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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

बचने इंफ्लूएंजा वायरस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के भागने के वेरिएंट की पीढ़ी

Published: August 29, 2017 doi: 10.3791/56067
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 3, 1, 1
1Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Graduate School of Biomedical Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3The Department of Medicine, Section of Rheumatology, The Knapp Center for Lupus and Immunology Research, The University of Chicago

Summary

हम एक विधि है जिसके द्वारा हम महत्वपूर्ण मानव या murine मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कि इंफ्लूएंजा के वायरल hemagglutinin एक वायरस के लक्ष्य के बंधन के लिए आवश्यक अवशेषों की पहचान का वर्णन । प्रोटोकॉल अंय वायरस सतह नच और उनके इसी बेअसर एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Abstract

इंफ्लूएंजा वायरस एक उल्लेखनीय अनुकूलन और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचने की क्षमता का प्रदर्शन । एक तरह से प्रतिजनी बदलाव के माध्यम से होता है कि सतह पर होते हैं नच का वायरस । भागने वेरिएंट की पीढ़ी elucidating कैसे वायरस प्रतिरक्षा का पता लगाने से बचने और एंटीबॉडी बंधन के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण अवशेषों की पहचान करने में एक शक्तिशाली तरीका है । यहां, हम कैसे इंफ्लूएंजा उत्पंन करने के लिए पर एक प्रोटोकॉल का वर्णन मानव या murine मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) वायरल hemagglutinin के खिलाफ निर्देशित (HA) का उपयोग करके वायरस से बच वेरिएंट । हमारी तकनीक के उपयोग के साथ, हम पहले से ही महत्वपूर्ण या तो सिर या उपंयास एवियन H7N9 हा के डंठल को लक्षित एंटीबॉडी के बंधन के लिए आवश्यक अवशेषों की विशेषता । प्रोटोकॉल आसानी से अंय वायरस प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । भागने वेरिएंट का विश्लेषण प्रतिजनी बहाव मॉडलिंग के लिए महत्वपूर्ण हैं, एक न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं (SNPs) प्रतिरोध और वायरस स्वास्थ्य प्रदान, और टीकों और/या चिकित्सीय चिकित्सा के डिजाइन में निर्धारित ।

Introduction

अंय आरएनए वायरस के समान, इंफ्लूएंजा एक वायरस एक त्रुटि प्रवण पोलीमरेज़ कि प्रतिकृति के प्रत्येक दौर के साथ एक भीड़ की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है1,2,3। इंफ्लूएंजा एक वायरस के लिए एक आश्चर्यजनक अनुकूलन और प्रतिजनी बहाव है, जो सतह नच कि एंटीबॉडी बंधन के नुकसान की ओर जाता है पर उत्परिवर्तनों के एक संचय के माध्यम से हासिल की है के माध्यम से मानव प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचने की क्षमता है । वायरल सतह के प्रतिजनी बहाव नच, हा और neuraminidase (NA), आवश्यक वैक्सीन को सालाना तैयार करने और व्यवस्थापित करने की जरूरत है.

अलगाव और प्रतिजन-विशिष्ट एंटीबॉडी की पीढ़ी में तकनीकी प्रगति टीके की एक उच्च संख्या-प्रेरित mAbs4,5,6,7,8में झुकेंगे । बारी में, mAbs के epitopes के लक्षण वर्णन है कि मोटे तौर पर इंफ्लूएंजा एक वायरस बहुत कई सार्वभौमिक इंफ्लूएंजा टीके के विकास के लिए सहायता प्राप्त है बेअसर9,10,11, 12,13,14. Elucidating एक मॉब के प्रतिजनी पदचिह्न बेअसर के संरचनात्मक निर्धारकों को पता चलता है और वैक्सीन डिजाइन की दिशा में एक सूचित दृष्टिकोण के लिए अनुमति देता है । हालांकि, यह न तो यथार्थवादी है और न ही लागत प्रभावी प्रयोगशालाओं के लिए एक्स-रे क्रि या क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से mAbs के व्यापक पैनलों की विशेषता के लिए वायरल प्रतिजन पर epitopes नक्शा करने के लिए15, 16 , 17 , 18.

एक्स-रे क्रि या क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी महंगे उपकरणों की आवश्यकता है, विशेष तकनीक और संभावित डेटा उत्पन्न करने के लिए समय की एक व्यापक राशि. एक वैकल्पिक और तेजी से दृष्टिकोण त्रुटि प्रवण आरएनए-निर्भर आरएनए पोलीमरेज़ के माध्यम से विविध वायरल आबादी के तेजी से उत्पादन का उपयोग कर रहा है बच म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए mAbs के epitopes का निर्धारण करने के लिए19,20, 21,22,23. भागने वेरिएंट की पीढ़ी किसी विशेष उपकरण या तकनीक की आवश्यकता नहीं है और पारंपरिक प्रयोगशाला एजेंट और उपकरणों के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है ।

यहां, हम एक विधि है कि महत्वपूर्ण मॉब बाध्यकारी है कि इंफ्लूएंजा हा पहचान के लिए आवश्यक अवशेषों के मानचित्रण के लिए अनुमति देता है का वर्णन ।

Protocol

< p class = "jove_content" > सावधानी: इंफ्लूएंजा के एक नंबर मानव आबादी में घूम वायरस ( जैसे , H1, H3) है कि देखभाल और उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए 2 वर्ग रोगजनकों है । वायरस की हैंडलिंग संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए । माउंट सिनाई में संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा निम्नलिखित प्रोटोकॉल को अनुमोदित किया गया ।

< p class = "jove_content" > ध्यान दें: हा-विशिष्ट एंटीबॉडी कि वायरल प्रतिकृति को बाधित आम तौर पर मैं में वर्गीकृत किया जा सकता है) लोगों कि बांध पर या गोलाकार सिर और द्वितीय के शीर्ष पर रिसेप्टर बाइंडिंग साइट के आसंन) लोगों कि बाँध के बाहर की रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन, जो गोलाकार सिर और हा के डंठल क्षेत्र के पार्श्व पक्ष भी शामिल है । एंटीबॉडी कि लक्ष्य रिसेप्टर बाइंडिंग साइट लक्ष्य कोशिकाओं की सतह पर sialic एसिड रूपांकनों की सगाई को रोकने और एक hemagglutination अवरोध (हाय) परख का उपयोग कर मापा जा सकता है. एंटीबॉडी कि हाय-नकारात्मक हैं, ऐसे डंठल के रूप में विशेष एंटीबॉडी, अभी भी वायरल प्रतिकृति को बाधित कर सकते हैं, लेकिन केवल बेअसर परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है ।

