Summary
Le système de cocultivation hydroponique décrit supporte des plantes intactes avec des écrans en mèches métalliques et les cocultive avec des bactéries. Les tissus végétaux, les bactéries et les molécules sécrétées peuvent ensuite être récoltées séparément pour des analyses en aval, permettant simultanément d'étudier les réponses moléculaires des hôtes de la plante et des microbes ou microbiomes en interaction.
Abstract
Une conception expérimentale imitant les interactions naturelles plantes-microbes est très importante pour délimiter les processus complexes de signalisation des plantes-microbes. Arabidopsis thaliana - Agrobacterium tumefaciens Fournit un excellent système modèle pour étudier la pathogenèse bactérienne et les interactions avec les plantes. Les études antérieures sur les interactions plantes- acides gras ont largement dépendu des cultures en suspension de cellules végétales, des blessures artificielles de plantes ou de l'induction artificielle de facteurs de virulence microbienne ou des défenses végétales par des produits chimiques de synthèse. Cependant, ces méthodes sont distinctes de la signalisation naturelle in planta , où les plantes et les microbes reconnaissent et répondent selon les manières spatiales et temporelles. Ce travail présente un système de cocultivation hydroponique où les plantes intactes sont soutenues par des écrans à mailles métalliques et cocultivées avec Agrobacterium . Dans ce système de cocultivation, aucune phytohormone synthétique ou chimique qui induit une micr.La virulence obial ou la défense végétale est complétée. Le système de cocultivation hydroponique ressemble étroitement aux interactions naturelles plantes-microbes et à la signalisation de l'homéostasie in planta . Les racines des plantes peuvent être séparées du milieu contenant Agrobacterium , et la signalisation et les réponses des hôtes de la plante et des microbes en interaction peuvent être étudiées simultanément et systématiquement. À n'importe quel moment / intervalle donné, les tissus végétaux ou les bactéries peuvent être récoltés séparément pour diverses analyses "omiques", démontrant la puissance et l'efficacité de ce système. Le système de cocultivation hydroponique peut être facilement adapté pour étudier: 1) la signalisation réciproque de divers systèmes de microbes végétaux, 2) la signalisation entre un hôte végétal et plusieurs espèces microbiennes ( c.-à-d. Les consortiums microbiens ou les microbiomes), 3) comment les éléments nutritifs et les produits chimiques sont impliqués Dans la signalisation des plantes-microbes, et 4) comment les microbes interagissent avec les hôtes de la plante et contribuent à la tolérance des plantes au biotique oR stress abiotique.
Introduction
Les microbes associés aux plantes jouent un rôle important dans le cyclisme biogéochimique, la bioremédiation, l'atténuation des changements climatiques, la croissance et la santé des plantes et la tolérance des plantes aux contraintes biotiques et abiotiques. Les microorganismes interagissent avec les plantes directement à travers le contact de la paroi cellulaire de la plante et indirectement par la sécrétion chimique et la signalisation 1 , 2 , 3 . En tant qu'organes sessiles, les plantes ont développé des mécanismes directs et indirects pour résister à l'infection par des agents pathogènes. Les défenses directes comprennent les défenses structurelles et l'expression des protéines de défense, tandis que les défenses indirectes incluent la production secondaire de métabolites de plantes et l'attraction d'organismes antagonistes aux pathogènes envahissants 4 , 5 . Les exsudats de racines dérivés des plantes, les sécrétions, les mucilages, les mucigel et les lysats modifient les propriétés physico-chimiques de la rhizosphère pour attirer ou repousserDes microbes vers leurs hôtes 6 . La composition chimique de la sécrétion des racines est spécifique à l'espèce, servant ainsi de filtre sélectif qui permet à certains microorganismes capables de reconnaître de tels composés se développer dans la rhizosphère 6 . Ainsi, des espèces microbiennes compatibles peuvent être stimulées pour activer et améliorer leurs associations, soit au bénéfice ou au détriment de l'hôte 1 de la plante.
La compréhension des interactions plantes-microbes dans la rhizosphère est essentielle pour améliorer la productivité des plantes et le fonctionnement de l'écosystème, car une majorité de l'exposition microbienne et chimique se produit à la structure racine et à l'interface sol-air 2 , 6 , 7 , 8 . Cependant, l'examen des interactions souterraines des plantes-microbes et des réponses réciproques a été un défi en raison de son intrigué La nature complexe et dynamique et le manque de modèles expérimentaux appropriés avec structure racine naturelle et morphologie végétale dans des conditions de croissance très contrôlables. Comme l'un des phytopathogènes les plus fortement étudiés, Agrobacterium infecte un large éventail de plantes d'importance agricole et horticole, y compris la cerise, la pomme, la poire, le raisin et la rose 9 . Agrobacterium est un organisme modèle important pour la compréhension des interactions plantes-pathogènes et est un outil puissant dans la transformation des plantes et l'ingénierie des usines 10 , 11 , 12 , 13 , 14 .
Les interactions Molecular Plant- Agrobacterium ont été bien étudiées depuis plusieurs décennies et la compréhension actuelle de la pathogenèse d' Agrobacterium est importante 9 ,F "> 11 , 15 , 16. La pathogénicité de l' agrobacterium est largement attribuée à ses capacités évoluées de perception des signaux dérivés des plantes, ce qui entraîne la modulation fine de son programme de virulence et la communication cellulaire à cellulaire, appelée détection de quorum 17 . Le programme Agrobacterium virulence est réglementé par plusieurs signaux disponibles dans la rhizosphère et implique deux ensembles de systèmes à 2 composants, le système ChvG / I et le système VirA / G. Les conditions acides de la rhizosphère activent la transcription de chvG / I , virA / G , Et plusieurs autres gènes impliqués dans la pathogénicité d' Agrobacterium , y compris virE0 , virE1 , virH1 , virH2 et les gènes du système de sécrétion de type VI (T6SS) 18. Composés phénoliques dérivés des plantes, y compris l'acétosyringone (4'-hydroxy-3 ', 5 '-diméthoxyacétophénone), activez le VSystème à 2 composants irA / G par des mécanismes de signalisation de phosphorylation 19 . VirA / G active alors tout le régulateur vir , ce qui entraîne le transfert et l'intégration d'un fragment d'ADN bactérien de ~ 20 kb appelé ADN de transfert (ADN-T) à partir de son plasmide inducteur de tumeur (Ti) dans le noyau de la plante 16 . T-DNA porte des gènes responsables de la synthèse des hormones végétales de l'acide indole-3-acétique (IAA) ( iaaM et iaaH ) et de la cytokinine ( ipt ), et une fois exprimée dans les cellules végétales, de grandes quantités de ces phytohormones sont produites. Il en résulte une prolifération anormale des tissus et un développement de la tumeur végétale, connue sous le nom de maladie de la couronne, qui est un problème chronique et résurgent pour les plantes 9 , 11 , 20 . IAA agit également collectivement avec de l'acide salicylique et de l'acide gamma-amino butyrique pour réprimer Agrobacterium virulence ou pour réduire Agrobacteriu M quorum sensing (QS) 17 , 21 , 22 . Pour contrer cette répression, l'ADN-T porte également des gènes pour la biosynthèse de l'opine, qui active Agrobacterium quorum qui détecte la pathogénicité d' Agrobacterium et sert également de source nutritive pour le pathogène 22 , 23 .
