Summary
Dieser Artikel veranschaulicht, wie Arabidopsis Thaliana Sämlinge in einer zweischichtigen mikrofluidischen Plattform Kultur, die die Hauptwurzel und Wurzelhaare zu einer optischen Ebene beschränkt. Diese Plattform kann für Echtzeit-optische Bildgebung der feinen Wurzel Morphologie als auch für hochauflösende Bildgebung mit anderen Mitteln verwendet werden.
Abstract
Wurzelhaare erhöhen Wurzel Oberfläche für bessere Wasseraufnahme und Nährstoffaufnahme durch die Pflanzen. Weil sie klein und oft verdeckt von ihrer natürlichen Umgebung sind, sind Wurzelhaare Morphologie und Funktion schwer zu studieren und Pflanzenforschung oft ausgeschlossen. In den letzten Jahren haben mikrofluidischen Plattformen eine Möglichkeit, Wurzelsysteme mit hoher Auflösung sichtbar zu machen, ohne die Wurzeln zu stören, während der Übertragung um ein bildgebendes System angeboten. Mikrofluidischen Plattform präsentiert hier baut auf bisherigen Anlage-on-a-Chip-Forschung, durch den Einbau einer Zweischicht-Gerät um die Arabidopsis Thaliana Hauptwurzel, die gleichen optischen Ebene als die Wurzelhaare beschränken. Dieses Design ermöglicht die Quantifizierung der Wurzelhaare auf ein Handy und Organelle Ebene und auch verhindert, dass z-Achse treiben während der Zugabe von experimentellen Behandlungen. Wir beschreiben, wie die Geräte in einer geschlossenen und hydratisiert Umgebung, ohne die Notwendigkeit für fluidische Pumpen, unter Beibehaltung einer gnotobiotischen Umgebung für den Keimling zu speichern. Nach dem optischen Bildgebung Experiment werden das Gerät zerlegt und als Substrat für Rasterkraftmikroskop oder Rasterelektronenmikroskopie während feine Wurzel Strukturen intakt zu halten verwendet.
Introduction
Feine Wurzel Funktionen erhöhen Wasser und Nährstoff Erwerb für die Pflanze neue Erde Räume zu erforschen und Vergrößerung der Oberfläche total Wurzel. Der Umsatz dieser feinen Wurzel Funktionen spielt eine wichtige Rolle bei der Stimulierung der unterirdischen Nahrungskette1 und die Anzahl der Feinwurzeln in bestimmten Pflanzenarten ist unter erhöhten atmosphärischen Kohlendioxyd verdoppeln2. Feinwurzeln sind in der Regel als jene kleiner als 2 mm im Durchmesser, definiert, obwohl neue Definitionen für die Charakterisierung von Feinwurzeln durch ihre Funktion3befürworten. Wie viele Feinwurzeln Wurzelhaare erfüllen die Funktion der Aufnahme und Absorption aber einen viel kleineren Raum mit Durchmessern in der Größenordnung von Mikrometern zu besetzen. Aufgrund ihrer geringen Größe Wurzelhaare sind schwer zu Bild in Situ und werden oft als Teil der Gesamtarchitektur der Wurzel im Feld Skalierung Experimente und Modelle übersehen.
Ex-Terra Wurzelhaare Studien, z. B. Sämlinge auf Agarplatten gewachsen, haben hat die wissenschaftliche Gemeinschaft mit wertvollen Informationen auf Zellwachstum und Transport4,5. Während Agarplatten Wurzelsysteme, zerstörungsfrei und in Echtzeit abgebildet werden können, bieten sie nicht hohe Umweltkontrolle für den Zusatz von experimentellen Behandlungen wie Nährstoffe, Pflanzenhormone oder Bakterien. Eine neue Lösung für hochauflösende Bildgebung, wobei jedoch auch dynamische Umwelt Kontrolle erleichtern seit dem Aufkommen von mikrofluidischen Plattformen für Pflanze Studien. Diese Plattformen haben die nicht-destruktive Wachstum und Visualisierung von mehreren Pflanzenarten für hohen Durchsatz Phänotypisierung6,7,8,9, isolierte chemische Behandlungen ermöglicht. 10, Force Messungen11,12, und die Zugabe von Mikroorganismen13. Mikrofluidischen Plattform Entwürfe konzentrierten sich auf die Verwendung von einzelnen Freifläche fluidische Schichten, in denen die Wurzeln ausbreiten können, erlaubt die Wurzelhaare, ein-und optischen Schwerpunkt während des Wachstums oder Behandlung zu treiben.
