convenzionali hanno rivelato il modello simile di etichettatura neurale su S1, tra cui anterograda denominata thalamocortical assoni e retrogradely neuroni corticothalamic (Figura 2, D ).
Per anterograda etichettato assoni, sono stati osservati dal livello 2 al livello 6 con alta densità sul livello 4, e il tipo tipica degli assoni thalamocortical è stato osservato in zona barile (Figura 2, D). In vista di ingrandimento più alto, BDA etichettatura chiaramente presentata axonal tronco, rami, dei collaterali e piccole varicosità (Figura 3A). Sotto gli assoni thalamocortical con etichetta da visualizzare, i neuroni piramidali corticali retrogradely con etichettati sono stati visualizzati e loro corpi cellulari distribuiti sugli strati 5/6, ma loro dendriti apicali esteso allo strato 2 (Figura 2, D). L'etichettatura del BDA ha presentato non solo i corpi delle cellule neuronali e dendriti, ma anche in spine dendritiche, apparendo come risoluzione di Golgi-like (Figura 3B).
Inoltre, la doppia colorazione fluorescente inoltre è stata effettuata per osservare la correlazione di etichettatura BDA e interneuroni nella destinazione corticale con streptavidina-AF594 e PV-immunochimica. Intorno il BDA etichettatura nella destinazione corticale, neuroni PV-positivi sono stati distribuiti dal livello 2 al livello 6 con alta concentrazione nel livello 4 (Figura 4A). Non c'erano nessun neuroni PV-positivi di essere etichettato con BDA, tuttavia, terminali axonal BDA-identificati sono stati trovati intorno alla superficie di corpi cellulari PV-positivo e PV-positiva terminali axonal intorno BDA-labeled corticali neuroni piramidali (Figura 4B, C ).
Figura 1. Fotografie di passaggi chiave chirurgiche e principali strumenti per essere utilizzati in questo esperimento.
A: il dispositivo stereotassica. B: il trapano odontoiatrico. C: strumenti chirurgici (bisturi, micropinze ed ecc) D: Micro-siringa con una micropipetta di vetro. E: posizionare la testa del ratto nel dispositivo stereotassica. F: pulire il sito chirurgico. G: confermare il punto di Bregma. H: forare il cranio. Io: esporre la corteccia cerebrale. J: 10% di carico BDA nella micro-siringa. K: montare la siringa nell'apparato per micro-iniezione. L: regolare la velocità della micro-pompa. M: inserire la micropipetta di vetro il VPM. N: suturare la ferita con filo sterile. O: irrorare il ratto nella cappa. P: sezionare il cervello. Q: dividere il cervello in tre blocchi con le matrici di cervello. R: tagliare il cervello su un palco congelamento microtomo sistema scorrevole. S: raccogliere le sezioni di cervello ordinate in un piatto 6 pozzetti. T: montare le sezioni su vetrini da microscopio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 2. Sito di iniezione ed etichettatura neurali tipici con alto peso molecolare BDA nella corteccia somatosensoriale.
A: sito di iniezione è stato determinato su un Atlante stereotassica. B: rappresentanza Fotomicrografo mostrando il sito di iniezione del BDA (rossa) nel nucleo posteromedial ventrale del talamo (VPM) sullo sfondo della colorazione di Nissl verde. C: microfotografia di contrassegno fluorescente BDA, compresi gli assoni thalamocortical nello strato 4 e corticothalamic neuroni negli strati 5/6. D: microfotografia di convenzionale BDA etichettatura con una procedura standard di avidina-biotina-perossidasi che mostra il modello simile di etichettatura neurale al contrassegno fluorescente BDA. VPL, nucleo posterolateral ventrale del talamo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 3. Alta qualità di etichettatura neurali ad alto peso molecolare BDA sullo sfondo del verde colorazione di Nissl.
A: vista di ingrandimento più alto dell'anterograda etichettato pergole assonale (rosso) in dettaglio. B: fotografie ad alta risoluzione che mostrano il corpo cellulare neuronale retrogradely etichettato, dendriti e delle spine dendritiche (rosso) in dettaglio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 4. La correlazione del BDA etichettatura e interneuroni della proteina legante il calcio PV-positivi nella destinazione corticale.
