Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

באמצעות שבב חוש הריח של Microfluidic מותאם עבור ההדמיה של פעילות. עצבית בתגובה פרומונים בנוירונים הראש הגברי C. Elegans

Published: September 7, 2017 doi: 10.3791/56026
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

Summary

השימוש מותאם "צ'יפ חוש הריח" עבור ההדמיה סידן יעיל של C. elegans זכרים מתואר כאן. מחקרים של חשיפה זכר גליצרול פרומון מוצגים גם.

Abstract

השימוש של סידן אינדיקטורים התעלתה ההבנה שלנו של דינמיקה עצבית ורגולציה. תולעים נימיות Caenorhabditis elegans, עם מערכת העצבים לחלוטין ממופה, אנטומיה שקוף, מציג מודל אידיאלי להבנת הדינמיקה עצבית בזמן אמת באמצעות מחווני סידן. בשילוב עם טכנולוגיות microfluidic עיצובים ניסיוניים, מחקרים סידן-הדמיה באמצעות אינדיקטורים אלה מבוצעות בבעלי חיים חינם-המעבר והן לכוד. עם זאת, רוב המחקרים הקודמים ניצול התקני לכידה, כגון השבב חוש הריח המתוארים Chronis. et al., יש התקנים שנועדו לשימוש ההרמפרודיט נפוץ יותר, כמו הזכר פחות נפוץ הוא שניהם מורפולוגית, מבחינה מבנית שונה. שבב חוש הריח מותאם היה מתוכנן, מפוברק ליעילות מוגברת בתחום ההדמיה עצביים זכר עם באמצעות בעלי חיים למבוגרים צעירים. פנייה סופחה התולעת בטעינת לנמל כדי לסובב את החיות, כדי לאפשר את ההפרדה של הנוירונים בודדים בתוך זוג הדו-צדדיים בתחום ההדמיה 2D. תולעים נחשפים זרימה מבוקרת של odorant בתוך המכשיר microfluidic, כמתואר במחקרים קודמים דו-מיניים. תופעות מעבר סידן ואז ניתוח שימוש בתוכנת קוד פתוח ImageJ. ההליך המתואר במסמך זה אמור לאפשר עבור כמות מוגברת של מבוססי זכר C. elegans סידן הדמיה מחקרים, העמקת ההבנה שלנו על מנגנוני איתות עצביים מין ספציפי.

Introduction

Microfluidic התקני מספקים גישה מוגברת דווקא בסביבות מבוקרות, שבו חיות, כגון תולעים נימיות C. elegans, יכול להיות מרומה השפעול1. מחקרים אלה כוללים מבחני התנהגות, מחקרי הדמיה סידן או הקרנות אפילו על הפנוטיפים ספציפיים, וכתוצאה מכך מדידות מדויקות יותר של תוצאות ניסוי1,2,3,4, 5,6. מיקרופלואידיקה לספק תנאים נוזלי בקנה מידה קטן שדרכו ניסויים מפורטים ניתן להפעיל תוך ניצול כמויות מינימליות של נוגדנים. יש הפקה מתמדת של עיצובים חדשים של המכשיר microfluidic, השימוש של כל משתנה, החל ארנאס המאפשרים טבעי sinusoidal התנועה של C. elegans מבחני התנהגות ולימודים הדמיה עצבית, מלכודת התקנים המשמשים הדמיה עצבית ולימודים חוש הריח, התקנים המאפשרים עבור תפוקה גבוהה פנוטיפי ניתוח גנטי מסכי4,5,6,7. בעקבות ייצור של תבנית בסיס, microfluidic מכשירים זולים לבנות — נתן את שימושית של המאסטר — וקל לשימוש, ומאפשר לדור נתונים מהירה באמצעות מחקרים תפוקה גבוהה. הזיוף של התקנים באמצעות פולימרים כגון polydimethylsiloxane (PDMS) מאפשר היצירה של מכשירים חדשים בתוך שעות.

מחקרי הדמיה סידן להשתמש סידן מקודדים גנטית אינדיקטורים (GECIs) המתבטא התאים היעד כדי למדוד את הדינמיקה עצבית של תאים אלה בזמן אמת8,9,10,11. הטבע שקוף של C. elegans מאפשר ההקלטה של פלורסנט רמות החלבונים האלה בבעלי חיים. באופן מסורתי, GECIs להסתמך על חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-מבוסס חיישן ה-GFP-קלמודולין-M13 פפטיד (GCaMP), אך מחקרים מאוחרים יותר הסתגלו חיישנים אלה כדי לאפשר יותר יחס אות לרעש ופרופילים עירור אדום-העביר. בעקבות הפיתוח של GCaMP3, חלבונים עם מפרטים אלה יש מגוונים, כולל חיישנים כגון GCaMP6s ו- GCaMP6f (לאט ומהר פלורסצנטיות חופש-המחירים, בהתאמה), כמו גם RFP-קלמודולין-M13 פפטיד (RCaMP), אשר יש אדום-העביר הפעלת פרופיל. השילוב של אלה GECIs עם C. elegans גנים ספציפיים תא יזם רצפי ניתן לייעד תאים עניין, במיוחד החישה הניריונים12,13,14,15 , 16.

בעוד קלות השימוש C. elegans במחקרים microfluidic הוא לכאורה, כמעט כל המחקרים התמקדו אנדרוגינוסים. למרות זכרים בלבד החשבונאי 0.01-0.02% מהאוכלוסייה פראי סוג, ממצאים שלא יסולא בפז יכול לנבוע האפיון שלהם. ואילו connectome הפיזי של מערכת העצבים אנדרוגינוס מופה באופן מלא במשך עשרות שנים17, connectome זכר נשאר שלם, במיוחד באזור הראש של בעלי חיים18. השימוש של סידן הדמיה של הזכרים יסייע ליצירת הבנה של מערכת העצבים זכר וההבדלים שעולות בין שני המינים. גודל קטן יותר מהזכרים הבוגרים C. elegans מונעת השמנה יעיל ואמין בנמלי טעינת התקנים חוש הריח מסורתי המיועד אנדרוגינוסים גדול יותר. כדי לטפל בבעיה זו, יש את הגירסה שבב חוש הריח Chronis19 פותחה עם יציאת הטעינה צר יותר, ערוץ בגובה נמוך, והופך בנמל הטעינה תולעת (אשר לסובב את החיה), המאפשר החזיית הדו-צדדיים שמאלה/ימינה זוגות עצביים. עיצוב זה מאפשר: (1) השמנה יעיל של זכרים בוגרים צעירים, (2) כיוון יותר אמין של החיה עבור הפריט החזותי של שני בני נוירונים לזווג דו צדדיים, (3) הדמיה מדויקת של פעילות עצבית בנוירונים זכר.

