Summary
Miktar donör türetilmiş hücre engraftment kök hücre transplantasyonu hastalarında Hemoglobinopati sonra izlemek için gereklidir. Akış Sitometresi tabanlı cep sıralama, koloni oluşumu tahlil ve ataları erythroid yerde farklılaşma ve sonraki analizi kısa tandem tekrarlar yayılması değerlendirmek için kullanılabilir bir arada.
Abstract
Eksik chimerism varlığı kemik iliği nakli için büyük talasemi veya orak hücre hastalığı hastaların büyük bir kısmı belirtilmektedir. Sonraki terapötik immunomodulation stratejileri-ebilmek geliştirmek klinik sonuç olarak bu gözlem çok büyük etkileri vardır. Geleneksel, Polimeraz zincir reaksiyonu tabanlı analizini kısa tandem tekrarlar donör kaynaklı kan hücrelerinde chimerism tanımlamak için kullanılır. Ancak, bu yöntem çekirdekli hücrelere sınırlıdır ve Disosiye tek hücreli soy arasında ayrım yapamaz. Biz kısa tandem tekrarlar akış sitometrik sıralanmış hematopoetik progenitör hücre analizi uygulanmış ve bu seçili veri bloğu oluşturan biriminden - erythroid koloniler, elde edilen kısa tandem tekrarlar hem kemik toplanan analizi ile karşılaştırıldığında kemik iliği. Bu yöntem ile farklı yayılması ve donör hücreleri erythroid yerde farklılaşma göstermek edebiliyoruz. Bu teknik chimerism ayarlama kök hücre nakli yapılan geçerli izleme tamamlamak uygundur ve böylece uygulanan gelecekte klinik çalışmalar, kök hücre araştırma ve tasarım gen terapisi denemelerin olabilir.
Introduction
Allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu (HKHT) olduğunu aksi takdirde son derece tehlikeye için hastalıksız sağkalım oranları daha--dan %90 ulaşmak, hematopoetik sistem doğuştan genetik bozukluklar çeşitli için yalnızca kullanılabilir şifalı yaklaşım ve hayat-sınırlı hastalar1. Bu önemli tedavi aracı etkinliği öncesi toksisite sınırlayarak optimize edilmiştir- ve sonrası rejimleri2nakli, ama aynı zamanda kararlı greft işlevi sürdürülmesi hedef alan müdahaleler tarafından hangi sayısal yakın izleme tarafından donör kaynaklı hücreler3,4,5.
Zaman donör ve alıcı türetilmiş hücre çeşitli bir de aynı anda mevcut chimerism (MC) karışık terimi kullanılır, ancak genel olarak, tam chimerism (CC) lymphohematopoietic bölme donör kaynaklı hücreler tarafından toplam yedek anlamına gelir Oranlar. Split chimerism (SC) karışık chimerism erythroid bölümünde gibi tek hücreli soy gözlenen birlikteliği ifade eder. Hastaların hastalık nüks ve donör lenfosit infüzyon veya immünsüpresif azaltılması gibi başlatmak sonraki immunomodulatory stratejileri için duyarlı belirlemek yardımcı gibi chimerism durum HKHT aşağıdaki komut istemi belirlenmesi önemlidir terapiler6.
