Summary
Dette manuskriptet beskriver nytten av ultralyd utføres på kvinner rotter å utvikle eksperimentelle modeller for reproduktiv og gynekologisk undersøkelse. En trinnvis forklaring på hvordan du utfører ultrasonographic evaluering vises.
Abstract
Med utviklingen av Assistert befruktning og etiske begrensningene for forskning på mennesker, har rotte dyr modeller vært mye brukt i reproduktiv medisin. Tidligere har studier av reproduksjonssystemet utvikling i Red vært basert på engangs histologiske undersøkelse av forbrukeravgift vev. Nylig, med utviklingen av høy oppløsning transabdominal ultralyd, høykvalitets sonography kan nå utføres for å evaluere de reproduktive organene rotter, slik at en ny metode for å studere reproduksjonssystemet. Bildene ble oppnådd ved å bruke en høy oppløsning ultrasonographic. Gynekologisk ultrasonography ble utført på 28 åtte uke gamle ikke-gravid rotter og 5 gravid Sprague-Dawley rotter. Beskriver vi hvordan gjenkjenne reproduksjonssystemet organer og tilhørende strukturer i typisk visninger under ulike faser av estrus syklus. Farge flyt Doppler ble brukt til å måle livmor arterien blodstrøm og evaluere livmor blood flow mønster endringer under ulike stadier av svangerskapet. Vi har vist at ultralyd undersøkelse er en nyttig metode for å vurdere endringer i interne reproduktive organer. Bruk øker muligheten for å gjennomføre flere eksperimenter, inkludert medisinsk eller kirurgisk prosedyrer, og gir deg muligheten til å overvåke sonographic endringer til indre organer uten å ofre dyr.
Introduction
Rotte dyr modeller har vært mye brukt i reproduktiv medisin, inkludert i fosteret og eggstokkene transplantasjon1,2. Men tidligere studier av reproduksjonssystemet utvikling i Red har vært basert på engangs histologiske undersøkelse av forbrukeravgift vev, og longitudinelle studier av daglige reproduktive organ endringer er ikke mulig i rotter3. Ultralyd har vært mye brukt i Assistert befruktning hos mennesker i over 30 år, men denne verdifulle teknologien er bare brukt på rotter nylig.
Målet vårt var å etablere en ultrasonographic tilnærming for å vurdere de reproduktive organene Sprague-Dawley rotter å utforme eksperimentelle modeller for reproduksjon og gynekologi etterforskning og å vise prosedyren fordi vi vet, Det finnes ingen gjeldende visualisert publikasjoner om denne prosedyren. Vi beskriver prosedyren for ultrasonographic undersøkelse av kvinnelige rottas reproduktive system og ultrasonographic resultatene på anatomi og livmor arterien blodstrøm bruker HD-ultralyd. Vi overvåket endometrium, eggstokkene og livmor arterien blodstrøm i ikke-gravide dyr på ulike stadier av estrus syklus å evaluere de betydelige forskjellene i endometrial tykkelse, ovarian morfologi og livmor blodstrømmen i ulike stadier av estrus syklusen, ligner på kvinner. Vi brukte høykvalitets ultralyd utstyr med en 70 MHz frekvens og en oppløsning på 30 µm. Målet vårt var å vurdere endringer i motstanden av livmor blodstrømmen i gravid rotter. Denne teknikken tillater for studier av daglige endringer i den reproduktive organer uten å ofre dyr.
Det er flere tekniske problemer i å utnytte ultralyd på rotter. Disse vanskelighetene inkluderer: rotte endometrium er mye tynnere enn en menneskelig kvinne4. Problemer med imaging eggstokkene rotter er blitt tilskrevet tykkere hud og bukveggen muskulaturen i rotter, som resulterte i nesten fullstendig demping av ultralyd5, og livmor arterien er mye vanskeligere å finne i ikke-gravid rotter. Vi har løst mange tekniske problemer med prosedyren, og for disse problemene som gjenstår, viser vi hvordan å minimere dem.