יותר ויותר מחקרים מראים כי גברים C. elegans להגיב באופן שונה מאשר אנדרוגינוסים למגוון רחב של ascarosides (ascr), או תולעים נימיות פרומונים20,21,22,23 ,24. לכן, לפתח הבנה של דינמיקה עצבית, ייצוגים בתוך connectome זכר הפך אפילו יותר רלוונטי. זכר C. elegans מכיל נוירונים ספציפיים סקס 87 לא נוכח אנדרוגינוס25,26, לשנות את connectome כדרכים שטרם נקבע. היכולת תמונה הדינמיקות האלה עצביות ייחודיות יאפשר לנו להבין טוב יותר את תגובות ספציפיות סקס וייצוגי עצבית.

פרוטוקול זה מתאר את השימוש שבב חוש הריח זכר הותאם עבור ההדמיה עצבית של זכר C. elegans chemosensation. הנוירון nociceptive שאש מגיב בצורה אמינה גליצרול 1 מ' אצל הזכרים, בקנה אחד עם הקודם אנדרוגיניות מחקרים27. חשיפה ascarosides עשוי להפיק תגובות כי הם משתנה חיה כדי חיה, הדורשות מספר גדול יותר של בעלי חיים כדי להיבדק. התגובה של הנוירונים צ'ם זכר הספציפי שהוצג בעבר, דרך אלקטרופיזיולוגיה וגם סידן הדמיה מחקרים, להגיב variably ascaroside #323.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור המכשיר

הערה: ראה הפניה 1.

הערה: תבניות בסיס סיליקון זוייפו. שימוש בטכניקות photolithographic רגיל עבור תכנים SU-8 photoresist על בסיס 1 , סיליקון 7. Photomasks עבור המתבנת וופל הודפסו ב 25,000 dpi. התכונות המכשיר הותאם זכר שבב חוש הריח Chronis עיצוב 19 עם שינוי התולעת בטעינת לנמל, בהתאמת עיצוב המתקבל מ צימר (מכתבים אישיים, 2016). פנייה נכלל כדי לקבוע את זווית הסיבוב של בעלי החיים. הרוחב של התולעת בטעינת ערוץ היציאה הוא הצטמצם ל 50 μm. כל הערוצים הם בגובה 32 μm. לאחר תבנית בסיס סיליקון לרשות המשתמש, המשתמש יכול לבצע עוקבות פרוטוקול, כפי שתואר לעיל 1.

  1. PDMS תערובת הבסיס, ריפוי סוכן ביחס של 10:1 לפי משקל.
  2. לערבב ביסודיות עם העברת פיפטות.
  3. דגה את התערובת ב desiccator ואקום לשעה עד כל הבועות גלוי יוסרו.
  4. יוצקים את התערובת על תבנית סיליקון מאסטר צלחת בקוטר 150 מ מ עד 5 מ מ עבה (100 גרם). השתמש פיפטה פסטר כדי להסיר את כל הבועות או אבק הוכנסו לתערובת.
  5. אופים ב- 65 מעלות צלזיוס לפחות 3 שעות או לילה.
  6. לחתוך את PDMS מן כייר באמצעות אזמל. ולחתוך את התקנים נפרדים בנפרד באמצעות סכין גילוח.
  7. חורים כניסת ולשקע עם אגרוף עורי 1 מ מ.
  8. לרוקן את החורים עם dH 2 O, אתנול, ואני שוב ב- dH 2 O כדי להסיר חלקיקים העקיצות. לייבש את המכשיר בדופק זרם האוויר.
  9. נקי ערוץ הצדדים והן את הצד העליון של המכשיר עם דבק, הסרת אבק או פסולת הנותרת על המכשיר כדי לאפשר מליטה מוצלח.
  10. פלזמה-בונד המכשיר, ערוץ-בצד למטה, לכוס שער מס ' 1-
    1. וחושפים כיסוי זכוכית, התקן (ערוץ מקצה לקצה) כדי פלזמה אוויר באמצעות תנאים המאפשרים התקשרות נכונה, כגון 100 W עבור 30 s או 24 W עבור 60 ס
      הערה: ניתן לכוונן הגדרות כדי לשפר את היעילות מליטה. פלזמה-מליטה התנאים לא קריטי כמו ניקוי נאות כאשר מנסים לשפר את יעילות מליטה. מכשיר נקי דיו לא יתבסס, אפילו בתנאים אידיאליים פלזמה.
    2. היפוך הזכוכית המכסה לצד ערוץ של ההתקן, לחץ למטה על האגודל עבור 5 ס

2. מאגר הכנה

  1. Dilute 1 x S התאים הבזליים (100 מ מ NaCl ו- 0.05 M KPO 4, pH 6.0) של מניה x 10 סטרילי.
  2. לדלל 1 מ' מניות tetramisole ריכוז סופי של 1 מ מ ב 1 x S בזאלי עבור כל מאגר פתרונות.
  3. להוסיף שתי fluorescein " בקרת זרימה ", " מאגר " מאגרי.
    1. ליצור מלאי 100-מ"ג/מ"ל של fluorescein 1 x S הבזליים.
    2. לדלל את המניה ריכוזי הסופי של µg/mL 1 בבקרת הזרימה, 0.1 µg/mL במאגר.
  4. ליצור הגירויים.
    1. גליצרול שתדללו כדי ריכוז סופי של 1 מ' 1 X S הבזליים.
    2. Ascaroside שתדללו #3 (ascr #3) כדי ריכוז סופי של מיקרומטר 1 1 X S הבזליים.

