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Genetics

कम्प्लीमेंट रीसेप्टर के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन पिघलती पीसीआर 1 लम्बाई पोलीमॉर्फिजिस जीनोटाइपिंग: अल्जाइमर रोग जीन संवेदनशीलता आकलन के लिए एक अभिनव उपकरण

Published: July 18, 2017 doi: 10.3791/56012
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3,4
1Department of Immunology, Reims University Hospitals, Robert Debré Hospital, 2Faculty of Medicine, LRN EA 4682, University of Reims Champagne-Ardenne, 3Department of Internal Medicine and Geriatrics, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 4Faculty of Medicine, EA 3797, University of Reims Champagne-Ardenne

Summary

यहां, हम कई अनुप्रयोगों में इस्तेमाल के लिए पूरक रिसेप्टर 1 (सीआर 1) लम्बाई बहुरूपता निर्धारित करने के लिए एक अभिनव विधि का वर्णन करते हैं, विशेषकर अल्जाइमर रोग (एडी) जैसी बीमारियों की संवेदनशीलता का मूल्यांकन। एडी के रोगजनन में सीआर 1 आईसोफॉर्म की भूमिका को बेहतर ढंग से समझने के लिए यह विधि उपयोगी हो सकती है।

Abstract

कॉम्प्लेन्मेंट रिसेप्टर 1 (सीआर 1), एक ट्रांसममेब्रन ग्लाइकोप्रोटीन जो जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, कई कोशिका प्रकारों पर व्यक्त की जाती है, लेकिन विशेषकर लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) पर। पूरक घटकों C3b और C4b के लिए एक रिसेप्टर के रूप में, सीआर 1 पूरक कैस्केड की सक्रियता को नियंत्रित करता है और प्रतिरक्षा परिसरों और सेलुलर मलबे के फागोसिटास को बढ़ावा देता है, साथ ही साथ अलज़ाइमर रोग (एडी) में अमाइलॉइड-बीटा (एβ) पेप्टाइड। कई अध्ययनों ने एडी से जुड़े एकल न्यूक्लियोटाइड पॉलिमॉर्फ़िज्म (एसएनपी), साथ ही सीआर 1 जीन में कॉपी-नंबर विविधता (सीएनवी) की पुष्टि की है। यहां, हम सीआर 1 रिसेप्टर की लंबाई बहुरूपता निर्धारित करने के लिए एक अभिनव विधि का वर्णन करते हैं। रिसेप्टर में तीन डोमेन शामिल हैं, जिन्हें लंबे समय से मुताबिक़ पुनरावृत्ति (एलएचआर) कहा जाता है- एलएचआर-ए, एलएचआर-सी, और एलएचआर-डी-और एन एन डोमेन, एलएचआर-बी, जहां एन 0 और 3 के बीच पूर्णांक है। एक सिंगल जोड़ी का उपयोग करना विशिष्ट प्राइमरों के, जेनेटिक सामग्री का उपयोग एलएचआर-बी डोमेन के पहले टुकड़े को बढ़ाने के लिए किया जाता है (वेंई संस्करण एम्पलीकॉन बी) और एलएचआर-सी डोमेन (अपरिवर्तनीय एम्प्लिकॉन) का दूसरा टुकड़ा। वेरिएंट एम्प्लिकिक्स बी और अपरियंट एम्प्लिकॉन ने कहा प्राइमरों के संकरण वाले क्षेत्रों के बाहर पांच न्युक्लियोटाइड्स पर अंतर दिखाते हैं। एक मात्रात्मक उपकरण (उच्च-रिज़ॉल्यूशन पिघलने (एचआरएम) घटता) का उपयोग करके, वेरियंट एम्प्लिकिक्स बी और अपरिवर्तनीय एम्प्लिकिक्स की संख्या को कम किया जाता है, और सीर 1 लंबाई बहुरूपता के अनुसार भिन्न एम्प्लिकॉन बी का अपरिवर्तक एम्प्लिकॉन के अनुपात में अलग होता है। इस विधि में कैनेोनिकल फेनोटाइप विधि के कई फायदे उपलब्ध हैं, क्योंकि इसमें ताजा सामग्री की आवश्यकता नहीं है और यह सस्ता, तेज़ और बड़े जनसंख्या पर लागू है। इस प्रकार, एडी जैसे बीमारियों के रोगजनन में सीआर 1 एनोफर्म की भूमिका को बेहतर ढंग से समझने के लिए इस विधि का उपयोग करना उपयोगी होगा।

Introduction

एडी, मनोभ्रंश का सबसे आम कारण दुनिया भर के 3 करोड़ से अधिक लोगों को प्रभावित करता है और एक बड़ी सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या है 1 । चिकित्सकीय, ई neurocognitive स्वायत्तता 2 के एक प्रगतिशील हानि के लिए अग्रणी विकारों की विशेषता है। एडी दो न्यूरोपैथोलॉजिकल हॉलमार्कों की विशेषता है, अर्थात्, अतिरिक्त सेलुलर एमाइलॉइड जमा और इंट्रासेल्युलर न्यूरॉफिब्रिलरी टेंगल्स 3 ।

परंपरागत रूप से, बीमारी की शुरुआत के अनुसार, एडी को दो रूपों में वर्गीकृत किया जाता है। सबसे पहले प्रारंभिक शुरुआत एडी (ईओएडी) है, जहां लगभग 65 वर्ष की आयु से पहले शुरू होता है; यह प्रपत्र एडी के 5% से कम मामलों के खातों के लिए है। यह एडी का एक दुर्लभ, आटोसॉमल-प्रभावशाली रूप है, जिसके परिणामस्वरूप एमिऑलॉइड अग्रदूत प्रोटीन ( एपीपी) 4 , प्रेसीनलिलिन 1 ( पीएसईएन 1) 5 , या प्रेसनिलिन 2 ( पीएसईएन 2) में पूरी तरह से उत्परिवर्तन होता है।> 6 जीन दूसरा, बीमारी का अधिक सामान्य रूप (> 9% एडी के मामलों में) को "छिटपुट" देर से शुरुआत एडी (लोड) कहा जाता है और 65 साल या उससे अधिक उम्र के व्यक्तियों में अक्सर होता है यह कई आनुवांशिक और पर्यावरणीय जोखिम वाले कारकों के परिणाम 7 लोड में, एपोलिपोप्रोटीन ई ( एपीओई ) जीन के 4 एलील प्रमुख आनुवांशिक जोखिम वाले कारक 8 , 9 हैं । इसके अलावा, 20 से अधिक जीन लोकी जीनोम-व्यापी एसोसिएशन अध्ययन (जीडब्ल्यूएएस) द्वारा एडी के जोखिम से जुड़े होने के कारण पहचाने गए हैं, जिनमें से एक पूरक घटक (3 बी / 4 बी) रिसेप्टर 1 ( सीआर 1 ) जीन 10 , पर स्थित है। पूरक-संबंधित प्रोटीन के क्लस्टर में गुणसूत्र 1q32 सीआर 1 जीन पूरक रिसेप्टर प्रकार 1 (सीआर 1) प्रोटीन, पूरक गतिविधि नियामकों का एक घटक है।