Vellykket overvåking av sonographic endringer i de reproduktive organene rotter uten å ofre dyr, åpnes muligheten for fremtidige dyremodeller reproduktiv medisin og andre kirurgiske prosedyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble gjennomført i strengt samsvar med anbefalingene i Guide og bruk av forsøksdyr National Institutes of Health og i samsvar med ANKOMME (dyr forskning: rapportering i Vivo eksperimenter) retningslinjer. Protokollen fikk en lisens for dyr eksperimentering i samsvar med direktiv 2010/63/EU med Autorisasjonsnummer A13170404 (Anexo 1). Alle eksperimentene ble utført i et EU-sertifisert laboratorium følgende nasjonale retningslinjer for etisk omsorg for dyr (RD 53/2013, EU-direktivet 63/2010). Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyr eksperimenter av universitetet i Murcia.
1. dyr forberedelse
Merk: Alle eksperimentene ble støttet av dyr eksperimentering delen av Murcia universitetet og obstetrikk og gynekologi avdeling i Murcia University.
- Bruk 8 uke gamle Sprague-Dawley rotter (28 hunnrotter) vekt 200-250 g alle eksperimentene.
Merk: Her, vi også brukt 5 gravid rotter. - For å få gravid rotter, bur åtte uke gamle kvinner og fruktbare hannrotter og kompis fra 17:00-23: 00 h. identifikasjon vaginal plugg morgenen ble tolket som parring suksess. Vurdere dag 1 av svangerskapet, dagen etter at de ble koblet.
- Utføre eksperimenter på 9, 15 og 18 dager av svangerskapet.
- Huset rotter i grupper på to med gratis tilgang til mat og vann og vedlikehold på vanlig 12t lys/mørke sykluser.
- Når acclimating anlegget vilkårene i minst to uker, kan du bruke daglig morgen vaginal cytologi for å vurdere for estrus frekvens og regularitet.
Merk: Tjueåtte rotter med en vanlig 4-5 dag estrus fase var valgt for inkludering i studien.
2. forberedelse av rotter for Imaging
Merk: Bildene ble oppnådd med høy oppløsning transabdominal ultrasonography. Estrous syklus faser ble fastsatt av vaginal smøre cytologi.
- Før tenkelig studien, bedøve demningen i kammeret induksjon med 2-3% isoflurane gass.
- Fjerne dyret og umiddelbart plassere snuten innenfor en forpart koblet til anestesi systemet og opprettholde dyret på 1,5-2% isoflurane under ultrasonographic undersøkelse.
- Fjern pelsen kyst marg. til caudal magen med avklipt og depilatory fløte.
- Plass bedøvet rotta i supine posisjon på et oppvarmet bord å sikre rotta og sikre optimal komfort og vedlikehold av fysiologiske parametre for varigheten av tenkelig økten. Alle fysiologiske parametere skal integreres med bilder og data fanget i sanntid via programmet ultralyd.
- Forsiktig sett en endetarms sonde (etter smøring) for å overvåke kroppstemperatur (37,5 ° C ± 0,5 ° C).
- Plasser svingeren (30 Hz) i en stillestående holder og flytte den loddrette aksen og x-akse (fremover-to-back og side til side) bruker en manuelt betjent styrespak eller for hånd.
- Bruke oljebaserte ophthalmica balsam øynene til rotta å unngå tørking under prosedyren.
3. eksamen prosedyre
Merk: Anatomi av rats´ reproduktive organer: skjeden ligger dorsal til urin blæren og deler inn i to livmor horn som strekker seg mot nyrene. Eggstokkene er koblet til livmor hornene via oviducts (figur 1). Livmoren ligger i regionen bakenfor nyrene.
-
Identifikasjon av livmor
- Ved hjelp av blæren som et landemerke finne livmorhalsen, følg livmorhalsen for å finne grenen av venstre og høyre livmor hornene.
- Bytt til todimensjonal visning/video ved å velge "B-modus". Måle antero-posterior diameteren på hver livmor horn i regionen midt-isthmic på en sagittal midtlinjen. Oppdage mål med ultrasonographic systemprogramvaren.