< p class = "jove_title" > 1. हाय और बेअसर गतिविधियों पर आधारित एंटीबॉडी को श्रेणीबद्ध करना

  1. hi परख
    1. एक ९६-well V-नीचे की थाली में, 25 & #181, कॉलम 2 से 12 पर 1x पंजाबियों के एल जोड़ें ।
    2. पतला मॉब 7B2 (head-विशिष् ट), 6F12 (डंठल-विशिष् ट) < सुप class = "xref" > 23 और एक isotype कंट्रोल को १०० & #181; g/mL में 1x पंजाबस और aliquot ५० & #181; 1 कॉलम में पतला एंटीबॉडी की तैयारी के एल । इसके अलावा ५० & #181 को जोड़कर कोई मॉब नियंत्रण शामिल करें; 1x पंजाब के एल (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a ).
    3. 2-गुना सीरियल कमजोर पड़ने से एंटीबॉडी का स्थानांतरण करके 25 & #181; L कॉलम 1 से कॉलम 2 तक, और आगे । अंतिम 25 & #181; L को स्तंभ 12 से छोड़ें (< सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्र 1a ).
      नोट: कोई एंटीबॉडी नियंत्रण की एक पंक्ति शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    4. वायरस शेयर (एक मिश्रित वायरस के एक//8 hemagglutination इकाइयों के लिए/25 & #181; L पतला वायरस स्टॉक को कमजोर करने के लिए (a/कैलिफोर्निया/04/09 के आंतरिक क्षेत्रों के साथ एक// इसमें 25 & #181; पतला वायरस स्टॉक (8 hemagglutination) को प्रत्येक वेल (पंक्तियाँ A से G) तक जोड़ें ।
      नोट: एंटीबॉडी और वायरस के मिश्रण का अंतिम आयतन होना चाहिए ५० & #181; L का प्रारम्भिक अंतिम एकाग्रता के साथ ५० & #181; g/mL.
    5. ४५ min.
      6. के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर थाली मशीन बैक-अनुमापन पंक्ति (H) के लिए
    6. , add ५० & #181; H2 को H12 करने वाले कुओं पर 1x पंजाबियों का एल. Add १०० & #181; l के 8 hemagglutination इकाइयों/25 & #181; l से वेल H1. प्रश्नपत्र पतला कर दो गुना स्थानांतरित करके ५० & #181; L H1 से H2, और आगे । अंतिम ५० & #181; L को अच्छी तरह से H12 से त्यागें । अंत में, जोड़ें ५० & #181; L के ०.५% चिकन लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) ९६ के सभी कुओं के लिए अच्छी तरह से वी नीचे प्लेट.
      नोट: मॉब नमूनों की परख में अंतिम मात्रा होनी चाहिए १०० & #181; l: मॉब (25 & #181; l), विषाणु (25 & #181; l) और आरबीसी (५० & #181; l). कोई मॉब नियंत्रण के अंतिम खंड में शामिल होना चाहिए 25 & #181; l 1x पंजाबन, 25 & #181; l of virus और ५० & #181; l आरबीसी.
    7. पर प्लेट को 4 & #176; ग के लिए 1 ज.
    8. नेत्रहीन उच्च गतिविधि के लिए प्लेटें पढ़ें । यदि कोई विशेष एंटीबॉडी के लिए कोई धनात्मक readout है, तो एस्केप भिन्न रूप जनरेट करने के लिए चरण २.१ पर आगे बढ़ें । यदि एंटीबॉडी हाय-नकारात्मक है, नीचे आगे बढ़ना १.२ कदम के आकलन के लिए अगर एंटीबॉडी एक सेल संस्कृति परख में गतिविधि बेअसर है ।
      नोट: एक उच्च सक्रिय मॉब के एक सकारात्मक readout एक अच्छी तरह से केंद्र में एक गहरे लाल आरबीसी गोली द्वारा संकेत दिया है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b ; 7B2 ) कि एक आंसू ड्रॉप जब ९६-अच्छी तरह से वी नीचे प्लेट एक ४५ & #176 पर आयोजित किया जाता है फार्म का होगा; कोण । एक नकारात्मक readout अच्छी तरह से (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b ; 6F12 और कोई मॉब) में एक गहरे लाल आरबीसी गोली फार्म नहीं होगा । isotype नियंत्रण भी एक गहरे लाल आरबीसी गोली फार्म नहीं होगा और डंठल के समान दिखना चाहिए-विशिष्ट एंटीबॉडी, 6F12 या कोई मॉब नियंत्रण नमूना (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b ) < सुप वर्ग = "xref" > २३ .
  2. Microneutralization परख
    1. प्लेट मडि़हान डार्बी कुत्ते गुर्दे (MDCK) कोशिकाओं के घनत्व पर 2 x 10 4 कोशिकाओं/एक ऊतक संस्कृति में इलाज ९६-अच्छी तरह से थाली और गर्मी में ३७ & #176; ग और 5% कं 2 के लिए 17 से 19 ज .
      नोट: कोशिकाओं को भी उपयोग करने से पहले 4 एच की एक ंयूनतम के लिए अच्छी तरह से नीचे का पालन करने की अनुमति दी जा सकती है ।
      2. एक अलग ९६-खैर प्लेट में
    2. , मानव मॉब के सात 3-गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने 4D05 5 , CR9114 17 या isotype आईजीजी नियंत्रण, २०० & #181 के एक प्रारंभिक एकाग्रता में; g/एमएल 1x ंयूनतम आवश्यक माध्यम (मेम) में पूरक tosyl phenylalanyl chloromethyl कीटोंन (TPCK)-स्वास्थ्यकर्मी trypsin (1 & #181; g/mL) (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ).
      नोट: पंक्ति A को शामिल करना चाहिए ७५ & #181; पतला एंटीबॉडी के एल (२०० की एकाग्रता शुरू & #181; g/एमएल) । प्रश्नपत्र पतला (3 गुना) प्लेट से नीचे 25 & स्थानांतरित करके #181; L पंक्ति A से पंक्ति B तक, और आगे भी । पंक्तियों a to H का अंतिम खंड होना चाहिए ५० & #181; L. कमजोर पड़ने वाले तबादलों के बीच सुझावों को बदलने की जरूरत नहीं है ।
    3. वायरस के स्टॉक को पतला (एक/शंघाई के आंतरिक खंड के साथ-साथ एक//13 के लिए एक//8/34) ५०% ऊतक संस्कृति संक्रामक खुराक (TCID ५० ) के एक १०० करने के लिए/५० & #181; एल में 1x मेम TPCK के साथ पूरक-इलाज trypsin (1 & #181; g/मब) < सुप class = "xref" > 24 . Add ५० & #181; एंटीबॉडी तैयारियों (step 1.2.2) को पतला करने वाले विषाणुओं का भी L/ Add ५० & #181; अनसंक्रमित कोशिका नियंत्रण कुओं के लिए 1x मेम के एल.