सीआर 1 (सी 3 बी / सी 4 बी रिसेप्टर, सीडी 435), एसिडिमैट का ट्रांस्मेमेब्रन ग्लाइकोप्रोटीन200 सीएडी 11 , सी 3 बी, सी 4 बी, सी 3बी, सी 1, क्यू, मैनान-बाइंडिंग लैक्टिन (एमबीएल), और फाइकोलिन पूरक प्रोटीन 12 से जुड़ा हुआ है। सीआर 1 का जैविक कार्य सेल प्रकारों के साथ भिन्न होता है जिसमें यह व्यक्त किया जाता है। मनुष्यों में, कुल परिसंचारी सीआर 1 के 90% लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) 13 में पाए जाते हैं आरबीसी की सतह पर मौजूद, सीआर 1 ने सी 3 बी- या सी 4 बी-ऑप्शन वाले सूक्ष्मजीवों या प्रतिरक्षा परिसरों से बांध दिया है, जिससे संचलन से उनकी मंजूरी की सुविधा मिलती है। सीआर 1 से जुड़ी कॉम्प्लेक्स को वास्तव में फागोसाइट्स में स्थानांतरित किया जाता है जब आरबीसी यकृत और प्लीहा 11 , 14 के माध्यम से जाते हैं। सी 3 बी और सी 4 बी के बयान को सीमित करके सीआर 1 अत्यधिक पूरक सक्रियण को रोक सकता है। इसलिए, आरबीसी पर सीआर 1 की अभिव्यक्ति ऊतकों की सुरक्षा में एक आवश्यक तत्व माना जाता है, जैसे कि सेरेब्रल तंत्रिका तंत्र, प्रतिरक्षा जटिल बयान और परिणामी रोगों के खिलाफ। आरबीसी पर सीआर 1 को भी जाना जाता हैरोगजनक संक्रमण 15 , 16 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाइए। इसके अलावा, सीआर 1, जन्मजात प्रतिरक्षा में एक प्रमुख खिलाड़ी के रूप में, पूरक कैस्केड के नियमन और प्रतिरक्षा परिसरों के परिवहन और निकासी में शामिल है। सीआर 1 इस गतिविधि को सी 3 बी और सी 4 बी टुकड़े बाध्य करके और शास्त्रीय और वैकल्पिक कन्वेंसेज (सी 4 बी 2ए कॉम्प्लेक्स से सी 2 ए के विस्थापन और सी 3 बीबीबी कॉम्प्लेक्स से सी 3 बी के असंतुलन) को अलग करने के द्वारा जुड़ा हुआ है। प्लाज्मा सेरीन प्रोटीज कारक I (FI) के एक कॉफ़ेक्टर के रूप में, सीआर 1 सीआईबी और सी 3 बी के सीएबीबी और सी 3 बी के फैलाव को बढ़ाकर, सीओएक्टक्टर गतिविधि (सीए) के रूप में जाना जाता है, और सी 3 एम्पलीकरण पाश को रोक कर क्लासिकल और वैकल्पिक पूरक रास्ते को रोकता है। , बारी में आगे पूरक सक्रियण को रोकने। रोजर्स और सहकर्मियों के प्रमाण हैं कि एओ पेप्टाइड 17 एंटीबॉडी के अभाव में पूरक मार्ग को बाध्य और सक्रिय कर सकते हैं और सुझाव देते हैं कि एओ पेप्टाइड सीएल हैआरबीसी 18 पर व्यक्त सीआर 1 के पूरक-पूरक अनुपालन के माध्यम से परिसंचरण से घिरा हुआ है।

सीआर 1 तीन प्रकार के बहुरूपता दर्शाता है: स्ट्रक्चरल या लम्बाई बहुरूपता, घनत्व बहुरूपता, और नॉप्स रक्त समूह बहुरूपता 11 , 1 9 । संरचनात्मक बहुरूपता लंबे समय से मुताबिक़ पुनरावृत्ति (एलएचआर) की संख्या में भिन्नता से संबंधित है और इस प्रकार चार आइसोफर्म को परिभाषित करता है। वास्तव में, सीआर 1 प्रोटीन का बाह्य डोमेन दोहराए जाने वाली इकाइयों की एक श्रृंखला से बना है, जिसे संक्षेप में आम सहमति दोहराता (एससीआर) या पूरक नियंत्रण दोहराता (सीसीपी) कहा जाता है। इन एससीआर को डीओक्यूरिफ्रोन्यूक्लिइक एसिड (सीडीएनए) एन्कोडिंग सीआर 1 से पूरक किया गया है। एससीआर को सातों के मिलनसार समूहों में व्यवस्थित किया जाता है, जिन्हें एलएचआर के नाम से जाना जाता है। सीआर 1 को चार एलएचआर में व्यवस्थित किया जाता है, जिसे एलएचआर-ए, -बी, -सी, और-डी के रूप में नामित किया जाता है, जो सात एससीआर इकाई 1 9 , 20 के दोहराव से उत्पन्न होता है ,21

आवृत्ति के बढ़ते हुए क्रम में, पश्चिमी ब्लॉट (डब्ल्यूबी) द्वारा निर्धारित ये सीआर 1 आइसफर्म सीआर 1 * 1 (ए / एफ) (जेल वैद्युतकणसंचलन पर तेजी से प्रवास), सीआर 1 * 2 (बी / एस) (जेल वैद्युतकणसंचलन पर धीमी गति से प्रवास), सीआर 1 * 3 (सी / एफ`), और सीआर 1 * 4 (डी)। दो सबसे आम आइसोफर्म, सीआर 1 * 1 (ए / एफ) और सीआर 1 * 2 (बी / एस) क्रमशः चार और पांच एलएचआर से बना है, जबकि सीआर 1 * 3 (सी / एफ`) और सीआर 1 * 4 (डी) ) क्रमशः 3 और 6 एलएचआर से बना है। 30 एससीआर से बना सबसे आम आईसोफॉर्म (सीआर 1 * 1) में तीन सी 4 बी बाध्यकारी साइटें (एससीआर 1-3, 8-10 और 15-17) और दो सी 3 बी बाध्यकारी साइटें (एससीआर 8-10 और 15-17) , जबकि एससीआर 22-28 बाइंड सी 1 क्यू, फिकोलिन, और एमबीएल 12 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 इस प्रकार, सीआर 1 * 2 में एक अतिरिक्त सी 3 बी / सी 4 बी बाइंडिंग साइट की तुलना हैडी से सीआर 1 * 1 चित्रा 1 चित्रा 1 सीआर 1 के चार अलग-अलग आइसोफर्म के संरचनाओं, नामकरण और आणविक भार दिखाता है।

