Summary
Kwantificering van donor-afgeleide cellen is vereist voor het controleren van engraftment na stamceltransplantatie bij patiënten met Hemoglobinopathieën. Een combinatie van stroom cytometry gebaseerde cel sorteren, kolonie vorming assay, en na diverse analyses van korte tandem herhalingen kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de proliferatie en differentiatie van de progenitoren in het compartiment van de erythroid.
Abstract
De aanwezigheid van onvolledige chimerism is in een groot deel van de patiënten na beenmergtransplantatie voor thalassemie grote of sikkelcelziekte hebt genoteerd. Deze constatering heeft enorme implicaties, als latere therapeutische immunomodulatie strategieën klinische resultaten kunnen verbeteren. Conventioneel, wordt polymerase kettingreactie gebaseerde analyse van korte tandem herhalingen gebruikt voor het identificeren van chimerism in donor-afgeleide cellen van het bloed. Echter, deze methode is beperkt tot genucleëerde cellen en geen onderscheid maken tussen gedissocieerde eencellige geslachten. We toegepast van de analyse van korte tandem herhalingen te stromen van hematopoïetische voorlopercellen cytometrische-gesorteerd en vergeleken dit met de analyse van korte tandem herhalingen verkregen uit geselecteerde burst-vormende eenheid - erythroid kolonies, beide verzameld uit het bot beenmerg. Met deze methode zijn wij in staat om aan te tonen van de verschillende proliferatie en differentiatie van cellen van de donor in het compartiment van de erythroid. Deze techniek in aanmerking komt voor het voltooien van de huidige monitoring van chimerism in de stamcel transplantatie instellen en dus kan worden toegepast in de toekomst klinische studies, stamcelonderzoek en het ontwerp van gene therapie proeven.
Introduction
Allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) is de enige beschikbare curatieve aanpak voor een verscheidenheid van aangeboren erfelijke aandoeningen van het hematopoietische systeem, ziektevrije overleving tarieven van meer dan 90% bereiken, want anders zeer aangetast en beperkte levensduur patiënten1. De werkzaamheid van dit belangrijk therapeutisch instrument is geoptimaliseerd door het beperken van de toxiciteit van pre- en na transplantatie regimes2, maar ook door interventies gericht op het behoud van stabiele graft functie, die wordt gekwantificeerd door het nauwe toezicht op donor-afgeleide cellen3,4,5.
In het algemeen, impliceert volledige chimerism (CC) de totale vervanging van het compartiment van de lymphohematopoietic door donor-afgeleide cellen, overwegende dat de term gemengd chimerism (MC) wordt gebruikt als donor - en ontvanger-afgeleide cellen tegelijk aanwezig in verschillende zijn verhoudingen. Split chimerism (SC) duidt de coëxistentie van gemengde chimerism waargenomen in eencellige lineages, zoals in het compartiment van de erythroid. Snelle bepaling van de status van de chimerism na HSCT is van cruciaal belang, aangezien het kan helpen identificeren van patiënten vatbaar voor ziekte herval en starten van de daaropvolgende immunomodulerende strategieën, zoals donor lymfocyt infusies of vermindering van immunosuppressieve therapieën6.