Engraftment HKHT sonra izlemek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Isotyping immünglobulin ve sitogenetik analiz zavallı hassasiyet var ve çok biçimlilik7,8algılamak için onların yetenek sınırlıdır. Floresan situ hibridizasyon (balık) giriş hassasiyeti chimerism HKHT sonra izleme geliştirebilirsiniz ama seks uyumsuz allogrefler9' a sınırlı. Şu anda, Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) chimerism algılamak için kullanılan en yaygın yöntemdir ve değişken sayı tandem yineler (VNTRs) geleneksel özel-Akrilamid Jel Elektroforez üzerinde dayanır veya kısa tandem (STRs) tekrarlar. Rutin olarak kullanılan kantitatif PCR HKHT takip kalan donör hücreleri son derece küçük bir oranda tespit edebilmektedir. Önemli çalışmalar defa kısıtlamasıdır MC algılama olgun eritrositler yerine çekirdekli hücrelerin varlığı neredeyse sadece sınırlı, yani işlevsel olarak hastalar için önemli Hemoglobinopati tarafından etkilenir hücreleri. Farklı kan grupları bulunan hastalarda, cytofluorometric analiz chimerism kırmızı kan hücrelerinde monoklonal antikorlar eritrosit antijenleri doğru ABO ve C, c, D, E ve e10 yönetmen kullanarak tespit edebilmek olduğunu hatırlamaya değer olduğunu , 11. chimerism erythroid Silsilesi içinde değerlendirilmesi farklı, ama çok ilginç bir araç akış sitometrik erythroid ataları ve erythroid yaratıcı çeşitli yelpazesi klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar deneyleri kültür tarafından boylama kombinasyonudur STR12analizi ile izledi. Bu yaklaşım donör ve alıcı chimerism erythroid yerde göreli oranları ölçmek yapabiliyor ve kemik iliği nakli sürdürebilmek için strateji kullanılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. yalıtım, hematopoetik kemik iliği hücreleri çok parametreli Floresans aktif hücre sıralama tarafından
- işlemi başlamadan önce
- örnek boyama, aşağıdaki öğeler gerekir tahsil edilecek ve hazır:
- (GM), 50 mL konik tüpler degrade medya mononükleer hazırlanması için hücreleri
- boyama için 12 x 75 mm akış tüpler hücreleri
- Staining arabellek: fosfat tamponlu tuz (PBS) + % 3 fetal buzağı serum (FCS)
- Pipetler < / l Ben >
- FC blok ve antikor (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD Biosciences) boyama. Bu fluorochrome birlikte diğer kanallar içine ihmal edilebilir yayılma yoktur ancak diğer uygun fluorochrome kombinasyon mümkündür.
- Tazminat boncuk (gerekirse)
- Süspansiyon arabellek: Hank ' s dengeli tuz çözüm (HBSS) + 25 mM HEPES + % 3 FCS
- Trypan mavi ve hemasitometre
- Koleksiyonu tüpler: zengin herhangi bir ortamda yüksek serum tüpler (içeren 1 mL FCS + 25 mM HEPES)-ebilmek var olmak kullanılmış için sıralanmış hücreler topluluğu.
- Kemik iliği örnek: kalça kemiği arkasında iliyak kret gelen kemik iliği biyopsisi için onay genellikle gereklidir. Kemik iliği heparinized şırınga RT, boyama kadar muhafaza daha örneğidir. Protokolü aşağıdakileri kurum kurallarına uygun olarak gerçekleştirilen ' s insan araştırma Etik Komitesi insan refahı için.
- Bir tek hücre süspansiyon kemik iliği örneği oluşturur. GM 3 mL santrifüj tüpü ekleyin. Dikkatle tek hücre süspansiyon GM çözüm üzerine 4 mL katman. 20 ° c (C), 30 dk için 550 g, santrifüj (fren devre dışı). Plazma ve mononükleer hücre katmanı arayüzü bozulmamış terk steril bir pipet kullanarak trombosit içeren üst tabakasının çizin. Mononükleer hücre tabakası steril bir pipet kullanarak bir steril santrifüj tüpü transfer.
- 5 mL ile tampon boyama yıkama sonra 2 mL süspansiyon arabellek hücrelerde resuspend ve hücre konsantrasyonu belirlemek. Hücre süspansiyon bir vidalı kapak test tüpü içinde yer 5 µL. 95 µL % 0,2 Trypan mavi leke ekleyin. İyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 min için durmak için izin verir. Hücre sayımı gelince bir hemasitometre doldurun. Mikroskop altında gözlemlemek Eğer uygun olmayan lekeli ve canlı hücreleri saymak.
- 250 g 20 ° C'de 10 dakika için hücreleri santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve tampon 1 x 10 100 µL 6 bir konsantrasyon, boyama hücreler resuspend.
