Summary
Cuantificación de células procedentes de donantes es necesaria para supervisar el engraftment después del trasplante de células madre en pacientes con hemoglobinopatías. Una combinación de la clasificación de celda basados en citometría de flujo, análisis de formación de Colonia y posterior análisis de corto tándem repeticiones pueden utilizarse para evaluar la proliferación y diferenciación de progenitores en el compartimiento eritroide.
Abstract
La presencia de quimerismo incompleto se observa en una gran proporción de pacientes después de trasplante de médula ósea para la talasemia mayor o enfermedad de células falciformes. Esta observación tiene enormes consecuencias, como estrategias de inmunomodulación terapéutica posterior pueden mejorar el resultado clínico. Convencionalmente, análisis reacción-basado cadena de la polimerasa de repeticiones en tándem cortas se utiliza para identificar el quimerismo en las células sanguíneas derivadas de donantes. Sin embargo, este método está restringido a las células nucleadas y no puede distinguir entre linajes unicelular disociados. Aplicamos el análisis de repeticiones en tándem cortas de células progenitoras hematopoyéticas ordenados por citometría de flujo y esto comparado con el análisis de repeticiones en tándem cortas de ráfaga-formación seleccionada - colonias eritroides, ambos recogidos del hueso médula ósea. Con este método que son capaces de demostrar los diferentes proliferación y diferenciación de células del donante en el compartimiento eritroide. Esta técnica es elegible para completar el seguimiento actual de quimerismo en el trasplante de células madre que se ajuste y por lo tanto puede ser aplicados estudios clínicos en el futuro, la célula de vástago investigación y diseño de ensayos de terapia genética.
Introduction
Trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (HSCT) es el enfoque curativo sólo está disponible para una variedad de trastornos genéticos innatos del sistema hematopoyético, lograr tasas de supervivencia libre de enfermedad de más del 90% de lo contrario altamente comprometida y vida útil limitada de pacientes1. La eficacia de esta importante herramienta terapéutica ha sido optimizada por limitar la toxicidad de pre- y post-trasplante regímenes2, pero también por las intervenciones encaminadas a mantener la función estable del injerto, que se cuantifica por la vigilancia estrecha de células procedentes de donantes3,4,5.
En general, quimerismo completo (CC) implica la sustitución total del compartimiento del lymphohematopoietic por células derivadas del donante, mientras que el término mezclado chimerism (MC) se utiliza cuando las células derivadas del donante y del receptor están simultáneamente presentes en varios proporciones. Quimerismo dividido (SC) denota la coexistencia del chimerism mezclado observado en linajes unicelular, como en el compartimento eritroide. Determinación rápida del estado de quimerismo después de HSCT es crítica, como puede ayudar a identificar a los pacientes susceptibles de recaída de la enfermedad y estrategias de iniciar posteriores inmunomoduladores, como infusiones de linfocitos de donante o la reducción de inmunosupresores terapias6.
Varios métodos han sido desarrollados para supervisar el engraftment después de HSCT. Isotyping de las inmunoglobulinas y el análisis de citogenética tienen pobre sensibilidad y están limitados en su capacidad para detectar polimorfismo7,8. La introducción de fluorescente en situ del hibridación (pescado) puede mejorar la sensibilidad en el seguimiento de quimerismo después de HSCT, pero se limita a aloinjertos no coinciden el sexo9. Actualmente, la reacción en cadena de polimerasa (PCR) es el método más generalizado para detectar chimerism y está basada en electroforesis del gel de agarosa-acrilamida convencional de repeticiones en tándem número variable (VNTRs) o repeticiones de corto tándem (STRs). Rutinariamente utilizado PCR cuantitativa es capaz de detectar una proporción muy pequeña de células de donantes residual después de HSCT. La limitación principal de los estudios hasta ahora es que MC detección se limita casi exclusivamente a la presencia de células nucleadas, en lugar de eritrocitos maduros, es decir, las células funcionalmente crucial para los pacientes afectado por hemoglobinopatías. En pacientes con grupos sanguíneos diferentes, cabe recordar que el análisis de cytofluorometric es capaz de identificar el quimerismo de células de sangre rojas mediante la utilización de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia los antígenos de eritrocitos ABO y C, c, D, E y e10 , 11. un medio diferente, pero muy interesante de evaluación de quimerismo en el linaje eritroide es la combinación de flujo cytometric selección de progenitores eritroides y selección de diversos tipos de progenitoras eritroides por cultivo en análisis clonogenic, seguido por el análisis de STR12. Este enfoque es capaz de cuantificar las proporciones relativas de quimerismo de donante y receptor en el compartimiento eritroide y puede ser utilizado en la estrategia para sostener el injerto de médula ósea.
