Summary
مطلوب التقدير الكمي للخلايا المستمدة من الجهات المانحة لرصد engraftment بعد زرع الخلايا الجذعية في المرضى الذين يعانون من هيموجلوبينوباثيس. مزيجاً من التدفق الخلوي تقوم الخلية الفرز والمقايسة تشكيل مستعمرة والتحليل اللاحق للترادف قصيرة يكرر يمكن استخدامها لتقييم انتشار والتفريق بين فروعه في حجرة محمر.
Abstract
ويلاحظ وجود تشيميريسم غير مكتملة في نسبة كبيرة من المرضى بعد زرع نخاع العظم الثلاسيميا الكبرى أو مرض الخلية المنجلية. وهذه الملاحظة آثار هائلة، كما يمكن تحسين استراتيجيات المرباة العلاجية اللاحقة النتائج السريرية. تقليديا، يستخدم تحليل يستند إلى سلسلة من ردود الفعل بوليميريز ليكرر قصيرة جنبا إلى جنب لتحديد تشيميريسم في خلايا الدم المستمدة من الجهات المانحة. بيد أن هذا الأسلوب يقتصر على الخلايا المنواه ولا يميز بين الأنساب خلية واحدة معزولة. ونحن تطبيق تحليل يكرر قصيرة جنبا إلى جنب لتدفق الخلايا السلف المكونة للدم سيتوميتريك فرز ومقارنة ذلك مع تحليل يكرر قصيرة جنبا إلى جنب التي تم الحصول عليها من وحدة تشكيل انفجر مختارة-المستعمرات محمر، سواء التي تم جمعها من العظم نخاع. بهذه الطريقة نحن قادرون على إثبات انتشار مختلفة والتفريق بين الخلايا المانحة في حجرة محمر. هذا الأسلوب مؤهلاً لاستكمال الرصد الحالية من تشيميريسم في زرع الخلايا الجذعية الإعداد وبالتالي قد تكون الدراسات السريرية في المستقبل التطبيقية وأبحاث الخلايا الجذعية وتصميم تجارب العلاج بالجينات.
Introduction
زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم متمكنة (هسكت) هو النهج العلاجية متوفرة فقط لمجموعة متنوعة من الاضطرابات الوراثية فطرية للنظام المكونة للدم، وتحقيق معدلات البقاء خالية من المرض لأكثر من 90% لالا شديدة الخطر و 1من المرضى الحياة محدودة. وقد تم تحسين فعالية هذه الأداة العلاجية الهامة عن طريق الحد من سمية قبل-وبعد زرع الأنظمة العلاجية2، ولكن أيضا من التدخلات الرامية إلى الحفاظ على وظيفة مستقرة الفساد، الذي هو كمياً بالرصد الدقيق ل الخلايا المستمدة من المانحين3،،من45.
بشكل عام، تشيميريسم كاملة (CC) يعني استبدال مجموع من حجرة ليمفوهيماتوبويتيك بالخلايا المستمدة من الجهات المانحة، في حين يستخدم مصطلح مختلطة تشيميريسم (MC) عندما تكون الخلايا المستمدة من الجهات المانحة والمستفيدة الحالية في وقت واحد في مختلف نسب. تقسيم تشيميريسم (SC) يدل على التعايش بين تشيميريسم المختلطة التي لوحظت في الأنساب خلية واحدة، كما هو الحال في حجرة محمر. سرعة البت في وضع تشيميريسم عقب هسكت أمر بالغ الأهمية، كما أنها قد تساعد في تحديد المرضى عرضه للانتكاس المرض واستراتيجيات immunomodulatory اللاحقة بدء، مثل المانحين اللمفاويات دفعات أو الحد من كآبته 6من العلاجات.