Hier präsentieren wir ein Verfahren zur Entwicklung einer zweischichtigen mikrofluidischen Plattform mit Foto und Soft-Lithografie-Methoden, die auf früheren Pflanze-on-a-Chip-Designs durch die Beschränkung der Sämling Wurzelhaare, die gleichen Abbildungsebene als die Hauptwurzel aufbaut. Dies ermöglicht es uns, Wurzelhaare Entwicklung in Echtzeit, mit hoher Auflösung und Verlauf der experimentellen Behandlung zu verfolgen. Unsere Kultivierung Methoden ermöglichen Arabidopsis Thaliana Sämlinge gekeimt werden aus Samen innerhalb der Plattform und kultivierten für bis zu einer Woche in einer hydratisiert und sterile Umgebung, die nicht die Verwendung von Spritze Pumpe Ausrüstung erfordert. Einmal das Zeitraffer Image Experiment abgeschlossen hat, kann die hier vorgestellten Plattform geöffnet werden, ohne zu stören die Position der feineren Wurzel Merkmale. Dies ermöglicht die Verwendung von anderen hochauflösenden bildgebenden Verfahren. Hier bieten wir repräsentative Ergebnisse für die Quantifizierung und Visualisierung der Wurzelhaare Morphologie in dieser Plattform durch optische, Scan-Elektronen-Mikroskopie (SEM) und Rasterkraftmikroskop Mikroskopiertechniken (AFM).
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Protocol
(1) Zweischicht-Plattform Fertigung
- Herstellung von mehrschichtigen Meister
- Spin Beschichtung Epoxy-basierte negativer Photoresist (~63.45% Feststoffe, 1.250 cSt) nach den Vorgaben des Herstellers (2.000 u/min für 45 s) auf einen 4-Zoll-Durchmesser Siliziumwafer, die gewünschte Höhe von 20 µm für die erste Design-Schicht zu erhalten.
- Soft-Backen der Fotolack beschichtete Wafer für 4 min bei 95 ° C. Erlauben Wafer Abkühlen für 5 min. aussetzen den Wafer mit UV-Licht für 15 s (~ 150 mJ/cm2 bei 365 nm) über einer Fotomaske in einer UV kontaktieren Aligner um die Geometrie der untersten Ebene zu definieren.
- Nach Exposition den Wafer für 5 min bei 95 ° c Backen Ohne zu entwickeln, die Wafer zu Spin Coater und Spin auf eine zweite Schicht Epoxy-basierte negativer Photoresist zurück (~76.75% Feststoffe, 80.000 cSt) bei 3.000 u/min, eine zweite Schichthöhe von 150-200 µm zu erreichen.
- Lassen Sie die Wafer vor der Übertragung an eine Herdplatte 95 ° C für 45 min. 5 min ruhen. Nach dem Backen auf der Herdplatte entfernen des Wafers und der Resist abkühlen und härtet bei Raumtemperatur für weitere 5 Minuten auf einer flachen, Ebenen Oberfläche. Ausrichten und aussetzen den Wafer, die zweite Schicht Fotomaske für 30 s in einer UV-Kontakt-Aligner (Dosis von etwa 300 mJ/cm2).
- Führen Sie eine Post-Exposition Backen indem der Wafer auf eine Herdplatte für 15 min bei 95 ° C, und lassen Sie die Wafer auf einer flachen, Ebenen Oberfläche für 5 min abkühlen, bevor Sie zu entwickeln.
- Beide Resist-Schichten gleichzeitig zu entwickeln, indem der Wafer in einer Plastikschale und Eintauchen des Wafers in die entsprechenden Entwickler (siehe Materialtabelle). Schütteln Sie das Gericht gelegentlich um frische Entwickler über den Wafer zu waschen.
- Nach 17 min Spülen des Wafers mit Isopropanol (IPA). Wenn ein weißer Film angezeigt wird, weiterhin durchlaufen zwischen den Wafer mit Entwickler und IPA spülen, bis der Film verschwindet. Trocknen Sie die gemusterten Silizium-Wafer mit Stickstoff.
- Polydimethylsiloxan Soft-Lithographie
- Aussetzen der Silizium-Wafer, ein Luft-Plasma für 30 s in einem Plasma Reiniger hoch angesetzt (siehe Materialtabelle) zu reinigen. Silanize der Wafer mit Silan Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoro-n-Octyl) in einem chemischen Haube auf einer Heizplatte unter dem Flammpunkt von Silan (85 ° C) für 2 h.