घनत्व बहुरूपता एक स्थिर फेनोटाइप से मेल खाती है जो आरबीसी पर सीआर 1 के गठन अभिव्यक्ति के स्तर को दर्शाता है। स्वस्थ कोकेशियान विषयों में, यह दिखाया गया है कि आरबीसी प्रति सीआर 1 अणुओं की संख्या दस के एक घटक तक भिन्न हो सकती है (प्रत्येक सेल में 150 से 1200 अणुओं पर अलग-अलग) 26 । हेल्जेसोन फ़न्यटाइप के आरबीसी में सीआर 1 घनत्व बहुत कम है, जो सेल 27 , 28 प्रति 150 अणुओं से कम दिखाया गया था। लाल रक्त कोशिकाओं पर CR1 घनत्व आनुवंशिक रूप से CR1 जीन पर एक अलिंगसूत्र codominant biallelic प्रणाली, एक हिन dIII प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता (RFLP) 29 के साथ सहसंबद्ध साथ जुड़ा हुआ है। सीआर 1 जीन के इंट्रॉन 27 में एकल-बिंदु उत्परिवर्तन, दूसरे के एन्कोडिंग के बीच दूसराएसएचआर एलएचआर-डी में, परिणामस्वरूप इस क्षेत्र के भीतर एक बहुउद्देशीय हिन डीआईआईआई साइट की स्थापना 30 है । 7.4 और 6.9 केडीए के जीनोमिक हिन डीआईआईआई टुकड़े क्रमशः आरबीसी पर उच्च (एच एलील) या कम (एल एलील) सीआर 1 घनत्व से संबंधित एलीज की पहचान करते हैं। हालांकि, कुछ पश्चिम अफ्रीकी आबादी 31 , 32 में आरबीसी और हिन डीआईआईआई बहुरूपताओं पर सीआर 1 घनत्व के बीच कोई संबंध नहीं मिला। सीआर 1 घनत्व विनियमन को एक गैर-कोडिंग हिन डीआईआईआई बहुरूपता से जोड़ने वाली तंत्र अज्ञात है। कई बहुरूपताओं में, एससीआर 16 में Q981H और एससीआर 28 में पी 1786 आर आरबीसी 30 , 33 पर सीआर 1 घनत्व से जुड़ा हुआ है।

इंटरनेशनल नामकरण के अनुसार नोप्स (केएन) बहुरूपता, इंटरनेशनल सोसाइटी ऑफ़ ब्लड ट्रांसफ्यूज़न द्वारा सूचीबद्ध होने वाली 22 वीं रक्त समूह प्रणाली है। इसमें 9 एंटीजेनिक विशिष्ट हैंसीआर 1 द्वारा आरबीसी द्वारा व्यक्त की गईं, जिनमें तीन एंटीथेटिक एंटीजेनिक जोड़े, केएन 1 / के एन 2, केएन 3 / केएन 6, और केएन 4 / केएन 7 तथा साथ ही 3 पृथक एंटीजन, केएन 5, के एन 8, केएन 9 शामिल हैं। केएन 1, केएन 3, केएन 4, और केएन 5 एंटीजन उच्चतर आवृत्ति एंटीजन हैं जो केएन सिस्टम ( यानी, 99% से अधिक सामान्य आबादी में व्यक्त)। हालांकि, ईडी में इस बहुरूपता की भूमिका 13 तक निर्धारित की जाती है

इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल कई बीमारियों, जैसे कि एडी, सिस्टमिक ल्यूपस एरीथेमेटोसस और मलेरिया की संवेदनशीलता में शामिल CR1 लंबाई बहुरूपता जीनोटाइप्स का निर्धारण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। सीआर 1 लम्बाई बहुरूपता निर्धारण के लिए हमारी विधि सीआर 1 आइसफर्म और एलएचआर-बी और एलएचआर-सी ( चित्रा 2 ) के बीच अनुक्रम अंतर के एलएचआर-बी की संख्या का लाभ लेती है।

Protocol

मानव रक्त संग्रह और हैंडलिंग के लिए प्रोटोकॉल की समीक्षा की गई और क्षेत्रीय नैतिकता समिति (सीपीपी इस्ट 2) द्वारा अनुमोदित किया गया और प्रोटोकॉल संख्या 2011-A00594-37 है

नोट: निम्न प्रोटोकॉल मानव रक्त का प्रबंधन करने का वर्णन करता है। जैव-हानि सामग्री का निपटान करते समय संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करें। लैब कोट और दस्ताने जैसे प्रयोगशाला सुरक्षा उपकरण, पहना जाना चाहिए। प्रोटोकॉल का वर्णन करने वाला एक प्रवाह चार्ट चित्रा 3 में दिखाया गया है।

1. रक्त और शरीर द्रव डीएनए निकालना

  1. पाइपेट प्रोटीन के 20 μL (15 μg / μL) 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के नीचे।
  2. 1.5 एमएल ट्यूब में नमूने के 200 μL जोड़ें। 200 μL पूरे रक्त, प्लाज्मा, सीरम, बफी कोट, या शरीर तरल पदार्थ, या पीबीएस के 200 μL में 5 x 10 6 लिम्फोसाइटों तक का प्रयोग करें।
  3. नमूना के लिए 200 μL lysis बफर जोड़ें। 15 एस के लिए पल्स-व्हॉर्टिक्सिंग द्वारा मिक्स करें
  4. पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  5. ढक्कन के अंदर से बूंदों को हटाने के लिए संक्षेप में 1.5 एमएल ट्यूब को अपकेंद्रित करें।
  6. नमूने के लिए 200 μL इथेनॉल (96-100%) जोड़ें और 15 सेकंड के लिए पल्स-व्हॉर्टिक्सिंग द्वारा फिर से मिश्रण करें। मिश्रण करने के बाद, ढक्कन के अंदर से बूंदों को हटाने के लिए 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को संक्षेप में सेंटीफ्यूज करें।
  7. ध्यान से चरण 1.6 से झिल्ली स्तंभ (2 एमएल संग्रह ट्यूब में) से मिश्रण लागू करें। रिम गीले बिना, टोपी और 1 मिनट के लिए 6,000 xg पर अपकेंद्रित्र बंद करें एक साफ 2-एमएल संग्रह ट्यूब में झिल्ली स्तंभ रखें और छानने युक्त ट्यूब को त्याग दें।
  8. झिल्ली स्तंभ को ध्यान से खोलें और रिम गीले बिना 500 μL धोने बफर 1 जोड़ें। टोपी और 1 मिनट के लिए 6,000 xg पर अपकेंद्रित्र बंद करें एक साफ 2 एमएल संग्रह ट्यूब में झिल्ली स्तंभ रखें और छानने युक्त ट्यूब को त्याग दें।
  9. झिल्ली स्तंभ को सावधानीपूर्वक खोलें और 500 ग्राम वॉशिंग बफर 2 को गीला बिना रख देंई रिम टोपी और 3 मिनट के लिए पूर्ण गति (20,000 xg) पर अपकेंद्रित्र बंद करें
  10. एक नए 2 एमएल संग्रह ट्यूब में झिल्ली स्तंभ रखें और छानने के साथ संग्रह ट्यूब को त्यागें। 1 मिनट के लिए 20,000 xg पर अपकेंद्रित्र
  11. झिल्ली स्तंभ को साफ 1.5 एमएल ट्यूब में रखें और छानने युक्त संग्रह ट्यूब को त्याग दें।
  12. झिल्ली स्तंभ को ध्यान से खोलें और आसुत पानी के 200 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं और फिर 1 मिनट के लिए 6,000 xg पर अपकेंद्रित्र
  13. डीएनए एकाग्रता चरण के निर्धारण के लिए आगे बढ़ें या -20 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए नमूने फ्रीज करें