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Protocol
1. aislamiento de células hematopoyéticas de la médula ósea por clasificación de células activado por fluorescencia multiparámetro
- muestra tinción
- antes de iniciar el proceso, los siguientes elementos deben ser recogidos y preparados:
- medios de gradiente para la preparación de mononucleares células tubos (GM), cónico 50 mL
- tubos de flujo de 12 x 75 mm para la tinción de las células
- tampón de tinción: tampón de fosfato salino (PBS) + 3% de suero de ternero fetal (FCS)
- pipetas < / l i >
- FC bloque y tinción de anticuerpos (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD Biosciences). Con esta combinación de fluorocromo hay derrame insignificante en otros canales, pero cualquier otra combinación de fluorocromo adecuado también es posible.
- Cuentas de compensación (si es necesario)
- Tampón de suspensión: Hank ' s solución sal balanceada (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS
- Azul de tripán y hemocitómetro
- Tubos de colección: cualquier medio rico con tubos de alto del suero (que contiene 1 mL FCS + 25 mM HEPES) puede ser utilizado para la colección de células ordenadas.
- Médula ósea muestra: consentimiento informado para la biopsia de médula ósea de la cresta ilíaca de la parte posterior del hueso es normalmente necesario. La muestra de médula ósea es que mantuvo en jeringa heparinizada en RT hasta manchas. Los pasos del Protocolo se realizan cumpliendo con las directrices de la institución ' Comité de ética de investigación de s para el bienestar humano.
- Generar una suspensión unicelular de la muestra de médula ósea. Añadir 3 mL de GM para el tubo de centrífuga. Cuidadosamente la capa 4 mL de la suspensión de células individuales en la solución de GM. Centrifugar a 550 g por 30 min a 20 ° Celsius (C) (freno está desactivado). Drenaje de la capa superior que contiene el plasma y las plaquetas con una pipeta estéril, dejando la capa de células mononucleares sin perturbaciones en la interfase. Transferir la capa de células mononucleares a un tubo de centrífuga estéril utilizando una pipeta estéril.
- Después del lavado con 5 mL de tampón de tinción, resuspender las células en 2 mL de tampón de suspensión y determinar la concentración de la célula. Lugar 5 μl de la suspensión celular en un tubo de ensayo de tapón de rosca. Agregar 95 μl de tinción Trypan azul de 0.2%. Mezclar bien. Deje para reposar por 5 min a temperatura ambiente. Llenar un hemocitómetro para recuento celular. Bajo el microscopio, observar si no viables se tiñen y contar las células viables.
- Centrifugar las células a 250 g por 10 min a 20 ° C, desechar el sobrenadante y resuspender las células en tinción buffer a una concentración de 1 x 10 6 por 100 μl.
- Bloque de FcR por el uso de 2,5 μg bloque Fc por 1 x 10 6 células en hielo durante 10-15 minutos
- Agregar la combinación adecuada de 10 μg mAb mancha 1 x 10 6 células e incubar por 20 min a 4 ° C en la oscuridad, seguido por un paso de lavado con 3 mL de tampón de tinción. Correcta compensación, pequeñas alícuotas de células (o preferentemente cuentas de compensación) se tiñen con anticuerpos individuales cada uno; una alícuota restante sin mancha.
- Ajustar la concentración a 20 x 10 6 células/mL.
- Set arriba y optimiza el clasificador de células. El proceso de creación de un citómetro de flujo y software estandarizado con una instrucción detallada de la compañía y debe ser realizado por personal adecuadamente capacitado.
- antes de iniciar el proceso, los siguientes elementos deben ser recogidos y preparados:
- Clasificación en el clasificador de células
- preparar los tubos para recogida de paso 1.1.1.9.