    4. में वायरस-एंटीबॉडी मिश्रण को एक ३७ & #176; सी मशीनर (5% कं 2 के साथ) 1 ज.
      के लिए नोट: वायरस-एंटीबॉडी मिश्रण का कुल आयतन होना चाहिए १०० & #181; l: ५० & #181; l एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के (कदम 1.1.2) और ५० & #181; l वायरस युक्त १०० TCID ५० (step 1.2.3).
    5. महाप्राण कुएँ में मीडिया को जोड़कर पूरे १०० & #181; वायरस के एंटीबॉडी मिश्रण के अनुरूप कुओं को.
      नोट: आकांक्षा एक वैक्यूम करने के लिए संलग्न एक 8 चैनल aspirator एडाप्टर का उपयोग किया जाता है । वैकल्पिक रूप से, एक 8 या 12-अच्छी तरह से मल्टीचैनल माइक्रो-पिपेट मैंयुअल रूप से महाप्राण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इनोक्युलम हटाने या धोने के दौरान सभी आकांक्षा एंटीबॉडी के उच्चतम एकाग्रता से सबसे कम करने के लिए, सुझावों को बदलने की आवश्यकता के बिना किया जाता है ।
    6. वाश के साथ monolayer को २०० & #181; 1x पंजाब के एल. महाप्राण २०० & #181; 1x पंजाबियों के एल (चरण 1.2.5 में के रूप में) । एक बार दो धोने की कुल के लिए और अधिक धुलाई दोहराएं ।
    7. को जोड़कर MDCK कोशिकाओं के monolayer को संक्रमित करते हैं पूरे १०० & #181; L/वायरस-एंटीबॉडी मिश्रण (step 1.2.4 से) के monolayer पर ३७ & #176; ग (5% कं 2 ) के साथ 1 ज.
    8. संक्रमण के दौरान, एक अलग ९६ में अच्छी तरह से थाली, एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का एक और सेट तैयार करते हैं । Add १५० & #181; L के १०० & #181; g/एमएल के संबंधित एंटीबॉडी की पंक्ति A और १०० & #181; L 1x मेम का पूरक के साथ TPCK-स्वास्थ्यकर्मी trypsin (1 & #181; g/mL) पंक्तियों में b से H. ५० को स्थानांतरित करके 3 गुना कमजोर पड़ने का प्रदर्शन & #181; L से पंक्ति A से पंक्ति b , और आगे, पंक्ति के लिए नीचे h. छोड़ें पिछले ५० & #181; L से पंक्ति h. प्रत्येक कुआं के लिए कुल मात्रा बराबर होनी चाहिए १०० & #181; L. सेट एक तरफ.
      नोट: एंटीबॉडी 1x मेम में TPCK-इलाज trypsin के साथ पूरक पतला कर रहे हैं (1 & #181; g/mL).
    9. महाप्राण से वायरस-एंटीबॉडी इनोक्युलम से monolayer चरण 1.2.7 में और पूरे १०० & #181 के साथ मंगाया जाता है; एंटीबॉडी चरण 1.2.8 में तैयार उपयुक्त
      कमजोर पड़ने के ठीक/ नोट: यदि एक अच्छी तरह से समाहित १०० & #181 की अंतिम एंटीबॉडी एकाग्रता; g/ml संक्रमण (step 1.2.7) के दौरान, फिर भरपाई मीडिया में भी १०० & #181 की अंतिम एंटीबॉडी एकाग्रता होनी चाहिए; g/मब (step 1.2.8) ।
    10. में 24 ज के लिए ३७ & #176; सी मशीनर (5% कं 2 के साथ).
    11. महाप्राण से मीडिया ने ९६-वेल प्लेट्स और वाश विथ २०० & #181; 1x पंजाबस के तीन बार के एल/
    12. के साथ कोशिकाओं को ठीक करें १०० & #181; L के शीत ८०% एसीटोन के लिए 1 ज पर-20 & #176; C.
      नोट: ८०% एसीटोन समाधान में पतला है डबल आसुत (डीडी) एच 2 ओ ( जैसे , ८० मिलीलीटर की १००% एसीटोन प्लस 20 मिलीलीटर की ddH 2 0) । ८०% एसीटोन समाधान का उपयोग करने से पहले बर्फ पर ठंडा किया जा सकता है ।
    13. धोने से कोशिकाओं को २०० & #181; 1x पंजाबस के तीन बार के एल/
    14. के साथ प्लेटों को ब्लॉक करें २०० & #181; एल/5% दूध का अच्छा 1x पंजाबियों में पतला और आरटी पर 1 h.
      15. के लिए मशीन प्लेट
    15. Add १०० & #181; biotinylated विरोधी इंफ्लूएंजा एक nucleoprotein (एनपी) प्राथमिक एंटीबॉडी पतला 1:2000 में 1x पंजाबियों/1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) और आरटी पर 1 ज.
      के लिए मशीन प्लेट नोट: इंफ्लूएंजा बी वायरस के लिए, एक इंफ्लूएंजा बी वायरस विशेष विरोधी एनपी एंटीबॉडी इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
    16. ने तीन बार 1x पंजाबियों के साथ प्लेटें धो दीं ।
    17. Add १०० & #181; streptavidin के एल-हार्स मूली peroxidase (एचआरपी) संयुग्म एंटीबॉडी पतला 1:3000 में 1x पंजाबस/1% BSA और आरटी पर 1 ज.
      18. के लिए प्लेटें मशीन
    18. के साथ प्लेटें धोना २०० & #181; 1x पंजाब के तीन बार के एल.
    19. जोड़ें एचआरपी सब्सट्रेट एजेंट पर १०० & #181; L/अच्छी तरह से और भ.
      पर अंधेरे में गर्मी नोट: मशीन समय अम्लीय रोक बफर के अलावा से पहले अनुकूलित किया जाना चाहिए (नीचे). सामांयतया, 15 से 30 मिनट के लिए पर्याप्त है ।
    20. शमन के साथ रिएक्शन ५० & #181; 5 एम एचसीएल का अच्छा/
      चेतावनी: 5M एचसीएल एक उच्च संक्षारक एजेंट है कि आंखों, त्वचा और श्लेष्मा झिल्ली को नुकसान का कारण बन सकता है । इस एजेंट के अलावा उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ एक वेंट हूड के तहत किया जाना चाहिए ।
    21. ४९२ एनएम पर प्लेटें पढ़ें और पृष्ठभूमि (संक्रमित कोशिकाओं) कुओं घटाना ।
    22. निम्न सूत्र के साथ प्रतिशत अवरोध की गणना:
      < img alt = "समीकरण" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067eq1.jpg"/>
    23. यदि कोई एंटीबॉडी बेअसर गतिविधि (और कोई उच्च गतिविधि) है, तो चरण २.२ के लिए आगे बढ़ें ।
      नोट: एंटीबॉडी कि कमी में इन विट्रो बेअसर गतिविधि कमी होगी हाय गतिविधि.
< p class = "jove_title" > 2. एस्केप उत्परिवर्ती वेरिएंट की पीढ़ी