2. डीएनए एकाग्रता का निर्धारण

नोट: चित्रा 4 देखें

  1. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर डीएनए मोड का चयन करने के लिए 1 दबाएं। बाएं और दाएं तीर का उपयोग करके 5 मिमी पथ की लंबाई का चयन करें। बाएं और दाएं तीर का उपयोग करके 1 के एक कमजोर पड़ने का कारक चुनें
  2. वें का उपयोग करते हुए यूनिट (माइक्रोग्राम / एमएल) का चयन करेंई बायां और दायां तीर बाएं और दायां तीर का उपयोग करके 50 के एक कारक का चयन करें ओके दबाएं
  3. पाइपेट क्युवेट में आसुत जल के 10 μL। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में क्युवेट रखें ओए / 100% टी बटन दबाएं
  4. क्यूवेट में डीएनए नमूना (डिस्टिल्ड वॉटर में 1/4 कमजोर पड़ने) के 10 μL पिपेट। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में क्युवेट रखें हरा बटन दबाएं (पढ़ें / प्रारंभ करें) एकाग्रता ध्यान दें
  5. -20 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए नमूना फ्रीज करें

3. एचआरएम-पीसीआर प्रोटोकॉल

  1. डीएनए नमूने पिघलना डीएनए नमूनों को 1.5 एमएल ट्यूबों में पानी के साथ पतला करें ताकि उन्हें 10 एनजी / μ एल की एकाग्रता में समायोजित कर सकें।
    नोट: पतला डीएनए की कुल मात्रा 2 μL और 10 μL के बीच होनी चाहिए।
  2. प्राइमर समाधान पिघलना प्राइमर समाधान 1.5 एमएल ट्यूबों में पानी के साथ 6 माइक्रोन के एक ही एकाग्रता में समायोजित करने के लिए पतला।
    नोट: प्राइमर अनुक्रम और प्रतिक्रिया की स्थिति टी में प्रदान की जाती हैसक्षम 1

तालिका एक
तालिका 1: उच्च-रिजोल्यूशन पिघलने विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर्स और पैरामीटर

  1. एचआरएम-पीसीआर किट समाधानों को पिघलना और सभी सामग्री की वसूली सुनिश्चित करने के लिए भंवर द्वारा सावधानीपूर्वक मिश्रण करें। संक्षेप में उन्हें खोलने से पहले डीएनए बाध्यकारी डाई, एमजीसीएल 2 , और एक माइक्रोसॉसिटरिफ़्यूज में पानी के साथ एंजाइमिक मिश्रण वाले तीन शीशों को स्पिन कर दें। उन्हें कमरे के तापमान पर स्टोर करें
  2. कमरे के तापमान पर 1.5 एमएल ट्यूब में, नीचे दिए गए क्रम में निम्नलिखित घटकों को जोड़कर एक 20 μL प्रतिक्रिया के लिए पीसीआर मिश्रण तैयार करें:
    1. डीएनए बाध्यकारी डाई के साथ एंजाइमेटिक मिश्रण के 10 μL;
    2. 2 एमएलएम 25 एमएम एमजीएल 2 ;
    3. प्राइमर 1 के 1 μL, 6 माइक्रोन (अंतिम एकाग्रता: 300 एनएम);
    4. 1 μL प्राइमर 2, 6 माइक्रोन (अंतिम एकाग्रता: 300एनएम); तथा
    5. 5 μL पानी
      नोट: एक से अधिक प्रतिक्रिया के लिए पीसीआर मिश्रण को तैयार करने के लिए, ऊपर चलने वाले प्रतिक्रियाओं की संख्या के साथ-साथ एक अतिरिक्त प्रतिक्रिया को बढ़ाएं।
  3. Vortexing द्वारा ध्यान से मिक्स करें।
  4. पिपेट 1 9 μL पीसीआर मिश्रण, ऊपर तैयार, एक सफेद मल्टीवेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में।
  5. चरण 3.1 में तैयार किए गए एकाग्रता-समायोजित डीएनए टेम्पलेट के 1 μL जोड़ें।
    नोट: नियंत्रण प्रतिक्रियाओं के लिए, हमेशा नमूनों के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण चलाएं। नकारात्मक नियंत्रण तैयार करने के लिए, टेम्पलेट डीएनए को पानी के साथ बदलें।
  6. सील पन्नी के साथ सफेद मल्टीवेल प्लेट सील करें
  7. अपकेंद्रित्र में सफेद मल्टीवेल प्लेट रखें और इसे एक उचित काउंटर ( यानी, एक मल्टीवेल प्लेट) के साथ संतुलन दें। एक मानक स्विंग-बकेट अपकेंद्रित्र में 1 मिनट पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र जिसमें उपयुक्त एडाप्टर के साथ मल्टीवेल प्लेट्स के लिए एक रोटर होता है।
  8. एचआरएम-पीसीआर उपकरण में सफेद मल्टीवेल प्लेट को लोड करें
  9. निम्न पीसीआर स्थितियों के साथ एचआरएम-पीसीआर प्रोग्राम शुरू करें:

    निषेध: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 1 चक्र
    प्रवर्धन: 10 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 15 डिग्री के लिए 62 डिग्री सेल्सियस, और 20 डिग्री के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 47 चक्र
    पिघलने की अवस्था: 95 डिग्री सेल्सियस; रैंप दर: 0.02 डिग्री सेल्सियस; 25 अधिग्रहण प्रति डिग्री सेल्सियस; 1 चक्र
    शीतलक: 30 एस के लिए 40 डिग्री सेल्सियस; रैंप दर 2.2 डिग्री सेल्सियस; 1 चक्र

4. एचआरएम विश्लेषण सीआर 1 लंबाई पॉलीमॉर्फिज़्म निर्धारित करने के लिए

नोट: वर्णित पद्धति ( चित्रा 5 ) हमारे सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) के लिए विशिष्ट है, हालांकि अन्य सॉफ़्टवेयर पैकेज का उपयोग किया जा सकता है

  1. CR1 लंबाई बहुरूपता स्कैनिंग विश्लेषण करने के लिए एक जीन स्कैनिंग सॉफ्टवेयर खोलें।
  2. प्रवर्धन कार्यक्रम और पिघलने वाले वक्र कार्यक्रम वाले प्रयोग को खोलें।
  3. मॉड्यूल बार में नमूना संपादक पर क्लिक करें और फिर एस का चयन करेंडिब्बाबंदी कार्यप्रवाह।
  4. नमूने ( यानी नाम, अज्ञात या नकारात्मक नियंत्रण) के गुणों को परिभाषित करें।
  5. मॉड्यूल बार में विश्लेषण पर क्लिक करें।
  6. नई विश्लेषण सूची बनाएं , जीन स्कैनिंग का चयन करें ।
  7. पिघलने वाले घटता को सामान्य करने के लिए सामान्यीकरण टैब पर क्लिक करें
  8. पिघलने वाले घटता के तापमान अक्ष (एक्स-अक्ष) को रीसेट करने के लिए तापमान बदलाव टैब पर क्लिक करें।
    नोट: निचला ग्राफ़ पिघलने वाले घटता दिखाता है जो दोनों सामान्यीकृत और तापमान-स्थानांतरित हो गए हैं।
  9. परिणामों का विश्लेषण करने और समूह निर्धारण निर्धारित करने के लिए गणना बटन पर क्लिक करें।
  10. सामान्य और अनुशंसित पिघलती घटता और सामान्यीकृत और तापमान शिफ्ट अंतर प्लॉट देखने के लिए चार्ट क्षेत्र में फॉरेस्ट प्लॉट टैब पर क्लिक करें।

