Summary
화살 비행기에서 운동학 걸음 걸이 분석 운동 실행 하는 방법에 대 한 매우 정확한 정보를 생성 합니다. 우리는 중재 면역 demyelination 대상이 쥐에 대 한 걸음 걸이 적자를 식별 하기 위해 이러한 기술의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이러한 방법은 다른 마우스 모델을 갖춘 장애인된 운동에 대 한 걸음 걸이 적자 하 사용할 수 있습니다.
Abstract
화살 비행기에서 운동학 걸음 걸이 분석 여러 경화 증 (MS)에서 모터 적자 하 자주 사용 되었습니다. 우리는 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE)로 알려진 MS의 마우스 모델에서 걸음 걸이 적자를 식별 하기 위해 이러한 기술의 응용 프로그램을 설명 합니다. EAE를 받게 하는 쥐에 있는 마비 및 모터 적자는 일반적으로 임상 점수 규모를 사용 하 여 평가 됩니다. 그러나,이 규모는 모터 적자의 정확한 본질에 대 한 약간의 정보를 제공 하 서 수 데이터를 생성 합니다. EAE 질병 심각도 rotarod 성능, 일반 모터 조정의 측정을 제공 하 여 평가 했다. 대조적으로, 화살 비행기에서 뒷 다리의 운동학 걸음 걸이 분석 방법 움직임은 장애인에 대 한 매우 정확한 정보를 생성 합니다. 이 절차를 수행 하려면 반사 마커 마우스는 디딜 방 아에 걷는 동안 공동 움직임을 감지 하는 후방 다리에 배치 됩니다. 동작 분석 소프트웨어는 산책 하는 동안 마커의 움직임을 측정 하는 데 사용 됩니다. 운동학 걸음 걸이 매개 변수는 다음 결과 데이터에서 파생 됩니다. 우리는 어떻게 이러한 걸음 걸이 매개 EAE의 엉덩이, 무릎, 그리고 발목 관절의 장애인된 운동 척도를 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 이러한 기술은 질병 메커니즘을 이해 하 고 MS와 기동성 손상 다른 신경 퇴행 성 질환에 대 한 잠재적인 치료 식별을 사용할 수 있습니다.
Introduction
걸음 걸이 운동을 달성 하는 데 사용 하는 팔 다리의 반복적인 움직임의 시리즈 이다. 걸음 걸이 두 단계로 분할 되는 단계 사이클 구성: 발 이동 거꾸로 바닥에 시체 전달; 추진 때 자세 단계 그리고 발 지상과 이동 전달 꺼져 스윙 단계. 걸음 걸이의 소요는 척수 상해 (SCI), 다 발성 경화 증 (MS), 루 경화 증 (ALS), 파 킨 슨 병 (PD), 및 뇌졸중; 등 많은 신경 퇴행 성 질환의 특징 기능 이러한 장애의 임상 설치류 모델은 종종 그들의 각각 걸음 걸이 장애1정리. 쥐에 있는 운동의 기본 제어 메커니즘 집중적으로 공부2,3되었습니다. 또한, 많은 인간의 신경 장애4의 마우스 모델 있다. 마우스에 걸음 걸이 분석 따라서 해 부 관계가 알려진 모터 적자의 여러 측면을 측정 하는 매력적인 접근 이다. 마우스 모델에서 걸음 걸이의 연구는 운동 신경 장애, 적자의 neuropathological 기지에 대 한 통찰력을 제공 하 고 잠재적인 치료의 식별을 가능 하 게 수 있습니다.
설치류에서 걸음 걸이 측정 하는 데 사용 된 몇 가지 기술이 포함 (예를 들어, 바소 마우스 규모5 및 오픈 필드 테스트6) 육안 검사 및 복 부 비행기7에서 보 행의 분석. 더 최근에, 화살 평면 운동학 hindlimb 움직임을 측정 하는 방법 때문에 그들은 이동의 실행에 대 한 자세한 정보를 제공 하 고 따라서 걸음 걸이8, 에 있는 미묘한 변화에 더 민감합니다 인기 얻고 있다 9 , 10 , 11. 디딜 방 아9,12 에 걷고 있는 동안 화살 비행기에서 hindlimb 운동 연구 개발 기구학 기술을 광범위 하 게 과학, ALS, 외상 성 대뇌 피 질의 부상, 뇌졸중의 맥락에서 연구 하 고 헌팅턴 병8,9,10,11,13,14,,1516. 반면, 이러한 기술을 다 발성 경화 증17의 마우스 모델에 대 한 운전 적자의 연구에서 제한 된 사용을 보았다.