- Blok FcR 2,5 µg Fc blok başına 1 x 10 6 hücreler buz 10-15 dakika süreyle kullanılması
- Ekle 10 µg mAb uygun kombinasyonu 1 x 10 6 hücre leke ve karanlıkta, 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya takip yıkama adım 3 mL ile tampon boyama. Doğru tazminat için hücrelerin (veya tercihen tazminat boncuklar) küçük aliquots her biri tek antikorlar ile lekeli; günahı kalan bir aliquot.
- 20 x 10 6 hücre/ml konsantrasyonu ayarlayın.
- Set up ve hücre sıralayıcısı optimize. Bir Akış Sitometresi ve yazılım kurma işlemi şirket tarafından sağlanan ayrıntılı bir talimat ile standart ve uygun eğitimli personel tarafından gerçekleştirilmesi gerekiyor.
- örnek boyama, aşağıdaki öğeler gerekir tahsil edilecek ve hazır:
- Sıralama hücre sıralayıcısı on
- Adım 1.1.1.9 koleksiyonu tüpleri hazırlayın.
- İleri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) görüntülemek için bivariate bir komplo içeren bir şablon ayarlama.
- Hücreleri çalıştırın ve faiz ölçekte nüfusu yerleştirmek için FSC/SSC ayarlamak
- Negatif kontrol tüp kaydetmek.
- Tek pozitif kontrol tüpleri çalıştırın; her tüp için verileri kaydetmek.
- Tazminat alma yazılım tarafından sağlanan fonksiyonu ile el ile veya otomatik olarak hesaplamak.
- Deneysel örnek alacak ve onları lenfositik ve myeloid hücreleri içerecek şekilde bir bivariate FSC/SSC nokta arsa üzerinde ( şekil 1A) kapı. FSC (Yani, yükseklik, genişlik ve alanı) farklı sinyaller karşılaştırarak birini ve toplamları dahil değildir ( şekil 1B). Singlet hücreleri CD45 ve CD36 görüntüleme bivariate nokta arsa üzerinde görselleştirmek ( şekil 1 c). CD45 için olumlu olaylar leucocytes (kendi ataları dahil), bu CD45 için negatif ve erythroid ataları CD36 için olumludur. CD36 + (istenirse, bu hücreler daha da CD36 yüksek ayrılabilir ve düşük ifade hücreleri) tanımlamak için gating araçları ve CD45 + hücreler kullanın. CD45 + başka bir nokta arsa CD34 ve SSC parametrelerini görüntüleme olaylarda görselleştirin. CD34 + hücre (lökosit ataları) ve SSC yüksek hücre (farklılaşma çeşitli aşamalarında myeloid hücrelerin) tanımlamak için Araçlar perdeleme kullanın.
- Kapıları belirledikten sonra kapıları dış koleksiyonu tüpler içine sıralama için seçilebilir.
- Hücreler gerekli sayıda elde kadar 4 ° C de sıralama ile devam et
- ( şekil 1E, 1F) sıralanmış hücre popülasyonlarının saflığı belirlemek için bir sonrası sıralama analizi gerçekleştirmek.
2. Klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar tahlil
- reaktifler hazırlanması
işlemine başlamadan önce aşağıdaki öğeleri toplanan hazırlanan ve olmak zorunda:- Pipetler, 100 mm plakalar
- Trypan mavi ve hemasitometre
- yeniden oluşturma insan rekombinant Eritropoietin (EPO) 500 U/mL steril PBS en az %0,1 içeren, insan serum albümin. Bu çözüm küçük aliquots bölmek ve tekrarlanan donma-çözülme önlemek için-20 ° C'de devam.
- Hazırlama tamamlamak Iscove ' modifiye Dulbecco s ' s orta (IMDM) son %5 FCS, 2 mM Glutamine, 100 adet/mL penisilin/streptomisin (PS) konsantrasyonları ile. Tam IMDM Orta olarak ayrı Wells farklı konsantrasyonlarda insan rekombinant Eritropoietin (EPO) ekleme: 3 adet EPO/iyi, 6 adet EPO/iyi ve 12 EPO birimleri/iyi (1 x, 2 x, 4 x EPO sırasıyla).