- Gießen Sie ein 10:1-Verhältnis von Polydimethylsiloxan (PDMS), Härtemittel auf master Siliziumwafer. Entgasen Sie der gemischten PDMS in einer Vakuumkammer und dann heilen Sie das Polymer in einem 70 ° C Ofen für 1 h oder bis die PDMS vollständig ausgehärtet ist.
- Mit einem Skalpell schneiden die PDMS-Geräte und schälen von Meister Siliziumwafer. Verwenden Sie einen 1,5 mm-Biopsie-Punch um Saatgut und Behandlung Buchten, Stanzen Samen Einlauf im 45° Winkel zum Wurzelwachstum in den Hauptkanal fördern erstellen.
- Verwenden Sie klare Klebeband zu entfernen Fremdkörper aus dem PDMS-Gerät und der Gerät-Design-Seite nach unten auf ein Glas Deckglas. Autoklaven der montierten Geräte.
2. Anbau Geräte
- Arabidopsis Thaliana Saatgutvorbereitung
- Oberfläche zu sterilisieren A. Thaliana Samen in einem Microfuge Rohr mit einer Lösung aus 30 % handelsübliche Bleichmittel in deionisiertes Wasser und 0,1 % Triton X-Reinigungsmittel für 7 min. Waschen Samen 4 Mal mit sterilem Wasser verdünnt.
- Samen von Microfuge Röhre kühl, über Nacht oder bis zu einer Woche bei 4 ° c zu Schichten
- Gerät-Vorbereitung
- Stellen Sie sterilisierte Geräte in einem Vakuum-Entgasung Kammer um Luft aus dem Gas zu entfernen durchlässig PDMS und fluidische Kanäle, einfache Füllung zu verbessern.
- Entfernen Sie die Geräte aus der Vakuumkammer und sofort Tauchen Sie die Geräte in einer Petrischale gefüllt mit ¼ Kraft pflanzlicher Basis Flüssigmedien bei pH 5,7.
- Durchziehen Sie Flüssigkeit mit einer Pipette, die Buchten um das Gerät zu füllen. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in Kanälen durch Sichtkontrolle bleiben.
- Übertragen Sie einzelne Geräte auf neue trockene Petrischalen. Gießen oder Pipette heißen Agar rund um das Gerät bis die Agar-Ebene ist fast bündig mit der Oberseite des Geräts PDMS. Lassen Sie Agar, erstarren.
Hinweis: Geräte sind nun bereit für die Saat oder bei 4 ° C bis benötigt gespeichert werden können.
- Saat in Geräten
- Übertragen Sie in einer sterilen Umgebung einen sterilisierte Samen auf den Einlass von jedem Gerät mit einer kleinen Pipette.
- Abdeckung der Petrischale mit Wachs (siehe Materialtabelle) und legen Sie in eine hell/dunkel Radfahren Wachstum Kammer oder Fensterbank bei Raumtemperatur. Ausrichten der Petrischale, sodass die Geräte senkrecht sind und Schwerkraft die Wurzeln fördert wachsen durch den Kanal.
3. Behandlung
- Experimentelle Behandlungen
- Zum gewünschten Zeitpunkt in der Entwicklung der Keimling fügen Sie die experimentelle Behandlung des Keimlings indem eine vorgeschriebene Menge der Behandlung zu jedem der 8 Seite Ports per Pipette hinzu.
- Versiegeln der Petrischale und Rückkehr zum Wachstum Kammer oder Fensterbank.
- Fahren Sie fort mit imaging-Proben zum gewünschten Zeitpunkt zu einzelnen Zeitpunkten zu erfassen oder Zeit verfallen Bildgebung zu beginnen.
4. optische Bildgebung
- Niedriger Auflösung (4-20 X)
- Legen Sie die gesamte Petrischale mit dem Gerät und der Keimling unter einem invertierten Hellfeld-Mikroskop für niedrigere Auflösung (4-20 X) Hellfeld oder differential Interferenz Kontrast (DIC) Bildgebung. Optimierung der Lichtverhältnisse zu morphologischen Merkmale von Interesse zu erhellen, Belichtungszeiten, Lampenhelligkeit, Blende und die Polarität des Lichts anpassen. Fahren Sie die Etappe auf den gewünschten Bereich des Root "und" Fokus im Stamm oder der Root hair(s) von Interesse.