실험적인 자기 면역 뇌 (EAE) MS18의 가장 일반적으로 사용 되 마우스 모델 이다. EAE 유도의 두 가지 주요 방법을 통해 활성 또는 수동 접종 이다. 활성 EAE 마우스와 수 초 항, 일으키는 autoreactive T 세포 중재 neuroinflammation demyelination 척수와 소 뇌에 접종 됩니다. 다른 한편으로, 수동 EAE 순진한 마우스19autoreactive T 세포 활성 EAE 가진 쥐에서 전송 하 여 유도 된다. 중앙 신경 조직 (CNS) 항 원에 의해 질병 과정 및 neuropathology 영향을 다른 곳에서 설명 된 대로 및 마우스 스트레인20,,2122,23,24 ,25. EAE 실험, 통제 쥐 수 초 항 원 없이 완전 한 Freund의 보조 (CFA)와 주입 됩니다. EAE 오름차순 마비 꼬리 약점으로 시작 하는 앞 발을 포함 잠재적으로 수 여 증 및 마비20인 특징 이다. 우리는 최근 myelin oligodendrocyte 당단백질 35-55 (MOG35-55)를 받게 하는 C57Bl/6 마우스의 걸음 걸이 변화를 특징-EAE를 유도. 이러한 연구 걸음 걸이 분석을 정상적인 발목 운동에서 편차는 매우 EAE 쥐26의 요 추 척수의 백 질 손실의 정도 연관 때문에 클래식 행동 분석 보다 우수한 것으로 나타났습니다. 대조적으로, 백색 질 손실 및 2 개의 다른 전통적인 행동 조치 (임상 점수 및 rotarod) 간의 상관 관계의 강도 훨씬 약한26했다.
우리 여기 EAE 마우스는 디딜 방 아에 걷는의 화살 평면에서 운동 적자를 검출 하기 위하여 운동학 걸음 걸이 분석의 사용을 설명 합니다. 5 반사 마커 엉덩이, 무릎, 그리고 고속 비디오 녹화에서 발목 관절의 움직임을 식별 하기 위해 hindlimb에 배치 했다. 동작 분석 소프트웨어 공동 여행에 대 한 운동학 적 데이터 추출에 사용 되었다. 이러한 기술 운동 적자 EAE의 MOG35-55 모델에 대 한 계량에 유틸리티는 설명 합니다. 이 기술은 또한 신경 장애의 다른 마우스 모델에서 걸음 걸이 적자의 연구에 적용 됩니다.
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Protocol
이 프로토콜은 동물 관리 지침에 캐나다 위원회 및 실험실 동물에 Dalhousie 대학 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 반사 마커 생성:
- 반사 종이의 시트에서 작은 원 원하는 수 펀치 휴대용 구멍 펀치를 사용 하 여. 각 동물 필요 5 마커 단일 기록; 큰 2 및 3 개의 작은 마커.
- 원의 중심에는 경계에서 확장 직선 컷을 만들어 좋은 위를 사용 하 여.
- 공개 접착제 표면 마커의 역행 종이 제거 합니다. 미세 집게를 사용 하 여 마커 단단히를 원뿔 모양에 당신의 손가락을 사용 하 여 자체에 그것을 곱슬 곱슬. 작은 마커를 만들기 위해 콘을 단단히 곱슬 곱슬. 큰 마커 있도록 느슨하게 컬 콘.
- 휴대용 풀 총을 사용 하 여, 내부 원뿔 모양의 마커를 접착제로 집게와 콘의 끝을 창과 동안를 골 판지의 평면 부분에 마커를 준수. 접착제는 축소 하 고 빛의 최적의 반사 되도록 기록 하는 동안 절곡에서 마커를 막을 것 이다. 언제 접착제는 건조 (약 10 분), 메스 ( 그림 1A)와 골 판지에서 마커를 제거.