En dépit d'une compréhension générale globale des interactions avec les plantes d' Agrobacterium et du transfert d'ADN-T résultant dans l'hôte de la plante, les événements de signalisation complexes au stade initial de l'interaction sont moins bien compris. Ceci est en partie dû aux limites des approches classiques pour enquêter sur la signalisation des plantes Agrobacterium . Les cultures en suspension de cellules végétales et les blessures artificielles spécifiques au site sont couramment utilisées pour étudier les interactions moléculaires-microbes 24 ,. ef "> 26, 27 Cependant, les suspensions cellulaires manquent la morphologie des plantes typiques, en particulier, les cellules de suspension des plantes ne sont pas des structures profondes et exsudats racinaires, qui sont très importants pour l' activation chimiotactisme microbienne et la virulence 28, 29 Le maintien de la morphologie des plantes. Et la structure racine a été traitée par des plantes blessant artificiellement, ce qui facilite l'infection spécifique au site, ce qui entraîne la détection de gènes induits par la défense des plantes dans les tissus végétaux infectés directement 30 , 31. Cependant, les blessures artificielles sont significativement différentes de l'infection pathogène dans la nature , D'autant plus que les blessures entraînent une accumulation d'acide jasmonique (JA), qui interfère systémiquement avec la signalisation et la défense des plantes naturelles 26. En outre, les produits chimiques de synthèse sont généralement utilisés pour induire artificiellement les réponses de l'hôte de la planteOu la virulence des agents pathogènes. Bien que la supplémentation de tels composés chimiques reflétant les concentrations en planta soit possible, une telle supplémentation ne tient pas compte de la diffusion des exsudats radiculaires progressivement dans la rhizosphère environnante, ce qui génère un gradient chimiotactique détecté par les microbes 28 , 32 . Compte tenu des limites des approches conventionnelles pour étudier les interactions entre les plantes et les microbes, la précision et la profondeur des données obtenues pourraient être entravées et restrictives, et les connaissances générées par les approches conventionnelles ne peuvent pas se traduire directement en plan . De nombreux aspects de la signalisation des plantes- Agrobacterium ne sont pas encore entièrement compris, en particulier au stade précoce des interactions, lorsque les symptômes de la maladie ne sont pas encore développés.
Pour modifier les limites des approches conventionnelles, ce travail présente un hydroponique c caisse peu coûteux, étroitement contrôlable et flexibleSystème d'ocultivation qui permet aux chercheurs d'acquérir des connaissances plus approfondies sur les voies complexes de signalisation et de réponse au stade initial des interactions moléculaire-microbe moléculaire. La culture hydroponique a été largement utilisée pour étudier les nutriments des plantes, les exsudats radiculaires, les conditions de croissance et les effets de la toxicité métallique sur les plantes 33 , 34 . Il existe plusieurs avantages des modèles hydroponiques, y compris les petites exigences spatiales, l'accessibilité de divers tissus végétaux, le contrôle strict des conditions nutritives / environnementales et le contrôle des ravageurs / maladies. Les systèmes hydroponiques sont également moins limitatifs pour la croissance des plantes par rapport aux techniques de gélose / phytoagar, ce qui limite généralement la croissance après 2-3 semaines. Fait important, le maintien de structures entières facilite la sécrétion naturelle des racines nécessaire à la chimiotaxie microbienne et à l'induction de la virulence 8 , 29 . Le système décriLe lit ici est plus simple et moins exigeant en main-d'œuvre que les alternatives 33 , 34 . Il utilise moins de pièces et ne nécessite aucun outil autre que les ciseaux standard. Il utilise des mailles métalliques (par opposition au nylon 33 ) comme un solide support pour la croissance des plantes et une méthode simple d'aération dans des conditions stériles en secouant pour soutenir la croissance microbienne. En outre, le système peut utiliser des grilles métalliques de différentes tailles pour soutenir la croissance des plantes, ce qui permet d'inclure diverses espèces de plantes sans limiter la largeur de leurs racines.
Dans le système de cocultivation hydroponique présentée ici, les plantes sont cultivées dans un système hydroponique stérile où les racines des plantes sécrètent des composés organiques soutenant la croissance des bactéries inoculées. Dans ce système de cocultivation, aucun produit chimique artificiel, tel que des hormones végétales, un élicateur de défense ou des produits chimiques inductifs de la virulence, est complété, ce qui reflète la cellule naturelle- signification de l'homéostasie lors des interactions plantes-microbes. Avec ce système de cocultivation hydroponique, il a été possible de déterminer simultanément l'expression des gènes dans le tissu racidique d'Arabidopsis thaliana Col-0 lors d'une infection par Agrobacterium , ainsi que l'activation des gènes Agrobacterium lors de la cocultivation avec Arabidopsis . Il a également été démontré que ce système est approprié pour étudier l'attachement d' Agrobacterium aux racines des plantes, ainsi que le profil de la racine de la plante, lors de la cocultivation (infection) avec Agrobacterium ( Figure 1 ).
Figure 1: Vue d'ensemble du système de cocultivation hydroponique, avec des analyses d'échantillons. Les plantes sont cultivées au-dessus du maillage (pousses au-dessus du maillage), les racines étant immergées dans un milieu hydroponique qui est ensuite inoculé avec des bactéries fOu coculture. Les tissus végétaux et les bactéries sont ensuite séparés pour des extractions et des analyses simultanées. Ce chiffre a été modifié à partir de la référence 35 .