3. התקנת מכשיר

הערה: ראו 1.

Figure 1
איור 1. הגדרת התקן Microfluidic. (א) מאגרי מים, אבובים. 30 מ ל מזרק ללא בוכנה משמש " אשמורת. " זה מצורף שסתום זכוכית עם שלוש אפשרויות זרימה. שקע אחד מחובר מזרק 3 מ עם פומפה, בעוד השני מחובר מחט (כתום) המוחדר לאורך צינור שמחבר ההתקן microfluidic. כיוונון (B) הכולל microfluidic הדמיה הניסוי. המכשיר מושם על שלב של מיקרוסקופ epifluorescence הפוכה, מעל העדשות אובייקטיבי. " בקרת זרימה " מאגר נוסע דרך שסתום 3-דרך אשר נשלטת על ידי יחידת על המדף מעל ההתקנה. שורות המכילות מאגרי מוכנסים ואז יציאות ההתקן המתאים. (ג) היציאות של המכשיר microfluidic. " בקרת זרימה " יציאות לאגף את היציאות כניסת אחרים: " גירוי ", " מאגר " יציאות. " שקע " פורט הוא הנמל הימני ביותר. בשל המיקום של הזירה הטעינה תולעת, " תולעת טעינת " פורט הוא הנמל המרכזי ביותר על המכשיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. הכן שלושת מאגרי נוזלים על ידי הצמדת מזרק 30 או 60 מ ל 3-דרך שסתום סכינים סטריליים, עם מזרק 3 מ"ל ואת המחט מחוברת לשסתום סכינים סטריליים גם כן (כמו איור 1 א'). להתחבר המחט אבובים המשתרע על המכשיר microfluidic (כמו איור 1A -B).
  2. להסיר את בועות האוויר מן המאגר אבובים.
  3. למלא את המזרק 3 מ עם אבובים המצורפת עם 1 x S בזאלי והוספתו לתוך השקע עם מסמרים
  4. בעדינות אל תפעילו לחץ על המזרק עד המאגר יופיע בחלק העליון של החורים כניסת.
  5. להתחבר בקרת זרימה, מאגר, אבובים הגירוי המתאים כניסת חורים (כמו איור 1B -C), המבטיח טיפות נוזל נמצאים שני הנמל טעינה חור ואת הצנרת מאגר להיקשר.
  6. שוב, בעדינות אל תפעילו לחץ על המזרק מחובר ליציאת ה-outlet עד טיפות מופיעים התולעת טעינת כניסת יציאת.
  7. להוסיף סיכה מוצק חסימה לתוך התולעת טעינה עם מסמרים
  8. להסיר את המזרק מיציאת ה-outlet ולצרף קו שקע מחובר אבק הבית (-670 טנדר של גוה של).
  9. בדוק המכשיר עבור בועות בזרם ערוצי, מבחינה ויזואלית, באמצעות אישור וידאו דרך תוכנה תואמת המצלמה בשימוש, כגון תוכנת קוד פתוח מיקרו-מאנגר. ראה שלב 6 לקבלת עצות אודות השימוש מיקרו-מנהל.
    1. אם כל הבועות קיימות, לחכות להם או להיספג לתוך PDMS קיר לפני טעינת כל חיות; הנוכחות של בועות יפריע את הזרימה הנכונה של נוזלים דרך המכשיר.
  10. באמצעות מסנן ה-GFP, לאשר זרימה נאותה הדינמיקה בתוך המכשיר לפני תולעת טעינה על-ידי הגורמים השסתום 3-דרך התבוננות את המעבר של מאגרי.
    1. לקבוע הדינמיקה זרימה נאותה: לבחון את fluorescein נוכח זרימת בקרה, מאגר הפתרונות ( איור דו-ממדי -2E) שינוי כאשר הערך בקרת זרימה משתנה על ידי לחיצה על הפקד הלחצן המתאים השסתום אסידו על הקישור שסתום ( איור 1B).
    2. לאחר פתיחת מיקרו-מנהל, לחץ על " Live " להתבונן תמונה חיה של המכשיר. הפעל את מקור האור פלואורסצנט לצפות את הזרימה של מאגרי במכשיר ( איור דו-ממדי -2E).

Figure 2
איור 2: זכר-הותאם microfluidic חוש הריח שבב. (א) זרימת דפוסים של המכשיר כאשר התולעת נחשף למאגר. מאגר (B) מוצג בראון, בקרת זרימה (FC) מוצג צהוב, עם גירוי (S) בלבן. התולעת בטעינת לנמל הותאם לכלול העקומה, המאפשר שליטה טובה יותר של תולעת התמצאות. תבניות (ב') הזרימה של המכשיר כאשר התולעת חשוף לגירוי. מאגר (B) מוצג בראון, בקרת זרימה (FC) מוצג צהוב, עם גירוי (S) בלבן. (ג) מדידות של המכשיר מותאם כמו מפוברק. התולעת טעינת נמל מסתיים מיקרומטר 42 פתיחה, עם ערוץ 50 מיקרומטר תוכנן עבור רוחב זכר. הגובה נמדד של הערוצים הוא 32 מיקרומטר, למרות יעד של 25 מיקרומטר בעיצוב. (D-E) A לכוד זכר p לביטוי ההזמנות-6:: GCaMP3. יזם ההזמנות-6 הוא לא ספציפי אפר, ביטוי מסוימים עלולים להיות שנצפו בתוך הנוירון אסי, למרות אין תופעות מעבר הסידן נצפתה אסי. התמונה היא (D) שילוב של תאורה בהירים-שדה, פלורסנט, בעוד (E) הוא פלורסנט בלבד. פסי סולם מציינות 42 מיקרומטר. (F) לאש נוירון מגיב 1 מ' גליצרול גירוי עם פעילות עצבית חזקה. האזור הכחול מסמל את הזמן של הגירוי גליצרול 1 מ'. אזור מוצל מציין השגיאה הסטנדרטית, עם n = 20 פולסים של שבע תולעים. עקבות אדומות מציינות תגובות depolarizing. Y-axes הצג ΔF/F 0. סרגל קנה מידה מציין 5 ס אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

4. הכנת החיה

הערה: ראה הפניה 23.