- Måle endometrial tykkelse fra echogenic grensen til echogenic grensen over endometrial hulrommet på en sagittal midtlinjen i "B-modus".
- Endre til Doppler fargemodus ved å velge "Farge Doppler". Bruk farge Doppler identifisere blodtilførselen av endometrium og måle blodstrømmen av endometriet. Velg følgende parametere i Doppler fargemodus: høypassfilter satt på 4 Hz, pulserende repetisjon frekvens sett mellom 4 og 48 kHz og pulserende Doppler gate mellom 0,2 til 0.5 mm.
-
Identifikasjon av livmor arterien blodstrøm
- Få Doppler bølgeformer i livmor arterien i nærheten lateral mindreverdig margin utero-cervical krysset nær iliaca arterien på hver side.
- Bruk følgende parametere i Doppler modus: høypassfilter satt til 6 Hz, pulserende repetisjon frekvens sett mellom 4 og 48 kHz og pulserende Doppler gate mellom 0,2 til 0.5 mm.
- Pass på å justere blodstrøm og Doppler strålen å minimere Doppler vinkelen. Registrere vinkelen mellom Doppler strålen og fartøyet. Verdier tatt utenfor en vinkel på 60° bør er unøyaktige og unngås6.
- Mål peak systolisk hastighet (PSV) og ende-diastolisk hastighet (EDV) fra tre påfølgende sykluser. Deretter beregne den systolisk, diastolisk (S/D) ratio (PSV/EDV) og motstand indeks (RI) ([PSV-EDV] / PSV) verdier for hver livmor horn.
- Måle livmor arterien blodstrømmen 5 gravid rotter under den 9th, 15th, 18th dag av svangerskapet.
-
Identifikasjon av eggstokk og eggstokkene arterien blodstrøm
Merk: Female rotten eggstokkene ligger lateral på nyrer på begge sider av dyret og bor i fett pads på slutten av livmor Hornet (figur 1).- Bilde eggstokken, starte med sonde i tverrgående flyet og plasserer den på den laterale delen av dyret under ribbeina. Nyre og fett pad har en hyperechoic utseende sammenlignet eggstokken.
- Måle eksterne grensen eggstokken og follikler. Tallene på skalaen bildet er i millimeter, med 0,1 mm trinn.
Merk: Doppler fargemodus og Doppler strømmodus bildebehandling bidrar med identifikasjon av eggstokkene intensitet og retningsflyt.
4. design av studien
- Sjekk estrus syklusen av vaginal smøre cytologi.
- Del alle rotter i to grupper. Gruppe 1 eller pre fruktbare (eller periovulatory), Inkluder rottene som var i proestrus og estrus syklus faser. Gruppe 2 eller etter fruktbare, Inkluder rotter som var tidlig diestrus og sent diestrus syklus faser.
- Overvåke og sammenligne antero-posterior diameteren på hver livmor horn i regionen midt-isthmic i grupper 1 og 2.
- Overvåke og sammenligne endometrial tykkelse og kjennetegner endometrium i 1 og 2.
- Overvåke og sammenligne størrelsen (maksimal diameter) og egenskapene til eggstokkene, og lokalisere alle periovulatory follikler i begge eggstokkene i grupper 1 og 2.
- Overvåke og sammenligne livmor arterien blodstrømmen i 1 og 2.
- Overvåke og sammenligne livmor arterien blodstrømmen av gravid rotter i ulike stadier av svangerskapet (dager 9, 15 og 18 av svangerskapet).
- Utføre statistiske analyser ved hjelp av SPSS. Presentere data som gjennomsnittlig ± standardavviket (SD) eller median med interquartile områder. Analysere resultatene med Student t-test mellom de ulike gruppene. En P-verdien for mindre enn 0.05 ble betraktet som en statistisk signifikant forskjell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det var ingen betydelige forskjeller i antero-posterior livmor horn diameter eller tykkelse for endometrium mellom de to sidene av livmor horn (tabell 1). Sammenlignet med gruppen 2, mener endometrial tykkelse i gruppen 1 var tykkere, men ikke signifikante forskjeller (P > 0,05) ble funnet mellom de to gruppene (Figur 3). Likevel, vi fant væske inne i livmoren (i 8 av 28 rotter) nær estrus syklusen knyttet til endringer i endometrium morfologi (figur 2).