2. 녹음에 대 한 동물을 준비
- Anesthetize isoflurane 가스 (2.5%, 2 리터/분 O 2)를 유도 챔버에 마우스를 배치 하 여 마우스. 일단 마우스를 의식이 없는 코 콘 반복 물 난방 담요 위에 위치에 놓습니다. Anesthetization의 목적은 마커 배치;에 대 한 마우스를 고정 하 절차는 고통 스러운. 따라서, 마 취 깊이 평가 될 필요 하지 않습니다.
- 양쪽 눈에 국 소 눈 윤 활 유를 적용.
- 전기 면도기를 사용 하 여 원하는 hindlimb를 면도. 발목에서 시작 하 고 척추와 갈비뼈;의 하단까지 이 마커 접착에 악영향을 줄 것 이다 아무 모피 왼쪽은 확인.
참고: 여기, 오른쪽 hindlimb 기록 했다; 그러나, 어느 hindlimb를 사용할 수 있습니다. - 영구 마커를 사용 하 여 장 골도 머리와 엉덩이 관절의 위치를 나타냅니다. 장 골도 머리 바로 아래에 있는 갈비뼈의 하단 이며 쉽게 만져 서 마우스 아래 무릎을 함께 가져다 ' s 몸.
참고: 고관절 flexing과 골반과 대 퇴 골 사이 조음 지점을 찾기 위해 다리를 확장 하 여 찾을 수 있습니다. - 미세 집게를 사용 하 여, 작은 표시기의 뾰족한 끝을 잡고와 빠른 연기 접착제 접착제에 기지 또는 동등한 대안을 찍어. 네 번째 손가락의 끝에 마커를 놓고 접착제를 건조 수 있도록 2-3 s에 대 한 장소에서 개최 합니다. 같은 방식으로 ( 그림 1B)에 metatarsophalangeal 관절과 발목에 다른 두 개의 작은 마커 장소.
- 작은 표식으로 같은 방식으로 장 골도 머리와 엉덩이 관절 ( 그림 1B)에 큰 마커를 배치.
- 원뿔에서 마우스를 제거 하 고 즉시 전송 케이지를 사용 하 여 녹음을 전송. 고정 된 디딜 방 아에 마우스를 놓고 마 취에서 완전히 회복 허용.
3. 걸음 걸이 기록
- 이전 마우스 기록에 ' s 걸음 걸이, 디딜 방 아에 알려진 치수 보정 블록의 사진을 받아.
참고:이 비디오를 실제 측정을 변환할 수 있는 픽셀을 허용할 것 이다. 카메라는 디딜 방 아에서 약 120 cm 배치 되어야 한다. - 디딜 방 아와 같은 높이 수준에서 카메라 위치
- . 다음과 같은 보정 이미지 레코딩 위한 동일한 카메라 위치를 유지.
참고: 모든 쥐 같은 속도로 걷기를 이상적 이더라도, 일부 수 하지 일관이 속도 도달.
- 마우스 20 cm/s, 걸을 수 없는 경우 필요에 따라 속도 감소 하 고 반드시이의 메모. 일관 된 단계 사이클 달성 될 때까지 디딜 방 아의 속도 줄일 수.
참고: 나중에 데이터 분석 속도 차이 대 한 조정할 수 있습니다.
4. 분석
- 모션 분석 소프트웨어를 사용 하 여 비디오 처리.
참고: 우리의 실험에서 우리가 사용 이미징 및 통계 소프트웨어를 위한 사용자 지정 스크립트 (재료의 표 참조)을 박사 니콜라 Stifani에 의해 작성 되었습니다. 다음 단계는 선택한 동작 분석 소프트웨어를 사용 하 여 수행 됩니다.- 동영상에서 마커의 픽셀 좌표를 추출 하 고 교정 비디오를 사용 하 여 센티미터 픽셀 값을 변환 하 고 각 프레임에서 공동 각도 계산.
- 시작과 끝 단계 시간 길이 대 한 정보를 취득 함으로써 각 단계 사이클의 식별.
- 정상화 단계 사이클 기간 200 정규화 된 프레임에는 스윙과 자세 각각 100 프레임으로 표시 됩니다.
- 정규화 된 프레임을 사용 하 여 계산 스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여 데이터 분석에 대 한 운동학 적 매개 변수 (자료의 표 참조).