وقد وضعت عدة أساليب لرصد engraftment بعد هسكت. إيسوتيبينج المناعية وتحليل cytogenetics حساسية فقيرة ومحدودة من حيث قدرتها على الكشف عن تعدد الأشكال7،8. الأخذ بتهجين الفلورسنت في الموقع (الأسماك) يمكن تعزيز الحساسية في رصد تشيميريسم بعد هسكت، ولكن يقتصر على الجنس متطابقة اللوجرافتس9. في الوقت الراهن، تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو الأسلوب الأكثر انتشارا المستخدمة للكشف عن تشيميريسم، وهو يستند إلى التقليدية [اغروس]-الاكريلاميد جل التفريد ليكرر جنبا إلى جنب رقم متغير (فنترس) أو تكرار قصيرة جنبا إلى جنب (المشبوهة). تستخدم بشكل روتيني PCR الكمي قادراً على الكشف عن نسبة ضئيلة للغاية من خلايا المانحين المتبقية بعد هسكت. القيد الرئيسي للدراسات حتى الآن هو أن الكشف MC يكاد يقتصر على وجود الخلايا المنواه، بدلاً من الكريات الحمراء الناضجة، إلا وهي الخلايا أن وظيفيا حاسمة بالنسبة للمرضى الذين يتأثرون هيموجلوبينوباثيس. في المرضى الذين يعانون من مختلف فصائل الدم، فإنه يجدر بنا أن نتذكر أن التحليل سيتوفلوروميتريك غير قادرة على تحديد تشيميريسم في خلايا الدم الحمراء باستخدام الأجسام المضادة الموجهة نحو المستضدات كرات الدم الحمراء أبو وج، ج، د، ه، وه10 , 11-وسائل مختلفة، ولكن مثيرة جداً للاهتمام لتقييم تشيميريسم في النسب محمر هو المزيج من تدفق سيتوميتريك فرز موروث محمر ومختارة من مختلف أنواع السلف محمر باستزراع في فحوصات كلونوجينيك، يتبع بتحليل لشارع12. هذا النهج قادرة على قياس الارتفاع النسبي للمانح-مقابل-المتلقي تشيميريسم في حجرة محمر ويمكن استخدامها في الاستراتيجية الرامية إلى إدامة الفساد نخاع العظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-"عزل خلايا نخاع العظام المكونة للدم" عن طريق تنشيط Fluorescence معلمة متعددة "الخلية فرز"
- تلطيخ عينة
- قبل البدء في العملية، تحتاج إلى البنود التالية التي سيتم جمعها وأعد:
- وسائط متدرجة لإعداد وحيدات النوى الخلايا (جنرال موتورز)، 50 مل مخروطية أنابيب
- أنابيب تدفق 12 × 75 مم لتلطيخ الخلايا
- Staining المخزن المؤقت: الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) + 3% مصل العجل الجنين (FCS)
- الماصات
- FC كتلة وتلطيخ أجسام مضادة (CD34 APC، CD36 فيتك، V450 CD45، دينار بحريني العلوم البيولوجية). مع هذا الجمع fluorochrome هناك لا تذكر امتداده إلى قنوات أخرى، ولكن أي تركيبة fluorochrome مناسبة أخرى ومن المحتمل أيضا.
- حبات التعويض (إذا لزم الأمر)
- تعليق المخزن المؤقت: هانك ' s حل متوازن الملح (حبس) + 25 مم حبيس + FCS 3%
- تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير
- أنابيب جمع: أي المتوسطة الغنية بأنابيب المصل عالية (الذي يحتوي على 1 مل FCS + 25 مم حبيس) يمكن أن تستخدم لجمع الخلايا مفروزة. عينة
- نخاع العظام: المستنيرة لخزعة نخاع العظم من الحرقفي في الجزء الخلفي عظم الفخذ مطلوب عادة. عينة نخاع العظم مما أبقى في الحقن هيبارينيزيد في الرايت حتى تلطيخ. يتم تنفيذ الخطوات التالية البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية للمؤسسة ' s لجنة أخلاقيات البحوث البشرية لرفاه الإنسان.