A: la distribuzione di BDA etichettatura (rosso) e interneuroni PV-positivo (verde) nella corteccia somatosensoriale. B: vista di ingrandimento più alto della distribuzione degli assoni BDA-etichettati e interneuroni PV-positivi nello strato 4. C: fotografia di alta risoluzione del BDA-labeled corticale cellula piramidale (rosso) e interneuroni PV-positivo (verde) in strati di 5/6. Tutti i campioni erano controcolorati con DAPI (blu). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File Video supplementari: I video supplementari Visualizza brevemente la procedura chirurgica, iniezione di BDA in VPM, perfusione e sezionamento e risultati. Nel file video denominato "IV. Rappresentante risultato", vengono visualizzati i risultati di sistema tridimensionale laser confocale microscopia e analisi scansione. Alta risoluzione animazione mostra il corpo cellulare neuronale retrogradely etichettato, dendriti e delle spine dendritiche (rosso) in dettaglio. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Selezionando un elemento tracciante corretto è un passo fondamentale per un esperimento di successo analisi neurale. Nella famiglia del BDA, ad alto peso molecolare BDA (10.000 peso molecolare) è stato consigliato di essere preferenzialmente trasportato attraverso il percorso neurale anterograda contrariamente a basso peso molecolare BDA (peso molecolare 3.000)2,3 , 11 , 12 , 13. Tuttavia, molti studi hanno suggerito che ad alto peso molecolare BDA potrebbe potenzialmente essere usato anche per l'analisi via retrograda in parallelo con anterograda traccia1,2,3. Attraverso i percorsi neurali reciproci tra VPM e S1, abbiamo fornito ulteriore prova per sostenere l'idea che ad alto peso molecolare BDA è adatto per bidirezionale tratto traccia4. In modo simile in questo settore, ad alto peso molecolare BDA è stato utilizzato anche nel sistema visivo e uditivo per esaminare le connessioni reciproche tra il corpo genicolato laterale dorsale e corteccia visiva così come il corpo genicolato mediale e la corteccia uditiva 3 , 14.
Nell'esperimento l'analisi neurale, l'altra considerazione importante è la scelta del metodo per l'etichettatura neurale di colorazione. Nella maggior parte degli studi precedenti, sia il protocollo ABC convenzionale e fluorescente streptavidina metodo di colorazione sono stati utilizzati per l'esame di etichettatura BDA e ha rivelato il simile modello morfologico1,2,3 , 4 , 5. qui, abbiamo trovato quel streptavidina-AF594 non era solo una scelta corretta per l'etichettatura BDA, ma adatto anche per la combinazione con altri marker neurale, quali fluorescente Nissl e PV-antigene, fornendo una nuova opportunità per osservare la correlazione del BDA etichettatura e altri elementi neurali. Anche se il metodo convenzionale di doppio-macchiatura per BDA e altri marcatori neurali sono stati effettuati anche frequentemente con i due colori DAB procedura14,15, non è adatto per l'utilizzo di un sistema di analisi tridimensionale sotto un microscopia a scansione laser confocale. Da un punto di vista tecnico, il nostro studio presente fornisce un prezioso riferimento per confrontare distintamente tra BDA etichettatura ed altre etichette.
La tecnica di analisi delle vie neurali è stato inizialmente utilizzata per rivelare connessioni neuronali tra il sito di iniezione e il suo obiettivo nel sistema nervoso; Tuttavia, i ricercatori erano ancora all'inseguimento la struttura ideale di etichettatura neurale con un tracciante corretto16,17. A differenza di altri traccianti, quali perossidasi di rafano e subunità B della tossina del colera, ad alto peso molecolare BDA produce la qualità più alta di etichettatura neurale per quantificare il numero di supporti conici assonale e dendriti neuronali16,17 . Anche se l'analisi quantitativa di etichettatura BDA non è stato effettuato nello studio presente, la qualità superiore di etichettatura neurale con BDA fornisce maggiori opportunità di capire da vicino le caratteristiche morfologiche su pergole axonal con etichettate e un neurone dendriti.
Simile all'applicazione di molti altri traccianti, una serie di questioni importanti dovrebbero essere considerata per questa procedura sperimentale, tra cui: la concentrazione e il volume del BDA usato per iniezione, corretto sito di iniezione, il diametro della punta della pipetta di vetro, processo chirurgico, il tempo di sopravvivenza ottimale, aspersione, sezione e osservazione al microscopio. È direttamente connesso con la qualità del BDA etichettatura quello che ci aspettavamo. Oltre ai passaggi critici menzionati sopra, esistono limitazioni tecniche che richiedono attenzione, come la distanza dal sito iniettato il contrassegnati dell'obiettivo, che dipende dalla specie animale modello usato nell'esperimento3, 5 , 18. in una parola, uno studio di successo traccia dipende ogni passo in tutta la procedura sperimentale.
Nello studio presente, abbiamo fornito un protocollo raffinato per dimostrare che il BDA fluorescente che macchia il metodo è un modo efficace per ottenere l'alta qualità di etichettatura neurale, che può essere abbinato contemporaneamente con altri marcatori neurali utilizzando l'istochimica fluorescente o immunochimica. Confrontando la colorazione BDA convenzionale con la procedura DAB, possiamo più facilmente analizzare la struttura fine del BDA etichettatura e distinguerlo da altri elementi neurali nell'analisi di destinazione sotto un laser confocale microscopia a scansione del fluorescente presente approccio.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato dal National Foundation scienze naturali della Cina (progetto codice n. 81373557; n. 81403327).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
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