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Protocol
1. Planification expérimentale
- Déterminer les objectifs spécifiques de l'expérience.
- Lisez tout le protocole ci-dessous. Déterminez quelles sections sont pertinentes pour les objectifs spécifiques et si des modifications doivent être apportées. Voir ci-dessous des exemples.
- Considérez si les expériences utiliseront plantes A. thaliana et A. tumefaciens bactérie, comme ci - dessous, ou une autre combinaison de plantes microbe.
NOTE: Bien que diverses espèces de plantes puissent être utilisées, l'épaisseur des racines des plantes peut nécessiter un maillage de taille différente (étape 3.3) et les paramètres de croissance (étapes 3.10-3.11 et 4.4) et la taille du réservoir hydroponique et le volume moyen (étape 4.2) peut également nécessiter un ajustement ( Figure 2 ). Les microbes peuvent être facilement inoculés sous forme de cultures pures, d'espèces mixtes (consortiums) ou d'échantillons environnementaux (microbiomes), mais tout changement peut affecter le protocole, en particulier l'étape 4.5. - Prendre en compteTypes d'expériences qui serviront à analyser les échantillons.
REMARQUE: La microscopie à fluorescence (étape 5) nécessite des organismes qui sont marqués avec une construction rapporteur fluorescente.
- Considérez si les expériences utiliseront plantes A. thaliana et A. tumefaciens bactérie, comme ci - dessous, ou une autre combinaison de plantes microbe.
- Concevoir des contrôles appropriés. Inclure des réservoirs hydroponiques sans semis qui sont inoculés avec des bactéries témoins et des citernes avec des semis témoins qui ne sont pas inoculés avec des bactéries.
- Prévoir des expériences avec le nombre approprié de graines et de réservoirs hydroponiques. Envisagez les contrôles, les répliques biologiques (3 au minimum) et les quantités de papier nécessaires pour toutes les analyses.
- Déterminer la longueur de cocultivation appropriée pour les objectifs expérimentaux (étape 4.8).
- Révisez les étapes ci-dessous, si nécessaire.
Figure 2. Exemples d'autres plantes qui pourraient être cultivées dans le système hydroponique, prises en charge par un P En latform de Metal Mesh. Compatibilité d'un ensemble de mailles métalliques pour une variété de graines et de cultures. ( A ) Fil d'acier inoxydable de type 304, fil de 3 × 3 mesh x .047 "pour Vicia faba . ( B ) Fil de soudure en acier inoxydable de type 304 4 × 4 mesh x .035" pour Zea mays . ( C ) Fil de fer à l'acier inoxydable de type 304 4 × 4 mesh x .032 "fil de diamant pour Glycine max (soja). ( D ) Acier inoxydable type 304 soudure 6x6 mesh x .047" fil de diaphragme pour Raphanus sativus (hiver un radis). ( E ) Fil d'acier inoxydable de type 304, fil de 6 × 6 mesh x .047 "pour Triticum spp. ( F ) Fil de soudure en acier inoxydable de type 304 6 x 6 mesh x .035" pour Cucumis sativus . Ce chiffre a été modifié à partir de la référence 35 .955fig2large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
2. Stérilisation de la surface des graines végétales
- Vortex (à grande vitesse) environ 200 graines de A. thaliana avec 500 μL d'eau désionisée dans un tube de microcentrifugeuse. Pour les espèces végétales aux plus grandes graines, utiliser un grand tube pour faciliter la stérilisation de surface.
- Centrifugez-le à environ 9 000 xg pendant 30 s dans une microcentrifugeuse de table. Retirer l'eau (surnageant) à l'aide d'une pipette.
- Ajouter 300 μL d'hypochlorite de sodium à 2% aux graines et au vortex. Laisser à température ambiante pendant 1 min. Pour les espèces de plantes avec des graines plus importantes, utiliser des volumes plus importants pour couvrir les graines.
- Centrifugez environ 9 000 xg pendant 30 s dans une microcentrifugeuse de table. Retirer la solution d'hypochlorite de sodium à l'aide d'une pipette.
- Ajouter 500 μL d'eau stérile et désionisée aux graines et au vortex. Centrifugez environ 9 000 xg pour30 s et retirez l'eau à l'aide d'une pipette stérile.
- Répétez l'étape 2.5 et 4 fois supplémentaires.
- Ajouter 500 μL d'éthanol à 70% aux graines et au vortex. Laisser à température ambiante pendant 1 min.
- Centrifugez environ 9 000 xg pendant 30 s dans une microcentrifugeuse de table. Retirez l'éthanol à 70% à l'aide d'une pipette.
- Répétez l'étape 2.5 5 fois supplémentaires.
- Remettre en suspension les graines stérilisées dans 500 μL d'eau stérile et ultrapure.
3. Germination des semences et culture semi-solide des plantes
- Préparer le milieu semi-solide Murashige et Skoog (MS): 2.165 g / L MS sels basaux; 10 g / L de saccharose; 0,25 g / L MES; Et 59 ml / L de mélange vitaminé B5, pH 5,75, avec 4 g / L de phytoagar.
- Autoclave le support MS. Verser 25 ml dans chaque boîte de Petri profonde stérile (100 x 25 mm 2 ).
- Pour chaque boîte de Petri, découpez un carré de 90 x 90 mm en acier inoxydable.
REMARQUE: Le maillage recommandé pour A. thaliana < / Em> a une teneur de 304 (grade standard), un nombre de maille (nombre de trous par pouce linéaire) de 40 x 40 et un diamètre de fil de 0,01 "(0,0254 cm). Un carré de maille plus large est requis pour les grands réservoirs hydropiniques Ou des plates-formes supérieures. - Pliez les coins de chaque maillage carré juste pour que le maillage soit à l'intérieur de la plaque de Petri. Pliez les coins à un angle de 90 ° par rapport à la masse du maillage pour permettre à la maille d'être soutenue par les coins, en laissant assez d'espace pour le développement de la racine ( Figure 3a ).
- Mettez les carrés de mailles coupées dans un bécher, recouvrez avec du papier d'aluminium et stérilisez par autoclavage en utilisant un cycle sec de 30 min.