- Erwerben Sie einen einzigen Zeitpunkt oder einer Zeitreihe von Bildern. Um das Wachstum der Wurzelhaare visualisieren, Bild wachsenden Wurzelhaare einmal pro Minute. Visualisieren Sie das Wachstum der Hauptwurzel, erwerben ein Bild alle 30 min. Rückkehr der Petrischale und die Sämlinge zu Wachstum Kammer oder Fensterbank in senkrechter Position nach dem Imaging ist abgeschlossen.
- Höhere Auflösung (20-63 X) Bildgebung
- Der Keimling für eine gewünschte Zeit geworden ist, verwenden Sie Zange, um Deckglas und Gerät aus dem Agar zu entfernen. Reinigen Sie den unteren Rand des Deckglases mit einem Ethanol benetzt Labor Gewebe.
- Gelten Sie die empfohlene eintauchen-Medien für das Ziel entsprechend dem Vorschlag der Mikroskop-Objektiv-Hersteller. Legen Sie das Deckglas auf den Mikroskoptisch und erhöhen Sie die Bühne, um auf das Ziel der Immersion Medienkontakt. Optimieren Sie die Lichtverhältnisse, Belichtungszeiten, Lampenhelligkeit, Blende und die Polarität des Lichts anpassen. Fahren Sie der Bühne auf das gewünschte Gebiet und Fokus auf Root hair(s) von Interesse.
Hinweis: DIC musste zytoplasmatischen streaming zu visualisieren, und Fluoreszenz Markierungen sind erforderlich, um Organelle Bewegung sichtbar zu machen. - Quantifizierung der Wurzelhaare Wachstum im Laufe der Zeit ein Bild pro min zu erwerben. Um Organelle Bewegung zu visualisieren, minimieren Sie die Fluoreszenz Belichtungszeit Beibehaltung einer identifizierbaren Fluoreszenzsignal aus der Organellen. Erwerben Sie so schnell wie die Belichtungszeit erlaubt Bilder von den Organellen. Verwenden Sie für mehr Zeitraffer Aufnahmen einen live-Cell imaging Bühne Inkubator, um Umgebungstemperatur und Feuchtigkeit zu erhalten.
Hinweis: Ein 63 X Öl Ziel empfiehlt sich für bildgebende Wurzelhaare Organellen.
5. nicht-optische Bildgebung
- Gerät-Vorbereitung
- Sämling zur gewünschten Zeit geworden ist,
- Hinterlegung einer dünnen (~ 20 nm) Schicht aus Chrom auf die Wurzel und die umliegenden PDMS mit einer Dual Pistole Electron Beam Verdunstungskammer.
- Übertragen Sie die Wurzel und PDMS-Gerät zu einer Raster-Elektronenmikroskop Kammer.
Hinweis: Imaging-Bedingungen, d.h. Spannung, aktuelle und Arbeitsbedingungen Abstand müssen optimiert werden, um die gewünschte Auflösung für eine bestimmte Anwendung zu erreichen.
- Die Wurzelseite PDMS Gerät oben auf ein AFM Probenhalter anbringen. Kontrast in der Kamera zu erhöhen und leichter unterscheiden die Wurzel aus dem PDMS, platzieren Sie das PDMS-Gerät auf einem flachen reflektierenden Untergrund (z. B. Glimmer in Gold beschichtet) vor der Montage des Gerätes auf die AFM-Probenhalter.
- Sichern Sie eine flüssige gut Befestigung auf der Oberseite der PDMS-Gerätes zu und füllen Sie es mit Wasser, die Wurzeln während der Bildgebung hydratisiert zu halten.
- Laden Sie in der AFM Probenhalter. Einstellen Sie Z-Regler für die Dicke der PDMS-Gerät und befahren Sie die Wurzel mit einer Kamera zur Orientierung der Cantilever in die Region von Interesse.
- Richten Sie den Laser mit der Spitze des Nadelträgers. Verwenden Sie für optimale Ergebnisse mit Kontakt-Modus Bildgebung Kragarme mit Federkonstanten von 0,01 bis 0,03 N/m, minimale Kraft auf die Wurzel während des Scannens ausüben.
- Senken Sie langsam die Scannen-Mechanismus bis der Cantilever nur nimmt Kontakt mit der Probe. Passen Sie die Scangröße für die gewünschte Region und wählen Sie eine Scangeschwindigkeit von 1 Zeile/s mit 256 Spannung Punkte pro Zeile. Den Scan zu erwerben.