- Configurar una plantilla que incluye un diagrama bivariante forward scatter (FSC) y de dispersión lateral (SSC).
- Funcionamiento de las células y ajustar FSC/SSC para la población de interés a escala
- Grabar el tubo de control negativo.
- Ejecutar los tubos solo control positivo; registro de datos para cada tubo.
- Calcular la compensación manual o automáticamente con la función proporcionada por el software de adquisición de.
- Adquirir la muestra experimental y puerta en bivariado FSC/SSC punto parcela ( figura 1A) para incluir células linfocíticas y mieloides. Excluir dobletes y agregados a comparando las diferentes señales del FSC (es decir, altura, anchura y área) ( figura 1B). Visualizar las células de la camiseta en una parcela de punto bivariado con CD45 y CD36 ( figura 1). Son positivas para CD45 leucocitos (incluyendo sus progenitores), ésos negativo para CD45 y progenitores eritroides son positivas para el CD36. Utilizar herramientas bloquea definir CD36 + (si se desea, estas células se pueden dividir más lejos en CD36 alta y baja expresando las células) y células CD45 +. Visualizar eventos de CD45 + en otra parcela de punto Mostrar parámetros de CD34 y SSC. Uso herramientas para definir las células CD34 + (progenitores del leucocito) y SSC alta (células mieloides en distintas etapas de diferenciación) que bloquean.
- Una vez se han determinado puertas, las puertas pueden seleccionarse para clasificar en externos tubos.
- Proceda con la clasificación a 4 ° C hasta obtener el número de células
- Realizar un análisis de la clase para determinar la pureza de las poblaciones de células ordenadas ( Figura 1E, 1F).
2. Análisis clonogenic
- preparación de los reactivos
antes de iniciar el proceso, los siguientes elementos deben ser recogidos y preparados:- pipetas, placas de 100 mm
- azul tripán y hemocitómetro
- reconstituir eritropoyetina humana recombinante (EPO) a 500 U/mL en PBS estéril que contiene menos de 0.1% de albúmina sérica humana. Esta solución se dividen en pequeñas partes alícuotas y mantener a-20 ° C para evitar la congelación y descongelación repetida.
- Prepare completa Iscove ' s Modified Dulbecco ' s medio (IMDM) con concentraciones finales de 5% FCS, 2 mM glutamina, 100 unidades/mL de penicilina/estreptomicina (PS). Añadir eritropoyetina humana recombinante (EPO) a diferentes concentraciones en pocillos distintos al medio IMDM completado: 3 unidades EPO/pozo, 6 unidades EPO/pozo y 12 EPO unidades/bien (1 x, x 2, 4 x EPO respectivamente).
- Preparación de células de médula ósea
- 10 mL de la muestra de médula ósea diluir con 20 mL de PBS lentamente capas en la parte superior medio gradiente de densidad de 15 mL en un tubo cónico de 50 mL, mantener la interfaz clara entre las dos fases y nder las condiciones de esterilidad. Luego centrifugar los tubos cónicos de 15 mL 550 x g durante 30 min a temperatura ambiente (RT) como 9 aceleración y desaceleración como 0 (o freno de).
- Después de la centrifugación, retirar la interfaz en un nuevo tubo de 50 mL y añadir PBS hasta un volumen final de 50 mL.
- Después de la centrifugación con 250 g por 10 min a 10 º C, retirar el sobrenadante y resuspender las células en el medio IMDM completo en aproximadamente 0,5 x 10 6 células/mL. Tomar 10 μl de la suspensión de células en un microtubo, mezclar con el mismo volumen de solución de azul de tripán (0.4%) y cuenta con un hemocitómetro.
- OFacultativo: las células de CD34 + se enriquecen con magnético celular clasificación con Milteny CD34 granos según las instrucciones dadas por el fabricante. La principal ventaja de esta etapa de enriquecimiento es detectar la calidad de las células madre hematopoyéticas, que se cultivan en una matriz semisólida con 50 factor ng/mL de células madre (SCF), 20 ng/mL del granulocyte-macrófago colonia-factor estimulante (GM-CSF), 20 ng/mL Interleucina-3 (IL-3), 20 ng/mL interleukin-6 (IL-6), factor estimulante de colonias 20 ng/mL del granulocyte (G-CSF) y 3 diferentes concentraciones de EPO en 1.4.