- Une fois que le milieu s'est solidifié dans les boîtes de Petri et que le maillage est stérile, placez chaque maillot stérilisé sur le dessus du milieu semi-solide, les coins courbés vers le bas.
- Poussez la maille de telle sorte que les coins pénètrent dans le milieu et la masse du maillage touche la surface supérieure du milieu (> Figure 3b).
- Utilisez une pipette de transfert de 200 μl pour élaborer des graines de A. thaliana stérilisées en surface (les graines resteront sur le bout de la pipette en raison de la force de vide) et transférer doucement chaque graine sur le dessus. Placez les graines afin qu'elles soient correctement espacées pour les besoins expérimentaux ( p. Ex., 4 6 graines / assiette).
- Sceller les plaques de Petri avec des couvercles, en plaçant le ruban chirurgical poreux autour des bords.
- Stratifier les graines en plaçant la boîte de Petri entière à 4 ° C pendant 2 jours dans l'obscurité ( p. Ex., Enveloppez le papier d'aluminium pour simuler l'obscurité).
- Cultiver les graines dans la boîte de Petri à 22-24 ° C avec une photopériode de 16 h pendant 10 à 14 jours ( Figure 3c ).
Figure 3: Système de cocultivation des plantes et des plantes hydroponiques. L'pa gaucheNel représente un organigramme décrivant les six étapes clés de l'assemblage et de l'exploitation du système de co-culture hydroponique. Le panneau de droite démontre les matériaux expérimentaux réels, l'équipement et les procédures opérationnelles pour le système de cocultivation hydroponique lors de l'étude des interactions Arabidopsis-Agrobacterium . L'étape d'inoculation et l'étape finale pour l'échantillonnage végétal ou bactérien sont maintenant affichées. Ce chiffre a été modifié à partir de la référence 35 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
4. Système de cocultivation hydroponique
- Préparer le milieu liquide Murashige et Skoog (MS): 2.165 g / L de sels basiques MS, 10 g / L de saccharose, 0,25 g / L de MES et 59 ml / L de mélange vitaminé B5, pH 5,75.
- Autoclave le support. Verser 18 ml dans chaque verre cylindrique stérile ou un réservoir en plastique transparent (plats cristallins, 100 x 80 mm2) avec des couvercles stériles.
REMARQUE: Presteriliser les réservoirs et les couvercles en les enroulant dans du papier d'aluminium et l'autoclave. - Dans un capuchon de circulation stérilisé, utilisez une pince stérile pour transférer doucement chaque carré de maille avec des plants de 10 à 14 jours du milieu semi-solide à un réservoir cylindrique hydroponique ( figure 3d ). Sceller les couvercles sur les réservoirs à l'aide d'un ruban chirurgical poreux.
- Cultiver les semis sur le maillage dans le réservoir pendant 72 h à 22-24 ° C, avec une photopériode de 16 h et tremper à 50 tours par minute pour l'aération ( Figure 3e ).
NOTE: Cela permet aux plantes de s'adapter à l'environnement hydroponique avant l'inoculation (cocultivation) avec des microorganismes. Cette période d'attente permettra également d'apparaître une contamination microbienne accidentelle avant l'inoculation.- Commencez la prochaine étape le jour précédant la fin de la période d'incubation.
- Cultiver A. tumefaciens en milieu AB(0,5% p / v d' extrait de levure, 0,5% p / v de tryptone, 0,5% p / v de saccharose, 50 mM de MgSO 4, pH 7,0) à 28 ° C avec agitation par secousses pendant une nuit jusqu'à ce que la culture atteigne une densité optique finale de 1,0 à 600 Nm (OD 600 ), mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre, avec du milieu AB non inoculé comme blanc.
REMARQUE: Une OD 600 de 1,0 équivaut à environ 10 9 cellules / mL. - Laver les A. tumefaciens trois fois dans un volume égal de 0,85% de NaCl. Remettre en suspension dans un volume égal d'eau stérile double-distillée.
- Avant l'inoculation, examiner soigneusement le réservoir avec les semis pour s'assurer qu'il n'y a pas de contamination; Le milieu dans les réservoirs non contaminés doit être transparent et transparent.
- Jeter tout réservoir avec un liquide trouble (contamination) et numéroter le reste des réservoirs. Appliquez une petite quantité (20 μL) de milieu hydroponique de chaque réservoir numéroté et localisez-le sur une boîte à Pétri remplie de bouillon Luria (LB). IncuberLe plat à 28 ° C.
- Immédiatement, ajouter 50 μL de la suspension d' A. Tumefaciens (environ 5 x 10 7 cellules, estimées à partir de la DO 600 ) dans chaque réservoir hydroponique numéroté. Cocultez les plants de A. thaliana et A. tumefaciens à 22-24 ° C avec une photopériode de 16 h et secouez à 50 tr / min ( figure 3f ).
- Examinez la plaque LB tachetée à partir de l'étape 4.7.1. Après 12 et 28 h d'incubation pour vérifier la stérilité des citernes. En cas de contamination, n'utilisez pas le réservoir numéroté correspondant (inoculé avec des bactéries) pour d'autres essais en aval.
- Si on le souhaite, surveillez régulièrement la croissance de A. tumefaciens en retirant un échantillon de milieu du réservoir et en mesurant la DO 600 en utilisant un spectrophotomètre avec du milieu à partir d'un témoin non inoculé comme blanc ( Figure 4 ).
NONTE: les symptômes de la maladie végétale devraient apparaître après 7 jours ( figure 5 ). - Séparer les racines d' A. thaliana de la suspension bactérienne en soulevant la plaque de maille; Le moment de cette étape dépend des processus en aval. Voir les étapes 5-8 pour plus de détails.
- Si vous utilisez des racines pour des analyses ultérieures, rincer rapidement les racines dans de l'eau à double distillation. Si vous utilisez des feuilles ou d'autres tissus, coupez le tissu. Pour les analyses d'ARN, passez immédiatement à l'étape 7.1.