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Representative Results
Die hier beschriebenen Zweischicht-PDMS mikrofluidischen Geräte haben einen 200 µm hohen Kanal für die Hauptwurzel Arabidopsis und einer 20 µm hohe Kammer, seitlich wachsenden Wurzelhaare (Abbildung 1A) zu beschränken. Dieses Design darf für Pflanzenarten mit ähnlicher Wurzel Durchmessern wie Arabidopsis Thaliana und kann leicht geändert werden, um Platz für Arten in verschiedenen Größen. Das Design beinhaltet einen Einlass für die Pflanze sowie 8 Seite Einlässe für jede gewünschte chemische oder biologische Behandlung. Prefilling Geräte mit Medien und gießen Agar rund um das Gerät hält die Root-Umgebung für die Dauer des Experiments ohne die Notwendigkeit für externe strömungstechnische Geräte hydratisiert. (Abbildung 1 b) Der Agar stabilisiert auch das Gerät in der Petrischale, ermöglicht die Sämlinge vertikal angebaut werden, Wurzelwachstum, der Hauptkanal zu fördern. Die Petrischale hält die Sämlinge in gnotobiotischen Umgebung enthalten und ermöglicht das Wurzelsystem, durch die Petrischale zu Vergrößerungen bis 20 X abgebildet werden. Eine andere Möglichkeit wäre, direkt das PDMS-Gerät auf einem Glasboden Petrischale für noch höhere optische Vergrößerungen zu versiegeln.
Arabidopsis Thaliana Samen können direkt in das Gerät Inlet gepflanzt werden, die in einem 45-Grad-Winkel Wurzelwachstum in den Hauptkanal zu erleichtern gestanzt wird. (Abbildung 1) Die Höhe des PDMS-Gerät sollte ein paar Millimeter nicht überschreiten, wie die Blätter wachsen aus der Spitze der Plattform können müssen. Arabidopis Samen sind aufgrund ihrer geringen Größe sehr schwierig, so dass das aufstrebende Wurzel radikal den Kanal nach Keimung Gesichter zu orientieren. Daher etwa die Hälfte der Samen gepflanzt werden mit ihren Blättern in den Kanälen Keimen und kann nicht für Wurzel Visualisierung Experimente verwendet werden. Geräte von diese Sämlinge können Re-autoklaviert und verwendet wieder ab Schritt 2.2 werden. Um phototrophe Wachstum von Arabidopsis Thaliana Triebe zu fördern, kann die Anzeige Kammer des Gerätes in Alufolie zu blockieren Licht und Verbesserung der Erfolgsquote abgedeckt werden. Arabidopsis Thaliana Wurzeln haben für eine Woche in dieser Plattform stetig an welcher, die Stelle seitliche Wurzelbildung Wachstum gerichtet wird. (Abbildung 1) Das Wachstum der Wurzeln in dieser Plattform sind vergleichbar mit Wachstumsraten von Arabidopsis Thaliana Wurzeln in anderen mikrofluidischen Plattformen. 13 das Zweischicht-Design beschränkt erfolgreich die Wurzelhaare, die gleichen Abbildungsebene als die Hauptwurzel. (Abbildung 1E) Jedoch einige Wurzelhaare kann weiter wachsen in den Hauptkanal optische unscharf und zukünftige Designs sollten darauf abzielen, allmählicher Wurzelhaare in der Wurzelhaare Kammer führen.