Representative Results

चित्रा 6 ए डब्ल्यूबी द्वारा सीआर 1 लम्बाई बहुरूपता के phenotyping को प्रदर्शित करता है। चित्रा 6 बी और सी सीआर 1 लंबाई बहुरूपता के निर्धारण को सक्षम करने, एचआरएम-पीसीआर विश्लेषण के दौरान प्राप्त किये गये घटता दिखाता है। विभिन्न सीआर 1 आइसोफर्म के साथ विषयों के जीनोमिक डीएनए से पीसीआर-व्युत्पन्न एम्प्लिकेशंस के उच्च-रिज़ोल्यूशन पिघलने के बाद सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने वाले संलयन घटता का विश्लेषण घटता है कि उनके अलौकिक सीआर 1 एक्सप्रेशन फ़िनोटाइप के अनुसार विषयों को भेदभाव करता है।

चित्र 6 बी प्रस्तुति का एक पहला मोड दिखाता है, जिसे "सामान्य और स्थानांतरित पिघलता घटता" कहा जाता है, जबकि चित्रा 6 सी प्रस्तुति का दूसरा मोड प्रदर्शित करता है, जिसे "सामान्य और अस्थायी-अंतरित अंतर प्लॉट" कहा जाता है।

चित्रा 6 ए : (सीआर 1 * 3, सीआर 1 * 1) में प्रदर्शित फ़िनोटीप्स का प्रतिनिधित्व करते हैं, उनके अनुसार वितरित किया जाता है; (सीआर 1 * 1, सीआर 1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; और (सीआर 1 * 2, सीआर 1 * 4) इससे इस नई आणविक जीव विज्ञान विधि का उपयोग करके सीआर 1 लम्बाई बहुरूपता के जीनोटाइपिंग को सक्षम किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: पूरक रिसेप्टर 1 प्रोटीन की संरचना और बहुरूपता के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व प्रत्येक छोटी सहमती दोहराएँ (एससीआर) या पूरक नियंत्रण प्रोटीन (सीसीपी) एक वृत्त द्वारा प्रतिनिधित्व किया है एससीआर को एक दोहरावदार, उच्च-क्रम वाली संरचनाओं में वर्गीकृत किया जाता है जिन्हें एलएचआर कहा जाता है। बाह्य डोमेन से सेल झिल्ली तक, एलएचआर (LHR) हैं: एलएचआर-ए, -बी, -सी, -डी, और -एस (पूरक या अतिरिक्त एलएचआर)। सबसे आम CR1 isoform में(सीआर 1 * 1), सी 4 बी / कड़क गतिशील गतिविधि (डीएए) बाध्यकारी साइट एलएचआर-ए (एससीआर 1-3, हरी चक्कर) में स्थित है, सी 3 बी / सी 4 बी / कॉफ़ैक्टर गतिविधि (सीए) बाइंडिंग साइट 3 में स्थित है एन-टर्मिनल एससीआर एलएचआर-बी (एससीआर 8-10, लाल सर्किल) और एलएचआर-सी (एससीआर 15-17, बैंगनी सर्कल), और सी 1 / एमबीएल और फ़िकोलिन के बंधन स्थल एलएचआर-डी (एससीआर) में पाया जाता है 22-28, नीले हलकों)। मुताबिक़ संरचनाओं को समान रूप से रंग दिया गया है सीआर 1 * 2 (एस) आईसोफॉर्म एक अतिरिक्त एलएचआर (एलएचआर-एस) को प्रस्तुत करता है और इस प्रकार एक अतिरिक्त सी 3 बी / सी 4 बी बाध्यकारी साइट है। केडीए, किलोोडलटन एनआरसी, गैर-कम परिस्थितियां आरसी, कम स्थिति टीएम, ट्रांसमीटरब्रेन डोमेन यह आंकड़ा Brouwers एट अल से अनुकूलित किया गया था प्रकृति प्रकाशन समूह से अनुमति के साथ 36 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2 "/files/ftp_upload/56012/56012fig2.jpg" />
चित्रा 2 : एचआरएम-पीसीआर द्वारा प्राप्त अनुक्रम एम्प्लिकॉन पदों के साथ CR1 isoform संरचना का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व प्रत्येक बॉक्स एक एससीआर का प्रतिनिधित्व करता है। एससीआर को एलएचआर में वर्गीकृत किया जाता है: एलएचआर-ए, -बी, -सी और डी मुताबिक़ संरचनाओं को समान रूप से रंग दिया गया है सीआर 1 * 2 और सीआर 1 * 4 आइसोफर्म अतिरिक्त एलएचआर (एलएचआर-बी) पेश करते हैं और इस प्रकार एक अतिरिक्त एम्प्लिकॉन क्षेत्र (एम्प्लिकिक्स बी, लाल) में होते हैं। सीआर 1 * 3 में एलएचआर-बी का अभाव होता है और इसमें कम एम्प्लिकॉन क्षेत्र होता है (एम्प्लिकोन बी की कमी)। एम्प्लिकोन बी (1 9 6 बीपी) और अपरिवर्तनीय एम्प्लिकॉन (1 9 7 बीपी) के बीच न्यूक्लियोटाइड अंतर को क्रमशः लाल और नीले रंग में दर्शाया गया है। अनुपात में अंतर: (एम्पलिकॉन बी, लाल / अपरिवर्तनीय एम्प्लिकॉन में, नीले रंग में) प्रत्येक सीआर 1 आईसोफर्म के बीच एचआरएम-पीसीआर द्वारा निर्धारित किया जाता है, जो जीनोटाइपिंग को सक्षम करता है। सीएन 3 और सीएन 3आरई प्राइमर अनुक्रमों को रेखांकित किया जाता है। टीएम, ट्रांसमीटरब्रेन डोमेन सीवाईटी, साइप्लास्मेसिक पूंछPg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: मानव रक्त नमूनों से सीआर 1 लंबाई बहुरूपता जीनोटाइपिंग के लिए प्रोटोकॉल का फ्लोचार्ट। एक मानव डीएनए नमूना लीजिए डीएनए खून का नमूना प्राप्त करने के लिए डीएनए निकालें। 10 एनजी / μL पर डीएनए एकाग्रता प्राप्त करने के लिए डीएनए एकाग्रता निर्धारित करें और पतला। CR1 लंबाई बहुरूपता जीनोटाइप प्राप्त करने के लिए एचआरएम-पीसीआर का उपयोग करें इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4 : स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के स्क्रीनशॉट हमें डीएनए एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एड स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर डीएनए मोड का चयन करने के लिए 1 ( ए ) दबाएं। बाएं और दाएँ तीर ( सी ) का उपयोग करके 5 मिमी पथ की लंबाई ( बी ) का चयन करें। बाईं और दायां तीरों ( सी ) का उपयोग करके इकाई (माइक्रोग्राम / एमएल) ( डी ) का चयन करें। बाएं और दायां तीरों ( सी ) का उपयोग करके कमजोर पड़ने वाले कारक 1 ( ई ) का चयन करें बाएं और दाएं तीर का उपयोग करके 50 ( एफ ) का एक कारक चुनें ओके दबाएं ( जी ) पाइपेट क्युवेट में आसुत जल के 10 μL। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर ( एच ) में क्युवेट रखें ओए / 100% टी बटन ( I ) दबाएं क्यूवेट में डीएनए नमूना (डिस्टिल्ड वाटर में 1/4 कमजोर पड़ने) के 10 μL पिपेट। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर ( कश्मीर ) में क्युवेट रखें ग्रीन बटन दबाएं (पढ़ना / प्रारंभ करें) ( एल ) एकाग्रता ( एम ) ध्यान देंEs / ftp_upload / 56012 / 56012fig4large.jpg "target =" _ blank "> इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: प्रोटोकॉल के चरण 4 में उपयोग किए गए सॉफ़्टवेयर के ग्राफ़िकल इंटरफ़ेस के स्क्रीनशॉट। ( ए ) जीन स्कैनिंग सॉफ्टवेयर खोलें ( बी ) प्रवर्धन कार्यक्रम और पिघलने वक्र कार्यक्रम। ( सी ) मॉड्यूल बार में नमूना संपादक पर क्लिक करें। ( डी ) स्कैनिंग का चयन करें ( ई ) नमूने के गुणों को परिभाषित करें। ( एफ ) मॉड्यूल बार में विश्लेषण पर क्लिक करें। ( जी ) पिघलने वाले घटता को सामान्य करने के लिए सामान्यीकरण टैब पर क्लिक करें। ( एच ) तापमान शिफ्ट टैब पर क्लिक करें ताकि पिघलने वाले घटता दिखाया जा सकेसामान्यीकृत और तापमान-स्थानांतरित ( I ) परिणामों का विश्लेषण करने और समूह निर्धारण का निर्धारण करने के लिए गणना बटन पर क्लिक करें। ( जे ) सामान्य प्लॉट टैब पर सामान्य और स्विच किए गए पिघलने वाले घटता और सामान्यीकृत और तापमान स्थानांतरित अंतर प्लॉट देखने के लिए क्लिक करें। ( कश्मीर ) सीआर 1 लंबाई जीनोटाइप के अनुसार नमूने के रंग का समूह। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
चित्रा 6: डब्ल्यूटीबी में सीआर 1 लम्बाई बहुरूपताओं का फेनोटाइपिंग और एचआरएम-पीसीआर द्वारा प्राप्त किए गए उनके संबंधित प्रोफ़ाइल घटता। ( ए ) डब्ल्यूटीबी का उपयोग करते हुए सीआर 1 लम्बाई बहुविधता का फेनोटाइपिंग ( बी सी ) एचआरएम-पीसीआर विश्लेषण का उपयोग कर CR1 लंबाई बहुरूपताओं के जीनोटाइपिंग। विभिन्न सीआर 1 आइसफर्म प्रदर्शित करने वाले विषयों के जीनोमिक डीएनए से प्राप्त पीसीआर एम्प्लिकंस के मानव संसाधन विकास वक्र विश्लेषण; (सीआर 1 * 3, सीआर 1 * 1) (बैंगनी) विशिष्ट वक्र प्रोफाइल की पहचान करने के लिए नेतृत्व; (सीआर 1 * 1, सीआर 1 * 2) (नीला); सीआर 1 * 1 (हरा); सीआर 1 * 2 (लाल); और (सीआर 1 * 2, सीआर 1 * 4) (ग्रे) ये सीआर 1 लंबाई बहुरूपूप एलील जैसा कि प्रस्तुति के दो तरीकों- "सामान्य और शिफ्ट पिघलने वाले घटता" (बी) और "सामान्यीकृत और अस्थायी-अंतरित अंतर प्लॉट" (सी) -वर्व प्रोफाइल को (सीआर 1 * 3, सीआर 1 * 1) के अनुसार वितरित किया जाता है। ; (सीआर 1 * 1, सीआर 1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; और (सीआर 1 * 2, सीआर 1 * 4) समूह यह आंकड़ा महमौडी एट अल से अनुकूलित किया गया था 38 एल्सवीयर की अनुमति के साथ इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Discussion