Verschillende methoden zijn ontwikkeld voor het toezicht op engraftment na HSCT. Isotyping van immunoglobulinen en analyse van cytogenetica hebben slechte gevoeligheid en zijn beperkt in hun vermogen om het detecteren van polymorfisme7,8. De invoering van fluorescente in situ -hybridisatie (FISH) gevoeligheid in chimerism monitoring na HSCT kan verbeteren, maar is beperkt tot seks-mismatched allografts9. Op dit moment de Kettingreactie van de polymerase (PCR) is de meest voorkomende methode gebruikt voor het opsporen van chimerism en is gebaseerd op de Elektroforese van het gel van de conventionele agarose-acrylamide variabele nummer tandem herhalingen (VNTRs) of korte tandem herhaalt (STRs). Routinematig gebruikt is kwantitatieve PCR kundig voor speurder een zeer klein deel van de resterende donor cellen na HSCT. De belangrijkste beperking van de studies tot nu toe is dat MC detection is vrijwel uitsluitend beperkt tot de aanwezigheid van genucleëerde cellen, in plaats van rijpe erytrocyten, namelijk cellen dat functioneel cruciaal voor patiënten ondervinden Hemoglobinopathieën. Bij patiënten met verschillende bloedgroepen is het goed te beseffen dat cytofluorometric analyse vermag chimerism in rode bloedcellen te identificeren met behulp van monoklonale antilichamen gericht op de erytrocyt antigenen ABO en C, c, D, E en e10 , 11. een verschillende, maar zeer interessant middel voor de beoordeling van de chimerism in het geslacht erythroid is de combinatie van stroom cytometrische sorteert van erythroid voorlopercellen en selectie van verschillende types van erythroid voorlopercellen kweken in clonogenic tests, gevolgd door analyse van STR12. Deze aanpak is kunnen kwantificeren van de relatieve verhoudingen van donor-versus-ontvanger chimerism in het compartiment van de erythroid en kan worden gebruikt in de strategie om te ondersteunen de prothese beenmerg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. isolatie van hematopoietische beenmergcellen door Multi-parameter fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren
- monster kleuring
- vóór de aanvang van het proces, de volgende items moeten worden verzameld en bereid:
- verloop media voor de bereiding van mononucleaire cellen (GM), 50 mL conische buizen
- 12 x 75 mm flow buizen voor kleuring cellen
- Staining buffer: fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 3% foetaal kalfsserum (FCS)
- pipetten < / l Ik >
- FC blok en kleuring van antilichamen (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD Biosciences). Met deze combinatie van fluorescerende er is verwaarloosbaar spillover naar andere kanalen, maar elke andere geschikte fluorescerende combinatie is ook mogelijk.
- Compensatie kralen (indien nodig)
- Ophanging buffer: Hank ' s evenwichtig zout oplossing (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS
- Blauwe Trypan en hemocytometer
- Collectie buizen: elk rijk medium met hoge serum buizen (met 1 mL FCS + 25 mM HEPES) kan worden gebruikt voor het verzamelen van gesorteerde cellen.
- Het beenmerg monster: geïnformeerde toestemming voor het beenmerg biopsie uit de iliacale crest van de rug van de heup bot is meestal vereist. Het monster van het beenmerg is dan gehouden in EDTA spuiten op RT tot vlekken. De volgende stappen van het protocol worden uitgevoerd met inachtneming van de richtsnoeren van de instelling ' s menselijke ethiek onderzoekscommissie voor menselijk welzijn.
- Genereren een eencellige schorsing van het monster van het beenmerg. Voeg 3 mL GM tot de centrifugebuis. Zorgvuldig laag de 4 mL van de eencellige vering op de GM-oplossing. Centrifugeer bij 550 g gedurende 30 minuten bij 20 ° Celsius (C) (rem is uitgeschakeld). Tekenen van de bovenste laag met plasma en bloedplaatjes met behulp van een steriele precisiepipet, waardoor de mononucleaire cellaag ongestoord op de interface. De laag van mononucleaire cellen overbrengen in een steriele centrifugebuis met behulp van een precisiepipet steriele.
- Na het wassen met 5 mL buffer kleuring, resuspendeer de cellen in 2 mL schorsing buffer en bepaal de concentratie van de cel. Plaats 5 µL celsuspensie in een reageerbuis schroefdop. Voeg 95 µL van 0,2% Trypan blauwe vlek. Meng grondig. Laat staan gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Vul een hemocytometer voor het tellen van de cel. Onder een Microscoop, observeren als niet-levensvatbare zijn gekleurd en levensvatbare cellen tellen.