- توليد تعليق خلية واحدة فقط من عينة نخاع العظم. أضف 3 مل من جنرال موتورز إلى أنبوب الطرد المركزي. طبقة مل 4 من تعليق خلية مفردة على الحل الآلية العالمية بعناية. أجهزة الطرد المركزي في 550 غ لمدة 30 دقيقة في 20 درجة مئوية (ج) (الفرامل يتم إيقاف تشغيل). رسم من الطبقة العليا التي تحتوي على البلازما والصفائح الدموية ماصة معقمة، تاركاً طبقة الخلايا وحيدات النوى دون عائق في الواجهة باستخدام. نقل طبقة الخلايا وحيدات النوى إلى أنبوب عقيمة للطرد مركزي باستخدام ماصة معقمة.
- بعد الغسيل مع مل 5 تلطيخ المخزن المؤقت، ريسوسبيند الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لتعليق 2 مل وتحديد تركيز الخلية. 5 مكان ميليلتر من تعليق خلية في أنبوب اختبار ملولبة. إضافة ميليلتر 95 من 0.2% تريبان الأزرق وصمة عار. مزيج دقيق. السماح إلى الوقوف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ملء هيموسيتوميتير أما بالنسبة لخلية العد. تحت مجهر، نلاحظ إذا كان غير قابل للحياة ملطخة وحساب الخلايا قادرة على البقاء-
- الطرد المركزي الخلايا في غ 250 لمدة 10 دقائق في 20 درجة مئوية، وتجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في تلطيخ المخزن المؤقت بتركيز يصل إلى 1 × 10 6 لكل 100 ميليلتر.
- FcR كتلة باستخدام 2.5 ميكروغرام كتلة Fc الواحدة 1 × 10 6 خلايا على الجليد ل 10-15 دقيقة
- إضافة مزيج مناسب من 10 ميكروغرام ماب وصمة عار 1 × 10 6 خلايا واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام، تليها خطوة غسيل مع مل 3 تلطيخ المخزن المؤقت. لتعويض الصحيح، ملطخة مختبرين صغيرة من الخلايا (أو يفضل التعويض الخرز) مع واحد من الأجسام المضادة كل؛ واحد قاسمة المتبقية أونستينيد.
- ضبط التركيز إلى 20 × 10 6 خلايا/مل. ويصل
- مجموعة الأمثل فارز الخلية. عملية إنشاء تدفق سيتوميتير والبرمجيات هي موحدة مع تعليمات مفصلة قدمتها الشركة والاحتياجات التي ينبغي أن تؤديها إلى أفراد مدربين تدريبا مناسباً.
- قبل البدء في العملية، تحتاج إلى البنود التالية التي سيتم جمعها وأعد:
- الفرز على فارز خلية
- إعداد أنابيب جمع من الخطوة 1.1.1.9.
- إعداد قالب يحتوي على مؤامرة المتغيرين لعرض المبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC).
- تشغيل الخلايا وضبط منتدى التعاون الأمني/SSC لوضع سكان اهتمام بمقياس
- سجل أنبوب مراقبة سلبية.
- تشغيل أنابيب التحكم إيجابية واحدة؛ وتسجيل البيانات لكل أنبوبة.
- حساب التعويض أما يدوياً أو تلقائياً مع الدالة المقدمة من البرنامج اقتناء.
- الحصول على العينة التجريبية، وبوابة لهم على المتغيرين منتدى التعاون الأمني/SSC دوت قطعة ( الشكل 1A) لتضمين الخلايا اللمفاوية والنقوي على حد سواء. استبعاد دوبليتس والمجاميع بمقارنة الإشارات المختلفة من منتدى التعاون الأمني (أي والارتفاع والعرض والمنطقة) ( الشكل 1B). تصور الخلايا القميص على مؤامرة دوت المتغيرين عرض CD45 و CD36 ( الشكل 1). الأحداث الإيجابية ل CD45 leucocytes (بما في ذلك المتكفل بهم)، وتلك السلبية ل CD45 وهي إيجابية بالنسبة CD36 المتكفل محمر. استخدام أدوات النابضة لتعريف CD36 + (إذا كان مطلوباً، هذه الخلايا يمكن كذلك تقسيم CD36 عالية ومنخفضة إذ تعرب عن الخلايا) والخلايا CD45 +. تصور أحداث CD45 + في آخر الأرض دوت عرض معلمات CD34، والتعاون بين بلدان الجنوب. استخدام النابضة أدوات لتعريف CD34 + الخلايا (الكريات البيض فروعه) وال SSC عالية الخلايا (الخلايا النقوي في مراحل مختلفة من التمايز).