특정 관절의 평균 각도 설정,로 정규화 된 프레임 내의 모든 각도의 평균 걸릴
- :
참고: x 여기에 각도 값을 대표 한 정규화 주어진 프레임, 그리고 n 정규화 된 프레임 수를 나타냅니다. - 주어진된 마우스에 대 한 특정 관절의 운동 범위를 설정 하려면 다음과 같이 정규화 된 프레임의 집합에서 가장 큰 각도에서 가장 작은 각도 빼기:
운동의 범위 각도 최대-최소 각도 =.
참고: 여기 최대 각도 각도 최소는 최고의 그리고 가장 작은 각도 정규화 단계 주기 내에서 각각 달성. - RMS 차이 설정 하려면 먼저 기준 기록에서 각 실험 시간 포인트의 평균 각도 뺍니다. 다음, 각 차이 광장, 모든 제곱 평균 제곱근의 뜻. 방정식은 다음과 같습니다:
참고: 여기
기록; 기준선에서 평균 각도 나타냅니다 y 각 점에서 실험 시간-; 평균 각도를 나타냅니다. n의 정규화 된 프레임 수를 나타냅니다. 루트 제곱된 (RMS) 차이점은 초기 녹음에서 걸음 걸이에 대 한 편차를 평가 하는 데 사용 되는 측정 뜻.
- :
- 과학 그래프 및 통계 소프트웨어를 사용 하 여 분석 하 고 데이터 (재료의 표 참조).
기록; 기준선에서 평균 각도 나타냅니다 y 각 점에서 실험 시간-; 평균 각도를 나타냅니다. n의 정규화 된 프레임 수를 나타냅니다. 루트 제곱된 (RMS) 차이점은 초기 녹음에서 걸음 걸이에 대 한 편차를 평가 하는 데 사용 되는 측정 뜻.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
그림 1 은 운동학 걸음 걸이 분석을 위해 사용 하는 프로시저의 도식 적인 표현입니다. 첫째, 반사 마커는 만들었고 5 해 부 지점에서 마우스에 배치. 마우스는 디딜 방 아에 걷는 하는 동안에 다음 걸음 걸이 기록 됩니다. 동작 분석 소프트웨어는 이후 분석에 대 한 운동학 적 데이터를 추출 하는 데 사용 됩니다.
그림 2A -C 떨어져 1 주 간격 3 연속 기록 세션에서 기록 된 엉덩이, 무릎, 그리고 발목 관절 각도 대 한 제어 CFA 마우스의 단계 주기를 나타냅니다. 파형 간의 중복 세션 1-3에서에서 단계 사이클에서 최소한의 편차를 보여줍니다. 그림 2D -F 녹음 세션 1-3에서 큰 도보 가변성을 표시 두 번째 컨트롤 CFA 마우스의 단계 주기를 나타냅니다. 단계 사이클은 y 축을 따라 이동 하 고, 파형의 모양 기록 사이 일관 된 남아 있다. 가변성의이 수준 마우스 산책 하는 것이 일반적입니다.
그림 3A -C EAE 3 연속 녹음 세션에 기록 된 마우스의 단계 주기를 나타냅니다. 처음부터 걸음 걸이에 최소한의 변경 내용이 두 번째 녹음 세션, 하지만 제 3 세션에 의해, 걸음 걸이 뿌리깊은 변경 된 모든 3 개의 관절 되었습니다. 엉덩이에 대 한 단계 주기에 중요 한 병합 발생 했습니다, 움직임의 상당한 감소를 나타내는. 무릎 더 수축 하 고 확장 하 고 동물의 시체를 지 원하는 수 체중 되고있다. 발목 관절에 움직임 또한 실질적으로 변경 했다. 발 dorsiflexion와 발바닥 굴곡 각각 스윙 (화이트 패널) 및 자세 (녹색 패널) 단계 동안 지연 됩니다. 이 적자는 동물 모두 스윙 단계에서 발 인상 및 입장 단계 동안 몸 앞으로 추진 하는 능력에 손상으로이 관절에서 근육의 약점의 표시.