< p class = "jove_content" > नोट: एंटीबॉडी कि है या कमी उच्च गतिविधि को निष्क्रिय आगे विशिष्ट प्रोटोकॉल के साथ नीचे वर्णित के साथ विश्लेषण कर रहे हैं ।

  1. प्रोटोकॉल 1: हाय-पॉजिटिव/बेअसर-पॉजिटिव एंटीबॉडी ( < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 ए )
    1. 10 6 पट्टिका बनाने इकाइयों/milliliter (PFU/एमएल) में 1x पंजाब में एक वायरस स्टॉक तैयार a ४०० & #181; L volume.
    2. ( उदा. , 0, ०.५, ०.०५ और ०.००५ मिलीग्राम/एमएल) के एंटीबॉडी के चार कमजोर पड़ने को बढ़ाने में ब्याज की मात्रा में 1x पंजाब में १०० & #181; L कमजोर पड़ने के प्रति.
      नोट: जंगली प्रकार के वायरस हमेशा समानांतर में और एंटीबॉडी के अभाव में पारित किया जाना चाहिए । इन पारित वायरस के अनुक्रम कोशिका संस्कृति की स्थिति और बच उत्परिवर्तनों के लिए अनुकूलन के बीच भेद करने में सहायता करेगा ।
    3. Mix १०० & #181; l के 10 6 PFU/एमएल के साथ वायरस के १०० & #181; l प्रत्येक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने या १०० & #181 के; l 1x पंजाबियों के.
    4. में 1 ज के लिए ३७ & #176; सी मशीनर (5% कं 2 के साथ) । भंवर संक्षेप में । इंजेक्षन २०० & #181; प्रत्येक मिश्रण के एल में विशिष्ट-रोगज़नक़ मुक्त (SPF) embryonated चिकन अंडे.
    5. पर अंडे की मशीन ३७ & #176; ग (बिना कं 2 ) के लिए 40-44 h.
    6. बलिदान वायरस संक्रमित-embryonated अंडे की मशीन द्वारा 4 & #176; ग के लिए कम से कम 6 ज.
    7. फसल को अंडों से allantoic द्रव, जैसा कि पहले बताया < सुप class = "xref" > 24 , < सुप class = "xref" > 25 .
    8. प्रदर्शन hemagglutination परख, जैसा कि ऊपर वर्णित < सुप class = "xref" > 24 , < सुप class = "xref" > 26 . यदि allantoic द्रव की तैयारी के सभी hemagglutination titers नहीं है, एंटीबॉडी कमजोर पड़ने से लेकर चरण 2 से दोहराएं ०.००५ मिलीग्राम/एमएल से ०.००००५ मिलीग्राम/एमएल
      नोट: एक उच्च सकारात्मक एंटीबॉडी के एक संतृप्त एकाग्रता सभी वायरस कणों मौजूद बेअसर हो सकता है. इसलिए, यह passaging में मौजूद एंटीबॉडी की मात्रा में कमी करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
    9. हाय परख प्रदर्शन द्वारा एस्केप वेरिएंट की पुष्टि करें < सुप वर्ग = "xref" > २४ (स्टेप १.१).
      नोट: उच्च सक्रिय एंटीबॉडी ब्लॉक के लक्ष्य कोशिकाओं पर sialic एसिड रूपांकनों के हा सगाई । इसलिए, अपने cognate एंटीबॉडी की उपस्थिति में एक वायरस agglutinate कोशिकाओं (आरबीसी गोली की उपस्थिति) की क्षमता खो देता है । सैद्धांतिक रूप से, उच्च सक्रिय एंटीबॉडी का बच वेरिएंट अभी भी अपने cognate एंटीबॉडी की उपस्थिति में sialic एसिड रूपांकनों बाँध कर सकते हैं और इस तरह कोशिकाओं (कोई आरबीसी गोली) agglutinate कर सकते हैं. एंटीबॉडी ब्याज की हाय अभी भी detectable है, तो एंटीबॉडी.
      10. के एक उच्च शुरू एकाग्रता के साथ कदम 2.1.2 से प्रोटोकॉल दोहराएँ
  2. प्रोटोकॉल 2: हाय-नकारात्मक/बेअसर-पॉजिटिव एंटीबॉडी ( < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 बी )
    नोट: आदेश में कमी हाय कि एंटीबॉडी बेअसर के खिलाफ भागने वेरिएंट उत्पन्न करने के लिए गतिविधि, वायरस एंटीबॉडी की मात्रा में वृद्धि की उपस्थिति में पारित किया जाना चाहिए ।
    1. प्लेट MDCK कोशिकाओं में एक 6-खैर प्लेट में एक घनत्व पर 1 x 10 6 कोशिकाओं/अच्छी तरह से और एक ३७ & #176 में 4 एच के लिए कम करने के लिए मशीन; सी मशीन (5% कं 2 के साथ).
    2. वायरस स्टॉक को पतला करने के लिए 10 6 PFU/एमएल या पिछले बीतने से वायरस 1x मेम में TPCK-स्वास्थ्यकर्मी trypsin के साथ (1 & #181; g/mL) एक ५०० & #181 में; L volume.
    3. एंटीबॉडी के एक कमजोर पड़ने तैयार (०.०२ मिलीग्राम/एमएल मूल मार्ग के लिए या उच्च सभी निंनलिखित मार्ग के लिए) 1x मेम में TPCK-स्वास्थ्यकर्मी के साथ trypsin में एक २५० & #181; L volume.
    4. Mix २५० & #181; पतला वायरस के l के साथ २५० & #181; l के पतला एंटीबॉडी (+ एंटीबॉडी) या २५० & #181; l of 1x मेम (नो एंटीबॉडी कंट्रोल).
    5. एक ३७ & #176 में 30 मिनट के लिए वायरस-एंटीबॉडी मिश्रण मशीन, सी मशीन (5% सह 2 के साथ).
    6. महाप्राण ने एक ग् पाश्चर पिपेट का इस् तेमाल करते हुए मीडिया को monolayer की 1 मिलीलीटर वाली कोशिकाओं की धुलाई की ।
    7. Add ५०० & #181; कुएं में मिश्रण के एल और एक ३७ & #176 में मशीन; सी मशीनर (5% कं 2 के साथ) 1 h.
      8. के लिए
    8. 1 ज के बाद, TPCK-इलाज trypsin (1 & #181; g/mL) के साथ 1x मेम के 2 मिलीलीटर के साथ कुओं का पूरक ।
    9. ४८ एच पद पर कोशिकाओं की जांच-माइक्रोस्कोप पर cytopathic प्रभाव (सीपीई) के लक्षण के लिए संक्रमण या वायरल वृद्धि का पता लगाने के लिए एक hemagglutination परख प्रदर्शन < सुप क्लास = "xref" > २६ .
    10. अगर वहां एंटीबॉडी के साथ पूरक संस्कृतियों में सकल सीपीई है, कई क्रायो में supernatant फसल-ट्यूबों, मार्ग संख्या के साथ लेबल और पर स्टोर-८० & #176; C.
    11. Save १०० & #181; supernatant के एल TPCK-trypsin और एंटीबॉडी के साथ अनुपूरक 1x मेम की 2 मिलीलीटर के साथ MDCKs के एक ताजा monolayer को संक्रमित करने के लिए । हर मार्ग के लिए कोई एंटीबॉडी नियंत्रण शामिल करने के लिए याद रखें ।
      नोट: अगले मार्ग (हर दो दिन) में दो गुना (या शोधकर्ता के विवेक पर) द्वारा एंटीबॉडी की एकाग्रता में वृद्धि ।
    12. प्रत्येक लगातार बीतने में एंटीबॉडी की एकाग्रता में वृद्धि जब तक वायरस विकास अभी भी एक अंतिम एकाग्रता के साथ व्यवहार्य है ०.६ मिलीग्राम/एमएल के एंटीबॉडी । प्रत्येक मार्ग के supernatant की एकाधिक शीशियों फ्रीज और स्टोर पर-८० & #176; ग.
      नोट: कोई एंटीबॉडी नियंत्रण एक मार्ग से दूसरे में वायरस के विकास की पुष्टि करने में महत्वपूर्ण है । यदि कोई एंटीबॉडी नियंत्रण में सकल सीपीई है, लेकिन + एंटीबॉडी समूह में कोई सीपीई, यह इंगित करता है कि एंटीबॉडी की एकाग्रता बहुत अधिक था और कोई बच वेरिएंट उत्पन्न किया गया. यदि कोई एंटीबॉडी नियंत्रण में सकल सीपीई है, लेकिन + एंटीबॉडी समूह में केवल मध्यम सीपीई, यह संभावित भागने वेरिएंट की उपस्थिति को इंगित करता है. अगले मार्ग में, गद्यांश की मात्रा बढ़ा कर २०० & #181; supernatant के एल और एस्केप वेरिएंट पैदा करने की संभावना को बढ़ाने के लिए एंटीबॉडी की एकाग्रता बनाए रखें ।
< p class = "jove_title" > 3. पट्टिका शुद्धिकरण के माध्यम से एस्केप वेरिएंट का अलगाव