Figure 4: Croissance d' Agrobacterium dans le Système de Cocultivation Hydroponique. La croissance d' Agrobacterium en présence ou en l'absence d'un hôte végétal ( Arabidopsis ) a été surveillée toutes les 4 h. Les cellules Agrobacterium ont été cultivées dans un milieu AB AB / O, lavé 3 fois avec NaCl 0,85% et inoculé dans le système hydroponique, avec ou without Arabidopsis co-culture, d'un diamètre extérieur initial de l' ordre de 600 à 0,1. Les valeurs de la DO 600 sont le moyen de trois répliques biologiques, avec des écarts types ( OD 600 de 1,0 = 1 x 10 9 cellules / mL).
Figure 5: Phénotypes végétaux représentatifs et symptômes observables lors de la cocultivation. Dans les 4 jours suivant l'inoculation, aucun symptôme de maladie n'est visible ( A ) par rapport aux plantes non inoculées ( B ). Après 7 jours de cocultivation (infection), les symptômes de la maladie sont observés dans les plantes infectées ( C ), tandis que les plantes non inoculées restent en bonne santé ( D ).
5. Microscopie à fluorescence
- Utiliser A. tumefaciens abritant une construction journalière pour une protéine autofluorescente pourLa configuration de cocultivation à l' étape 4.5 .
NOTE: Un plasmide pJP2 modifié exprimant pCherry, un dérivé de dsRed 36 , est utilisé ici. - Après une co-culture appropriée ( p. Ex., 48 h) à l'étape 4.8, séparer les racines secondaires individuelles (branches latérales de la racine principale) à l'aide de ciseaux stériles.
- Rincer les racines dans de l'eau double distillée pour enlever le matériau lâchement lié. Immergez chaque racine dans 30 μL d'eau sur une glissière de microscope et recouvrez-la avec une lamelle de verre.
- Sceller les bords de la lamelle avec un vernis à ongles pour éviter la déshydratation des racines.
- Visualiser la fixation de A. tumefaciens aux racines A. thaliana par microscopie à fluorescence.
NOTE: Ici, un microscope confocal avec excitation à partir d'un laser à l'hélium-néon (545/594 nm) est utilisé pour visualiser la fluorescence rouge pCherry à 590-630 nm sous un objectif de lentille d'eau 63X inversé avec une ouverture numérique de 1,4 (
Figure 6: Attachement de racine d' agrobacterium , déterminé par microscopie confocale. L' Agrobacterium marqué par fluorescence rouge pCherry a été visualisé à 590-630 nm, avec excitation à partir d'un laser à l'hélium-néon (543/594 nm). La visualisation a été réalisée sous un objectif de lentille d'eau 63X inversé avec une ouverture numérique de 1,4. Barres d'échelle = 11 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
6. Analyse des transcriptules bactériennes
- Après une co-culture appropriée ( par exemple, 8 h) à l'étape 4,8, séparer les racines du milieu hydroponique comme à l'étape 4,9. Transférer 1,5 ml du milieu hydroponique à un micro 1,5 mLCentrifuger le tube et centrifuger à 12 000 xg pendant 2 min pour granuler les cellules.
- Retirer le surnageant. Transférer encore 1,5 ml du milieu hydroponique au même tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml et centrifuger à 12 000 g pendant 2 min pour granuler les cellules.
- Retirer le surnageant.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici en congélérant les échantillons à -80 ° C jusqu'à l'utilisation. - Extraire l'ARN des cellules de A. tumefaciens en utilisant des méthodes standard 37 ou un kit approprié d'isolation et de purification d'ARN avec traitement DNase pour éviter la contamination de l'ADN.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici en gelant des aliquotes d'ARN à -80 ° C jusqu'à l'utilisation. - Utilisez l'ARN isolé pour une variété d'analyses en utilisant des méthodes standard, y compris les suivantes.
- Utilisez un microarray commercial selon le protocole du fabricant pour détecter les ensembles de gènes qui sont différentiellement exprimés en cocultivé par rapport au contrôleCulture.
- Utiliser une réaction quantitative en chaîne à la polymérase en temps réel (qRT-PCR) pour détecter l'expression de gènes spécifiques ou pour valider les données microarray 38 .
7. Analyse des transcriptions végétales
- Après une cocultivation appropriée ( par exemple, 8 h) à l'étape 4.8, séparer les racines du milieu hydroponique, comme à l'étape 4.9, ou séparer d'autres tissus au besoin. Placez immédiatement environ 150 mg de racines ou d'autres tissus végétaux dans de l'azote liquide.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici en congélérant les échantillons à -80 ° C jusqu'à l'utilisation. - Broyer les échantillons congelés à une poudre à l'azote liquide à l'aide d'un mortier et d'un pilon.
- Extraire l'ARN de la poudre en utilisant des méthodes standard 39 ou un kit approprié d'isolation et de purification d'ARN avec traitement DNase pour éviter la contamination de l'ADN.
NOTE: Le protocole peut être mis en pause ici en gelant des aliquotes d'ARN au-80 ° C jusqu'à l'utilisation. - Utilisez l'ARN isolé pour une variété d'analyses en utilisant des méthodes standard, y compris les suivantes.
- Utilisez un microarray commercial selon le protocole du fabricant pour détecter les ensembles de gènes qui sont différentiellement exprimés dans les plantes co-cultivées versus témoins.
- Utilisez qRT-PCR pour détecter l'expression différentielle de gènes spécifiques ou pour valider les données microarray 38 .
8. Profils du secretome
- Après une co-culture appropriée ( par exemple, 72 h) à l'étape 4.8, séparer les racines du milieu hydroponique comme à l'étape 4.9. Stériliser les 18 mL de milieu hydroponique en le faisant passer dans un filtre à pores de 0,2 μm dans des tubes coniques de 50 ml.
- Geler les échantillons à -80 ° CO / N.
- Desserrez les bouchons sur les tubes coniques de 50 ml et placez-les dans une machine à lyophiliser pendant 36 h. Procédez au stockage ou à la préparation des échantillons (en tant que desCribé ci-dessous) pour l'analyse HPLC et la détection de composés.
REMARQUE: le protocole peut être mis en pause ici. - Remettre en suspension chaque échantillon dans 5 ml d'eau double-distillée dans un tube à essai scellé.
- Ajouter 5 ml d'acétate d'éthyle et mélanger en inversant le tube plusieurs fois.
- Laisser les phases se séparer à température ambiante pendant 5 min.
- Transférer le dessus (phase organique) à un nouveau récipient par pipettage. Si nécessaire, regroupez plusieurs fractions organiques.