Abbildung 1: Wachstum von Arabidopsis Thaliana im zwei-Schicht-Mikrofluidik-Plattform. (A) Gerät besteht aus zwei Schichten Wurzelhaare, die gleichen Abbildungsebene als die Hauptwurzel beschränken (Skala 1 mm). A. Thaliana Sämlinge können (B) werden in einer gnotobiotischen Umgebung, (C) gekeimt aus Samen im Inneren des Gerätes enthalten, skalieren bar = 400 µm, (D) und überwacht für Wachstum im Laufe einer Woche (Fehlerbalken sind Standardabweichung, SD) . (E) ein repräsentatives Wurzel ist abgebildet in der Plattform Skala bar = 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Im Rahmen der Mikrofluidik-Plattform kann Wurzelhaare auf zellulärer Ebene hinsichtlich ihrer Länge, Dichte und die Winkligkeit ihres Wachstums aus der Wurzel quantifiziert werden. (Abbildung 2A) Wurzelhaare Länge und Dichte von A. Thaliana Wildtyp, die Sämlinge wachsen in unserer Plattform im Bereich von Sämlingen, die vertikal auf Agarplatten gewachsen sind. 14 der Winkel der Wurzelhaare Wachstum ist in der Regel senkrecht zur Oberfläche der Wurzel. In unserer Plattform kann die Winkligkeit der Wurzelhaare Wachstum in Richtung der Spitze ein Artefakt der Entbindung von der Wurzelhaare zu einer 2-dimensionalen Ebene sein. Mechanische Stimulation, in diesem Fall durch die Wände des Gerätes mikrofluidischen nachweislich induzieren Veränderungen im Wurzelwachstum und Ausrichtung, die die Diskrepanz zwischen einer geschlossenen mikrofluidischen Plattform und einer offenen Nährbodenplatte erklären kann. 15 es ist unwahrscheinlich, dass dieser Phänotyp das Ergebnis ein Nährstoff Stress in unserer Plattform ist wie A. Thaliana Sämlinge gespeicherten Nahrungsmittelreserven aus den Samen in den ersten Tagen des Wachstums nutzen. Obwohl Hypoxie in vollständig gesättigte Wurzelsysteme ein Problem sein kann, zeigte die Sauerstoff-Durchlässigkeit des PDMS zuvor die Biokompatibilität des Polymers mit Sauerstoff abhängige Gewebe. 16 , 17
Einer der stärksten Vorteile von mikrofluidischen Plattformen über Agar-Platte-Methoden ist die Fähigkeit, genaue Konzentrationen von chemischen Behandlungen gleichmäßig auf die Organismen hinzufügen. Im einzigen Kanal mikrofluidischen Plattformen kann die Zugabe von Behandlungen potenziell feinen Wurzelhaare aus optischen Fokus verdrängen. Hier zeigen wir die Wartung der Wurzelhaare optischen Schwerpunkt in unserer Zweischicht-mikrofluidischen Plattform während der Zugabe von fluoreszierenden Perlen. In Abbildung 2 b wird ein Sämling (i) vor und (Ii) nach der Zugabe von fluoreszierenden Carboxylated Polystyrol-Kügelchen (blau und rot) abgebildet. Die Zugabe dieser abiotischen Behandlung die Ausrichtung oder den optischen Mittelpunkt der Wurzelhaare der Keimling nicht stören.
Höhere Vergrößerung Bildgebung und fluoreszierenden Marker können verwendet werden, Bild und quantifizieren Organelle Pegeländerungen im Wurzelhaare Entwicklung (Abbildung 2). Zytoplasmatischen streaming kann man in einem Wurzelhaare aus (i) differentielle Interferenzbild Kontrast und in einem anderen Wurzelhaare aus ein Sämling mit einer dreifachen Organelle Marker18, die Flugbahn und die räumliche Verteilung der drei Organellen Golgi Ii) (mCherry), (Iii) Peroxisomen (GFP) und (iv) Mitochondrien (YFP) können die maximale Intensität Projektion in jeder jeweiligen Panel gesehen werden. Die Bewegung dieser drei Organellen werden in eine kumulative Verteilung Grundstück in Abbildung 2erfasst.
Abbildung 2: Wurzelhaare Charakterisierung und Behandlung. Wurzelhaare wurden auf einem zellularen l quantifiziert.Evel durch (A) Länge, Dichte und Kantigkeit für n = 4 Wildtyp (WT)-Sämlinge (Fehlerbalken sind SD). Winkligkeit wird als der Winkel zwischen der Hauptwurzel Spitze und der Wurzelhaare Tipp mit der Hauptwurzel Spitze definiert als 0 ° c-Marke bestimmt. (B) den optischen Mittelpunkt der Wurzelhaare bleibt unverändert (i) vor und (Ii) nach der Behandlung mit fluoreszierenden Styroporkügelchen (Maßstabsleiste = 100 µm). (C) Organelle Ebene Quantifizierung imaging zeigt (i) zytoplasmatischen streaming von einem differenziellen Interferenzbild Kontrast und in einem separaten Wurzelhaare, die Fluoreszenz der drei Organellen: Golgi (Ii) (Iii) Peroxisomen und (iv) Mitochondrien (Maßstabsleiste = 10 µm). Organelle Bahnen wurden visualisiert durch die Zusammenlegung von fluoreszierender Aufnahmen jeder 23-32 s für 20 s. Die Bewegungen der drei Organellen wurden automatisch verfolgt und kumulative Geschwindigkeit Verteilungen aufgetragen auf der rechten Seite. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Das PDMS-Gerät präsentiert hier hat nicht wurde chemisch gebunden an ein Glas Deckglas aber eher bildet eine schwächere physische Verbindung, die während des Schritts Autoklavieren hergestellt wird. Dies ermöglicht das Gerät auseinandergebaut werden, nachdem das optische Bildgebung Experiment abgeschlossen ist. Das PDMS-Gerät kann geschält aus dem Glas, invertiert und als Substrat für die höhere Auflösung nicht optische Bildgebung der Wurzel Morphologie (Abbildung 3A) verwendet werden. Die Plattform hält bequem die Wurzel an seinem Platz beim Kontakt mit einem Freischwinger während Rasterkraftmikroskopie (Abb. 3 b). Weiter, wenn bei der Demontage geachtet wird, bleibt Wurzelhaare in Position auf dem PDMS-Substrat. Davon zeugt von das optische Bild der Wurzel vor der Demontage (Abbildung 3) und nach Demontage der Plattform und den Keimling in ein 20 nm leitfähige Chromschicht für die Bildgebung mit einem Rasterelektronenmikroskop (Abbildung 3D Beschichtung ). Um weiter den Keimling zu bewahren vor die Plattform zu dekonstruieren, kann ein Aldehyd-basierte Fixiermittel in die Plattform zu vernetzen Gewebe Pflanzenproteine an Stelle injiziert werden.