यहां, हम सीआर 1 की लंबाई बहुरूपता का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से सुलभ पद्धति का वर्णन करते हैं। प्रवर्धन या खंडीय संकरण के लिए आणविक जीव विज्ञान तकनीकों ने संतोषजनक परिणाम देने में सक्षम नहीं हुए हैं जो सभी व्यक्तियों में सीआर 1 लंबाई बहुरूपता के निर्धारण की अनुमति देते हैं। इसका कारण CR1 जीन की पुनरावृत्ति संरचना ( यानी, सीआर 1 के अत्यधिक पुनरावृत्तीय एससीआर) के कारण है यहां वर्णित आणविक जीव विज्ञान विधि सीआर 1 अणु में एलएचआर-बी के मात्रात्मक वितरण का लाभ उठाती है। सीआर 1 अणु में एन एलएचआर-बी डोमेन शामिल हैं, जहां एन 0 और 3 के बीच की संख्या है, और केवल एक एलएचआर-सी डोमेन है, जैसा कि चित्रा 2 में वर्णित और सचित्र है। मात्रात्मक डोमेन बी पता लगाने से यह संभव है कि एक अतिरिक्त या अनुपस्थित डोमेन बी को भेदभाव करना संभव हो।

निकाली गई आनुवांशिक सामग्री से, एलएचआर-बी से एक पहला डीएनए टुकड़ा पीसीआर द्वारा विशिष्ट प्राइमरों की एक जोड़ी का उपयोग करके बढ़ाया जाता है, represenएलएचआर-बी के एक विशिष्ट प्रकार को "वैरिएन्ट एम्प्लीकॉन बी" नामक एक प्रकार के रूप में चिह्नित किया गया एक दूसरा डीएनए टुकड़ा, जिसे "अपरिवर्तनीय एम्प्लिकॉन" कहा जाता है और एलएचआर-सी से संबंधित है, को भी विस्तारित किया जाता है। यह दूसरा डीएनए टुकड़ा एलएचआर-सी का टुकड़ा है, लेकिन एलएचआर-ए या-डी का एक और अपरिवर्तनीय टुकड़ा भी इस्तेमाल किया जा सकता है।