그림 4 에 다음 데이터는 Fiander 그 외 여러분 에서 게시 했다 (2017) 26 허가입니다. 데이터를 사용 하 여 단방향 반복된 측정 ANOVA Holm Sidak와 여러 비교 테스트 기준26모든 시간 포인트를 비교 분석 했다. 척도 걸음 걸이를 각 시간 지점에서 동작 (그림 4B 와 그림 4E) 및 RMS 차이 (그림 4C 와 그림 4 층)의 평균 각도 (그림 4A , 그림 4D) 범위 계산 적자 (n = 8 그룹 당). 현재 EAE 실험, 임상 점수 개시 DPI 14, 녹음의 두 번째 주 후 했다. CFA 쥐 평균 무릎 각도 (그림 4A) 또는 무릎 RMS 차이 (그림 4C), 변화를 보여 줬 지만 무릎 움직임의 범위에 있는 작은 증가 전시 했다 [F(2,7) = 5.871, p = 0.0083], DPI 16에 기준선 ( 를 기준으로 30 그림 4B). 이 작은 변화는 CFA 사출에서 발생 하는 통증을 반영 수 있습니다. CFA 동물 달리 큰 변경 사항은 무릎에서 평균 각도 EAE 동물에 대 한 공동 [F(6,7) 11.08, p = < 0.0001] (그림 4D), 모션의 범위 [F(6,7) 14.42, p = < 0.0001] (그림 4E) 및 RMS 차이 (그림 4 층)입니다. 평균 각도 크게 감소 되었다, 나타내는 EAE 쥐 더 산책 하는 동안 근육이 수축 하는 그들의 무릎을 했다. 이 동물 그들의 몸 무게를 지원 하기 위해 그들의 무릎 관절을 확장 하지 못했습니다 나타내는 근육의 약점, 있을 수 있습니다. 모션의 범위는 또한 감소 하 고, 다시 무릎 관절을 확장 하는 동물의 무 능력으로 인해 가능성이 높습니다. 무릎 RMS 차이에 크게 증가 EAE 생쥐에서 무릎 관절의 움직임은 그들의 초기 기록에서 실질적으로 다른 것을 나타냅니다.
그림 5 의 데이터를 사용 하 여 단방향 반복된 측정 ANOVA Holm Sidak와 그 3.5 0의 임상 점수에서 발견 0.5-임상 점수에서 걸음 걸이 매개 변수 값을 비교 하는 여러 비교 테스트 분석 되었다. 이제 분석 또한 Spearman로 (ρ)을 사용 하 여 수행 되었다. 평균 무릎 각도 (그림 5A), 동작 (그림 5B), 및 RMS 차이 (그림 5C)의 범위 임상 점수와 강하게 상관 했다 (p < 0.001). 관절의 움직임 및 클래식 임상 점수 사이의 이러한 상관 관계 EAE 마우스 모터 적자를 평가 하기 위해 운동학 걸음 걸이 분석의 타당성을 입증할. 모션 (그림 5A) 및 RMS 차이 (그림 5C)의 무릎 범위 크게 2.0의 임상 점수에 시작 감소 했다 (p< 0.05). 이 결과 장애인된 무릎 움직임 임상 점수 2.0 보다 낮은 의해 감지 모터 적자에 기여 하지 않는 것이 좋습니다. 그러나, 무릎 평균 각도 (그림 5B) 1.0의 임상 점수에 시작 감소 했다 (p< 0.05). 이 무릎 운동에 대 한 평균 각도 3 측정의 가장 중요 한 것을 제안 합니다.