- Hazırlık kemik iliği hücrelerinin
- 20 mL PBS ile seyreltilmiş kemik iliği örneği 10 mL yavaş yavaş 15 mL yoğunluk gradient orta iki aşamadan ile sizin aranızdaki açık arayüz bakımı bir 50 mL konik tüp üzerine katmanlı nder steril koşullar. O zaman 9 olarak ayarla hızlanma ve yavaşlama 0 (veya fren KAPALÕ) ile 550 x g (RT) oda sıcaklığında 30 dk de 15 mL konik tüpler santrifüj kapasitesi.
- Santrifüjü sonra yeni bir 50 mL tüp içine arayüzü kaldırın ve PBS 50 mL nihai bir birime ekleyin.
- İle 250 g 10 ° C'de 10 dakika aralıklarla sonra süpernatant kaldırmak ve tam IMDM orta yaklaşık 0.5 x 10 6 hücre/mL, hücrelerde resuspend. Hücre süspansiyon 10 µL bir microtube almak, mix Trypan mavi çözüm (% 0,4) aynı birimle ve bir hemasitometre kullanarak saymak.
- Optional: manyetik hücre üretimi tarafından verilen talimatlara göre Milteny CD34 boncuk ile sıralama tarafından zenginleştirilmiş CD34 + hücre. En büyük avantajı bu zenginleştirme adım 50 ng/mL kök hücre faktörü ile (SCF), 20 ng/mL granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF), 20 ng/mL eklendi yarı katı matris üzerinde yetiştirilen hematopoetik kök hücre kalitesini tespit etmektir İnterlökin-3 (IL-3), 20 ng/mL İnterlökin-6 (Il-6), 20 ng/mL granülosit koloni uyarıcı faktör (G-CSF) ve EPO 3 farklı konsantrasyonda olduğu gibi 1.4.
- 0.1 - hücrelere seyreltik 0,15 + x 10 6 mononükleer hücre/mL veya 2 x 10 3 CD34 tam IMDM orta ekleyerek hücre/mL Methocult H4434 orta EPO ve transfer 300 µL 3 ml ile desteklenmiştir. Sonra 1,1 ajitasyon ve kısa kuluçka için 5 dk plaka üç kez mL 35 mm çanak üzerinde. İki kültür tabakları ile birlikte su - üçüncü - 100 mm levha yerleştirilir.
- Hücreleri kültürlü bir oksijen 37 ° C kuluçka %5 CO 2 için 14 gün.
- Analiz kolonileri
- koloniler, 40 X büyütme puanlama bir kılavuz ile işaretlenmiş bir kültür tabağına ters bir mikroskop ile onların morfolojisi göre attı. Bizim tahlil amacı gereği, koloni oluşturan birimler (CFU) 4 kategoride sınıflandırılır: multipotential progenitör hücre (CFU-et), granülosit-makrofaj progenitör hücre (CFU-GM), veri bloğu oluşturan birim-erythroid (BFU-E) ve oluşturan colony birim-erythroid (CFU-E). Üretici görmek ' s yönergeler için daha fazla koloni subclassification.
- Daha fazla çözümleme için CFU tahlil plaka hücrelerden ayrı ayrı 4 kategorilerine göre 4 mL oda sıcaklığında %2 içeren PBS askıya tarafından kurtarıldı FCS/IMDM. 4 ° C'de 10 dakika için 400 g de aralıklarla sonra hücreleri PBS içinde resuspended, sayılır ve DNA ekstraksiyon için işlenen.
3. Analizi Chimerism
- DNA izolasyon
- hücreleri tarafından Santrifüjü 400 g 10 dakika süreyle de cips
- Bir kan DNA ekstraksiyon Kiti (QIAmp DNA kan ekstraksiyon kiti) kullanarak DNA izole. Elüsyon arabellek (AE) 37 ° C de eluted DNA verimini artırmak için önceden ısıtmak.