दो डीएनए के टुकड़े, एम्पिलिकोन बी और अपरिवर्तनीय एम्प्लिकॉन, एक ही प्राइमरों द्वारा प्रवर्धित होते हैं और न्यूक्लियोटाइड सीक्वेंस में पांच अंतर प्रदर्शित करते हैं। इस विशेषता ने इस प्रकार के रूप में एम्पलिपिक बी की संख्या और एक मात्रात्मक आणविक जीव विज्ञान उपकरण, एचआरएम का उपयोग करके अपरिवर्तनीय एम्प्लिकिक्स की संख्या निर्धारित करने के बाद के चरण में यह संभव बना दिया है, जिसे इस उद्देश्य के लिए अनुकूलित किया गया था। एम्प्लिकॉन बी और अपरिवर्तनीय एम्प्लिकॉन (अनुपात: एम्प्लिकोन बी / अपरियंट एम्प्लिकॉन) की संख्या के बीच का अनुपात सीआर 1 अणु की लंबाई के अनुसार भिन्न होता है। दरअसल, सीआर 1 * 4 3 एम्प्लीकॉन बी यूनिट्स को 1 अपरिवर्तनीय एम्प्लिकॉन से प्रदर्शित करता है, सीआर 1 * 2 2 एम्पलीकॉन बी यूनिट्स को 1 अपरियंट एम्प्लिकॉन, सीR1 * 1 1 एम्पलीकॉन बी से 1 अपरिवर्तनीय एम्प्लिकॉन प्रदर्शित करता है, और CR1 * 3 में 0 एम्प्लिकॉन बी यूनिट्स को 1 अपरिवर्तनीय एम्प्लिकॉन ( चित्रा 2 ) से प्रदर्शित करता है। इस प्रकार, यह एचआरएम-पीसीआर विधि सीआर 1 लम्बाई बहुरूपता के जीनोटाइपिंग को सक्षम बनाता है।

फिर भी, अध्ययन शुरू होने पर, इस तकनीक के संदर्भ विषयों के उपयोग की आवश्यकता होती है जिनके CR1 phenotypes पहले से ही ज्ञात हैं ( यानी, पहले से WB द्वारा स्थापित) क्रम में सीआर 1 की जीनोटाइपिंग स्थापित करने में सक्षम होने के लिए प्राप्त वक्र के संदर्भ प्रोफ़ाइल के अनुसार एचआरएम-पीसीआर द्वारा दो प्रकार के प्रतिनिधित्व, अर्थात्, "सामान्यीकृत और बदले गए पिघलने वाले घटता" और "सामान्यीकृत और अस्थायी-अंतरित अंतर प्लॉट" उपलब्ध हैं। वे WB ( चित्रा 6 ) द्वारा प्राप्त सीआर 1 लम्बाई पॉलिमॉर्फिज्म फिन्योटाइपिंग के अनुसार वक्र प्रोफाइल के अलग-अलग समूहों को दिखाते हैं। "सामान्य और बदली पिघलती घटता" चरण से, हमारी पद्धति यह संभवत: भेदभाव करना संभव बनाती हैरंग के द्वारा समूहीकृत सीआर 1 के आइसोफ्रों के अनुरूप curves के विशिष्ट समूहों। हालांकि, "सामान्यीकृत और अस्थायी शिफ्ट फर्क प्लॉट," जो एक अलग गणितीय प्रस्तुति से मेल खाती है, वक्र के अलग-अलग समूहों के आसान दृश्य के लिए अनुमति देता है। यद्यपि निर्माता के सॉफ़्टवेयर को इस अध्ययन में नियमित रूप से इस्तेमाल किया गया था, अन्य सॉफ्टवेयर (जैसे कि यूनालीज़) का उपयोग वक्र विश्लेषण के लिए डेटा निष्कर्षण कार्यक्रम के रूप में किया जा सकता है।

तिथि करने के लिए, डब्ल्यूबी विश्लेषण तकनीक मूल तकनीक है जो प्रोटीन के स्तर पर अलग सीआर 1 लम्बाई बहुरूपता की पहचान को सक्षम करती है। हालांकि, इस तकनीक में कई नुकसान हैं विशेष रूप से, डब्ल्यूबी द्वारा प्रोटीन विश्लेषण सेल झिल्ली के निकालने के बाद ही किया जा सकता है। नतीजतन, यह जटिल और बहुत समय लेने वाली है। इसके अलावा, इस तकनीक को उपयोगी संसाधनों को प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया की शुरुआत में उचित परिस्थितियों में एक नया रक्त नमूना प्राप्त करने की आवश्यकता हैults। इसके विपरीत, एचआरएम-पीसीआर डीएनए पर प्रदर्शन लंबे समय तक भंडारण के बाद भी शुष्क रक्त स्पॉट या नमूने का उपयोग करना संभव बनाता है। एचएमआर-पीसीआर को एक विशेष डीएनए पिघला हुआ उपकरण, या तो एक समर्पित उपकरण या एचआरआर सॉफ्टवेयर के साथ एक एचएमआर-क्षमता थर्मासायक्लर की आवश्यकता है। एसएनपी का पता लगाने के कई कारकों पर निर्भर है: i) बड़े पीसीआर टुकड़ों में शामिल एसएनपी छोटे पीसीआर के टुकड़ों में एक ही एसएनपी की तुलना में अधिक मुश्किल है; Ii) वर्ग III और IV के एसएनपी कक्षाएं I और II 34 की तुलना में अधिक मुश्किलें हैं; और iii) एचएनआर प्लेटफॉर्म के रिज़ॉल्यूशन पावर की परवाह किए बिना, एसएनपी जो निकटतम पड़ोसी आधार समरूपता ( जैसे, 5'-जी (जी / सी) सी -3 ') से घिरा हुआ है , को पिघलने से हल नहीं किया जा सकता। यह परख की वैधता का आकलन करने के लिए यूएमईएलटी सॉफ्टवेयर 35 के साथ रुचि के एसएनपी युक्त भविष्यवाणी पीसीआर टुकड़े का परीक्षण करने के लिए उपयोगी हो सकता है। अंत में, एचएमआर-पीसीआर एक एनालॉगिक विधि है, जिसका अर्थ है कि पिघलने वाले घटता शर्त की समानताएक संदर्भ और एक टेम्पलेट का इस्तेमाल करना जरूरी नहीं है कि टेम्पलेट अनुक्रम संदर्भ के समान है, क्योंकि टेम्पलेट अनुक्रम संदर्भ से भिन्न हो सकता है लेकिन थर्मोडायनामिक रूप से समतुल्य है। हालांकि, ये सीमाएं यहां वर्णित विधि पर लागू नहीं होतीं, जो 5 न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों के मामले में भिन्नता वाले एम्प्लिकॉन के मिश्रण के आधार पर आधारित होती हैं।