- Centrifugeren van de cellen bij 250 g gedurende 10 minuten bij 20 ° C, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in de kleuring van buffer bij een concentratie van maximaal 1 x 10-6 per 100 µL.
- Blok FcR door het gebruik van 2,5 µg Fc blok per 1 x 10 6 cellen op ijs gedurende 10-15 minuten
- Toevoegen de juiste combinatie van 10 µg mAb aan vlek 1 x 10 6 cellen en incubeer gedurende 20 min bij 4 ° C in het donker, gevolgd door een wassen stap met 3 mL buffer kleuring. Voor correcte vergoeding, zijn kleine porties van de cellen (of bij voorkeur compensatie kralen) gekleurd met één antilichamen elke; één aliquot resterende onbevlekt.
- Aanpassen van de concentratie tot 20 x 10 6 cellen/mL.
- Set up en optimaliseren van de cel sorteerder. Het proces van het opzetten van een stroom cytometer en software is gestandaardiseerd met een gedetailleerde instructies door het bedrijf en hoeft te worden uitgevoerd door naar behoren opgeleid personeel.
- vóór de aanvang van het proces, de volgende items moeten worden verzameld en bereid:
- Sorteren op de sorter cel
- bereiden collectie buizen uit stap 1.1.1.9.
- Een sjabloon instellen waarmee een bivariate complot omvat om weer vooruit scatter (FSC) en kant scatter (SSC).
- Uitvoeren van de cellen en het aanpassen van FSC/SSC om de bevolking van belang op schaal
- Opnemen van de negatieve controle buis.
- De buizen enkele positieve controle uitgevoerd; de gegevens voor elke buis opneemt.
- Berekenen vergoeding handmatig of automatisch met de functie verstrekt door de software van de acquisitie.
- Het experimentele monster verwerven en hen op een bivariate FSC/SSC dot perceel ( figuur 1A) zowel lymfatische en myeloïde cellen poort. Paren en aggregaten uitsluiten door het vergelijken van de verschillende signalen van FSC (d.w.z., hoogte, breedte en gebied) ( figuur 1B). Visualiseren van de singlet-cellen op een perceel van de bivariate dot CD45 en CD36 weer te geven ( Figuur 1 c). Gebeurtenissen positief voor CD45 zijn leukocyten (waaronder hun progenitorcellen), die voor CD45 negatieve en positieve voor CD36 zijn erythroid progenitoren. Gebruik gating tools om definiëren CD36 + (indien gewenst, deze cellen kunnen verder worden onderverdeeld in CD36 hoge en lage uiten cellen) en CD45 + cellen. Visualiseer CD45 + gebeurtenissen in een ander punt perceel CD34 en SSC parameters weer te geven. Gebruik hulpmiddelen om CD34 + cellen (leukocyte progenitoren) en SSC hoge cellen (myeloïde cellen in verschillende stadia van differentiatie) te definiëren gating.
- Zodra poorten hebben vastgesteld, de poorten kunnen worden geselecteerd voor sorteren in externe collectie buizen.
- Ga verder met het sorteren bij 4 ° C, totdat het vereiste aantal cellen is verkregen
- Uitvoeren van een analyse van de post sorteren om te bepalen van de zuiverheid van de gesorteerde cel populaties ( figuur 1E, 1F).
2. Clonogenic test
- bereiding van reagentia
voordat u begint het proces, de volgende items moeten worden verzameld en voorbereid:- pipetten, 100 mm platen
- Trypan blauw en hemocytometer
- reconstrueren menselijke recombinante erytropoëtine (EPO) bij 500 U/mL in steriel PBS met ten minste 0,1% menselijk serum albumine. Deze oplossing in kleine porties verdelen en houd bij-20 ° C om herhaalde bevriezen-ontdooien.