- DNA toplama Nanodrop ND-1000 spectra Fotometre ile ölçmek. Örnekleri OD 260/280 ile 1.8-2.0 arasında daha fazla çözümleme için kullanılır.
- Seyreltik DNA'sı DNAase ücretsiz H 2 O için toplam hacmi 50 µL 0.1 ng/µL.
- STR-analiz
- tepki karışımı, AmplTaq altın DNA polimeraz ve Profiler artı astar ayarla 20 µL genomik DNA ile karıştırılarak PCR reaksiyonu ayarla (0.1 ng/µL) kılavuzuna göre (astar kiti içerir etiketlenmemiş astar STR loci D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 ve D7S820 ve cinsiyet marker amolgenin yükseltmek için arabelleği). Nükleaz ücretsiz su olarak negatif kontrol ve 9947A pozitif kontrol olarak içerir. Öncesi nakli DNA donör ve alıcı da dahil.
- Eppendorf mastercycler gradyan ile aşağıdaki koşullar kullanarak gerçekleştirmek PCR reaksiyon: 11 dk için 95 ° C 28 amplifikasyon döngüleri 95 ° c için 1 dakika, 59 ° C için 1 dakika ve 72 ° C için 1 dakika, 45 dk. 60° C tarafından takip
- Kümesi parçası kadar analiz tepki 12 µL ekleyerek Hi-Di Formamid ve 0.5 µL GeneScan 500 ROX boyutu standart (tüm uygulamalı Biyosistem) 1 µL PCR ürünü için. İlk ve son pozisyon Allelic bir merdiven (Genotyper Amp Fl STR mavi, yeşil II ve sarı, uygulamalı Biyosistem) gereklidir.
- Başlangıç Elektroforez ve edinme Elektroforez aletle.
- Analiz Loci, gen ve tepe yükseklikleri örnekleri ve yazılım 13 denetimleriyle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücre FACS sıralama tarafından lymphohematopoietic ataları ayrılması
Burada aşağı akım STR analiz için gerekli hücre popülasyonlarının sıralama sonuçlar gösterilmektedir. Kemik iliği hücreleri V450 Birleşik anti-CD45 FITC Birleşik anti-CD36 ve APC Birleşik anti-CD34 ile lekeli. Faiz nüfusu megakaryocyte erythroid parçalanmayabilir ataları (MEP), hücreleri eritrositler gelişimi için sorumlu olduğunu. Bu hücreler CD36 hızlı, ama lökosit ortak antijen CD45 için negatif vardır (şekil 1 c). Gerekirse, bu hücreler daha fazla dayalı onların CD36 ifade düzeyde farklı. Birkaç ek nüfus denetimleri hizmet etmek için sıralayabilirsiniz. CD45 + CD34 + yüksek SSC sinyal ile başka bir progenitör hücre nüfus ve CD45 + hücreler olarak lenfoid/Miyeloid öncüleri olgun myeloid hücrelerin (şekil 1 d) sıralanır. Sıralama ben enstrüman bir BD FACSAria ile gerçekleştirildi. Sonra sıralama, erythroid progenitör hücre saflık olduğunu > %85 (şekil 1E) ve myeloid hücre saflık olduğunu > %95 (şekil 1F).
Resim 1 . Erythroid Progenitor hücreler ve Myeloid progenitör hücre FACS sonra boylama. Şekil 1A/1B ilgi nüfusu seçmek için FSC-A SSC-A, FSC-H FSC-A ve bir çokgen kapısı araç kullanımını görüntüler. 1 C MEP CD45 vs CD36 üzerinde gösterir; 1 D olgun myeloid hücrelerin görüntüler. 1E ve 1F pozitif hücrelerinin yüzdesi gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Üretimi patlama kurma birimleri - erythroid kolonileri
Bazı hücreler kemik iliği türetilen ve CD34 özel manyetik boncuklar tarafından ayrılmış çoğalırlar ve ayırt etmek için görünür. Yarı katı orta kolonilere 14 günlük Kuluçka döneminden sonra oluşur. Stimülasyon EPO çeşitli konsantrasyonları ile büyük ölçüde belirgin kırmızı (erythroid) koloniler (Şekil 2) oluşumu artar.