- Sécher sous un courant doux d'azote gazeux (~ 45 min).
- Réinstaller l'échantillon dans une solution appropriée pour la HPLC ( par exemple, 100% de méthanol).
- Effectuer HPLC selon les méthodes standard 40 .
- Détecter les composés par les moyens appropriés.
REMARQUE: La spectrométrie de masse par temps d'émission d'ionisation par électropulse (ESI-TOF-MS) 40 est utilisée ici.
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Representative Results
Croissance dans le système de co-culture hydroponique
La courbe de croissance de A. tumefaciens C58 a démontré une phase de retard significative dans les 16 premières années de cocultivation, suivie d'une croissance très stable lorsqu'on co-cultivé avec A. Thaliana Col-0, jusqu'à une DO 600 maximale d'environ 0,9 à partir de 48 heures de post-inoculation. En revanche, essentiellement, aucune croissance bactérienne n'a été observée dans la culture témoin sans A. thaliana ( figure 4 ). Ces résultats suggèrent que, sans addition de nutriments fournis artificiellement, les composés chimiques sécrétés par des racines de plantes sont capables de soutenir la croissance d' Agrobacterium dans le système de cocultivation hydroponique. La phase de retard significative pendant les 16 premières années de cocultivation peut être attribuée à la perception complexe de l'hôte et à la sécrétion progressive des racines lors de la cocultivation avec le pathogène. </ P>
Les plants de A. thaliana cocultivés n'ont montré aucun symptôme de maladie au cours des 3 premiers jours, par rapport aux plantes témoins cultivées en l'absence de A. tumefaciens ( Figure 5a , 5b ). Cependant, après 5 jours de cocultivation, les différences deviennent progressivement visibles et les plantes de contrôle traitées simulées étaient plus vertes et plus saines. Après 7 jours de cocultivation avec Agrobacterium , le tissu végétal a montré une chlorose et une nécrose, ainsi qu'une floraison précoce ( Figure 5 c, 5 d ). La floraison précoce dans Arabidopsis est une conséquence générale de l'infection par une gamme de pathogènes phylogénétiquement disparates 41 , 42 .
Visualisation microscopique de l'attachement d' Agrobacterium aux racines des plantes
A. tumefaciens marqué avec une fluorescence rouge pCherry a été localisé dans la structure de la racine de la plante avec une forme typique de tige ou de filament, approximativement 0,5 μm de largeur et 3-5 μm de longueur ( Figure 6 ). La plupart des cellules bactériennes ont été fixées verticalement à la surface de la paroi de la racine, selon des résultats antérieurs selon lesquels Agrobacterium se lie à la paroi cellulaire de manière polaire 32 .
Ces résultats suggèrent que le système de cocultivation hydroponique peut être utilisé pour étudier la dynamique bactérienne in planta , comme la fixation à la structure racine et le processus d'infection, en temps réel. En fait, en l'absence d'autres microbes, ce système de co - culture fournit une plate - forme sans bruit pour l'observation directe de l' attachement bactérie plante dans planta. Activation des transcriptions d' Agrobacterium virulence
Après 8 heures de cocultivation, les cellules de A. tumefaciens ont été récoltées pour l'isolement de l'ARN et les taux de transcription des gènes représentatifs de la virulence ont été évalués par qRT-PCR ( Figure 7 ). L'expression des gènes de virulence ropB, virA, virD1, virH1, virE0 et chvG a été considérablement régulée à la hausse pendant la co-culture avec l'hôte de la plante, par rapport au contrôle sans A. thaliana . Plus précisément, l'abondance de l'ARNm a augmenté de 100% pour la chvG , de 70% pour virD1 , de 94% pour virA , de 40% pour virE0 , de 330% pour ropB et de 48% pour virH1 .
Ces résultats suggèrent que, sans supplémentAvec des produits chimiques induisant de la virulence synthétique, les substances sécrétant des produits chimiques dans le système de cocultivation hydroponique sont capables d'activer la programmation d' Agrobacterium virulence. L'induction des gènes de virulence d' Agrobacterium est révélatrice de la réponse d' Agrobacteria aux signaux dérivés de plantes dans le système de cocultivation hydroponique. Il est très intéressant que Agrobacterium ropB et chvG soient induits lors de la cocultivation avec Arabidopsis, car des études antérieures ont indiqué que ces gènes sont induits par des conditions acides 18 , mais pas par l'acétosyringone, un composé induisant la virulence bien connu 19 . Ce résultat suggère que les composés non identifiés provenant des racines d' Arabidopsis sont capables d'induire l'expression de ropB et de chvG . Cependant, de tels produits induisant de la virulence doivent être identifiés plus avant.
Figure 7. Activation d' Agrobacterium Virulence dans le Système de Cocultivation Hydroponique. Les niveaux d'ARNm de six facteurs de virulence d' Agrobacterium ont été mesurés quantitativement par qRT-PCR. L'abondance des transcrits des facteurs de virulence a été normalisée par rapport aux transcrits 16S de l'ARNr. Les données représentent les moyennes ± écart-type (barres d'erreur) de 3 répliques biologiques, avec les valeurs P obtenues par test t de l'élève.
Expression des transcriptions des plantes
L'analyse de qRT-PCR a été effectuée pour cinq gènes précédemment exprimés de façon différentielle dans A. thaliana (données non publiées). Comme prévu, qRT-PCR a confirmé que l' AGP 30 (AT2G33790) et le NAS 1 (AT5G04950) étaient régulés à la baisse (respectivement 97 et 89%) alors que HSP21 (AT4G27670), PGIP 1 (AT5G06860) et ELIP 1 (AT3G22840) ont été régulés à la hausse (respectivement 3,800, 540 et 510%) dans chacune des 3 répliques par rapport aux témoins ( figure 8 ).
Figure 8: qRT-PCR de A. Thaliana Root Transcripts. L'abondance de chaque transcription de l'ARNm a été normalisée à celle des transcriptions ACTIN II. Les données sont les moyennes de 3 répliques biologiques ± l'écart type (barres d'erreur), avec les valeurs P obtenues par test t de l'élève.