  1. אש הדמיה התגובות 1 מ' גליצרול.
    1. מקום כ 20 C. elegans זכרים הם חיוביים עבור p ההזמנות-6:: GCaMP3 ביטוי מערך על צלחת אגר צמיחה נמטודות (NGM) בינוני נזרע עם מדשאה של OP50 e. coli. להשתמש את הביטוי של פלורסנט GECI ו/או שותף הזרקת סמן לצורך זיהוי חיובי מערך חיות.
      הערה: בעלי חיים חיובית מערך לזרוח על פי GECI פעם (קרי, חיות לבטא GCaMP לזרוח ירוק תחת גירוי אור כחול, בעוד RCaMP חיות לזרוח אדום תחת גירוי אור ירוק). סמני הזרקת משותף שיכול לנוע בין חלבונים פלורסנט אחרים, כגון ה-GFP, RFP, סמנים פנוטיפי, כגון rol-6, או יכול להציל פנוטיפ דומיננטי, כמו מוטציה פא-1 28.
      1. אם בוחר מייד לפני וזמינותו, פיק זכרים בוגרים צעירים. אם בוחרים ביום שלפני וזמינותו, לאסוף זכרים זחל L4.
  2. הדמיה צ'ם התגובות 1 מיקרומטר ascr #3-
    1. פיק כ-20 L4 C. elegans זכרים (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; פא-1 (e2123ts); לו-5 (e1490); לייט-1 (ce314)) כי הם חיוביים dsRed שיתוף הזרקת סמן ביטוי.
      הערה: הביטוי dsRed בתוך הנוירונים ריי של הסיפור הגברי הוא קל יותר להתבונן, לאשר מאשר GCaMP ביטוי בתוך הנוירונים צ'ם ארבע.
    2. לבודד אלה גברים הרמפרודיטים על צלחת אגר NGM נזרע עם מדשאה של OP50 e. coli עבור h 5-14 לפני ביצוע הניסוי הדמיה-
      הערה: זכרים לא מבודדים למשך תקופה מינימלית של 5 שעות אינם מגיבים בהתנהגותו ascr #3, ולכן ייתכן שיישומים אפילו פחות שנחשולי סידן כדי ascaroside ממה שרואים כאן.

5. טעינת בעלי חיים

הערה: ראו refefence 1-

  1. לבחור תולעת אחת על גבי צלחת אגר NGM unseeded בטכניקות תחזוקה תולעת רגיל.
    1. פיק תולעים על ידי שלהוב מעדר (עשוי תיל פלטינה שעברו שיטוח), אוסף חיידקים על האיסוף, ו " שמרחתי " תולעת לאסוף אותו. הנח בעדינות את התולעת על צלחת חדשה, ולאפשר לו לזחול מחוץ בכוחות עצמו.
  2. להוסיף כ- 5 מ ל 1 x S בזאלי לבסיס unseeded, כך צלחת מוצף.
  3. לצייר את התולעת לתוך מזרק טעינה (קרי, מזרק 3 מ עם אבובים המצורפת) כי כבר שמולאו מראש עם 1 x S הבזליים.
    1. להיות בטוח למצוץ את התולעת רק אל הצנרת, לא כל הדרך לתוך המזרק.
      הערה: אם התולעת נוסע לתוך המזרק, לא ניתן כמעט להחזיר אותו לתוך הצנרור.
  4. לבטל את שואב האבק לעצור את הרצף על-ידי הפעלת את השסתום סכינים סטריליים outlet-
  5. להסיר את ה-pin מוצק חוסם את התולעת טעינה עם מסמרים
  6. . סובב את השסתום סכינים סטריליים מחובר ליציאת אאוטלט ( איור 1B) כך הוא פולט.
    הערה: השתמש בשידור חי שידור הוידיאו בעת טעינת התולעת כדי לאשר את המיקום והכיוון של החיה (שלבים 5.8-5.13).
  7. הוסף את התולעת טעינת צינור לתוך התולעת טעינה עם מסמרים
  8. בעדינות אל תפעילו לחץ על המזרק עד התולעת מופיע בערוץ הטעינה.
  9. אם התולעת מתחיל להזין את הערוץ הזנב-הראשון, למשוך על הבוכנה מזרק כדי למנוע את התולעת להיכנס לתעלה.
  10. מעבר בין החלת ולבטל את הלחץ עד הראש נכנס הערוץ הראשון-
  11. פתח הואקום על-ידי הפעלת את השסתום סכינים סטריליים אסידו מחובר ליציאת לשקע כדי לפתוח אותו כדי לשאוב במקום אווירה.
  12. ידנית הפעילו לחץ על ידי מדכא הבוכנה מזרק אוריינט ולמקם את הראש תולעת כזה חשוף לערוץ זרימה מאגר, אבל בינתיים לא כי הראש יכול לנוע בחופשיות ( איור 2 D-2E).

6. גירוי ורכישה

  1. באמצעות תוכנה קוד פתוח מיקרוסקופ, כגון מיקרו-המנהל, להקליט על ידי לכידת תמונות כמו ערימה TIFF ב 10 מסגרות לשנייה באמצעות אור כחול עירור (470 ננומטר) ב-30 ס
  2. להגדיר את החשיפה בתפריט הראשי כדי גב' 100
    1. פתח " Acq רב D. " מהתפריט הראשי של התוכנה. להגדיר " מספר " כדי " 300, " ו " מרווח הזמן " כדי " 0. " לחץ על " ידרשו! " לרכוש את הוידאו.
  3. החל דופק s 10 של ה s גירוי 5 לאחר הרכישה. התאמת משך stimulus ביישום כרצונכם.
    1. לאחר שרכשה 5 s של וידאו, לשנות את השסתום 3-דרך שליטה המאגר בקרת זרימה כדי להחיל את הגירוי על החיה הנבדקת. לחץ על הלחצן השמאלי ביותר על הקישור שסתום ( איור 1B).
    2. S 10 לאחר החשיפה לגירוי (הפעם ניתן לכוונן לפי הצורך על-ידי המשתמש), לשנות את הזרימה של מאגרי בלחיצה על הלחצן השמאלי ביותר שוב על הקישור שסתום.
  4. רשומה תחת מאגר רק עד החלון 30-s הושלמה כדי לאפשר את זריחה GECI לשוב בסיסית.
  5. חוזר כרצונכם. חכה 30 s בין הקצה של רכישת אתחול של מהמבחן הבא.