Doppler studier også viste ingen vesentlige endringer i flyten hastighet bølgeform mønstre i hver side av livmor horn eller i forskjellige faser av estrus syklus i ikke-gravid rotter (tabell 1 og 2, figur 4A). Men i gravid rotter, som svangerskapet avansert, peak systolisk og ende-diastolisk hastigheter betraktelig, og den beregnede motstand indeksen sunket betraktelig (tabell 3, figur 4B).
Gjennomsnittlig diameter på eggstokken var ikke signifikant forskjellig (tabell 1). Morfologi av eggstokken var forhold mellom de to gruppene, ble periovulatories follicles og væske rundt eggstokken sett etter eggløsning (tabell 2, figur 2).
Figur 1 : Anatomi Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Måling av endometrial tykkelse (B-modus). Tykkelsen av endometriet (blå linjen) (A). Antero-posterior livmor horn diameter (store blå linjen) og tykkelsen på endometrium (kort blå linje) under estrus syklus (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : (A) måling av diameteren på den venstre eggstokken; (B) eggstokk og follicles i estrus fasen.
Figur 4 : Måling av livmor arterien blodstrøm. (A) livmor arterien blodstrøm i ikke-gravid rotter. (B) livmor arterien blodstrøm i 15 th dag av gravid rotter.
(P > 0,05, ingen signifikant forskjell i hver gruppe). SD: Standard DesviationPSV: topp systolisk velocityEDV: ende-diastolisk velocityS/D: systolisk å diastolisk ratioRI: motstand indeks. ((RI)=[PSV–EDV]/PSV)
|
Variabel (mm±SD) |
Venstre side | Høyre side | P. verdi |
| Horn diameter (mm) | 1.78±0.24 | 1.73±0.28 | 0.626 |
| Endometrium tykkelse (mm) | 0.75±0.06 | 0.76±0.05 | 0.752 |
| Eggstokken diameter (mm) | 3.69±0.52 | 3.62±0.32 | 0.107 |
| Hårsekken størrelse (mm) | 1.68±0.31 | 1.74±0.29 | 0.859 |
| PSV (mm/s) | 91.52±17.91 | 93.07±22.87 | 0.055 |
| EDV (mm/s) | 34.18±9.36 | 36.67±11.14 | 0.178 |
| S/D | 2.78±0.59 | 2.62±0.50 | 0.294 |
| RI | 0.62±0.08 | 0.60±0.08 | 0.876 |
| (P > 0,05, ingen signifikant forskjell i hver gruppe). | |||
| SD: Standard Desviation | |||
| PSV: topp systolisk hastighet | |||
| EDV: ende-diastolisk hastighet | |||
| S/D: systolisk diastolisk forhold | |||
| RI: motstand indeks. ((RI)=[PSV–EDV]/PSV) | |||
Tabell 1: Forskjellene i venstre og høyre livmor horn og eggstokken.
|
Variabel (mm±SD) |
Estrus fase (Gruppe 1) |
Non-estrus fase (Gruppe 2) |
P.Value |
| Horn diameter (mm) | 1.71±0.18 | 1.83±0.23 | 0.433 |
| Endometrium tykkelse (mm) | 0.78±0.04 | 0.72±0.05 | 0.168 |
| Eggstokken diameter (mm) | 3.71±0.56 | 3.66±0.47 | 0.515 |
| PSV (mm/s) | 92.05±17.93 | 94.15±20.62 | 0.886 |
| EDV (mm/s) | 37.81±9.64 | 34.72±5.38 | 0.096 |
| S/D | 2.61±0.58 | 2.77±0.44 | 0.249 |
| RI | 0.60±0.08 | 0.63±0.06 | 0.232 |
| (P > 0,05, ingen signifikant forskjell i hver gruppe). | |||
| SD: Standard Desviation | |||
| PSV: topp systolisk hastighet | |||
| EDV: ende-diastolisk hastighet | |||
| S/D: systolisk diastolisk forhold | |||
| RI: motstand indeks. ((RI)=[PSV–EDV]/PSV) | |||
Tabell 2: Forskjellene mellom forskjellige estrous syklus faser i ikke-gravid rotter.