- Voorbereiden voltooien Iscove ' s gewijzigd Dulbecco ' s Medium (IMDM) met de eindconcentraties van 5% FCS, 2 mM Glutamine, 100 eenheden/mL penicilline/streptomycine (PS). Menselijke recombinante erytropoëtine (EPO) bij verschillende concentraties in aparte putten toevoegen aan het volledige IMDM medium: 3 eenheden EOB per putje, 6 eenheden EOB per putje en 12 EOB eenheden per putje (1 x, 2 x, 4 x EPO respectievelijk).
- Voorbereiding van beenmergcellen
- 10 mL van het monster van de beenmerg verdund met 20 mL PBS langzaam lagen zijn geplaatst op de top van 15 mL dichtheid kleurovergang medium in een conische buis van 50 mL, handhaven van duidelijke interface tussen de twee fasen en u nder steriele omstandigheden. Centrifugeer dan de conische buisjes van 15 mL bij 550 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) met versnelling ingesteld als 9 en vertraging instellen als 0 (of rem uitschakelen).
- Na het centrifugeren, verwijderen van de interface in een nieuwe tube van 50 mL en voeg PBS tot een eindvolume van 50 mL.
- Na het centrifugeren met 250 g gedurende 10 minuten bij 10 ° C Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in volledige IMDM medium bij ongeveer 0,5 x 10 6 cellen/mL. 10 µL van de celsuspensie rekening een microtube, meng met een gelijk volume Trypan blauwe oplossing (0,4%) en rekenen met behulp van een hemocytometer.
- Optional: CD34 + cellen zijn verrijkt door magnetische cel sorteren met het Milteny CD34 kralen volgens de instructies die zijn gegeven door de vervaardiging. Het belangrijkste voordeel van deze verrijking stap is om te ontdekken de kwaliteit van hematopoietische stamcellen, die zijn geteeld op een semi-solide matrix toegevoegd met 50 ng/mL stamcel factor (SCF), 20 ng/mL granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF), 20 ng/mL interleukine-3 (IL-3), 20 ng/mL Interleukine-6 (IL-6), 20 ng/mL granulocyt kolonie-stimulerende factor (G-CSF) en 3 verschillende concentraties van het EOB in 1.4.
- Verdun de cellen tot 0,1 - 0,15 x 10 6 mononucleaire cellen/mL of 2 x 10 3 CD34 + cellen/mL door toevoeging van volledige IMDM medium aangevuld met EPO en overdracht 300 µL tot 3 mL Methocult H4434 medium. Na agitatie en een korte broedtijd 5 min plaat drie keer 1,1 mL op een 35 mm-schotel. Twee van deze cultuur gerechten samen met een derde - gevuld met water - worden geplaatst in 100 mm platen.
- Cellen worden gekweekt in een incubator bevochtigde 37 ° C met 5% CO 2 voor 14 dagen.
- Analyse van kolonies
- kolonies worden volgens hun morfologie gescoord met een omgekeerde Microscoop op 40 X vergroting in een cultuur schotel gemarkeerd met een scorende raster. Voor de toepassing van onze assay, de kolonie vormende eenheden (kve) zijn ingedeeld in 4 categorieën: multipotential voorlopercellen (CFU-GEMM), granulocyt-macrofaag voorlopercellen (CFU-GM), burst zelftappende eenheid-erythroid (BFU-E) en kolonievormende eenheid-erythroid (CFU-E). Raadpleeg de fabrikant van ' s instructies voor verdere kolonie subclassification.
- Voor verdere analyse, cellen van de CFU assay plaat worden teruggevorderd afzonderlijk volgens de 4 categorieën door op te schorten bij kamertemperatuur 4 mL PBS met 2% FCS/IMDM. Na centrifugeren bij 400 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, de cellen zijn geresuspendeerde in PBS, geteld en verwerkt voor DNA-extractie.
3. Analyse van Chimerism
- DNA isolatie
- Pellet de cellen door centrifugeren op 400 g gedurende 10 minuten
- Isoleren DNA met een bloed DNA extractie kit (QIAmp DNA bloed extractie kit). Vooraf de elutie buffer (AE) warm bij 37 ° C te verbeteren van het rendement van DNA geëlueerd.