그림 1 : 쥐와 녹음 운동학 걸음 걸이 대 한 도식. 일단 반사 마커 만들어집니다, 장 골도 머리, 엉덩이 관절, 발목, metatarsophalangeal 합동, 및 네 번째 손가락의 끝에 배치 됩니다. 마우스는 디딜 방 아에 걷는 동안 걸음 걸이 고속 카메라에 의해 기록 됩니다. 동작 분석 소프트웨어는 이후 분석에 대 한 걸음 걸이 매개 변수를 추출 하는 데 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : CFA를 받은 두 통제 쥐에 있는 단계 주기 파형의 예
흰색과 녹색 배경 스윙 및 자세 단계를 각각 나타냅니다. 1 마우스, hip (A), (B), 무릎 및 발목 (C) 단계 주기 파형 중복 서로 떨어져 1 주 간격 3 연속 녹음 세션에서. 2 마우스, hip (D), (E), 무릎 및 발목 (F) 단계 주기 파형 일탈 약간 서로에서 걷는 동작에 내재 된 변동성으로 인해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 단계 주기 파형 EAE 가진 쥐에. 흰색과 녹색 배경 떨어져 일주일 간격 3 연속 녹음 세션에 대 한 각각, 스윙 및 자세 단계를 나타냅니다. 3rd 녹음 세션, hip (A), (B), 무릎 및 발목에 의해 (C) 파형 EAE 질병의 진행으로 인해 크게 변경 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 평균 각도, 움직임, 그리고 루트 평균 제곱의 범위 운동학 적 데이터를 분석 하는 데 사용 됩니다. 평균 각도, 움직임, 그리고 RMS 차이의 범위 EAE 마우스 모터 적자 척도를 계산 했다. 평균 무릎 각도 (A), CFA 마우스 동작 (B), 및 RMS (C)의 범위는 비교적 일정 남아 있었다. EAE 가진 쥐 장애인된 무릎 평균 각도 (D), (E), 움직임과 RMS (F)의 범위를 보여주었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차;으로 표현 p< 0.05, * * p< 0.01, * * * p< 0.001, 하루 게시물 예방 접종 (DPI)-2;에서 차이 # p < 0.05, 피크 적자에서 차이. 참조 26에서에서 원래 게시자에서 허가로 증 쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 모션 및 RMS 차이의 평균 무릎 각도, 임상 점수와 상관
상관 관계 분석 사이 무릎 움직임의 3 개의 운동학 적 측정 및 임상 점수는 두 가지 방법 비교를 수행 했습니다. 임상 점수 평균 무릎 각도 (A), (B), 움직임과 RMS 차이 (C)의 범위 강하게 상관 했다. 모션 및 RMS 차이의 무릎 범위 감소 2.0, 임상 점수에서 시작 동안 평균 무릎 각도 이전 1.0의 임상 점수 감소 했다. 데이터는 평균 ± 표준 편차;으로 표현 p< 임상에서 0.05 차이 점수 0.0. 대 한 Spearman로 (ρ), * * * p< 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
EAE 가진 쥐, 모터 적자를 측정의 두 가지 가장 일반적인 방법 임상 점수 이며 rotarod27,28에서 대기 시간을가. 이 기술은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 하지만 편리 하 고 널리 사용 되, 임상 점수 의미는 임상 점수 차이의 크기는 알려져 있지 않습니다만 서 수 수준 데이터를 생성 하 여 제한 됩니다. 임상 점수 또한 모터 적자의 본질에 대 한 정확한 정보를 제공할 수 있는에서 겪고 있다. Rotarod 테스트 임상 득점의 몇 가지 제한에만 일반 모터 조정 측정 향상과 산책의 특정 측면을 측정 하지 않습니다.
비교 함으로써, 운동학 걸음 걸이 분석 운동, 다양 한 관절에서 모션 및 평균 각도의 범위를 포함 하 여의 특정 측면에 대 한 민감한 측정을 제공 합니다. 집 고 양이35-55 EAE 마우스 엉덩이 무릎 관절의 움직임에 미묘한 적자 DPI9, 임상 증상 또는 rotarod 적자26의 발병 하기 전에 약 5-9 일에서 발견 되었습니다. 이 적자는 임상 증상의 완전 한 죄 사 함에도 불구 하 고 유지 되 고 rotarod 적자26의 부재에서 관찰 되었다. 중요 한 것은, 발목 움직임 척수26에서 백색 질 손실이 매우 잘 연관 RMS 차이 의해 측정 된 손상.
몇 가지 방법 론 적 포인트는 구체적인 언급을 받을 자격이: 1) 공동 마커의 정확 하 고 일관 된 위치는 중요 한-고관절 및 장 골의 크레스트 신중 하 게 고 동;에 의해 식별 되어야 합니다 2) 그것은 8-12 단계 사이클에서 녹음을 얻을 필요가 있다. 더 분석 될 수 있다; 대표 평균 단계 주기 생산 단계 사이클 평균 3) 최적의 조명 조건은 표식 기록에 명확 하 게 표시 되도록 설정할 수 있어야 합니다. 마커를 제대로 조명 하지 경우이 힘 드는 과정 동영상 디지털화 하는 것 많은 모션 분석 프로그램 수동 추적을 필요로 하는 마커를 추적 하을 수 있을 것입니다 만들 수 있습니다.