- متى تحددت البوابات، البوابات يمكن تحديده للفرز في أنابيب جمع خارجي-
- المضي قدما مع الفرز عند 4 درجة مئوية حتى تم الحصول على العدد المطلوب من الخلايا
- القيام بتحليل ما بعد فرز لتحديد نقاء الخلية فرز السكان ( الشكل 1E، 1F).
2. الإنزيم كلونوجينيك
- إعداد الكواشف
قبل البدء في هذه العملية، تحتاج العناصر التالية جمعها وإعداد:- الماصات ولوحات 100 مم
- تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير
- إعادة تشكيل الاريثروبويتين الماشوب البشري (EPO) في U/mL 500 في برنامج تلفزيوني العقيمة التي تحتوي على مالا يقل عن 0.1% ألبومين المصل البشري. تقسيم هذا الحل إلى مختبرين الصغيرة وتبقى في-20 درجة مئوية لتجنب تجميد أذاب المتكررة.
- تحضير إكمال Iscove ' s دولبيكو التعديل ' s المتوسطة (إيمدم) مع التركيزات النهائية من السفح 5%، 2 مم الجلوتامين، 100 وحدة/مل البنسلين/ستربتوميسين (PS). إضافة البشري الماشوب الاريثروبويتين (EPO) بتركيزات مختلفة في آبار منفصلة للمتوسط إيمدم كاملة: 3 وحدات المكتب الأوروبي للبراءات/حسنا، 6 وحدات المكتب الأوروبي للبراءات/جيدا و 12 مكتب البراءات الأوروبي وحدات/جيدا (1 x, 2 x, 4 x EPO على التوالي)-
- إعداد خلايا نخاع العظم
- 10 مل عينة نخاع العظم تضعف مع 20 مل برنامج تلفزيوني يتم ببطء طبقات أعلى 15 مل الكثافة المتوسطة التدرج في أنبوب 50 مل مخروطية، الحفاظ على واجهة واضحة بين المرحلتين، وكنت nder ظروف معقمة. ثم الطرد المركزي أنابيب مخروطية الشكل 15 مل في 550 غ س لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع تسارع على النحو 9 والتباطؤ في تعيين ك 0 (أو الفرامل قبالة).
- بعد الطرد المركزي، إزالة الواجهة في أنبوب 50 مل جديدة وإضافة برنامج تلفزيوني لوحدة تخزين نهائي من 50 مل.
- بعد الطرد المركزي مع 250 غرام لمدة 10 دقائق في 10 درجة مئوية إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في المتوسط إيمدم كاملة في حوالي 0.5 × 10 6 خلايا/مل. تأخذ 10 ميليلتر من تعليق خلية في microtube وتخلط مع نفس الحجم من محلول تريبان الأزرق (0.4%) والعد باستخدام هيموسيتوميتير.
- سبشونال: هي إثراء CD34 + الخلايا بالخلية المغناطيسية الفرز مع الخرز CD34 ميلتيني وفقا للتعليمات الصادرة عن التصنيع. والميزة الرئيسية لهذه الخطوة تخصيب اليورانيوم هو الكشف عن نوعية الخلايا الجذعية المكونة للدم، والتي تزرع في مصفوفة شبه صلبة أضيف مع 50 نانوغرام/مل الخلايا الجذعية عامل (SCF)، 20 نانوغرام/مليلتر بلعم المحببات محفزة لمستعمرة عامل (GM-CSF)، 20 نانوغرام/مليلتر انترلوكين-3 (إيل-3) 20 نانوغرام/مليلتر انترلوكين-6 (إيل-6)، عامل تحفيز مستعمرة المحببات 20 نانوغرام/مليلتر (ز-CSF) وتركيزات مختلفة 3 من مكتب البراءات الأوروبي كما هو الحال في 1.4.