  1. प्लेट MDCK कोशिकाओं में एक 6-खैर प्लेट में 1 x 10 6 कोशिकाओं के घनत्व पर/अच्छी तरह से और एक ३७ & #176 में 4 एच के लिए मशीन; सी मशीन (5% कं 2 के साथ).
  2. TPCK-इलाज trypsin के साथ 1x मेम में एंटीबॉडी पतला ३०० पर शुरू & #181; g/mL की मात्रा में २५० & #181; l और मिश्रण के साथ २५० & #181; इसी एस्केप उत्परिवर्ती वायरस के एल. वायरस एंटीबॉडी के अभाव में पारित भी पट्टिका शुद्ध किया जाना चाहिए ।
  3. कोशिकाओं से मीडिया को महाप्राण, 1x पंजाबियों से तीन बार धो लें और पूरे ५०० & #181 जोड़ें; वायरस-एंटीबॉडी मिक्सचर (step ३.२) के एल.
  4. एक ३७ & #176 में 1 ज के लिए प्लेटें, सी मशीन (5% कं 2 के साथ) बनाने के लिए आगे और पीछे हर 10 मिनट के monolayer के सूखने को रोकने के लिए रॉक यकीन है ।
  5. महाप्राण वायरस-एंटीबॉडी मिश्रण और एंटीबॉडी (३०० & #181; g/mL; चरण ३.२) की इसी मात्रा युक्त ओवरले के साथ कुओं की भरपाई ।
  6. एक ३७ & #176 में 40-44 ज के लिए थाली मशीन, सी मशीन (5% कं 2 के साथ).
  7. सर्कल एक नीले या काले रंग का मार्कर के साथ दिखाई पट्टिकाएं उठा पट्टिका की सुविधा के लिए ।
  8. प्रत्येक बच उत्परिवर्ती वायरस के लिए चार पट्टिकाएं उठाओ-एंटीबॉडी संयोजन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जंगली प्रकार के वायरस है कि MDCK कोशिकाओं या एंटीबॉडी के अभाव में अंडे में पारित किया गया ।
  9. ने पट्टिका को फिर से सस्पेंड कर १०० & #181; 1x पंजाबियों के एल.
  10. इंजेक्षन पूरे १०० & #181; पट्टिका के एल एस्केप उत्परिवर्ती वायरस 10 दिन पुराने SPF embryonated चिकन अंडे में.
  11. एक ३७ & #176 में 40-44 ज के लिए अंडे की मशीन; सी मशीन (बिना 5% कं 2 ).
  12. वायरस की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए एक hemagglutination परख प्रदर्शन (१.१ कदम).
< p class = "jove_title" > 4. वायरल आरएनए के निष्कर्षण और हा अनुक्रम भिन्नता का विश्लेषण