이 기법에의 한 추가 제한 노동 집약적인 것입니다. 예를 들어 기록 하 고 10 쥐의 그룹에서 데이터 분석, 전체 프로세스는 약 7.0-9.0 시간 (h) 소요 예상. 만들기 50 마커 (마우스 당 5) 소요 약 2.0 h. 녹음 마우스 동작을 산책 할 수 있습니다 혼자 또는 한 쌍에서. 마우스; 당 약 10 분 소요 쌍에서 일 하는 동안 그것은 마우스, 당 약 25 분 걸립니다 혼자 일, 따라서, 녹음 10 쥐 걸릴 수 있습니다 1.5 h (쌍)에서 4.0 h (솔로). 마지막으로, 데이터 분석 및 그래프 약 3.5 시간 소요. 이 기술은 노동 집약 이다, 하지만 우리는 질병 메커니즘 운동학 걸음 걸이 분석에 의해 제공에 대 한 잠재적인 통찰력이이 투자 정당화 느낀다. 직렬 측정 비 접촉 라이브 마우스에서 찍은 수 있습니다 질병 병 리의 좋은 행동 상호 데 유용 합니다. 발목 운동학 및 요 추 척수의 백 질 손실26사이 근처 완벽 한 상관 관계를 감안할 때,이 방법을 사용할 수 있습니다 실험의 과정을 통해 demyelination EAE 쥐에서 remyelination의 임시 프로필을 확인할 수 있도록 평가를 복구.
걸음 걸이 분석은 hindlimbs의 움직임을 제한 하는 심각한 마비에 의해 복잡 합니다. 그러나, 심지어 심하게 마비 쥐 (임상 점수 > 3.0)는 수시로 어느 정도까지 ambulate 수. 이러한 경우 앞 발 앞으로, 동물을 당겨 하는 데 사용 됩니다 그리고 일부 hindlimb 운동 발생는 운동학 걸음 걸이 분석에 의해 측정 될 수 있다. 이러한 심각한 경우에도 여전히 hindlimb 기능 복구 시간 측정을 가능 하다. 매우 심한 경우에만 (임상 점수를 가진 동물의 20% > 피크 질병, DPI 16-23에 3.5) 우리 없었다 hindlimb 움직임의 유용한 녹음을 얻을 수. 그럼에도 불구 하 고,이 동물에는 일반적으로 DPI 30, 의미 있는 기록 그 시간 시점에서 얻을 수 있도록 몇 가지 hindlimb 기능 회복.
이 기술의 미래 응용 프로그램 운동 중 동시 시 녹음과 hindlimb의 운동학 적 데이터 커플링 이다. 이 기술은 마우스 모델의 ALS 및 과학에 완료 되었습니다 그리고 근육 활동, 신경 분포, 그리고 걸음 걸이 관계를 명료 하 게 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 또한 더 결합 될 수 있는 MS와 초점 EAE 모델29,30 또는 cuprizone 유도 demyelination31를 포함 하 여 더 많은 개별 걸음 걸이 적자 생산할 수 있는 demyelination의 모델을 대상으로.
우리가 EAE 쥐에서 관절의 움직임의 측정에 대 한 설명은 걸음 걸이 손상 하는 다른 질환에도 적용할 수 있습니다. 걸음 걸이에 뚜렷한 변화 한 마우스 모델의 PD, SCI, ALS, 및 치기8,,910,11,13,14보고 되었습니다. 예를 들어 PD의 설치류 모델 감소 폭 길이 속도, 걷는 속도32를 유지 하기 위해 높은 종 지 인 특징 이다. 운동학 걸음 걸이 분석 따라서 질병 메커니즘을 명료 하 고 이러한 모델을 사용 하 여 잠재적인 치료를 식별 하는 강력한 행동 도구를 제공 합니다.
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Disclosures
저자 들은 아무것도 공개 선언 합니다.