- تمييع الخلايا إلى 0.1-0.15 × 10 6 وحيدات النوى خلايا/مل أو 2 × 10 3 CD34 + خلايا/مل بإضافة كاملة إيمدم المتوسطة وتستكمل مع ميليلتر 300 البراءات ونقل إلى 3 مل المتوسطة H4434 ميثوكولت. بعد الانفعالات وحضانة قصيرة للوحة 5 دقيقة ثلاث مرات 1.1 مل على طبق 35 ملم. اثنان من هذه الأطباق الثقافة إلى جانب ثالث-مليئة بالمياه-وتوضع في لوحات 100 مم-
- هي الخلايا المستزرعة في حاضنة هوميديفيد 37 درجة مئوية مع 5% CO 2 لمدة 14 يوما-
- تحليل مستعمرات
- وسجل المستعمرات وفقا التشكل مع مجهر مقلوب في 40 X التكبير في صحن ثقافة ملحوظ مع شبكة التهديف. لأغراض الفحص لدينا، وتصنف الوحدات تشكيل مستعمرة (زيمبابوي) في 4 فئات: السلف مولتيبوتينتيال الخلايا (زيمبابوي-جيم)، خلايا السلف بلعم المحببات (زيمبابوي-جنرال موتورز)، انفجر تشكيل وحدة-محمر (أولما-E) ومستعمرة تشكيل وحدة-محمر (زيمبابوي-E). راجع الشركة المصنعة ' s التعليمات لمزيد من مستعمرة سوبكلاسيفيكيشن.
- لمزيد من التحليل، الخلايا من لوحة المقايسة زيمبابوي يتم استرداد كل على حدة وفقا للفئات 4 تعليق في درجة حرارة الغرفة 4 مل برنامج تلفزيوني يحتوي على 2% FCS/إيمدم. بعد الطرد المركزي في 400 غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، حراكه في برنامج تلفزيوني الخلايا وحسابها ومعالجتها لاستخراج الحمض النووي-
3. تحليل تشيميريسم
- عزل الحمض النووي
- بيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 400 غرام للحد الأدنى 10
- "عزل الحمض النووي" استخدام دم طقم استخراج الحمض النووي (أدوات استخراج كيمب الحمض النووي الدم). قبل الحارة شطف المخزن المؤقت (AE) عند 37 درجة مئوية لتعزيز العائد من الحمض النووي التيد.
- قياس تركيز الحمض النووي مع شحني الأطياف ND نانودروب-1000. وتستخدم عينات مع 260/280 OD بين 1.8 2.0 لمزيد من التحليل.
- "الحمض النووي تضعف" مع دناسي مجاناً ح 2 س إلى 0.1 نانوغرام/ميليلتر في إجمالي حجم 50 ميليلتر.
- STR-تحليل
- إقامة تفاعل PCR بمزج خليط من رد الفعل، أمبلتاق الذهب دنا بوليميريز والتعريف بالإضافة إلى تعيين التمهيدي مع 20 ميليلتر الحمض النووي (0.1 نانوغرام/ميليلتر) وفقا للدليل (يحتوي على عدة التمهيدي الإشعال غير المسماة في المخزن المؤقت لتضخيم المكاني شارع D3S1358، الإرشاد، فجا، D8S1179، D21S11، D18S51، D5S818، D13S317، و D7S820، وأميلوجينين ماركر بين الجنسين). وتشمل المياه خالية من نوكلياسي كالمراقبة السلبية و 9947A كمراقبة إيجابية. قبل زرع الحمض النووي من الجهات المانحة والمتلقية على السواء مدرجة أيضا.