इसके अलावा, एचआरएम के विश्लेषण के आधार पर यहां वर्णित तकनीक के कई फायदे हैं। सबसे पहले, सीआर 1 की लंबाई बहुरूपता अधिक तेजी से निर्धारित होती है, क्योंकि परिणाम आनुवंशिक पदार्थों की निकासी के निष्पादन के बाद लगभग 2 घंटे में प्राप्त होते हैं। इसके विपरीत, डब्लूबी प्रोटीन विश्लेषण पर आधारित परंपरागत जैवसायनिक तकनीकों को अपेक्षाकृत लंबा कदम उठाने की आवश्यकता होती है: एक एरीलामाइड जेल के माध्यम से कोशिका झिल्लियों के वैद्युतकणसंचलन को निकालता है, प्रोटीन को नाइट्रोकेलुलोज़ या पॉलीविनालिडीन फ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली में स्थानांतरित करने के लिए एक कदम है, और इसकी पहचान करने के लिए एक कदम का आइसफॉर्म्सइम्यूनोकेमिल्युमिनेसिसेंस द्वारा सीआर 1 अणु। दूसरा, मानव संसाधन विकास मंत्री-पीसीआर तकनीक में भी बहुत महंगा नहीं होने का लाभ होता है, जो विशेष रूप से बहुत से लोगों ( यानी बड़े पैमाने पर) को लागू करने की संभावना के लिए महत्वपूर्ण है , ताकि अल्जाइमर रोग जैसे विकृतियों के विकास के लिए उनकी संवेदनशीलता को निर्धारित किया जा सके। ल्यूपस, या मलेरिया

हाल ही में, हमने और दूसरों ने दिखाया है कि CR1 * 2 isoform, जिसमें एक अतिरिक्त सी 3 बी / सी 4 बी बाइंडिंग साइट है, एडी 36 , 37 , 38 के साथ जुड़े थे। हमारे पहले प्रकाशित एक अध्ययन में, जीन और प्रोटीन के स्तर पर CR1 लंबाई बहुरूपताओं विषयों 38 की 98.9% में निरंतर चल रहे थे। मानव संसाधन विकास मंत्री (पीसीबी) द्वारा प्राप्त की गई बहुविध पल्मोरफिज़्म की तुलना करते हुए असंतोष के परिणाम (एचआरएम) (जीन) द्वारा निर्धारित एक (सीआर 1 * 1, सीआर 1 * 2) जीनोटाइप प्रोफाइल के साथ विषयों के अनुरूप थे, लेकिन पूर्वडब्ल्यूबी (प्रोटीन) के अनुसार एरिथ्रोसाइट की सतह पर केवल सीआर 1 * 1 आइसफोर्म दबाकर। हमारे अध्ययन में, सीआर 1 * 2 की कमी है, आफ़ॉर्म अभिव्यक्ति (एक मूक एलील को असर वाले व्यक्ति) प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य थे जब डब्लयूबी को लंबे समय तक एक्सपोज़र समय के साथ पेश किया गया था और इसे बताए गए मूक सीआर 1 एलील (सीआर 1 * 2) के अस्तित्व के आधार पर समझाया जा सकता है। हेलससन 39 द्वारा साहित्य में फिर भी, इस अवधारणा को समर्थन देने के लिए बड़े जनसंख्या पर आगे के अध्ययन की आवश्यकता है

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि निजी एसएनपी (एसएनपी केवल एक छोटे से परिवार समूह में या एक व्यक्ति में भी हो) अलग वक्र प्रोफाइल को जन्म दिया जाना चाहिए, जो सन्दर्भ फ़न्योटोप निर्धारण (डब्लूबी) का उपयोग कर पढ़ा जाना चाहिए, लेकिन इसे कैनोनिकल प्रोफाइल से भ्रमित नहीं किया जा सकता सीआर 1 लंबाई बहुरूपता जीनोटाइप का कोई गलत अर्थ है

Disclosures

लेखकों को विश्वविद्यालय के रीमिस शैम्पेन-आर्डेन (यूआरसीए) के पेटेंट के आविष्कारक हैं (पेटेंट संख्या डब्ल्यूओ 2015166194)

Acknowledgments

हम प्लेटोफॉर्मो रेजिओनेल डी बायोलॉजी इनोवांटे के सभी सदस्यों, इम्यूनोलॉजी विभाग के कर्मचारी, और आंतरिक चिकित्सा और जराचिकित्सा विभाग के कर्मचारियों के लिए धन्यवाद करते हैं, जिन्होंने प्रोटोकॉल अनुकूलित करने और मान्य करने में योगदान दिया। इस काम को रिम्स यूनिवर्सिटी अस्पताल (अनुदान संख्या एओएल 11 यूएफ 9 156) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। संपादकीय सहायता के लिए हम फियोना इक्र्नॉट (ईए 3 9 20, यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल बेसनकॉन, फ्रांस) का भी धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab coat protection
SensiCareIce powder-free Nitrile Exam gloves Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA 486802 sample protection
Eppendorf Reference 2 pipette, 0,5-10µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000024 sample pipetting
Eppendorf Reference 2 pipette, 20-100µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000059 sample pipetting
Eppendorf Reference 2 pipette, 100-1000µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000083 sample pipetting
TipOne 10µL Graduated, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1121-3810 sample pipetting
TipOne 1-100µL bevelled, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1120-1840 sample pipetting
ART 1000E Barrier Tip Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 2079E sample pipetting
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030120086 mix
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA SI-0236 mix
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 51306 DNA Extraction
Buffer AL Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 19075 Lysis buffer
QIAamp Mini Spin Column Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 1011706 DNA binding
Buffer AW1 Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 19081 Wash buffer
Buffer AW2 Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France 19072 Wash buffer
Biowave DNA spectrophotometer Biochrom Ltd, Cambridge CB4 OFJ, England 80-3004-70 DNA concentration 
Mikro 200 centrifuge Hettich Zentrifugen, D-78532, Germany 0002020-02-00 centrifugation
Multipette E3 Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4987000010 distribution
Light Cycler 480 multiwell plate 96, white Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 04729692001 reaction place
Light Cycler 480 sealing foil Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 04429757001 coverage
Heraeus Megafuge 11R centrifuge Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 75004412 centrifugation
LightCycler 480 Instrument II, 96-well Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 05015278001 high resolution melting polymerase chain reaction
LightCycler 480 High Resolution Melting Master Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany 04909631001 reaction reagents
light cycler 480 SW 1.5.1 software Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany software used for HRM PCR CR1 polymorphism data analysis
CN3 primer: 5'ggccttagacttctcctgc 3' Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium reaction reagent
CN3re primer: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3' Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium reaction reagent

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References

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आनुवंशिकी अंक 125 सीआर 1 सीडी35 पूरक सी 3 बी / सी 4 बी रिसेप्टर सीआर 1 लम्बा बहुरूपता पूरक अल्जाइमर रोग आणविक जीव विज्ञान न्यूरोसाइंसेस सिस्टमिक ल्यूपस इरिथेमेटोस आनुवंशिक जोखिम
कम्प्लीमेंट रीसेप्टर के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन पिघलती पीसीआर 1 लम्बाई पोलीमॉर्फिजिस जीनोटाइपिंग: अल्जाइमर रोग जीन संवेदनशीलता आकलन के लिए एक अभिनव उपकरण
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Kisserli, A., Tabary, T., Cohen, J.… More

Kisserli, A., Tabary, T., Cohen, J. H. M., Duret, V., Mahmoudi, R. High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment. J. Vis. Exp. (125), e56012, doi:10.3791/56012 (2017).

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