Acknowledgments
우리는 촬영 된 그의 기술 지원에 대 한 Sid Chedrawe를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품 MS 학회 캐나다 (EGID 2983)에서 자금을 지원 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | Nikon | Nikon D750 | Used to film the video |
| Reflective tape | B&L Engineering | MKR-Tape-2 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Glue gun | Craftsmart | E231647 | |
| scalpel handle #4 | Roboz | R5-9884 | |
| Scalpel Blade No.10 | Feather | 2020-12 | |
| C57BL/6 mice | Charles River Laboratories | ||
| Anesthetic machine | EZ Anesthesia | EZ-AF9000 Auto Flow System | |
| Recirculating water heating blanket | Androit | HTP-1500 | |
| topical eye lubricant | Refresh | DIN00210889 | |
| Shaver | Oster | 78997-010 | |
| High speed camera | Fastec | Fastec IL3-100 | |
| High power light | Smith Victor Corporation | Model 700 SG (600 Watt quartz light, 120 Volts) | |
| Light Stand | Promaster | LS1 | |
| Treadmill | Custom built at the Zoological Institute, University of Cologne | ||
| Microsoft Excel 2016 | Microsoft | Version 2016 | |
| KinemaJ | Nicolas Stifani | This is a script generated for use with ImageJ | |
| KinemaR | Nicolas Stifani | This is a script generated for use with Rstudio | |
| Vicon Motus | Vicon Motus | Version 9.00 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.00 |
References
- Giladi, N., Horak, F. B., Hausdorff, J. M. Classification of gait disturbances: distinguishing between continuous and episodic changes. Mov Disord. 28 (11), 1469-1473 (2013).
- Kiehn, O. Decoding the organization of spinal circuits that control locomotion. Nat Rev Neurosci. 17 (4), 224-238 (2016).
- Akay, T., Tourtellotte, W. G., Arber, S., Jessell, T. M. Degradation of mouse locomotor pattern in the absence of proprioceptive sensory feedback. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16877-16882 (2014).
- Hafezparast, M., Ahmad-Annuar, A., Wood, N. W., Tabrizi, S. J., Fisher, E. M. Mouse models for neurological disease. Lancet Neurol. 1 (4), 215-224 (2002).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
- Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. J Neurosci Methods. 206 (1), 7-14 (2012).
- Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behav Brain Res. 311, 340-353 (2016).
- Leblond, H., L'Esperance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. J Neurosci. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Ueno, M., Yamashita, T. Kinematic analyses reveal impaired locomotion following injury of the motor cortex in mice. Exp Neurol. 230 (2), 280-290 (2011).
- Zorner, B., et al. Profiling locomotor recovery: comprehensive quantification of impairments after CNS damage in rodents. Nat Methods. 7 (9), 701-708 (2010).
- Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. J Neurosci Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
- Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
- Taylor, T. N., Greene, J. G., Miller, G. W. Behavioral phenotyping of mouse models of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 211 (1), 1-10 (2010).
- Chen, K., et al. Differential Histopathological and Behavioral Outcomes Eight Weeks after Rat Spinal Cord Injury by Contusion, Dislocation, and Distraction Mechanisms. J Neurotrauma. 33 (18), 1667-1684 (2016).
- de Bruin, N. M., et al. Multiple rodent models and behavioral measures reveal unexpected responses to FTY720 and DMF in experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 300, 160-174 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Emerson, M. R., Gallagher, R. J., Marquis, J. G., LeVine, S. M. Enhancing the ability of experimental autoimmune encephalomyelitis to serve as a more rigorous model of multiple sclerosis through refinement of the experimental design. Comp Med. 59 (2), 112-128 (2009).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (5), e224 (2007).
- Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Fiander, M. D., Stifani, N., Nichols, M., Akay, T., Robertson, G. S. Kinematic gait parameters are highly sensitive measures of motor deficits and spinal cord injury in mice subjected to experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 317, 95-108 (2017).
- Jones, M. V., et al. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).
- van den Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
- Sasaki, M., Lankford, K. L., Brown, R. J., Ruddle, N. H., Kocsis, J. D. Focal experimental autoimmune encephalomyelitis in the Lewis rat induced by immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein and intraspinal injection of vascular endothelial growth factor. Glia. 58 (13), 1523-1531 (2010).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129 (Pt 8), 1972-1983 (2006).
- Franco-Pons, N., Torrente, M., Colomina, M. T., Vilella, E. Behavioral deficits in the cuprizone-induced murine model of demyelination/remyelination. Toxicol Lett. 169 (3), 205-213 (2007).
- Goldberg, N. R., Hampton, T., McCue, S., Kale, A., Meshul, C. K. Profiling changes in gait dynamics resulting from progressive 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced nigrostriatal lesioning. J Neurosci Res. 89 (10), 1698-1706 (2011).