Modifications des profils de sécrétion d'hôte
On a montré que les composés dérivés de la racine diffèrent largement entre les espèces de plantes 6 , 8 . RoLes exsudats incluent des signaux moléculaires qui suscitent diverses réponses de signalisation au cours des interactions plantes-microbes 1 , 43 . Cependant, les différences progressives dans les profils de sécrétion de l'hôte au fil du temps après l'interaction des microbes sont beaucoup moins comprises, sauf que les composés sécrétés par les racines sont impératifs pour l'attraction des bactéries bénéfiques 29 . Après 72 heures de cocultivation avec A. tumefaciens C58, les différences dans les profils de colonome A. Thaliana Col-0 ont été établies en utilisant une analyse LC-MS de mode ions positif et des comparaisons avec le col-0 non inoculé d' A. Thaliana ( c'est- à- dire en l'absence d' Agrobacterium ). Un changement clair dans le secretome a été observé, avec de nouveaux composés apparaissant à la suite de l'inoculation d' Agrobacterium ( Figure 9 ). Au total, 35 composés ont été comparativement améliorés dans le plan secret inoculé par AgrobacteriumTs, tandis que 76 ont été améliorés dans le secretome des plantes non inoculées ( figure 9 ). Ce dernier représente vraisemblablement des composés que A. tumefaciens C58 rencontrerait avant l'infection. Bien que ces composés n'aient pas été identifiés et que la sécrétion différentielle de composés dérivés de racines spécifiques n'a pas été déterminée dans le cadre de cette étude, l'analyse du secretome a démontré des différences détectables dans les profils de sécrétion d'hôte utilisant ce système de cocultivation hydroponique.
Figure 9: A. Thaliana Col-0 Root Secretome Analysis. L'analyse des profils de colonome A. Thaliana Col-0 a été complétée en trois exemplaires pour des échantillons simulés et inoculés. Les zones de pointe pour les 138 signaux de masse uniques (composés) trouvés dans les profils de sécrétion dans chaque groupe de traitement étaient en moyenne, etLes valeurs moyennes ont été utilisées pour calculer la différence d'abondance de chaque composé (inoculé sans inoculation minimale) afin de visualiser les différences dans les composés détectables. Les composés avec de grandes valeurs de différence négative étaient plus abondants dans le secretome des plantes inoculées, tandis que ceux avec de grandes différences positives étaient plus abondants dans le secretome des plantes simulées.
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Discussion
Compte tenu de la nature graduelle de la sécrétion racinaire, la concentration des produits chimiques induisant la virulence produite en planta et leurs effets sur les interactions dynamiques plantes-microbes se produisent dans les gradients spatiaux et temporels. Dans ce système de co-culture hydroponique, aucune phytohormone synthétique ou chimique qui induit une virulence microbienne ou des défenses végétales n'est complétée. En revanche, en utilisant des approches conventionnelles, l'ajout de produits chimiques de synthèse, tels que l'acétosyringone, crée une augmentation soudaine et artificielle des concentrations. Par conséquent, ce système de cocultivation hydroponique imite plus étroitement l'environnement naturel, où les microbes et les plantes hôtes reconnaissent et répondent selon les manières spatiales et temporelles.
Ici, il a été possible de démontrer que les gènes Agrobacterium virulence ont été activés lors de la co-culture avec Arabidopsis . Cela suggère que les produits chimiques dérivés des plantes naturelles induisent la virulence d' Agrobacterium . Avenir eIl est nécessaire d'identifier ces produits chimiques et de vérifier si le composé induisant la virulence, l'acétosyringone, est parmi eux. En outre, des changements substantiels dans l'expression du gène de la racine d' Arabidopsis et des profils de secretome ont été observés lors de la cocultivation avec Agrobacterium , ce qui démontre le potentiel du système de cocultivation hydroponique pour étudier les réponses des hôtes et les profils de sécrétion dans les interactions plantes-microbes. En fait, l'utilisation de la technique de la cocultivation hydroponique, l'expression des gènes et les profils de secretome des hôtes végétaux peuvent être étudiés à tout stade menant à l'interaction microbienne et à leur suite, ce qui aidera à élucider comment ces changements de transcription ou de secretome facilitent ou dissuadent les interactions subséquentes avec les plantes et les microbes .
En plus d'étudier la signalisation d' Arabidopsis - Agrobacterium , le système de cocultivation hydroponique peut être adapté pour étudier d'autres systèmes importants de microbes végétaux. Il peut être utilisé pourÉlucider les réponses des plantes à une grande variété de microorganismes pathogènes ou bénéfiques, agissant individuellement ou collectivement, et étudier l'attachement microbien et les réponses à différents hôtes de plantes dans des conditions relativement «naturelles». Le maintien de la morphologie typique des semis est important pour clarifier les interactions moléculaire-microbe moléculaire. Dans le cas d'autres bactéries, des champignons ou des agents pathogènes d'herbivorité, des nutriments supplémentaires peuvent être complétés pour soutenir la croissance microbienne pendant la cocultivation.
Cependant, il existe quelques paramètres à considérer pour la cocultivation avec différents systèmes de microbes végétaux. En fonction de la taille de la graine et de la morphologie de la racine, il est possible que des maillages métalliques avec des trous plus gros et un récipient de croissance plus important soient nécessaires pour que les semences et les semis soient plus grandes afin de s'assurer que les structures racines se développent complètement sous la surface de maille et que les tissus de pousses prolifèrent ci-dessus. L'installation peut également être modifiée pour inclure une plate-forme supérieure. Cela pourrait être accompli bEn découpant un plus grand carré de mailles et en le pliant plus loin des coins, pour élever la surface de maille plus haut du fond du récipient, ou en coupant le maillage en forme de croix grecque et en pliant chaque rabat aux indentations. Bien sûr, il existe des limites à tous les systèmes, et celui présenté ici ne sera pas utile pour les plantes plus grandes qui se développent pour des périodes plus longues ( par exemple, le maïs mature). En outre, certains organismes peuvent nécessiter plus d'aération que ce qui est fourni en secouant lors de l'utilisation de ce système.