- Diluir las células de 0.1 - 0.15 x 10 6 células/mL mononucleares o 2 x 10 3 CD34 + células/mL mediante la adición de medio IMDM completo suplementado con EPO y la transferencia de 300 μl a 3 mL de medio Methocult H4434. Después de agitación y una incubación corto de 5 minutos la placa tres veces 1, 1 mL en un plato de 35 mm. Dos de estos platos de cultura junto a un tercero - con agua - se colocan en placas de 100 mm.
- Las células se cultivan en una incubadora humidificada 37 ° C con 5% CO 2 para 14 días.
- Análisis de colonias
- colonias se calificó según su morfología con un microscopio invertido con 40 aumentos en un plato de cultura marcado con una cuadrícula de puntuación. Para los efectos de nuestro análisis, las unidades formadoras de colonias (UFC) se clasifican en 4 categorías: células multipotential del progenitor (UFC-GEMM), las células progenitoras del granulocyte-macrófago (UFC-GM), estallan formando unidad-eritroides (BFU-E) y formadoras unidad-eritroides (CFU-E). Ver fabricante ' instrucciones para la subclasificación de Colonia más.
- Para su posterior análisis, las células de la placa de ensayo de UFC se recuperan por separado según las 4 categorías suspensión a temperatura de 4 mL PBS con un 2% FCS/IMDM. Después de la centrifugación a 400 g durante 10 min a 4 ° C, las células se resuspendió en PBS, contadas y procesadas para la extracción de ADN.
3. Análisis de quimerismo
- De ADN
- que
- sedimenten las células por centrifugación a 400 g durante 10 min.
- Aislar ADN utilizando un kit de extracción de ADN (QIAmp DNA sangre kit de extracción) de la sangre. Precalentar el buffer de elución (AE) a 37 ° C para mejorar el rendimiento de ADN eluída.
- Medir la concentración de ADN con Nanodrop ND-1000 espectro fotómetro. Se utilizan muestras con OD 260/280 entre 1.8-2.0 para su posterior análisis.
- ADN diluir con ADNasa libre H 2 O a 0.1 ng/μl de un volumen total de 50 μl.
- STR-análisis
- configurar la reacción de PCR mezclando la mezcla de reacción, AmplTaq Gold ADN polimerasa y Profiler Plus Primer Set con 20 μl de ADN genómico (0.1 ng/μL) según el manual (el primer kit contiene la sin etiqueta cartillas en tampón de amplificación de los loci STR D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 y D7S820 y el género marcador amelogenina). Incluyen agua libre de nucleasa como control negativo y 9947A como control positivo. ADN antes del trasplante de donante y receptor son también incluido.
- Reacción de realizar PCR utilizando gradiente de mastercycler Eppendorf con las siguientes condiciones: 95 ° C durante 11 minutos, 28 ciclos de amplificación de 95 ° C por 1 min, 59 ° C por 1 min y 72 ° C por 1 min, seguido de 60° C durante 45 min
- Set up fragmento reacción de análisis mediante la adición de 12 μl Hi-Di Formamid y 0,5 μl GeneScan 500 ROX tamaño estándar (todas Applied Biosystems) 1 μl del producto de PCR. A la primera y la última posición se necesita una escalera alélica (Genotyper Amp Fl STR azul, II verde y amarillo, Applied Biosystems).
- Comenzar la electroforesis y adquisición con el instrumento de electroforesis.
- Analizar los Loci, alelos y alturas del pico de las muestras y los controles con el software 13.