- Meet de DNA-concentratie met Nanodrop ND-1000 spectra fotometer. Monsters met OD 260/280 tussen 1.8-2.0 worden gebruikt voor verdere analyse.
- DNA verdunnen met DNAase gratis H 2 O 0.1 ng/µL in een totaal volume van 50 µL.
- STR-analyse
- de PCR reactie instellen door het mengen van reactie Mix, AmplTaq Gold Polymerase van DNA en Profiler Plus Primer Set met 20 µL genomic DNA (0.1 ng/µL) volgens de handleiding (de primer-kit bevat de labelloze inleidingen in de buffer te versterken de STR loci D3S1358, vWA FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, en D7S820 en de amelogenin van de marker geslacht). Omvatten nuclease-gratis water als negatieve controle en 9947A als positieve controle. Pre transplantatie DNA van donor en ontvanger zijn ook inbegrepen.
- Uitvoeren van PCR reactie Eppendorf mastercycler verloop met de volgende voorwaarden: 95 ° C gedurende 11 min, 28 amplificatie cycli van 95 ° C voor 1 min, 59 ° C voor 1 min en 72 ° C gedurende 1 min, gevolgd door 60° C gedurende 45 min.
- Set up fragment analyse reactie door toevoeging van 12 µL Hi-Di-Formamid en 0,5 µL GeneScan 500 ROX grootte standaard (alle toegepast Biosystems) 1 µL van het PCR-product. Op eerste en laatste positie nodig is een allèlique Ladder (Genotyper Amp Fl STR blauw, groen II en geel, toegepast Biosystems).
- Start elektroforese en acquisitie met het instrument van elektroforese.
- Analyseren Loci, allelen en piekhoogten van monsters en besturingselementen met de software 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Scheiding van lymphohematopoietic voorlopercellen door het sorteren van de cel FACS
Wij tonen hier resultaten dan het sorteren van de nodige cel populaties voor downstream STR analyse. Beenmergcellen werden gekleurd met V450-geconjugeerde anti-CD45, de FITC-geconjugeerd anti-CD36 en de APC-geconjugeerde anti-CD34. De bevolking van belang is de Megakaryocyt erythroid progenitoren (MEP), nucleated cellen die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van erytrocyten. Deze cellen CD36 uitdrukken, maar zijn negatief voor de leukocyten gemeenschappelijk antigeen CD45 (Figuur 1 c). Indien nodig, kunnen deze cellen worden verder gedifferentieerd gebaseerd op hun niveau van de expressie CD36. Diverse extra populaties kunnen worden gesorteerd om te dienen als besturingselementen. We CD45 + CD34 + lymfoïde/myeloïde precursoren als de een andere voorvader-celpopulatie en CD45 + cellen met hoge SSC signaal gesorteerd als volwassen myeloïde cellen (Figuur 1 d). Sorteren is uitgevoerd met een BD-FACSAria ik instrument. Na het sorteren, erythroid progenitor cel zuiverheid was > 85% (figuur 1E) en myeloïde cel zuiverheid was > 95% (figuur 1F).
Figuur 1 . Sorteren van Erythroid voorlopercellen en myeloïde voorlopercellen na FACS. Figuur 1A/1B wordt weergegeven op FSC-A vs. SSC-A, FSC-H vs. FSC-A en het gebruik van een gereedschap Veelhoek poort te selecteren van de bevolking van belang. 1 C geeft aan MEP op CD45 vs. CD36; 1 D weergegeven volwassen myeloïde cellen. Het percentage positieve cellen in 1E en 1F wordt weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Generatie burst-vormende eenheden - erythroid kolonies
Sommige cellen afgeleid van beenmerg en gescheiden door CD34-specifieke magnetische kralen lijken te vermenigvuldigen en te onderscheiden. Na een incubatieperiode van 14-daagse op de semi-solide medium kolonies worden gevormd. Stimulatie met verschillende concentraties van Europese Octrooiorganisatie sterk opgedreven is de vorming van de kolonies van de prominente rood (erythroid) (Figuur 2).