- "بكر القيام" رد فعل استخدام التدرج ماستيرسيكلير ايبندورف مع الشروط التالية: 95 درجة مئوية لمدة 11 دقيقة، تليها دورات التضخيم 28 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة, 59 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 60 درجة مئوية ل 45 دقيقة
- مجموعة أعلى جزء تحليل رد فعل إضافة 12 ميليلتر فورماميد دي مرحبا و 0.5 ميليلتر "جينيسكان 500 روكس الحجم القياسي" (جميع النظم البيولوجية التطبيقية) إلى 1 ميليلتر من منتج PCR. مطلوب في المركز الأول والأخير "سلم الاليلي" (أمبير جينوتيبير فلوريدا شارع الأزرق والثانية الأخضر والأصفر، النظم البيولوجية التطبيقية)-
- تبدأ الصك التفريد الكهربي واقتناء.
- "تحليل المكاني"، الآليلات ومرتفعات الذروة للعينات والضوابط مع البرمجيات 13-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الفصل بين فروعه ليمفوهيماتوبويتيك بنظام مراقبة الأصول الميدانية الخلية الفرز
نحن هنا إظهار النتائج من فرز السكان خلية اللازمة لتحليل تقارير عن المعاملات المشبوهة المتلقين للمعلومات. خلايا نخاع العظام كانت ملطخة CD45 المضادة مترافق V450، CD36 المضادة مترافق FITC و CD34 المضادة مترافق APC. سكان الفائدة هو megakaryocyte محمر موروث (الهندسة الكهربائية والميكانيكية)، المنبسطة الخلايا المسؤولة عن تطوير الكريات الحمراء. هذه الخلايا إكسبريس CD36، لكن سلبية مستضد الكريات البيض شيوعاً CD45 (الشكل 1). إذا لزم الأمر، هذه الخلايا يمكن أن تكون زيادة متباينة تستند على مستوى التعبير CD36. يمكن فرز السكان إضافية عديدة لتكون بمثابة عناصر التحكم. نحن فرز CD45 + CD34 + السلائف اللمفاوية/النقوي كآخر السكان خلية السلف والخلايا CD45 + مع إشارة SSC عالية كخلايا النقوي الناضجة (الشكل 1). وأجرى الفرز مع فاكساريا دينار بحريني أنا صك. بعد الفرز، كان محمر السلف خلية نقاء > 85% (الشكل 1E) ونقاء خلية النقوي > 95% (الشكل 1F).
الشكل 1 . فرز الخلايا السلف محمر وخلايا السلف النقوي بعد نظام مراقبة الأصول الميدانية- يعرض الشكل 1A/1B على فسكا مقابل سكة، ومنتدى التعاون الأمني-ح مقابل فسكا واستخدام أداة المضلع بوابة لتحديد سكان الفائدة. ج 1 يشير إلى الهندسة الكهربائية والميكانيكية في CD45 مقابل CD36؛ 1-د يعرض الخلايا النقوي ناضجة. ويبين النسبة المئوية للخلايا إيجابية في 1E و 1F . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
جيل الاندفاع تشكيل وحدات - المستعمرات محمر
تظهر بعض الخلايا المشتقة من نخاع العظم ومفصولة الخرز المغناطيسية الخاصة CD34 تتكاثر والتفريق. بعد فترة حضانة تستمر 14 يوما في المستعمرات متوسطة شبه صلبة تتشكل. إلى حد كبير زيادة التحفيز بتركيزات مختلفة من مكتب البراءات الأوروبي تشكيل المستعمرات الأحمر بارز (محمر) (الشكل 2).
الرقم 2. جيل الاندفاع تشكيل وحدة-محمر (أولما-E). يظهر هو الصورة المجهرية الطاقة المنخفضة ممثل من مستعمرة أولما-ه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الشركات متعددة الجنسيات: | |||
| 1 X البراءات | 2 X البراءات | 4 X البراءات | |
| زيمبابوي-E | 2 | 2 | 2 |
| أولما-E | 9 | 10 | 8 |
| زيمبابوي-الآلية العالمية | 30 | 30 | 29 |
| زيمبابوي-جيمم | 1 | 1 | 2 |
| CD34+ الخلايا: | |||
| 1 X البراءات | 2 X البراءات | 4 X البراءات | |
| زيمبابوي-E | 1 | 1 | 0 |
| أولما-E | 5 | 11 | 6 |
| زيمبابوي-الآلية العالمية | 25 | 26 | 32 |
| زيمبابوي-جيمم | 0 | 2 | 3 |
الجدول 1. تحليل للمستعمرات في خلايا نخاع العظام لم يتم فرزها و CD34 + تحديد الخلايا. وسجل المستعمرات وفقا التشكل مع مجهر مقلوب في 40 X التكبير في صحن ثقافة ملحوظ مع شبكة التهديف. لأغراض الفحص لدينا، تصنف المستعمرات في أربع فئات: تشكيل مستعمرة وحدة-محمر (زيمبابوي-E)، انفجر تشكيل وحدة-محمر (أولما-E) وخلايا السلف بلعم المحببات (زيمبابوي-جنرال موتورز) والسلف مولتيبوتينتيال الخلايا (زيمبابوي-جيم).