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Representative Results
Separación de progenitores lymphohematopoietic por clasificación de celular FACS
Aquí demostramos resultados de clasificación de las poblaciones celulares necesarios para posteriores análisis de STR. Células de médula ósea fueron manchadas con V450 conjugado anti-CD45 FITC conjugado anti-CD36 y conjugado con APC anti-CD34. La población de interés es de las megacariocitos progenitores (MEP), nucleadas las células eritroides responsables del desarrollo de los eritrocitos. Estas células expresan CD36, pero son negativas para el antígeno común del leucocito CD45 (figura 1). Si es necesario, estas células pueden ser más distinguidas en base a su nivel de expresión de CD36. Varias poblaciones adicionales pueden ordenarse para servir como controles. Nos ordenan CD45 + CD34 + precursores linfoide/mieloide como otra población de células progenitoras y células CD45 + con alta señal SSC como células mieloides maduras (figura 1). Clasificación fue realizada con un FACSAria BD instrumento. Después de clasificar, pureza de células eritroides progenitoras fue > 85% (Figura 1E) y pureza de células mieloides > 95% (Figura 1F).
Figura 1 . Clasificación de las células eritroides progenitoras y células progenitoras mieloides después FACS. Figura 1A/1B muestra en FSC-A VS SSC-A, FSC-H vs FSC-A y el uso de una herramienta de polígono puerta para seleccionar la población de interés. C 1 indica MEP en CD45 vs CD36; 1 D muestra las células mieloides maduras. Se muestra el porcentaje de células positivas en 1E y 1F . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Generación de explosión formando unidades - colonias eritroides
Algunas células de médula ósea y separados por granos magnéticos CD34 específicos parecen proliferar y diferenciarse. Después de un período de incubación de 14 días en las colonias medio semisólidos se forman. Estimulación con diferentes concentraciones de EPO había aumentada grandemente la formación de colonias rojo prominente (eritroide) (figura 2).
Figura 2. Generación de una explosión formando unidad-eritroides (BFU-E). Se muestra es una microfotografía de bajo consumo representativa de una colonia de BFU-E. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| MNC: | |||
| 1 X EPO | 2 X EPO | 4 X EPO | |
| UFC-E | 2 | 2 | 2 |
| BFU-E | 9 | 10 | 8 |
| CFU-GM | 30 | 30 | 29 |
| UFC-GEMM | 1 | 1 | 2 |
| CD34+ las células: | |||
| 1 X EPO | 2 X EPO | 4 X EPO | |
| UFC-E | 1 | 1 | 0 |
| BFU-E | 5 | 11 | 6 |
| CFU-GM | 25 | 26 | 32 |
| UFC-GEMM | 0 | 2 | 3 |
Tabla 1. Análisis de colonias de células de médula ósea sin clasificar y CD34 + celdas seleccionan. Las colonias son evaluadas según su morfología con un microscopio invertido con 40 aumentos en un plato de cultura marcado con una cuadrícula de puntuación. Para los efectos de nuestro análisis, las colonias se clasifican en cuatro categorías: forman colonias unidad-eritroides (CFU-E), formando ráfagas unidad-eritroides (BFU-E), las células progenitoras del granulocyte-macrófago (UFC-GM) y las células multipotential del progenitor (UFC-GEMM).
Análisis de quimerismo
Análisis de quimerismo se realizan utilizando el amplificadorFlSTR Profiler Plus Kit (Applied Biosystems, California) según protocolo del fabricante en ABI Prism 310 genética analizador (Applied Biosystems, California). Análisis se realizan con el GeneMapper Software (Applied Biosystems, California). Loci D21S11, D7S820, FGA y SVA se utilizaron para calcular los resultados (porcentaje de receptor donante específicos y DNA).
| Muestra | DNA receptor | Donante de ADN |
| CD45 | 25% | 75% |
| CD36hi | 25% | 75% |
| CD36lo | 55% | 45% |
| CD34 | 25% | 75% |
Tabla 2. Por ciento receptor y donante de ADN en las células obtenidas de la clasificación de células activado por fluorescencia de células de médula ósea. Se da el quimerismo de células donantes en linajes celulares específicos del compartimento lymphohematopoietic.
| Muestra | DNA receptor | Donante de ADN |
| BM-MNC | 24.71% | 75.29% |
| BM-CD34 |
Tabla 3. Por ciento receptor y donante de ADN en las células obtenidas de los análisis Clonogenic. Se da el quimerismo de células donantes en linajes celulares específicos del compartimento lymphohematopoietic.