7. ניתוח תמונה

  1. פתח הערימה TIFF עם התוכנה פתוח, ImageJ, על-ידי גרירת קובץ לתוך חלון ImageJ.
  2. לחץ באמצעות הסמן וגרור כדי להגדיר את האזור עניין (ROI) סביב נוירון עניין. הגדר את האזור כדי לכלול את soma של נוירון עניין (כמו באיור 3 א).
  3. מגרש z-הערימה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית רועי על פני ערימות על-ידי לחיצה על פתח-> תמונה - > ערימות - > עלילה פרופיל ציר z.
  4. לחץ " רשימת " בחלון שנפתח. לחץ על עריכה - > העתק כדי להעתיק את הערכים. להדביק את הערכים לתוכנית של גליון נתונים.
  5. לנתח את פלורסצנטיות רקע לכל פעימה על-ידי גרירת רועי לאזור של התולעת שאינו מכיל ביטוי GCaMP.
  6. לבצע רקע חיסור לכל פעימה על-ידי חיסור הערך פלורסצנטיות רקע מהערך עוצמת קרינה פלואורסצנטית נוירון.
  7. לחשב ΔF/F 0 עבור כל מסגרת של הדופק לכל.
    1. F לחשב את 0 כערך בעוצמה ממוצעת של רועי 1 הראשון s של רכישה (למשל, מסגרות 1-10).
    2. לחשב ΔF/F 0 על-ידי חלוקת הערך המופחת-רקע מסגרת של עניין על-ידי הערך המחושב של 0 F.
  8. חזור על כל נוירון עם תמונה ודופק כל גירוי.
  9. נוירונים עם פרופילים תגובה עקבית, כגון אש, ממוצע כל פולסים עבור כל נוירון, לחשב את ה-SEM (כמו דמות 2F).
  10. להתוות את הממוצע ΔF/F 0 עם SEM לאורך זמן עבור כל נוירון.
    הערה: במקרה זה, מקובל לכלול heatmaps את התגובות עצביים בודדים בכל ניסוי גם כן. בנוירונים שמראות לא עקבי לשינויים שנחשולי סידן עם חשיפה לגירויים מעבר stimulations חוזרות, או אנשים שונים 23, ייתכן יותר החלות על הצג עקבות הדופק בודדים (כמו ב איור 4). ראו דיון לפרטים לקבוע כיצד להציג את הנתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתן לראות דוגמה של הגדרת התקן הכוללת איור 1A-B. איור 1A , מתאר את בניית מאגר תקין וההתקנה. איור 1B מציגה את החיבורים של המאגרים למכשיר microfluidic. איור 1C מתאר התקן microfluidic עם יציאות בודדות המסומנות על בהירות.

העיצוב של המכשיר הותאם זכר microfluidic מכיל עיקול בנמל הטעינה, אך זרימת dynamics זהים על המכשיר עוצב על ידי Chronis et al.19(2A באיורג-2). הזרימה של מאגרי יכול להיות נשלט על ידי שינוי איזה שסתום בקרת זרימה פתוחה (איור 2 א-2B). המידות של המכשיר כפי מפוברק להשתנות מן הקובץ מעוצב. המדידות הניתנים איור 2C הן מדידות "מפוברק בשם".

לאחר טעינת זכר C. elegans לתוך המכשיר הותאם זכר חוש הריח, שלהם השמה התמצאות, וכן ערוץ הזרימה dynamics, ונוכל לאמת דרך שדה בהיר והדמיה פלורסנט (איור דו-ממדי-2E). החשיפה של תולעים ביטוי GCaMP3 הנוירון nociceptive, אש, עד 1 מ' גליצרול תוצאות השינויים גלויים בזריחה בתוך הנוירון אפר, מעידה על פעילות עצבית (2F איור). שינויים עדינים של קרינה פלואורסצנטית יהיה בלתי נראה לפי העין, אבל ניתן להשתמש בתוכנה כדי לכמת את השינויים האלה. התוכנה ImageJ חינם יכול לשמש כדי לנתח ולכמת את עוצמת אש נוירונים בתגובה לחשיפה 1 מ' גליצרול פלורסנט לאורך זמן (2F איור). . זה דומה תצפית אנדרוגינוסים27 ו, בשל החוסן של התגובה העצבית אפר גליצרול, זה הוא ציין בבעלי כל נבדק.

כמות קטנה של תנועה צירית או המסתובבת צפוי ב unparalyzed בעלי חיים, לעתים קרובות המחייב באלגוריתם נוירון-מעקב במהלך ניתוח וידאו (איור 3 א). התוספת של המשותקים במאגרי (למשל, tetramisole 1 מ מ) כמעט מבטלת את האפקט הזה, למרות כמה חיות (~ 10%) עדיין זז במהלך משפטי. זה יכול להיות מצויין: (א) באמצעות. זכרים בוגרים, אשר לכודים ביעילות רבה יותר; (ב) להקטין את רוחב או עובי של התולעת טעינת יציאה עוד יותר; או (ג) גם להגדיל את הריכוז את האיש המשותק בשימוש או שימוש אחר המשותק. פעולה זו גם תבטיח כי אין יותר מדי הראש מסופו של המלכודת וחשוף לערוץ ריח. אם משפט עם תולעת התנועה מתרחשת, האזור של ניתוח יכול להיות עבר וקרא מהמיקום עצביים חדשים, החל מ- המסגרת לאחר מכן התנועה מתרחשת (איור 3B). שחזור ידני של עקבות עצביות על-ידי המשתמש נדרש במקרה זה. קבצי script זה לנתח את השינויים פלורסנט בתוך הנוירון ופעל זה המרכז של הנוירון כפי שהוא נע יכולה להיכתב גם19.