Şekil 2. Bir veri bloğu oluşturan birim-erythroid (BFU-E) nesil. BFU-E koloninin temsilcisi bir düşük güç photomicrograph gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| MNC: | |||
| 1 X EPO | 2 X EPO | 4 X EPO | |
| CFU-E | 2 | 2 | 2 |
| BFU-E | 9 | 10 | 8 |
| CFU-GM | 30 | 30 | 29 |
| CFU-ET | 1 | 1 | 2 |
| CD34+ hücreleri: | |||
| 1 X EPO | 2 X EPO | 4 X EPO | |
| CFU-E | 1 | 1 | 0 |
| BFU-E | 5 | 11 | 6 |
| CFU-GM | 25 | 26 | 32 |
| CFU-ET | 0 | 2 | 3 |
Tablo 1. Analiz kolonileri sıralanmamış kemik iliği hücrelerinde ve CD34 + hücre seçili. Koloniler, 40 X büyütme puanlama bir kılavuz ile işaretlenmiş bir kültür tabağına ters bir mikroskop ile onların morfolojisi göre attı. Bizim tahlil amacı gereği, kolonilerin dört kategoride sınıflandırılır: koloni oluşturan birim-veri bloğu oluşturan erythroid (CFU-E), birim-erythroid (BFU-E), granülosit-makrofaj progenitör hücre (CFU-GM) ve multipotential progenitör hücreler (CFU-et).
Chimerism analizi
Chimerism analiz AmpFlSTR Profiler artı seti (Uygulamalı Biyosistem, California) üreticinin protokolüne göre ABI prizma 310 genetik analiz üzerinde (Uygulamalı Biyosistem, California) kullanılarak gerçekleştirilir. Çözümleme GeneMapper (Uygulamalı Biyosistem, Kaliforniya) yazılımı ile yapılır. Loci D21S11, D7S820, FGA ve vWA sonuç (yüzde, alıcı ve verici özel DNA) hesaplamak için kullanılmıştır.
| Örnek | Alıcı DNA | Donör DNA |
| CD45 | % 25 | % 75 |
| CD36hi | % 25 | % 75 |
| CD36lo | % 55 | % 45 |
| CD34 | % 25 | % 75 |
Tablo 2. Yüzde alıcı ve verici DNA hücreler kemik iliği hücrelerinin Floresans aktif hücre sıralama elde. Chimerism lymphohematopoietic bölmenin belirli hücresel soy donör hücrelerinin verilir.
| Örnek | Alıcı DNA | Donör DNA |
| BM-MNC | %24,71 | %75.29 |
| BM-CD34 |
Tablo 3. Hücrelerdeki klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar tahlil elde edilen yüzde alıcı ve verici DNA. Chimerism lymphohematopoietic bölmenin belirli hücresel soy donör hücrelerinin verilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çalışmada amacı HKHT hastalarda takip erythroid ataları donör/alıcı chimerism analiz Hemoglobinopati için tedavi için seyirci iki yaklaşımın bir arada sunmaktır: 1.) floresan aktif hücre sıralama hematopoetik progenitör hücrelerin kemik iliği örneklerinde kısa tandem tekrarlar ve 2 analizi tarafından takip.) Koloni oluşturan birim büyüyen kemik iliği hücrelerinin atası çeşitli kolonilerde sınıflandırılması takip kısa tandem tekrar analiz tarafından. Bu yaklaşım yenilik donör/alıcı chimerism bireysel sömürgelerinde değerlendirmek için bir protokol teknikleri birleştirerek yatıyor.