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Discussion
El objetivo del actual estudio es proporcionar al público una combinación de dos enfoques para el análisis de quimerismo donante/receptor en progenitores eritroides después de HSCT en pacientes trataron por Hemoglobinopatías: 1.) clasificación celular activado por fluorescencia de células progenitoras hematopoyéticas en muestras de médula ósea seguidas de análisis de repeticiones en tándem cortas y 2.) Unidad Formadora de colonias de crecimiento de las células de la médula ósea, clasificación de las colonias en varios tipos de progenitor seguido por análisis de repeticiones en tándem cortas. La novedad de este enfoque reside en combinar las técnicas en un protocolo para evaluar chimerism donante/receptor en colonias individuales.
La especial importancia de este enfoque puede encontrarse en el contexto del chimerism mezclado después de HSCT para los pacientes tratados por hemoglobinopatías. Varios estudios han demostrado que una proporción significativa de pacientes expresan un bajo porcentaje de células mieloides de donantes que se correlaciona con que de eritroides precursoras células und resultados de larga duración estable mezclada quimerismo hematopoyético3, 11; en cambio, en los mismos pacientes un alto porcentaje de glóbulos rojos derivados de donantes (2 a 5 veces mayor que el de leucocitos maduros) destaca y sugieren que la eritropoyesis ineficaz lleva a cabo en una etapa posterior de desarrollo eritroide. Estas observaciones se han atribuido a la propensión a la apoptosis acelerada en eritroblastos de donantes y la persistencia de los linfocitos T y B residual responsables por permitir que un allograft mixto14,15. En el contexto de inmunomodulación después de trasplante de células madre hematopoyéticas hemos demostrado recientemente que la modificación de la terapia inmunosupresiva después del trasplante hematopoyético para resultados de ß-talasemia en una ventaja selectiva para la compartimiento eritroide genéticamente corregidas, dando una amplificación de 2 a 2.5 veces de la madre del donante residual células12. Esta observación apoya la utilidad de la determinación de progenitores eritroides donante versus residual, ya que proporciona una comprensión de este fenómeno y apoya los ensayos clínicos futuros estudiando la terapia génica para el tratamiento de las hemoglobinopatías. De hecho, la proporción de células nucleadas gen modificado para alcanzar un nivel terapéutico de circular células de sangre rojas puede ser similar a la observada en pacientes tratados con trasplante de células madre para hemoglobinopatías.
Para determinar el cuadro completo de la eritropoyesis de donantes modificado el protocolo y proporcionar un enfoque experimental detallado, paso a paso. El paso crítico en este protocolo es el proceso de creación de un citómetro de flujo y software, que está estandarizado con instrucciones detalladas y debe ser realizado por personal adecuadamente capacitado. Presentación de nuestro protocolo en el formato visualizado permite al público seguir nuestro protocolo fácilmente. Comparamos nuestros resultados PCR usando la DNA genomic de progenitores eritroides obtenidos forman colonias unidades en muestras BM versus ADN obtienen de progenitores de médula ósea eritroide FACS y ordenada. Los datos de injerto donante de los dos enfoques son básicamente constantes. Sin embargo, generalmente se encontró menos variación en muestras obtenidas de la formación de colonias unidades. Esto es probablemente debido a la mejoría en la supervivencia de los precursores de glóbulos rojos de donantes en el ensayo in vitro en comparación con las contrapartes de donantes no tratadas y ordenadas. En este sentido, este protocolo se puede ampliar creando artificialmente las combinaciones quiméricas con proporciones conocidas de progenitores sanos y progenitores de una serie de pacientes con hemoglobinopatías diferentes. El análisis clonogenic y la evaluación del quimerismo deben reflejar exactamente en poner proporciones.
Aunque se carece de un entendimiento preciso de los mecanismos implicados en este escenario particular, el método presentado aquí es de vital importancia para proporcionar información relevante para el monitoreo rutinario de engraftment e información pronóstica en práctica clínica. Intento de rescatar la función del injerto está limitado por el riesgo de desarrollo de injerto - versus - host disease y puede guiarse mediante el control de serial engraftment. Finalmente, este método también podría proporcionar una base útil para las áreas de investigación comprometidas con la mejora de la atención de pacientes con hemoglobinopatías, particularmente aquellos afectados por la aguda injerto - versus - host disease y enfermedad autoinmune.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Kinderkrebshilfe arco iris Südtirol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
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