זכר C. elegans חש אטרקטיבי פרומונים אימונופרוביוטיים שנקרא ascarosides באמצעות ארבעה מין ספציפי צ'ם נוירונים23... כאשר הסידן שנחשולי שנצפו אצל זכרים, התגובות הם משתנה בתוך הצורה, סימן, ובהיקף בין הנוירונים והן חיות (איור 4A-B). עם זאת, זכר בתגובה פרומונים לא אמינה כמו נצפית כמו סידן שנחשולי בבעלי חיים רבים (איור 4C) זה לא מדכא, כמו רוב ascarosides לא זכה שנחשולי סידן על תחושה13,14,15.

Figure 3
איור 3: תנועה תולעת המיעון במהלך תקופת רכישת התמונה. (א) ΔF/F0 (שינוי בעוצמת פלורסנט מחולק עוצמת פלורסנט רקע הממוצע עבור 1 הראשון s של רכישה) מחושב באמצעות ImageJ על-ידי הגדרת אזור שבו נוירון עניין היה אמין סטטית עבור 1 s. במהלך הגירוי הדופק (אזור כחול), החיה הזיז, כפי שניתן לראות את התמונות לעיל המעקב סידן, וכתוצאה מכך נוירון כבר לא מוחזקים בתוך אזור שנותחה (תיבת צהוב). מציינות הסורגים בקנה מידה 42 מיקרומטר. המופע קווים מקווקווים האזור של המעקב המתאים למיקום של התולעת בתוך כל תמונה. (B) אם האזור של ניתוח מועבר לעקוב הנוירון במהלך המשפט, עקבות בודדים נבנות מחדש להעביר את הדינמיקה עצבית בפועל, הסימן מופיע כאילו החיה לא זז. קווים מקווקווים להראות את האזור של המעקב שתוקן לתנועה תולעת. שאריות אפר נוירונים, שמאל וגם ימין (ASHL (אדום) ו- ASHR (כחול), בהתאמה) מוצגים. Y-axes הצג ΔF/F0. סרגל קנה מידה מציין 5 ס אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: זכר C. elegans צ'ם בתגובה μM 1 ascr #3 הוא משתנה. הנוירונים צ'ם זכר ספציפיים להציג דפוסים ייחודיים בתגובה אימונופרוביוטיים פרומונים. (א) מוצגות התגובות שנצפתה ב כל נוירון צ'ם עבור פעימה אחת חיה תגובה אחת. ישנם ארבעה צ'ם נוירונים: נכון הגבי (CEM ד ר), שמאלה הגבי (CEM DL), הגחון (CEM VR), הגחון לשמאל ולימין (CEM VL). שלושה מתוך ארבעת הנוירונים להגיב עם depolarizations של הצורה ובהיקף בדרגות שונות, הרביעי לא להגיב ascaroside. תוצאה (B) כשליש החיות לכודה (2/7 נבדק במחקר זה) בנוירונים רק שלושה מסוגל לדימות. התגובות של תולעת בכיוון זה הביא תופעות מעבר סידן צ'ם, שהיו שונים מאלה הנהוגות התולעת הראשונה. זה לא היה בגלל השינוי בכיוון של התולעת, כמו ד ר צ'ם גלוי בשני הכיוונים ומוצגים התגובה משתנה בין בעלי חיים. (ג) תולעים רבים אינם להגיב עם כל תופעות מעבר לזיהוי סידן (5/7 נבדק במחקר זה). שרידים בודדים המוצגים הם נציג של החיות יחיד המוצג של תמונות מעל החלקות. אתגודל ברים מציינות 42 מיקרומטר. עקבות: האזור הכחול מציין את זמן החשיפה ascr #3 1 μM. עקבות אדומות מציינות את התגובה depolarizing. עקבות שחור מציינות אין תגובה שנצפו. Y-axes הצג ΔF/F0. סרגל קנה מידה מציין 5 ס אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השבב חוש הריח הותאם זכר משלבת פנייה לתוך נמל טעינה צר יותר, אשר מאפשר שליטה רבה יותר כיוון ועבור לכידה יעילה של זכר C. elegans. דבר זה מאפשר הפריט החזותי של שני ימינה ושמאלה חברי זוגות דו צדדיים עצביים, ללא צורך z-לערום. עקום זה מוביל אוריינטציה מרחק אנכי 100% של הזמן תולעים שבו זוג הדו-צדדיים רק אחד מכוון עם סמן פלורסנט, כגון אפר (איור דו-ממדי-E)29,30. עם זאת, בכיתות עצביים עם ארבעה סימטרי בצורה רדיאלית הנוירונים, כגון צ'ם, כל הנוירונים ארבע גלויים רק שליש מהזמן. שליש אחר של תולעים נבדק יש רק שלושה הנוירונים ארבע גלויות, ובמשך שאר השלישי, ההבדל רק ניתן להבחנה בין הגבי ו הגחון תא הגופים, לא אסימטריה משמאל לימין (נתונים לא מוצג). הנמל צר יותר בשילוב עם גובה הערוץ התחתון כדי למנוע התנודה בתולעת לאורך ציר z. עיצוב זה מאפשר ההדמיה של הזכרים בעתיד מחקרים, אשר, בשילוב עם הידע גדל והולך כל הזמן של25,connectome זכר31, יאפשר הבנה טובה יותר של תפקוד עצבי סקס ספציפיים.