  1. से वायरल आरएनए निकालने २०० & #181; एल एस्केप उत्परिवर्ती वायरस allantoic द्रव का एक मोनो-चरणबद्ध समाधान के साथ phenol और guanidine isothiocyanate.
    चेतावनी: Phenol एक अस्थिर तरल एजेंट है कि खांसी, सांस की तकलीफ और मध्यम से संपर्क द्वारा त्वचा जलन पैदा कर सकता है ।
  2. एक रिवर्स transcriptase और जीन के उपयोग के साथ वायरल आरएनए से हा खंड बढ़ाना इंफ्लूएंजा एक हा खंड के लिए विशिष्ट प्राइमरों < सुप वर्ग = "xref" > २७ .
    नोट: 2 तालिका में वर्णित इंफ्लूएंजा बी वायरस के लिए यूनिवर्सल प्राइमर बढ़ाना दोनों हा (~ १,८०० बीपी) और ना (~ १,५०० बीपी) < सुप क्लास = "xref" > 28 .
  3. 1% agarose जेल में आरटी-पीसीआर उत्पाद का समाधान और सही ढंग से आकार बैंड (~ १,८०० bp) काट ।
  4. जेल एक सिलिका-झिल्ली आधारित शुद्धिकरण प्रक्रिया का उपयोग कर पीसीआर उत्पाद निकालें और सीडीएनए sequencing के लिए बाहर भेजें ।
  5. एमिनो एसिड एंटीबॉडी के लिए आवश्यक अवशेषों ख्यात एस्केप वेरिएंट और पारित जंगली प्रकार के वायरस के कारण या तो सेल संस्कृति अनुकूलन या प्रतिरक्षा चयन के लिए पर पाया परिवर्तन विभेदन से पहचान ।
  6. एक pCAGGs अभिव्यक्ति वेक्टर (नोटि और NheI) में जंगली प्रकार या बच संस्करण हा युक्त पीसीआर उत्पाद क्लोन ।
    7. एस्केप वैरिएंट HA के लिए एंटीबॉडी का
  7. बाइंडिंग दो विकल्पों में से एक (या दोनों) नीचे वर्णित के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 5. एस्केप वेरिएंट के एंटीबॉडी बाइंडिंग िरा

  1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस
    1. प्लेट 293T कोशिकाओं के घनत्व पर 2 x 10 4 कोशिकाओं/अच्छी तरह से एक ९६ में प्लेट और मशीन में ३७ & #176; सी मशीन (5% सह 2 के साथ) के लिए 24 एच ।
    2. Transfect के साथ कोशिकाओं को ०.१० & #181; छ/pCAGGS plasmids के साथ अच्छी तरह से बच उत्परिवर्ती हा, वायरस पारित हा, और जंगली-प्रकार हा (एक अभिकर्मक एजेंट के उपयोग के साथ unगद्यांश) एंकोडिंग ।
    3. ९६-अच्छी तरह से प्लेटें ४८ ज में ३७ & #176; सी मशीनर (5% कं 2 के साथ).
    4. फिक्स के साथ १०० & #181; भ.
      पर 15 मिनट के लिए ०.५% paraformaldehyde का L चेतावनी: Paraformaldehyde एक अस्थिर तरल एजेंट है कि खांसी, सांस की तकलीफ और मध्यम से संपर्क द्वारा त्वचा जलन पैदा कर सकता है । इसे एक संभावित ह्यूमन यलो के रूप में नामित किया गया है । एजेंट के अलावा एक वेंट रासायनिक हुड में किया जाना चाहिए ।
    5. के साथ धो लें 1x तीन बार । 1 ज पर RT.
      6. के लिए 1x पंजाब में 5% दूध के साथ ब्लॉक
    6. को तीन बार 1x पंजाबियों से धोएं । 5 & #181; g/एंटीबॉडी के 1 ज पर भ.
      7. के लिए ब्याज के साथ मशीन १०० & #181 के साथ
    7. की मशीन; एंटीबॉडी (एंटी-ह्यूमन या एंटी-माउस Alexa ४८८) के एक कमजोर पड़ने पर 1:2000 1x पंजाब में 1% BSA अंधेरे में आर टी में 1 ज के लिए ।
    8. को तीन बार 1x पंजाबियों से धोएं । सकारात्मक या नकारात्मक धुंधला के लिए एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर कोशिकाओं का निरीक्षण ।
  2. प्रतिदीप्ति-आपन कोशिका छँटाई (FACS)
    1. प्लेट 293T कोशिकाओं के घनत्व पर 2 x 10 5 कोशिकाओं/अच्छी तरह से एक 6-खैर प्लेट में और ३७ पर मशीन & #176; ग (साथ 5% कं 2 ) के लिए 24 ज.
    2. Transfect के साथ कोशिकाओं को ०.५० & #181; छ/अच्छी तरह से pCAGGS plasmids से बच उत्परिवर्ती हा, वायरस केवल पारित हा, और एक अभिकर्मक एजेंट के उपयोग के साथ जंगली-प्रकार हा ।
    3. के लिए 6 अच्छी तरह से प्लेटें ४८ ज पर ३७ & #176; C (5% कं 2 के साथ).
    4. ४८ एच के बाद, विकास मीडिया महाप्राण और 1x पंजाबियों के साथ दो बार धीरे धो (सुनिश्चित करें कि monolayer परेशान है) ।
    5. हार्वेस्ट transfected 293T कोशिकाओं के साथ ५०० & #181; FACS बफर के एल (1x पंजाबस/2% भ्रूण बछड़ा सीरम).
      नोट: FACS बफ़र का उपयोग करने से पहले 4 & #186; C पर पूर्व-ठंडा होना चाहिए ।
    6. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर काटा 293T कोशिकाओं केंद्रापसारक 4 & #176; C.
    7. महाप्राण के FACS बफर, और २०० & #181 के साथ reसस्पैंड; FACS बफर युक्त mAbs के एल ब्याज (अंतिम एकाग्रता 1 से 5 & #181; g/एमएल) । 20 min.
      8. के लिए आर टी पर मशीन
    8. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक 4 & #176; C. धो दो बार के साथ ५०० & #181; L के FACS बफर. एक गिलास पाश्चर पिपेट के साथ सावधानी के रूप में गोली को परेशान नहीं महाप्राण ।
      9. २०० & #181 के साथ
    9. reसस्पैंड; FACS बफ़र के माध्यमिक एंटीबॉडी संयुग्मित युक्त Alexa ४८८ (1:1000 के अंतिम कमजोर पड़ने) के एल । 4 पर अंधेरे में मशीन & #176; C for 20 min.
    10. 5 मिनट के लिए ३०० g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक 4 & #176; C. धो दो बार के साथ ५०० & #181; L के FACS बफर और ध्यान से धोने बफर महाप्राण.
    11. reसस्पैंड in ५०० & #181; L के FACS बफर और mAbs के बंधन का आकलन और/polyclonal सीरा से कोशिकाओं transfected के साथ हा by FACS.
      नोट: कोई मॉब/polyclonal सीरा नियंत्रण के साथ ही प्रयोग में एक untransfected नमूना शामिल करने के लिए याद रखें ।