| Variabel | D9 | D15 | D18 | P-verdi |
| PSV(mm/s) | 111.08±5.93a, b | 122.64±7.49c | 131.91±3.50 | < 0,05 |
| EDV(mm/s) | 38.80±3.37d, e | 56.43±3.10f | 79.29±5.47 | < 0,05 |
| S/D | 2.87±0.12g, h | 2.17±0.16jeg | 1.67±0.14 | < 0,05 |
| RI | 0.65±0.02 j, k | 0.54±0.04L | 0.39±0.05 | < 0,05 |
| PSV = Peak systolisk hastighet | ||||
| EDV = ende-diastolisk hastighet. | ||||
| S/D = systolisk, diastolisk forhold (PSV/EDV). | ||||
| RI = motstand indeksen ((RI) = ([PSV-EDV] / PSV). | ||||
| D9 = dag 9 av svangerskapet | ||||
| D15 = dag 15 av svangerskapet | ||||
| D18 = dag 18 av svangerskapet | ||||
| SD: feil indikere standardavvik (±). | ||||
| (P < 0,05, ingen signifikant forskjell i hver gruppe) | ||||
| P verdien: D9 vs D15 en = 0,03; d = 0,001; g = 0.01; j = 0,01. D9 vs D18 b = 0.003; e = 0,001; h = 0.01; k = 0,001. D15 vs D18 c = 0,03; f = 0,001; Jeg = 0,03; L = 0,04. |
||||
Tabell 3: Forskjellene i livmor arterien blodstrømmen i gravid rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremgangsmåter for endringer og feilsøking som var nødvendig i denne studien, til tross for vårt mål med å identifisere alle faser av estrus syklus i rotter ved hjelp av ultralyd, kunne vi ikke finne noen betydelige forskjeller. Vi hypothesize at disse vanskelighetene kan være fordi estrus syklusen varer bare et par dager i rotter, i motsetning til syklusen hos kvinner. Vi er sikker på at alle mål ble gjort på nøyaktig riktig tidspunkt å avgjøre noen forskjeller. Derfor vi omgrupperte estrus syklus faser i to faser evaluere for eventuelle forskjeller, men ingen ble observert. Som forventet, fant vi ingen signifikant forskjell mellom målinger av hver livmor horn, som vil tillate oss å velge enten horn for å utføre målinger i fremtiden. Studier av effekten av isoflurane bruk på Red er motstridende. Det kan være teratogene, men bare hvis administrert bedøvende konsentrasjoner i mange timer eller flere dager. I vårt eksperiment var eksamenstid i gravid rotter mindre enn 30 min, så vi ikke fant bivirkninger i alle gravid rotter eller deres avkom.
Vi ønsker å ha funnet flere likheter med ultralyd vurdering av skjede hos kvinner, der det er klare echogenic forskjeller mellom follikulær fase, periovulatory og sekretoriske faser, men slike endringer ble ikke sett i rotte modell. Dette faktum kan forklares fordi rotte estrus syklus faser bare fire til fem dager. Kort estrus syklus faser og svangerskapet perioder gjør rotta et ideelt dyr for forskning på reproduksjon5. Likevel, dette kan være grunnen hvorfor det er ingen betydelige forskjeller i diameter av livmor horn, endometrial tykkelse og eggstokkene diameter i estrus og ikke-estrus faser. Det er vanskelig å ta målinger på nøyaktig riktig tidspunkt å fastslå forskjellene, og til tross for å ta målinger hver dag, vi fant ikke betydelige endringer.