הניתוח מבוצע פרוטוקול זה משתמש התוכנה חינם ImageJ כדי למדוד שינויים בזריחה בנוירון עניין. באמצעות העיצוב הנוכחי, 1 מ tetramisole במאגר ביעילות משתק את התולעים ומונעת תנועת הנוירונים להיות עם תמונה. אם התנועה לא ניתנת למניעה, או אם המשתמש רוצה להימנע משימוש המשותקים, יש סקריפטים מעקב מורכבים יותר לכתוב הנוירונים לעקוב אחר זה כאשר הם עוברים7. עם זאת, בפרוטוקול זה, תולעים זכר להעביר רק כשהם היו קטנים מדי כדי להיות מוגבל ביעילות ליד הנמל טעינה וכאשר הראייתי של גירוי מאוד aversive, כגון גליצרול. גם במקרים אלה, התנועה הוא קצר, לא דורשת כמויות גדולות של מעקב אחר שינויים – הגדרת רועי סביב המיקום החדש של נוירון מקלה על הקריאות פלורסנט שגוי (איור 2).

מגבלה של תולעת יחיד, דימות מבוסס השמנה היא שהתולעת ההיא אחד בלבד יכול לדימות-זמן1. מגבלה נוספת של אלה מלכודות היא כי תולעים יכול להיתקע בתוך המכשיר, גורם להתקני מהחורים סתום של "למעלה" לאחר הדמיה רק כמה תולעים. עם זאת, זמן שירות מהיר הזיוף של מכשירים חדשים של תבנית הבסיס מקלה על החיסרון הזה. תאורה אור כחול מורחב גם הוכח לזירוז נזקי ב C. elegans32,33. מסגרת זמן קצרה יחסית ניסיוני של פרוטוקול זה (30 s) מאפשר הדמיה ללא מדידה photobleaching. עם זאת, כדי להימנע photobleaching, נזקי בניסויים ארוכים יותר, מקור האור ניתן פעמו7. לדוגמה, במהלך כל חשיפה 100-ms, האור יכול להיות פעמו עבור גברת 10 זה הוכח לחסל את autofluorescence גוף מוגבר לאורך זמן7.

כדי לבחון כראוי את הזכרים על התגובות שלהם ascarosides, זחל-שלב 4 זכרים (L4) חייב תחילה להיות מבודדים הרמפרודיטים, במשך לפחות 5 שעות, על מנת להשיג מענה ליד נאיבי פרומונים23. בידוד על פחות זה משך הזמן עלול לגרום לבעלי חיים שאינם מגיבים לאיתותים ascarosides. עם זאת, הבידוד אין צורך בעת בדיקת רמזים הלא-ascaroside, כגון גליצרול. למען עקביות, אולם בעלי חיים היו תמיד מבודד לפני h לפחות 5 סידן הדמיה. נוירונים מסוימים, כגון צ'ם, לא כל גירוי מביאות לתגובה העצבית ולאחר כל צ'ם המגיבה עושה זאת כדי ליצור מסוימים "קוד" הייצוג העצבי. תופעה זו ב- CEM נצפתה באמצעות מחקרים אלקטרופיזיולוגיה, כמו גם עם סידן הדמיה מחקרים כמו אלו המתוארים כאן23. לפיכך, תופעות מעבר למדידה סידן בנוירונים צ'ם בכל בעל חיים חשופים ascaroside לא מובטח23. למעשה, רבים ascarosides נחקרו עד כה לא זכה סידן מדיד שנחשולי13,15,34,35. ההתמחרות מוצלחת של תופעות מעבר למדידה נצפתה במהלך אחד בלבד מתוך שלושת הפעימות של פרומון לשניים החיות חמש לחשוף את ascaroside של עניין (איור 3). זה תואם את שיעור ההצלחה שנצפתה בעבר אחרים מעבדות23. ההשתנות היא הגבלה כאשר לומד. פרומון התגובה ואינו בשל המוקד מבוסס-זכר של פרוטוקול זה.

כאשר חוקרים תופעות מעבר סידן elicited בתגובה ascarosides, אחד בו חוסר תגובה עקבית ללא חקירה מתמשכת. ניתן לבדוק באמצעות ניסויים כגון אלקטרופיזיולוגיה מחקרים כדי לאשר את התגובה משתנה בתוך מחלקה עצביים. על הנוירונים, כגון אש, אשר מגיבים בצורה אמינה, חוסר תגובה עקבית יכול להיות מעידה על בעיות ניסיוני גדול יותר, כגון שגיאות בשליטה גירוי. שיא עוצמת התגובות יכול ייחקרו גם אם השתנות צפוי בתגובה. ניתן להתוות את העקבות עם סטיית תקן או שגיאה סטנדרטית (כמו 2F איור). אם סטיית התקן היא קטנה, העקבות יכולים להיות מותווים וניתח ככזה. אם יש כמות ניכרת של וריאציה שמוביל סטיות תקן מתונה, הנתונים ניתן להתוות זהה, עם ליווי heatmaps ממוין לפי התגובה "סוג" להראות את הווריאציה התגובה-מאת-תגובה. אם יש וריאציה משמעותית (איור 3), שבה אין אפשרות להפיץ את הפסגות בצורה גאוסיאנית, תגובות יכולה להיות מחולקת לתגובה "סוגים" (למשל, depolarizing, hyperpolarizing, או ללא קיטוב)23. תגובות ליפול לתוך "סוג מסוים" יכולים להיות מותווים וניתח ביחד. באופן דומה, heatmaps צריך ללוות את ניתוח זה גם כן.