Representative Results

हम पहले इस विधि के रूपांतरों का इस्तेमाल किया है मानव और murine mAbs मौसमी इंफ्लूएंजा वायरस वैक्सीन, H7N9 टीकाकरण, या अनुक्रमिक डीएनए द्वारा प्रेरित करने के लिए एस्केप वेरिएंट उत्पंन/संयोजक हा प्रोटीन टीकाकरण4,5 ,6,7. जैसा कि ऊपर वर्णित है, एंटीबॉडी पहले हाय और microneutralization परख का उपयोग करने के क्रम में हमें सूचित करने के लिए जो विशिष्ट प्रोटोकॉल अगले4,5के साथ जारी रखने के लिए विशेषता थी । एंटीबॉडी 07-5D03, 07-5F01, 07-5G01, 07-4B03, 07-4E02 और 07-4D05 एवियन H7N9 वायरस (ए/शंघाई/1/2013) (तालिका 1), और इस प्रकार प्रोटोकॉल 1 (चरण २.१) का उपयोग किया गया था के खिलाफ उच्च और बेअसर गतिविधियों के लिए पाया गया । इस तरह के 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 और S6-B01 (तालिका 1), प्रोटोकॉल 2 (चरण २.२) के रूप में कमी उच्च गतिविधि, के साथ mAbs के लिए एस्केप वेरिएंट उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एस्केप उत्परिवर्ती मानचित्रण से पता चला है कि एंटीबॉडी के कई वायरल हा4,5 (चित्रा 4) पर अलग स्थानों में महत्वपूर्ण अवशेषों की पहचान । जबकि उच्च सकारात्मक एंटीबॉडी के बहुमत से बच उत्परिवर्ती अवशेषों के पास पहले से ही H7 हा की एंटीजन साइटों की सूचना दी, हाय-नकारात्मक एंटीबॉडी डंठल क्षेत्र में अंक उत्परिवर्तनों के साथ भागने म्यूटेंट उत्पन्न4,5 .

एंटीबॉडी हाय गतिविधि NEUT गतिविधि
07-5D03 + +
07-5F01 + +
07-5G01 + +
07-4B03 + +
07-4E02 + +
07-4D05 + +
41-5E04 - +
045-051310-2B06 - +
042-100809-2F04 - +
S6-B01 - +

तालिका 1: एंटीबॉडी हाय और बेअसर गतिविधि की मेज । दस H7-विशिष्ट mAbs व्यक्तियों से अलग एक प्रयोगात्मक H7N9 टीका अलग प्रदर्शन इन विट्रो एंटीवायरल गतिविधियों के साथ टीका लगाया5।

फॉरवर्ड प्राइमर (5 ' से 3 ') रिवर्स प्राइमर (5 ' से 3 ') Thermocylcer अटी
IAV TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT ४२ º सी के लिए ६० मिनट, ९४ º सी के लिए 2 मिनट/5 चक्र के लिए ९४ º c के लिए 20 s, ५० º c के लिए 30 s और ६८ º c के लिए 3 मिनट 30 एस, के लिए ४० º c के द्वारा पीछा किया 20 s, के लिए ९४ º c 30 s के लिए , और ६८ º सी के लिए 3 मिनट 30 एस के लिए ६८ º c पर एक अंतिम विस्तार समय के साथ 10 मिनट के लिए
IBV GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC ४५ º सी के लिए ६० मिनट, ५५ º सी के लिए 30 मिनट, ९४ के लिए º सी 2 मिनट के लिए, ९४ º सी के लिए 20 एस, 30 एस के लिए और ४० º सी के लिए 3 मिनट 30 एस, के लिए ६८ º सी के बाद 20 एस के लिए , ५८ º सी के लिए 30 एस, और ६८ º सी के लिए 3 मिनट 30 एस के लिए ६८ º c पर एक अंतिम विस्तार समय के साथ 10 मिनट के लिए

तालिका 2: यूनिवर्सल इंफ्लूएंजा वायरस प्राइमर । इंफ्लूएंजा के हा क्षेत्रों के प्रवर्धन के लिए प्राइमरी जोड़े एक27 और बी28 वायरस और उनके संबंधित thermocycler शर्तों ।

Figure 1
चित्रा 1: हाय परख । (a) एक उच्च परख की स्थापना के लिए एक योजनाबद्ध को दो माउस H1 की गतिविधि परीक्षण विशिष्ट mAbs 7B2 (सिर विशेष) और 6F12 (डंठल-विशेष) का उपयोग कर एक ९६-अच्छी तरह से वी नीचे प्लेट, और (ख) एक हाय परख23के परिणामों का एक उदाहरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Microneutralization परख । एक microneutralization परख की स्थापना के लिए दो मानव mAbs 4D05 की गतिविधि परीक्षण के लिए एक योजनाबद्ध5 और CR911417। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एस्केप म्यूटेंट की जनरेशन । सुझाव दिया पद्धति हाय और एंटीबॉडी द्वारा प्रदर्शित microneutralization गतिविधि पर निर्भर हो जाएगा । के खिलाफ बच म्यूटेंट की पीढ़ी (ए) उच्च सकारात्मक एंटीबॉडी बेअसर अंडे में एक ही मार्ग की आवश्यकता हो सकती है, जबकि (बी) बेअसर उच्च नकारात्मक एंटीबॉडी में एंटीबॉडी मात्रा में वृद्धि के साथ कई मार्ग शामिल हो सकते हैं कोशिका ऊतक संस्कृति । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एक epitope के नक्शे का एक उदाहरण के उपंयास एवियन H7N9 हा एस्केप उत्परिवर्ती वेरिएंट के साथ उत्पंन । टीका-प्रेरित एंटीबॉडी एक उंमीदवार H7N9 इंफ्लूएंजा एक टीके के साथ टीका लगाया व्यक्तियों से अलग से बच उत्परिवर्ती वेरिएंट उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । प्रत्येक लाल रंग में संकेत अवशेष एक मॉब के कुशल बंधन के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण अमीनो एसिड के स्थान का प्रतिनिधित्व करता है । डेटा Dunand-हेनरी एट अल, २०१५4से अनुकूलित किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