Figuur 2. Generatie van een Burst-vormende Unit-erythroid (BFU-E). Een representatieve spaarstand gekleurd van een kolonie BFU-E wordt getoond. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| MNC: | |||
| 1 X EOB | 2 X EOB | 4 X EOB | |
| CFU-E | 2 | 2 | 2 |
| BFU-E | 9 | 10 | 8 |
| CFU-GM | 30 | 30 | 29 |
| CFU-GEMM | 1 | 1 | 2 |
| CD34+ cellen: | |||
| 1 X EOB | 2 X EOB | 4 X EOB | |
| CFU-E | 1 | 1 | 0 |
| BFU-E | 5 | 11 | 6 |
| CFU-GM | 25 | 26 | 32 |
| CFU-GEMM | 0 | 2 | 3 |
Tabel 1. Analyse van de kolonies in niet-gesorteerde beenmergcellen en CD34 + selecteren cellen. Kolonies worden volgens hun morfologie gescoord met een omgekeerde Microscoop op 40 X vergroting in een cultuur schotel gemarkeerd met een scorende raster. Voor de toepassing van onze assay, de kolonies zijn ingedeeld in vier categorieën: kolonie-vormende eenheid-erythroid (CFU-E), burst-vormende eenheid-erythroid (BFU-E), granulocyt-macrofaag voorlopercellen (CFU-GM) en multipotential voorlopercellen (CFU-GEMM).
Analyse van chimerism
Chimerism analyse wordt uitgevoerd met behulp van het AmpFlSTR Profiler Plus Kit (Biosystems toegepast, Californië) volgens protocol van de fabrikant op ABI Prism 310 genetische Analyzer (Biosystems toegepast, Californië). Analyse is uitgevoerd met GeneMapper Software (Biosystems toegepast, Californië). Loci D21S11, D7S820, FGA en vWA werden gebruikt voor het berekenen van resultaten (percentage van ontvanger en donor-specifieke DNA).
| Monster | Ontvangende DNA | Donor DNA |
| CD45 | 25% | 75% |
| CD36hi | 25% | 75% |
| CD36lo | 55% | 45% |
| CD34 | 25% | 75% |
Tabel 2. Percentage ontvanger en Donor DNA in cellen verkregen fluorescentie-geactiveerde cel sorteren van beenmergcellen. Chimerism van donor cellen in specifieke cellulaire lineages van het compartiment van de lymphohematopoietic wordt gegeven.
| Monster | Ontvangende DNA | Donor DNA |
| BM-MNC | 24.71% | 75.29% |
| BM-CD34 |
Tabel 3. Percentage ontvanger en Donor DNA in cellen die zijn verkregen uit de bepaling van de Clonogenic. Chimerism van donor cellen in specifieke cellulaire lineages van het compartiment van de lymphohematopoietic wordt gegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van de huidige studie is bedoeld als het publiek een combinatie van twee benaderingen voor het analyseren van de chimerism van de donor/ontvanger in erythroid progenitoren HSCT na bij patiënten behandeld voor Hemoglobinopathieën: 1.) fluorescentie-geactiveerde cel sorteren van hematopoietische stamcellen in beenmerg monsters gevolgd door analyse van korte tandem herhalingen en 2.) kolonie-vormende eenheid groeit van beenmergcellen, indeling van de kolonies in verschillende types van voorlopercellen gevolgd door analyse van korte tandem herhalingen. De nieuwheid van deze benadering ligt in het combineren van de technieken in een protocol bij het evalueren van de donor/ontvanger chimerism in afzonderlijke kolonies.