تحليل تشيميريسم
تحليل تشيميريسم تتم باستخدام أمبيرفلوريداSTR منشئ ملفات التعريف بالإضافة إلى عدة (النظم البيولوجية التطبيقية، كاليفورنيا) وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة في محلل الوراثية من منظور من أبي 310 (النظم البيولوجية التطبيقية، كاليفورنيا). يتم إجراء التحليل مع برنامج جينيمابير (النظم البيولوجية التطبيقية، كاليفورنيا). واستخدمت D21S11 المكاني، D7S820، وفجا والإرشاد لحساب النتائج (النسبة المئوية من المتلقية والمانحة محددة الحمض النووي).
| عينة | المستفيدة من الحمض النووي | المانحة الحمض النووي |
| CD45 | 25% | 75 ٪ |
| CD36hi | 25% | 75 ٪ |
| CD36lo | 55% | 45% |
| CD34 | 25% | 75 ٪ |
الجدول 2. النسبة المئوية المتلقية والمانحة الحمض النووي في الخلايا التي تم الحصول عليها من فرز Fluorescence تنشيط خلية من خلايا نخاع العظام. تعطي تشيميريسم الخلايا المانحة في السلالات الخلوية محددة من حجرة ليمفوهيماتوبويتيك.
| عينة | المستفيدة من الحمض النووي | المانحة الحمض النووي |
| بي أم-الشركات متعددة الجنسيات | 24.71% | 75.29% |
| بي أم-CD34 |
الجدول 3. النسبة المئوية المتلقية والمانحة الحمض النووي في الخلايا التي تم الحصول عليها من الإنزيم كلونوجينيك. تعطي تشيميريسم الخلايا المانحة في السلالات الخلوية محددة من حجرة ليمفوهيماتوبويتيك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وهدف الدراسة الحالية تقديم مزيج من النهجين الجمهور لتحليل تشيميريسم الجهات المانحة والمتلقية في فروعه محمر بعد هسكت في المرضى علاج هيموجلوبينوباثيس: 1.) الأسفار تنشيط الخلية الفرز خلايا السلف المكونة للدم في عينات نخاع العظم متبوعاً بتحليل ليكرر قصيرة جنبا إلى جنب و 2). وحدة تشكيل مستعمرة تنمو خلايا نخاع العظام، تليها تصنيف مستعمرات في شتى أنواع السلف تحليل يكرر قصيرة جنبا إلى جنب. الجدة من هذا النهج يكمن في الجمع بين التقنيات في وضع بروتوكول لتقييم الجهات المانحة والمتلقية تشيميريسم في مستعمرات فردية.