हालांकि बच म्यूटेंट के द्वारा की पहचान अवशेषों के बहुमत सटीक गया है, इस दृष्टिकोण के प्रमुख निरंतर में से एक यह है कि भागने के वेरिएंट के बिंदु उत्परिवर्तन जरूरी एंटीबॉडी के आणविक पदचिह्न के भीतर नक्शा के रूप में निर्धारित नहीं कर सकते है संरचनात्मक विश्लेषण । यह एक निश्चित अवशेषों में एक उत्परिवर्तन की क्षमता के कारण है, एक allosteric प्रभाव के अनुरूप रूपांतरित अवशेषों के स्थान के लिए बाहर एक संरचना परिवर्तन का नेतृत्व करने के लिए । एक और सीमा यह है कि इस पद्धति केवल एंटीबॉडी बेअसर करने के लिए लागू किया जा सकता है; एंटीबॉडी कि इन विट्रो में कमी चयनात्मक दबाव म्यूटेंट भागने के लिए नेतृत्व नहीं होगा. हालांकि, इस सीमा से बचने के एक पैनल के उपयोग के साथ काबू किया जा सकता है पहले विशेषता बेअसर एंटीबॉडी द्वारा उत्पंन की गई । टैन एट अल. H7N9 वायरस के लिए एक बेअसर मॉब के एक भागने के संस्करण का इस्तेमाल किया एक गैर के epitope नक्शा एंटीबॉडी7बेअसर ।

बहरहाल, elucidating भागने वेरिएंट की पीढ़ी के माध्यम से एंटीबॉडी के epitopes क्रि और क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, दोनों जिनमें से उपकरणों की एक व्यापक निवेश की आवश्यकता के लिए एक व्यवहार्य विकल्प प्रदान करता है । अन्य विकल्प alanine स्कैनिंग या पेप्टाइड स्कैनिंग/म्यूटेंट का उपयोग कर mAbs के न्यूनतम बाइंडिंग क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए कर रहे हैं । Alanine स्कैनिंग mutagenesis29स्क्रीनिंग के दौरान वेरिएंट की एक बड़ी संख्या पैदा करने में काम की एक महत्वपूर्ण राशि की आवश्यकता हो सकती है, जबकि पेप्टाइड स्कैनिंग रैखिक epitopes के लिए सीमित है30. विधि इस प्रोटोकॉल में वर्णित कोई विशेष उपकरण या तकनीक और वास्तव में की आवश्यकता है, इन विट्रो बेअसर परख के लिए ब्याज की एंटीबॉडी के भागने के वेरिएंट उत्पंन संशोधित में मौजूदा का उपयोग करता है ।

कई मार्ग (उदा, डंठल-विशिष्ट एंटीबॉडी) की आवश्यकता है कि एस्केप वेरिएंट पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल एंटीबॉडी के शुरू एकाग्रता पर अत्यधिक निर्भर है 0 मार्ग में । यह सावधानी के पक्ष में गलती और एक लॉग में शुरू करने के लिए एक एंटीबॉडी के आधे से अधिक अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता से कम और मजबूत वायरस के विकास के लिए अनुमति देने के लिए बेहतर है । शोधकर्ता कल्पना कर सकते है कि कम प्रतिरक्षा दबाव की उपस्थिति में एक उच्च titer वायरस संस्कृति वायरल जनसंख्या में एक बड़ी आनुवंशिक भिन्नता होगी । एस्केप वेरिएंट के लिए धीरे से निम्नलिखित मार्ग में एंटीबॉडी एकाग्रता में वृद्धि के द्वारा चुना जा सकता है । इस स्थिति में कि वायरस की वृद्धि कम हो जाती है, वायरल supernatant की मात्रा पिछले बीतने में एंटीबॉडी एकाग्रता की समान मात्रा को बनाए रखते हुए अगले मार्ग में वृद्धि की जा सकती है.

यूनिवर्सल इंफ्लूएंजा टीके के बहुमत के उद्देश्य के लिए हा के डंठल क्षेत्र की ओर एक मजबूत एंटीबॉडी प्रतिक्रिया बटोरना है । डंठल-विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए भागने वेरिएंट के विश्लेषण इंफ्लूएंजा वायरस फिटनेस और प्रतिरक्षा दबाव के बीच संबंध को परिभाषित करने में महत्वपूर्ण हैं । दिलचस्प बात यह है, बच उत्परिवर्ती डंठल से उत्पंन वायरस-विशिष्ट mAbs सभी murine LD में vivo में तनु थे५० अध्ययन4। ये अध्ययन डंठल आधारित टीकाकरण प्लेटफार्मों के लिए एक मजबूत मामले प्रदान करते हैं । इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल छोटे अणु अवरोधकों के रूप में अन्य विरोधी वायरल यौगिकों, के लिए भागने म्यूटेंट की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, यह पद्धति इंफ्लूएंजा वायरस सतह नच तक ही सीमित नहीं है, लेकिन यह भी अधिक व्यापक रूप से अंय वायरल नच की epitopes निर्धारित करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

इस परियोजना के राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग, CEIRS अनुबंध HHSN272201400008C (F.K.) के तहत के संस्थानों से संघीय धन के साथ भाग में वित्त पोषित किया गया है; NIH U19AI109946-01 (F.K.); और P01AI097092-04S1 (P.E.L.) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid Corning, Inc. 353072 Assay plate use for the microneutralization assay
Falcon 96-well clear V-bottom plate Corning, Inc. 353263 Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay
1X Minimal Essential Medium (MEM) Gibco 11095080 Infection medium
Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Cleaves immature HA0 to HA1 and HA2
Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV) EMD Millipore MAB8258B An antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses
Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV) EMD Millipore MAB8260B-5 An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses
Streptavidin-HRP antibody EMD Millipore 18-152 This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody
HRP substrate (SIGMAFAST-OPD) Sigma-Aldrich P9187-5SET o-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP
96-well V-bottom plate Nunc 249662 Assay plate used for the hemagglutination assay
Chicken red blood cells Lampire Biological Laboratories 7201403 Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate
TRIzol Ambion 15596026 Extraction of RNA
Superscript III Invitrogen 12574018 Reverse transcriptase
Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Isolation of amplified PCR product
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668027 Transfection reagent
Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11013 Fluorescent secondary antibody for human antibodies
Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11001 Fluorescent secondary antibody for murine antibodies
6-well polystyrene microplate Corning, Inc. 353934
UltraPure Agarose Invitrogen 16500500
Nalgene long term storage Cryo-tubes ThermoFisher Scientific 5012-0020 Freezing of viral culture supernatant
reassortant A/California/04/09 (H1) Palese Laboratory reassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)
reassortant A/Shanghai/1/13 (H7) Palese Laboratory reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)
Bovine serum albumin solution (35%) Sigma-Aldrich A7979
Qiagen gel extration kit Qiagen 28704 Silica-membrane-based purification of DNA fragments

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References

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