Certes, il est très difficile ou même impossible de concevoir un système dans un laboratoire qui réplique exactement et parfaitement les interactions dynamiques plantes-microbes qui se produisent dans la nature. Bien que la cocultivation hydroponique représente plus étroitement les conditions naturelles de la rhizosphère, au moins conceptuellement, avec des structures racines intactes et la morphologie végétale, il n'y a pas de microorganismes du sol ou du sol dans le système. Cependant, ce système peut être adaptéPour répondre à différents besoins, comme étudier les microbiomes dans un environnement contrôlable et apprendre comment les plantes ou les microbes perçoivent et répondent à différents stimuli biotiques ou abiotiques. Ce système de cocultivation hydroponique peut également faciliter la compréhension des microbiomes et leurs fonctions en hydroponique ou en écosystèmes. Ceci est très important pour la gestion des maladies et la santé végétale pour l'industrie des serres hydroponiques ou pour l'écologie aquatique des plantes et des microbes.
En outre, ce système de cocultivation hydroponique peut être adapté pour étudier la bioremédiation et pour élucider les processus métaboliques et les voies régulatrices pertinentes dans les microbes ou les plantes. En outre, ce système de cocultivation hydroponique facilite l'étude des effets des éléments pré-existants (allelochimiques) et / ou appliqués (synthétiques) et des signaux / composés chimiques sur les microbes ou les hôtes végétaux 44 . La disponibilité d'affections indirectes des tissus végétaux ( c.-à-d.0; Feuille, prise de vue) dans le système de cocultivation hydroponique offre l'occasion d'explorer d'autres processus de défense des plantes, tels que l'amorçage des plantes, et comment ces signaux sont transduits.
La partie la plus critique de ce système de coproduction consiste à prévenir la contamination. En particulier, le transfert de plantes du milieu semi-solide dans le réservoir doit être effectué avec beaucoup d'attention pour éviter la contamination du milieu hydropique. Il est donc nécessaire que cette étape expérimentale soit effectuée dans des conditions stériles dans une armoire de sécurité biologique, et les expérimentateurs doivent attendre 2-3 jours après le transfert avant que des microorganismes ne soient inoculés pour l'expérience.
En résumé, le système de cocultivation hydroponique améliore les diverses limites des approches conventionnelles en maintenant la morphologie typique des plantes et l'intégrité des structures radiculaires de la plante tout au long du processus expérimental. En outre, le système évite la supplémentationSur des produits chimiques synthétiques, tels que des hormones végétales ou des produits chimiques induisant la défense / virulence. Ainsi, il imite plus étroitement l'environnement naturel, où les microbes et les plantes hôtes reconnaissent et répondent dans les manières spatiales et temporelles. Ce système de cocultivation peut être adapté pour étudier différents systèmes de microbes végétaux dans des conditions plus «naturelles» et gérables, y compris avec des microbes endophytiques ou épiphytes. Divers aspects des interactions in planta , telles que la pathogenèse, la symbiose ou la promotion de la croissance des plantes, peuvent être examinés. Le système de cocultivation hydroponique peut offrir de nouvelles idées sur les réponses physiologiques, biochimiques et moléculaires des plantes et des microbes. À n'importe quel point de temps / intervalle ou stade de croissance donné, les bactéries ou les plantes qui poussent dans le système de cocultivation hydroponique peuvent être échantillonnées séparément pour diverses analyses "omiques", y compris les transcriptomies végétales et microbiennes, la métabolomique végétale et microbienne, la structure et le secretome microbien et bioremediatisur. En outre, ce système de co-culture hydroponique peut être adapté pour étudier les interactions entre les hôtes de plantes et les microbiomes dans un environnement contrôlable. En résumé, les avantages de la cocultivation hydroponique illustrent un système supérieur pour découvrir l'interaction et la signalisation moléculaire-microbes moléculaires.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Brian Weselowski et Alexander W. Eastman pour leur aide et leur discussion utile. Nous tenons également à remercier les Drs. Eugene W. Nester, Lingrui Zhang, Haitao Shen, Yuhai Cui et Greg Thorn pour leur aide, des discussions utiles et une lecture critique du manuscrit. Cette recherche a été financée par Agriculture et Agroalimentaire Canada, Growing Forward-AgriFlex (RBPI numéro 2555) et Growing Forward II numéro de projet 1670, menée par les auteurs dans le cadre de leurs tâches. Cette étude a également été financée en partie par la subvention de découverte RGPIN-2015-06052 de recherche en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) décerné à ZC Yuan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plant seeds (Arabidopsis thaliana Col-0) | Arabidopsis Biological Resource Centre | CS7000 | https://abrc.osu.edu/order-stocks |
| bacteria (Agrobacterium tumefaciens C58) | University of Washington | N/A | |
| labeled bacteria | in-house | optional, depends on downstream analyses | |
| vortex | (various) | ||
| microcentrifuge tubes | (various) | ||
| microcentrifuge | (various) | ||
| 5% sodium hypochlorite | (various) | ||
| double distilled water | (various) | ||
| autoclave | (various) | ||
| micropipette | (various) | ||
| 70% ethanol | (various) | ||
| Murashige and Skoog (MS) basal salts | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| sucrose | (various) | ||
| MES | (various) | ||
| B5 vitamin mix | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| phytoagar | (various) | ||
| Deep Petri dishes | (various) | ||
| stainless steel mesh | Ferrier Wire Goods Company Ltd | N/A | grade: 304; mesh count: 40 × 40; wire DIA: 0.01 |
| micropore tape, 1" | 3M | 1530-1 | |
| diurnal growth chamber | (various) | ||
| cylindrical glass tanks, 100 × 80 mm | Pyrex | 3250 | other sizes can be used, in which case liquid content may need adjustment |
| flow hood | (various) | ||
| forcepts | (various) | ||
| yeast extract | (various) | ||
| tryptone | (various) | ||
| MgSO4 | (various) | ||
| shaking incubator | (various) | ||
| spectrophotometer | (various) | ||
| NaCl | (various) | ||
| shaker | (various) | ||
| scissors | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| fluorescence microscope | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| microscope slides and cover slips | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| nail polish | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| Bacterial RNA extraction kit | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| plant RNA extraction kit (RNeasy Plant Mini Kit) | Qiagen | 74903 or 74904 | optional, depends on downstream analyses |
| material and equipment for qRT-PCR | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for microarray analysis | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| liquid nitrogen | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| mortar and pestle | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| 0.2 µm pore filter | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| 50 mL conical tubes | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| freeze dryer | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| sealable test tubes | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| ethyl acetate | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| nitrogen gas | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for HPLC | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for ESI-TOF-MS | (various) | optional, depends on downstream analyses |
References
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