يمكن الاطلاع على الأهمية الخاصة لهذا النهج في سياق تشيميريسم مختلطة بعد هسكت للمرضى علاج هيموجلوبينوباثيس. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن نسبة كبيرة من المرضى التعبير عن نسبة منخفضة من خلايا النقوي المانحين الذي يرتبط مع أن من محمر الخلايا السليفة أوند نتائج مستقرة طويلة الأمد المختلطة المكونة للدم تشيميريسم3، 11؛ على النقيض من ذلك، في المرضى نفس نسبة مئوية عالية من خلايا الدم الحمراء المستمدة من الجهات المانحة (2 إلى 5 إضعاف أعلى من الكريات البيضاء الناضجة) يلاحظ، وتقترح أن تكون عديمة الفعالية الكريات الحمر تجري في مرحلة لاحقة للتنمية محمر. وقد نسبت هذه الملاحظات إلى الميل للمبرمج المعجل في erythroblasts المانحين واستمرار لمفاوية المتبقية T و B المسؤولة عن السماح allograft مختلطة14،15. وفي سياق المرباة بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم أثبتنا مؤخرا هذا التعديل للعلاج المثبطة للمناعة بعد زرع الأعضاء المكونة للدم للنتائج ß ثلاسيميا في ميزة انتقائية حجرة محمر تصحيح وراثيا، إعطاء تضخيم 2 إلى 2.5 إضعاف الجذعية المانحة المتبقية الخلايا12. وتدعم هذه الملاحظة الأداة المساعدة لتحديد المتكفل محمر المانحة مقابل المتبقية، كما أنه يتيح فهم هذه الظاهرة ويدعم التجارب السريرية مستقبلا دراسة العلاج الجيني لعلاج هيموجلوبينوباثيس. في الواقع، قد تكون نسبة الخلايا المنواه المعدلة وراثيا بحاجة إلى تحقيق مستوى علاجية تعميم خلايا الدم الحمراء مشابهة للتي لوحظت في المرضى الذين عولجوا بزرع الخلايا الجذعية هيموجلوبينوباثيس.
بغية تحديد الصورة الكاملة للجهات المانحة تكون الكريات الحمر تعديل للبروتوكول، وتقديم نهج تجريبي مفصلة خطوة بخطوة. أن الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول هي عملية إعداد cytometer تدفق والبرمجيات، والتي هي موحدة مع تعليمات مفصلة ويجب إجراؤها بواسطة أفراد مدربين تدريبا مناسباً. يسمح العرض لدينا بروتوكول في شكل تصور الجمهور لمتابعة أعمالنا البروتوكول بسهولة. قارنا نتائجنا PCR باستخدام الحمض النووي من محمر فروعه التي تم الحصول عليها من مستعمرة تشكيل وحدات في عينات BM مقابل الحمض النووي التي تم الحصول عليها من فروعه نخاع العظام محمر فرز نظام مراقبة الأصول الميدانية. البيانات انجرافتمينت المانحة من هذين النهجين تتسق أساسا. ومع ذلك، عادة ما تكون أقل تباين عثر في العينات التي تم الحصول عليها من تشكيل مستعمرة الوحدات. ومن المرجح نتيجة لتحسين بقاء سلائف خلايا الدم الحمراء المانحة في الفحص في المختبر بالمقارنة مع النظراء المانحين غير المعالجة وفرزها. في ضوء ذلك، يمكن توسيع هذا البروتوكول عن طريق إنشاء مصطنع تركيبات تشيميريك مختلطة مع النسب المعروفة المتكفل صحية وموروث من مجموعة من المرضى الذين يعانون من مختلف هيموجلوبينوباثيس. الإنزيم كلونوجينيك وتقييم تشيميريسم ينبغي أن تعكس بدقة في وضع النسب.
على الرغم من أن تفتقر إلى فهم دقيق للآليات التي تشارك في هذا الإعداد خاص، الأسلوب الذي قدم هنا أمر بالغ الأهمية لتوفير المعلومات ذات الصلة لرصد روتينية engraftment ومعلومات تشخيصية في الممارسة السريرية. محاولات لإنقاذ وظيفة الفساد محدودة بسبب خطر الإصابة بالاختلاس – مقابل – المضيف المرض ويمكن الاسترشاد برصد انجرافتمينت المسلسل. وأخيراً، هذا الأسلوب قد توفر أيضا أساسا مفيداً لمجالات البحث ملتزمة بتحسين العناية بالمرضى الذين يعانون من هيموجلوبينوباثيس، لا سيما تلك المتأثرة بالاختلاس الحادة – مقابل – المضيف المرض وأمراض المناعة الذاتية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل Südtirol ريجينبوجين كينديركريبشيلفي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