Het bijzondere belang van deze aanpak kan worden gevonden in het kader van gemengde chimerism na HSCT voor patiënten behandeld voor Hemoglobinopathieën. Verschillende studies hebben aangetoond dat een aanzienlijk deel van de patiënten express een laag percentage van donor myeloïde cellen die correleert met dat voorloper van erythroid und resultaten in langdurige stal hematopoietische chimerism3, gemengde cellen 11; daarentegen in de dezelfde patiënten een hoog percentage rode bloedcellen donor afkomstige (2 - tot 5 keer hoger dan die van volwassen leukocyten) wordt opgemerkt en stelt dat het ineffectief Erytropoëse in een later stadium van de ontwikkeling van de erythroid plaatsvindt. Deze opmerkingen zijn toegeschreven aan de neiging tot versnelde apoptosis in de erytroblasten van de donor en de persistentie van T en B resterende lymfocyten verantwoordelijk voor het toestaan van een gemengde allograft14,15. In het kader van immunomodulatie na transplantatie van hematopoïetische stamcellen we onlangs aangetoond dat wijziging van immunosuppressieve therapie na hematopoietische transplantatie voor ß-thalassemie resulteert in een selectieve voordelen voor de genetisch-gecorrigeerde erythroid compartiment, geven een 2 - tot 2.5 keer versterking van de stengel residuele donor cellen12. Deze observatie ondersteunt het hulpprogramma voor het bepalen van donor-versus-residuele erythroid progenitorcellen, zoals het biedt inzicht in dit verschijnsel en ondersteunt toekomstige klinische studie van de therapie van het gen voor de behandeling van de hemoglobinopathieën. In feite zou het aandeel van genetische gemodificeerde genucleëerde cellen die nodig zijn om een therapeutische niveau van circulerende rode bloedcellen vergelijkbaar is met die waargenomen bij patiënten behandeld met stamceltransplantatie voor Hemoglobinopathieën.
Om te bepalen van het volledige beeld van donor Erytropoëse wij het protocol bewerkt en bieden een gedetailleerde, stapsgewijze experimentele aanpak. De kritieke stap in dit protocol is het proces van het opzetten van een stroom cytometer en software, die is gestandaardiseerd met gedetailleerde instructies en moet worden uitgevoerd door naar behoren opgeleid personeel. Presentatie van ons protocol in de gevisualiseerde indeling kunt het publiek gemakkelijk ons protocol volgen. We vergeleken onze resultaten van de PCR gebruikend genomic DNA van erythroid voorlopercellen verkregen kolonie-vormende eenheden in BM monsters versus DNA FACS-gesorteerd op erythroid beenmerg progenitoren verkregen. De donor engraftment gegevens uit de twee benaderingen stroken fundamenteel. Echter meestal minder variatie werd gevonden in monsters verkregen kolonie-vormende eenheden. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de verbeterde overleving van donor rode bloedcellen precursoren in de in-vitro-assay ten opzichte van de onbehandelde en gesorteerde donor tegenhangers. In dit licht kan dit protocol worden uitgebreid door het kunstmatig scheppen gemengde chimeer combinaties met bekende verhoudingen van gezonde progenitoren en progenitoren uit een scala van patiënten met verschillende Hemoglobinopathieën. De bepaling van de clonogenic en de beoordeling van chimerism moeten nauwkeurig brengen verhoudingen.
Hoewel een nauwkeurig inzicht in de mechanismen die betrokken zijn in deze bijzondere omgeving ontbreekt, is de methode die hier gepresenteerd van het allergrootste belang voor het verstrekken van relevante informatie voor de routinebewaking van engraftment en prognostische informatie in klinische praktijk. Pogingen om te redden van graft functie worden beperkt door het risico van het ontwikkelen van graft - versus - host-ziekte en kunnen worden geleid door de seriële engraftment controle. Ten slotte kan deze methode ook voorzien in een nuttige basis onderzoeksgebieden inzetten voor verbetering van de zorg van patiënten met Hemoglobinopathieën, met name die getroffen zijn door acute graft - versus host klauwzeer en auto-immuunziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