Abbildung 3: Gerät Dekonstruktion und nicht-optische Bildgebung. (A) die mikrofluidischen Plattform zerlegt und als Substrat für hochauflösende nichtoptische bildgebenden Verfahren verwendet werden können. (B) die Oberflächentopographie (Beugung Bild) der Wurzelspitze eines Arabidopsis Thaliana ist abgebildet, mit Kontakt-Modus Rasterkraftmikroskopie, Skala bar = 2 µm. Die Lage des Nadelträgers im Stammverzeichnis wird durch einen schwarzen Pfeil in der Inset, Skala bar = 100 µm (C) optische Bild und (D) entsprechenden Scan Elektron Schliffbild der gleichen Sämling vor und nach dem Gerät zerlegt ist. Pfeile betonen Wurzelhaare, die ungestört bleiben Skala bar = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Schaffung einer Pflanze-on-a-Chip-Plattform in diesem Artikel beschriebene Verfahren ist einzigartig, da die Zweischicht-design Grenzen der Wurzelhaare zum einzigen Abbildungsebene und der Plattform dekonstruiert und als Substrat für nichtoptische hochauflösende Bildgebung verwendet werden . Mit hoher Auflösung nicht optische Bildgebung bieten wertvolle Informationen über das Pflanzengewebe, die aus optischen Bildgebung allein nicht erreicht werden konnten. Zum Beispiel bieten AFM Bildgebung Kraftmessungen um die Elastizität der Gewebe der Wurzel während der Entwicklung oder nach einer bestimmten chemischen oder biologischen Behandlung zu berechnen. In ähnlicher Weise SEM Imaging bieten hochauflösende Details der Oberflächentopographie der Wurzel Gewebe und Verbindung mit chemischen Bildgebung kann Auskunft über elementare Zusammensetzung des Gewebes. 19 zukünftige Generationen dieser mikrofluidischen Plattform beinhaltet Optimierung für die Kompatibilität mit anderen chemischen bildgebenden Systemen wie Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung-Massenspektrometrie (MALDI-MS) und kohärente Anti-Stokes Raman Spektroskopie (Autos).
Wichtige Schritte in diesem Verfahren bedeuten, mit Agar, das Gerät sicher und Hydratation der Anlage ohne die Notwendigkeit für komplizierte Flüssigkeitsströmung Verfahren. Vorsicht ist auch geboten, wenn das PDMS-Gerät aus dem Glassubstrat zu dekonstruieren, um die Morphologie der Wurzel intakt zu halten. Wenn das experimentelle Ziel ausschließlich für geringe bis mittlere Auflösung optische Bildgebung ohne Gerät Dekonstruktion, kann das Verfahren das Gerät auf die zugrunde liegenden Glassubstrat mit Sauerstoffplasma chemisch Bindung geändert werden. Je höher die Auflösung optische Bilder erreicht werden können, ohne das Gerät aus seiner Umgebung gnotobiotischen durch chemisch verbinden die PDMS direkt zu einem Glas Talsohle Petrischale und dann gießen Agar um die PDMS wie zuvor beschrieben.