Hemoglobinopati için HKHT hastalar için tedavi sonra önem bu yaklaşımın karışık chimerism içeriğinde bulunabilir. Çeşitli çalışmalar göstermiştir o düşük bir yüzde erythroid und sonuçlar uzun süreli istikrarlı hematopoetik chimerism3, karışık öncül hücreleri ile ilişkili olan donör myeloid hücrelerin hastaların önemli bir bölümünü ifade 11; Buna ek olarak, aynı hastalarda donör elde edilen kırmızı kan hücresi oranı yüksek (2 - için 5 - kat daha olgun lökositlerin yüksek) not edilir ve etkisiz arttığından erythroid geliştirme daha sonraki bir aşamada yer alan öneriyor. Bu gözlemler için hızlandırılmış apoptosis donör erythroblasts ve lenfosit T ve B arta kalan bir karışık homogreft14,15izin verdiği için sorumlu sebat için eğilimi atfedilmiş. Hematopoetik kök hücre nakli takip immunomodulation bağlamında son zamanlarda immünsupresif tedavinin değişimi hematopoetik ekimi için seçici bir avantaj sonuçlarında β-talasemi için sonra gösterdi genetik olarak düzeltilmiş erythroid bölmesi, bir 2 - için 2.5 - kat amplifikasyon kalan donör kök veren12hücreleri. Bu gözlem bu fenomen bir anlayış sağlar ve gen terapisi Hemoglobinopati tedavisi için eğitim gelecek klinik destekler gibi kalan karşı donör erythroid ataları, belirlenmesi yardımcı program destekler. Aslında, çekirdekli hücrelerin gen-modified kırmızı kan hücreleri dolaşan bir terapötik düzeyde sağlanması için gerekli oranda Hemoglobinopati için kök hücre nakli ile tedavi edilen hastaların gözlemlenen benzer olabilir.
Donör arttığından tam resim belirlemek için iletişim kuralı değiştirilmiş ve ayrıntılı, adım adım deneysel yaklaşım sağlar. Akış Sitometresi ayarlama işlemi bu protokolündeki kritik adımdır ve ile standart yazılım, ayrıntılı talimatlar ve uygun eğitimli personel tarafından gerçekleştirilmelidir. Bizim protokol görüntülenmeyecektir biçiminde tanıtımı bizim iletişim kuralı kolayca takip için seyirci sağlar. Koloni oluşturan üzerinden elde edilen erythroid ataları genomik DNA kullanarak bizim PCR sonuçları karşılaştırıldığında birimleri BM örneklerinde DNA karşı elde edilen FACS sıralanmış erythroid kemik iliği ataları. Donör engraftment verilerden iki yaklaşım temelde tutarlıdır. Ancak, genellikle daha az varyasyon koloni oluşturan üzerinden elde edilen örnekleri bulundu birimleri. Bu donör alyuvar öncüleri tüp bebek tahlil tedavi edilmezse ve sıralanmış donör meslektaşları ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş yaşama nedeniyle muhtemeldir. Bu ateşin içinde yapay olarak bilinen oranlarda sağlıklı ataları ve ataları çeşitli Hemoglobinopati hastalarda bir dizi karışık chimeric bileşimleri oluşturarak bu protokolü genişletilebilir. Klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar tahlil ve chimerism değerlendirilmesi doğru yerine oranlarını yansıtmaktadır.
Mekanizmaları belirli bu ayarda ilgili kesin bir anlayış eksik olsa da, burada sunulan engraftment ve prognostik bilgilerinde rutin kontrolü için ilgili bilgileri sağlamak için büyük önem yöntemdir klinik pratikte. Greft işlevi kurtarmak için girişimleri graft - versus - host hastalığı gelişme riski tarafından sınırlı olduğunu ve seri engraftment izleyerek destekli. Son olarak, bu yöntem de Hemoglobinopati, özellikle akut Greft - versus - host hastalığı ve Otoimmün hastalık etkilenen hastalarda dikkat geliştirmek için taahhüt araştırma alanları için yararlı bir olarak sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