Til tross for at begrensningene ovenfor foreslå vi bruk av ultrasonography å overvåke endringer i reproduktive systemet, inkludert tykkelse og morfologi av reproduktive organer. Vi kan bekrefte denne bruken av ultrasonography fordi tykkelsen av endometriet i 8-uke-gamle Sprague-Dawley rotter målt histopathologically (ett lag 359.13 ± 49.70 mm) av Jing et al. 7 ligner resultater her. Til tross for ulike teknikker for måling av endometrial tykkelse histopathologically og sonographically, fått vi lignende resultater. Selv om makt Doppler og farge Doppler har vært brukt på gravid rotter i flere år8,9, har det vært noen undersøkelser måle livmor arterien blodstrøm i ikke-gravid rotter. Med utviklingen av ultrasonography, kan vi nå dra nytte av denne teknikken for å overvåke endringer i skjede under hver annen scenen, selv på begynnelsen av svangerskapet.
Fremtidige anvendelser av ultralyd kan inkludere utforskning av mekanismen av embryoet implantasjon og behandling av tynt endometrium i rotte dyr modeller. Også ved å overvåke for å utvikle hårsekkene, kan vi få mer omfattende kunnskap om funksjoner i en ovarian transplantasjon modell. Foreløpig er det noen undersøkelser ved hjelp av 3D-bildebehandling og molekylære ultralyd imaging av reproduksjonssystemet rotter10, og vi vil bruke denne teknikken på tynt endometrium modell i fremtiden.
Vi kan trekke konklusjonen at rotta er en passende modell for studiet av reproduktive organ dynamics bruker transkutan ultralyd bio-mikroskopi, som ikke krever offer av dyret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av dyr eksperimentering delen av Murcia University og obstetrikk og gynekologi avdeling i Murcia University. Vi takker alle teknikere arbeider på CEIB (Centro eksperimentelle en Investigaciones Biomédicas), delen av dyr eksperimentering av universitetet i Murcia, som har samarbeidet på dette prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo3100 high-resolution in vivo micro-imaging system* | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| Vevo integrated rail system including physiological monitoring unit. | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| MX400 Transducter | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| Vevo Lab Software | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| HSD: Sprague Dawley SD | Envigo, inc. | Rat strain | |
| Lubricating Gel | General Supply | ||
| CIBERTEC CA-EAC20 Anesthesia Trolley System | Cibertec S.A | Anesthesia Machine | |
| Ecogel 100 ultrasound gel | Eco-Med Pharmaceuticals Inc. | ||
| Hair removal lotion (Nair) | General Supply | ||
| Isoflurane | Esteve Veterinaria | Inhalatory anesthesia | |
| * Required software is Vevo software including B-Mode application, pulse wave Doppler application, and vascular strain analysis tools package. |
References
- Hunter, R. K. II, et al. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cell Effects on a Rodent Model of Thin Endometrium. PLoS ONE. 10 (12), e0144823 (2015).
- Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nat Rev Genet. 7 (3), 185-199 (2006).
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. C. Murine Echocardiography and Ultrasound Imaging. J Vis Exp. (42), (2010).
- Lohmiller, J. J., Swing, S. P. Reproduction and Breeding. The Laboratory Rat. , 2nd, Elsevier Academic Press. 147-164 (2006).
- Jaiswal, R. S., Singh, J., Adams, G. P. High-resolution ultrasound biomicroscopy for monitoring ovarian structures in mice. Reprod Biol Endocrinol. 7 (69), (2009).
- Kim, G. H.
- Jing, Z., Qiong, Z., Yonggang, W., Yanping, L. Rat bone marrow mesenchymal stem cells improve regeneration of thin endometrium in rat. Fertil Steril. 101 (2), 587-594 (2014).
- Mu, J., Adamson, S. L. Developmental changes in hemodynamics of uterine artery, utero- and umbilicoplacental, and vitelline circulations in mouse throughout gestation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291 (3), H1421-H1428 (2006).
- Anderson, C. M., Lopez, F., Zhang, H. Y., Pavlish, K., Benoit, J. N. Reduced uteroplacental perfusion alters uterine arcuate artery function in the pregnant Sprague-Dawley rat. Biol Reprod. 72 (3), 762-766 (2005).
- Hongmei, L., et al. Ultrasound Molecular Imaging of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 Expression for Endometrial Receptivity Evaluation. Theranostics. 5 (2), 206-217 (2015).