Das Design der 8 Behandlung Seitenarmen war ein Versuch, die Behandlungen in bestimmten Regionen des Stamms zu beschränken. Dieses Design war jedoch nicht erfolgreich bei der Verhinderung der Verbreitung der Behandlung auf andere Bereiche der Wurzel durch den Leitwert von der Freifläche in die Hauptwurzel Kanal. Um den Stamm lokal zu behandeln, wird die Gerät Architektur müssen überarbeitet werden, um Anwendungen zu beschränken oder die Behandlung wird über eine viskosen Medien vorübergehend Diffusion in das Gerät langsam eingeführt werden müssen.
Wenn es wünschenswert für experimentelle Behandlungen über Flow hinzugefügt werden, werden Änderungen auch für diese Plattform erforderlich. Derzeit führt die Zugabe von Strömung auf der Plattform Buchten die Vertreibung des Samens aus dessen Einlass und Schwierigkeiten bei der Kontrolle der Lage der fluidischen Behandlungen. Diese Methode eignet sich gut für Sämlinge bis zu einer Woche alt. Es beschränkt sich wie lange Sämlinge weiterhin wegen der Länge der Hauptkanal in der Plattform wachsen. Zukünftige Änderungen beinhalten, verlängern den Hauptkanal und Einbeziehung von mehr 200 µm hohe Kanäle für Seitenwurzeln unter Beibehaltung der 20 µm groß Kammer für Wurzelhaare Confinement. Diese Änderung erfordert Kenntnisse über den erwarteten Speicherort der seitliche Wurzel entstehen, um ein entsprechendes Gerät zu entwickeln.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Handschrift hat von UT-Battelle, LLC unter Vertrag Nr. verfasst worden DE-AC05-00OR22725 mit dem US-Department of Energy. Behält sich die Regierung der Vereinigten Staaten und der Verlag durch die Annahme des Artikels zur Veröffentlichung, räumt ein, dass die US-Regierung eine nichtausschließliche eingezahlte, unwiderrufliche, weltweite Lizenz behält zu veröffentlichen oder zu reproduzieren das veröffentlichte Formular der Diese Handschrift, oder andere zu tun, für die Zwecke der US-Regierung zu ermöglichen. Das Department of Energy wird den Zugang der Öffentlichkeit zu diesen Ergebnissen der vom Bund geförderten Forschung gemäß dem DOE den Zugang der Öffentlichkeit Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan) zur Verfügung stellen.
Diese Arbeit wurde zum Teil von Genomic Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, biologische und Umweltforschung, als Teil der Mikrobe Schnittstellen wissenschaftlicher Fokus Betriebsfläche (http://pmi.ornl.gov) unterstützt. Die Herstellung von mikrofluidischen Plattformen Nanofabrikation Research Laboratory in der Mitte für Anwendungspotential Materialwissenschaften erfolgte in eine Damhirschkuh Büro der Wissenschaft Benutzer Anlage. JAA ist durch eine NSF graduate Research Fellowship DGE-1452154 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100> | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| laboratory tissue | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| Negative Photoresist Epoxy | Microchem | SU-8 2000s series | |
| Photoresist developer | Microchem | Su-8 developer | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane | Sigma Aldrich | use in chemical hood | |
| Air Plasma Cleaner | Harrick Plasma | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer base | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent | |
| Dessicator | Bel-Art | F42010-000 | |
| Scalpel | X-acto knife | ||
| Biopsy Punch | Ted Pella | 15110-15 | |
| Adhesive tape | Staples | Invisible Tape | |
| Microfuge tube | Eppendorf | ||
| Triton X | J.T.Baker XI98-07 | ||
| Bleach | Chlorox | concentrated | |
| Plant-Based Media | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Wax film | Parafilm | ||
| microscope | Olympus | IX51 | |
| Atomic Force Microscope | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| Petri dish | VWR | ||
| Scanning Electron Microscope | JEOL | 7400 | |
| Dual Gun Electron Beam Evaporator | Thermionics | Custom Dual Electron Gun Evaporation System |
References
- Pritchard, S. G. Soil organisms and global climate change. Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).
- Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O'Neill, E. G. Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment. Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).
- McCormack, M. L., et al. Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes. New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).
- Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. ROS regulation of polar-growth in plant cells. Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).
- Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. Root Hairs. , 211-232 (2009).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281 (2014).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat. Methods. 9 (11), (2012).
- Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip. Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).
- Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. Early characterization method of plant root adaptability to soil environments. Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).
- Rigas, S., et al. Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex. New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).
- Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits. J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).
- Talbot, M. J., White, R. G. Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope. Plant Methods. 9 (1), 40 (2013).