. להתקדם, מכשיר זה ניתן להתאים כדי לאפשר את ההדמיה של נמטודות זחל מבוים על ידי היצרות יציאת הטעינה עוד יותר. עוד היצרות של הסוף של יציאת הטעינה יאפשר עבור האילוץ של החיה כדי לאפשר הדמיה של רק cilia של נוירונים סנסוריים, בניגוד לגוף התא. בעוד מכשירים אחרים נועדו ההרמפרודיט למד יותר נפוץ, השבב חוש הריח מותאם הזה מאפשר ההדמיה של פעילות עצבית זכר את המעגלים העצביים. כפי עדיין להיות הובהר את connectome של הגבר, היכולת למדוד דינמיקה עצבית ברשתות מין ספציפי הוא קריטי להבנה מלאה אותות עצביים. ההבדלים בין תגובות אנדרוגיניות ו זכר יכול עכשיו להיבדק, נמדד באמצעות מכשיר זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות מנואל הצימר סיפק לנו הקובץ הראשוני בעיצוב הותאם לשימוש עם זכרים; פרנק שרדר על סינתזה ועל אספקת ascr #3; רוס Lagoy כדי להפוך את התובנה בסיוע הדמיה וניתוח; לורה Aurilio על הזיוף הבסיס, ומי, לצד כריסטופר המצנח, תרמו הסקירה של כתב היד הזה. מימון עבור עבודה זו סופקה תחת של מכוני הבריאות הלאומיים גרנט 1R01DC016058-01 (ס), המענק הלאומית למדע CBET 1605679 (D.R.A.), ופרס בורוז Wellcome הקריירה ב מדעי ממשק (D.R.A.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon Wafer University Wafer 452
SU-8 2035 MicroChem Y111070-0500L1GL
Developer MicroChem Y020100-4000L1PE
Wafer Mask Cad/Art Services - Custom order. Printed at 25,000 dpi.
Sylgard-184 Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
1.0 mm Dermal Punches Acuderm Inc. P150
Soft Tubing Cole-Palmer EW-06419-01
Hard Tubing IDEX Health & Science 1622
Pins New England Small Tube NE-1027-12
Blocking Pins New England Small Tube 0.415/0.425" OD x .500 Long Batch PB07027
3 mL syringes BD 309657
30 mL syringes Vitality Medical 302832 Used as buffer reservoirs.
Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer Component Supply Company NE-231PL-50
Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile Cole-Palmer EW-30600-07
Fisherfinest Premium Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5M
Mercator Control System LF-5 Plasma System Mercator LF-5
Scotch Tape Scotch BSN43575
Series 20 Chamber Warner Instruments P-2
Vacuum Desicator Bel-Art Scienceware 420250000 24 cm inner diameter.
Weigh Boats Cole-Palmer EW-01017-27
Classic Plus Balance Mettler Toledo PB1501-S/FACT
Glass Pasteur Pipettes Cole-Palmer EW-25554-06
Transfer pipettes Genesee Scientific 30-202
Oven Sheldon Manufacturing Inc 9120993 Model Number: 1500E.
60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes TriTech Research T3308
Zeiss Axio Observer.A1 Zeiss -
Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS Hammamatsu C11440-22CU
Blue Fluorescent Light Lumencor SOLA SM6-LCR-SA 24-30V/7.9A DC.
Illumination Adaptor Zeiss 423302-0000
Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve Parker 001-0017-900 3-way valve for controlling flow.
ValveLink8.2® AutoMate Scientific 01-18 Flow Switch Controller
Micro Manager Micro-Manager - Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release
ImageJ ImageJ - Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Agar, Bacteriological Grade Apex 9012-36-6
Peptone Apex 20-260
CaCl2 VWR BDH0224-1KG
MgSO4 Sigma-Aldrich 230391-1kg
Cholesterol Alfa Aesar A11470
Ethanol Sigma-Aldrich 270741-4L
Tetramisole Sigma-Aldrich L9756-10(G) Store at 4 °C.
Fluorescein Sigma-Aldrich FD2000S-250mg Light Sensitive. Store in photoprotective vials.
Glycerol Sigma-Aldrich G6279-1L
Ascaroside #3 - - Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University).
NaCl Genesee Scientific 18-215
KH2PO4 BDH BDH9268.25
K2HPO4 J.T. Baker 3252-025
ASH GCaMP3 line - - CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library.
CEM GCaMP6 line - - JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library.
E. coli (OP50) Caenorhabditis Genetics Center OP50
"Reservoir" - - To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
  2. Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).
  3. Chronis, N. Worm chips: Microtools for C. elegans biology. Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).
  4. Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm. Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).
  5. Lockery, S. R., et al. A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans. Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).
  6. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nat Commun. 7, 13023 (2016).
  7. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).
  8. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Front Mol Neuro. 6, 2 (2013).
  9. Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1 (2), 025008 (2014).
  10. Tatro, E. T. Brain-wide imaging of neurons in action. Front Neural Circuits. 8, 31 (2014).
  11. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  12. Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
  13. Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior. Elife. 5, (2016).
  14. Kim, K., et al. Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans. Science. 326 (5955), 994-998 (2009).
  15. McGrath, P. T., et al. Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes. Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).
  16. Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (8), e43164 (2012).
  17. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1 (1986).
  18. White, J. Q., et al. The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males. Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).
  19. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).
  20. Chute, C. D., Srinivasan, J. Chemical mating cues in C. elegans. Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).
  21. Izrayelit, Y., et al. Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans. ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).
  22. Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. Ascaroside signaling in C. elegans. WormBook. , 1-22 (2013).
  23. Narayan, A., et al. Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).
  24. Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).
  25. Sammut, M., et al. Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans. Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).
  26. Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures. Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).
  27. Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).
  28. Evans, T. C. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
  29. Cáceres, I. dC., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies. PLoS ONE. 7 (4), e35037 (2012).
  30. Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
  31. García, L. R., Portman, D. S. Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans. Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).
  32. Clokey, G. V., Jacobson, L. A. The autofluorescent "lipofuscin granules" in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes. Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).
  33. Coburn, C., et al. Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans. PLoS Biology. 11 (7), e1001613 (2013).
  34. Macosko, E. Z., et al. A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans. Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).
  35. Park, D., et al. Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).

Tags

מדעי המוח גיליון 127 מיקרופלואידיקה סידן הדמיה GCaMP C. elegans זכרים נוירון צ'ם ascaroside
באמצעות שבב חוש הריח של Microfluidic מותאם עבור ההדמיה של פעילות. עצבית בתגובה פרומונים בנוירונים הראש הגברי <em>C. Elegans </em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reilly, D. K., Lawler, D. E.,… More

Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons. J. Vis. Exp. (127), e56026, doi:10.3791/56026 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter