Summary
Descriviamo un metodo con cui identifichiamo residui critici necessari per l'associazione di anticorpi monoclonali umani o murini destinati l'emoagglutinina virale del virus di riossidazione A. Il protocollo può essere adattato ad altre glicoproteine di superficie del virus e loro corrispondenti anticorpi neutralizzanti.
Abstract
Virus influenzali esibiscono una notevole capacità di adattarsi e di eludere la risposta immunitaria. Un modo è attraverso cambiamenti antigenici che si verificano sulle glicoproteine di superficie del virus. La generazione di varianti di fuga è un metodo potente nel delucidamento come virus sfuggire rilevazione immune e nell'identificazione di residui critiche necessarie per il legame dell'anticorpo. Qui, descriviamo un protocollo su come generare varianti di fuga del virus di riossidazione A utilizzando umani o murini anticorpi monoclonali (mAbs) diretto contro il virale emoagglutinina (HA). Con l'uso della nostra tecnica, abbiamo caratterizzato precedentemente residui critici necessari per il legame degli anticorpi targeting la testa o il gambo del romanzo aviaria H7N9 HA. Il protocollo può essere facilmente adattato per altri sistemi di virus. Analisi delle varianti di fuga sono importanti per la modellazione deriva antigenica, determinazione di polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) che conferisce resistenza e fitness di virus e nella progettazione di vaccini e/o terapeutica.
Introduction
Simile ad altri virus RNA, virus di riossidazione A possedere una polimerasi errori che consente la generazione di una moltitudine di varianti antigeniche con ogni turno di replica1,2,3. Il virus dell'influenza A ha una sorprendente capacità di adattarsi e di eludere la risposta immunitaria umana tramite deriva antigenica, che si ottiene attraverso un accumulo di mutazioni sulle glicoproteine di superficie che conduce alla perdita del legame anticorpo. Deriva antigenica delle glicoproteine di superficie virale, HA e neuraminidasi (NA), richiede la necessità di riformulare e somministrare il vaccino ogni anno.
I progressi tecnologici nell'isolamento e la generazione di anticorpi antigene-specifiche hanno prodotto un numero elevato di mAbs indotta da vaccino4,5,6,7,8. A sua volta, la caratterizzazione degli epitopi di mAbs che sostanzialmente neutralizzare i virus dell'influenza A ha aiutato lo sviluppo di parecchi universale dell'influenza vaccino candidati9,10,11, 12,13,14. Delucidamento l'impronta antigenica di un mAb rivela i determinanti strutturali di neutralizzazione e consente un approccio consapevole verso la progettazione di vaccino. Tuttavia, non è né realistico né conveniente per i laboratori di caratterizzare strutturalmente ampi pannelli di mAbs attraverso cristallografia a raggi x o cryo-microscopia elettronica al fine di mappare epitopi dell' antigene virale15, 16 , 17 , 18.
Cristallografia a raggi x o cryo-microscopia elettronica richiede costose attrezzature, tecniche specializzate e potenzialmente una vasta quantità di tempo per generare dati. Un approccio alternativo e più veloce è utilizzando la generazione rapida di diverse popolazioni virali tramite errori RNA-dipendente polimerasi del RNA per generare mutanti di fuga per determinare gli epitopi di mAbs19,20, 21,22,23. La generazione di varianti di fuga non richiede attrezzature speciali o tecnica e può essere eseguita con attrezzature e reagenti di laboratorio convenzionali.
Qui, descriviamo un metodo che consente per la mappatura dei residui critici richieste per l'associazione mAb che riconoscono l'influenza HA.
Protocol
Attenzione: un certo numero di virus influenzali circolanti nella popolazione umana (ad es., H1, H3) sono gli agenti patogeni ai classe di livello 2 di biosicurezza devono essere maneggiati con cura e dispositivi di protezione personale. Gestione dei virus deve essere approvata da Institutional Review Board. Il seguente protocollo è stato approvato da Institutional Review Board al Mount Sinai.
Nota: anticorpi HA specifici che inibiscono la replicazione virale possono essere classificati generalmente in i) quelli che legano sopra o adiacente del sito di legame del recettore in cima alla testa globulare e ii) quelli che legano distale del grippaggio del ricevitore dominio, che comprende la parte laterale della testa globulare e la regione di gambo della HA. Gli anticorpi che il sito di legame del recettore di destinazione prevenire il fidanzamento di motivi di acido sialico sulla superficie delle cellule bersaglio e possono essere misurati con un test di emoagglutinazione inibizione (HI). Gli anticorpi che sono HI-negativi, come gli anticorpi specifici del gambo, ancora possono inibire la replicazione virale, ma può essere valutata soltanto utilizzando dosaggi di neutralizzazione.
1. categorizzazione anticorpi basato su attività di neutralizzazione e HI
- test HI
- In una piastra a 96 pozzetti fondo V, aggiungere 25 µ l di PBS 1X su colonne 2-12.
- Diluire il mAb 7B2 (testa-specifico), 6F12 (gambo-specifico) 23 e un controllo di isotipo a 100 µ g/mL in 1X PBS e aliquota 50 µ l delle preparazioni anticorpo diluito in colonna 1. Non includono anche un nessun controllo del mAb aggiungendo 50 µ l di PBS 1X ( Figura 1A).
- Eseguire 2 volte diluizioni seriali degli anticorpi trasferendo 25 µ l dalla colonna 1 alla colonna 2 e così via. Scartare le ultime 25 µ l dalla colonna 12 ( Figura 1A).
Nota: Assicurarsi di includere una riga di alcun controllo anticorpo. - Diluire lo stock di virus (un virus ricombinante esprimendo le HA e NA di A/California/04/09 con i segmenti interni del A/Puerto Rico/8/34) a 8 emagglutinazione unità/25 µ l diluito virus stock. Aggiungere 25 µ l dello stock di virus diluito (8 emoagglutinazione) in ciascun pozzetto (riga A G).
Nota: La miscela di anticorpo e virus dovrebbe avere un volume finale di 50 µ l con un'iniziale concentrazione finale di 50 µ g/mL. - Incubare la piastra a temperatura ambiente (TA) per 45 min.
- Per la riga di retro-titolazione (H), aggiungere 50 µ l di PBS 1X su pozzi H2 a H12. Aggiungere 100 µ l dell'8 emagglutinazione unità/25 µ l di bene H1. In serie diluire duplice trasferendo 50 µ l da H1 H2 e così via. Scartare le ultime 50 µ l dalla ben H12. Infine, aggiungere 50 µ l di 0,5% pollo globuli rossi (RBC) in tutti i pozzetti della piastra 96 pozzetti fondo V.
Nota: I campioni di mAb nel dosaggio dovrebbero avere un volume finale di 100 µ l: mAb (25 µ l), virus (25 µ l) e RBC (50 µ l). Il volume finale di nessun controllo mAb dovrebbe contenere 25 µ l di PBS: 1x, 25 µ l di virus e 50 µ l di RBC. - Incubare la piastra a 4 ° C per 1 h.
- Leggere visivamente le piastre per attività di HI. Se c'è una lettura positiva per un anticorpo particolare, procedere al passaggio 2.1 di generare varianti di fuga. Se l'anticorpo è HI-negativo, procedere sotto al passaggio 1.2 per valutare se l'anticorpo ha attività in un'analisi di coltura delle cellule di neutralizzazione.
Nota: Una lettura positiva di un mAb HI-attivo è indicata da una pallina di RBC rossa scura al centro di un pozzo ( Figura 1B 7B2) che formerà una lacrima quando la piastra a 96 pozzetti fondo V è tenuta ad un angolo di 45 °. Una lettura negativa non si formerà una pallina di RBC rossa scura nel pozzo ( Figura 1B 6F12 e nessun mAb). Il controllo di isotipo anche non si formerà una pallina di RBC rossa scura e dovrebbe sembrano identici per l'anticorpo specifico del gambo, 6F12 o no il mAb controllo esempio ( Figura 1B) 23.
- Microneutralization test
- piastra Madin Darby canino rene (MDCK) ad una densità di 2 x 10 4 cellule/pozzetto in una coltura di tessuti trattati piastra a 96 pozzetti e incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 per 17 a 19 h .
Nota: Le celle possono essere consentite anche di aderire al fondo del pozzo per un minimo di 4 h prima dell'uso. - In una piastra a 96 pozzetti separata, eseguire sette 3 volte diluizioni seriali del mAb umana 4D 05 5, CR9114 17 o isotipo IgG Controllo, a una concentrazione iniziale di 200 µ g/mL in terreno minimo essenziale (MEM): 1x completati con tosile phenylalanyl clorometil chetone (TPCK)-trattata tripsina (1 µ g/mL) ( Figura 2).
Nota: La riga A dovrebbe contenere 75 µ l di anticorpo diluito (a partire da concentrazione di 200 µ g/mL). In serie diluire (3 volte) giù il piatto trasferendo 25 µ l da riga A riga B e così via. Riga A H dovrebbe avere un volume finale di 50 µ l. Non c'è nessuna necessità di cambiare suggerimenti tra diluizione trasferimenti. - Diluire lo stock di virus (virus ricombinato esprimendo l'HA e il NA di A/Shanghai/1/13 con il segmento interno del A/Puerto Rico/8/34) a un 100 di coltura del tessuto 50% dose infettiva (TCID 50) / 50 µ l in 1x MEM supplementato con TPCK-trattati tripsina (1 µ g/mL) 24. Aggiungere 50 µ l/pozzetto di virus diluito ai preparativi dell'anticorpo (punto 1.2.2). Aggiungere 50 µ l di 1 X MEM per i pozzetti di controllo delle cellule non infette.
- Incubare le miscele virus-anticorpo in un incubatore a 37 ° C (con 5% CO 2) per 1 h.
Nota: Le miscele virus-anticorpo dovrebbero avere un volume totale di 100 µ l: 50 µ l della diluizione di anticorpo (punto 1.1.2) e 50 µ l di virus contenente 100 TCID 50 (punto 1.2.3). - Aspirare i media nei pozzetti e aggiungere l'intero 100 µ l di miscele virus-anticorpo corrispondente pozzetti.
Nota: L'aspirazione avviene mediante un adattatore 8 canali aspiratore collegato ad un vuoto. Alternativamente, una micro-pipetta multicanale di 8 o 12 pozzetti può essere usata per aspirare manualmente. Tutti i aspirazione durante la rimozione di inoculo o lavaggi è fatta dalla più alta concentrazione di anticorpo al più basso, senza la necessità di cambiare suggerimenti. - Lavare il monostrato con 200 µ l di 1X PBS. Aspirare 200 µ l di PBS 1X (come al punto 1.2.5). Ripetere il lavaggio una volta di più per un totale di due lavaggi.
- Infettare il monostrato di cellule MDCK aggiungendo l'intero 100 µ l/pozzetto di miscele virus-anticorpo (dal punto 1.2.4) su monostrato e infettare/Incubare a 37 ° C (con 5% CO 2) per 1 h.
- Durante l'infezione, in una piastra a 96 pozzetti separata, preparare un'altra serie di diluizioni di anticorpo. Aggiungere 150 µ l di 100 µ g/mL dell'anticorpo corrispondente nella riga A e 100 µ l di 1x MEM completati con TPCK-trattata tripsina (1 µ g/mL) nelle righe da B a H. eseguire diluizioni 3 volte trasferendo 50 µ l da riga A riga B , e così via, fino a riga H. scartare le ultime 50 µ l dalla riga H. Il volume totale per ciascun bene deve essere uguale a 100 µ l. accantonato.
Nota: Gli anticorpi sono diluiti in 1 x MEM completati con tripsina TPCK-trattati (1 µ g/mL). - Aspirare l'inoculo di virus-anticorpo dal monolayer al punto 1.2.7 e riempire con l'intero 100 µ l/pozzetto della diluizione di anticorpo appropriato preparata al punto 1.2.8.
Nota: Se un bene contained una concentrazione di anticorpi finale di 100 µ g/mL durante l'infezione (punto 1.2.7), poi i media rabbocco deve inoltre contenere una concentrazione finale di 100 µ g/mL (punto 1.2.8). - Incubare per 24 h in un incubatore a 37 ° C (con 5% CO 2).
- Aspirare i media dalle piastre da 96 pozzetti e lavare con 200 µ l/pozzetto di PBS 1X tre volte.
- Fissare le cellule con 100 µ l di freddo 80% acetone per 1 h a -20 ° C.
Nota: La soluzione di acetone di 80% è diluita in acqua distillata doppia (dd) H 2 O (per esempio, 80 mL di acetone 100% più 20 mL di ddH 2 0). La soluzione di acetone 80% possa essere refrigerata sul ghiaccio prima dell'uso. - Lavare le cellule con 200 µ l/pozzetto di 1X PBS tre volte.
- Blocco le piastre con 200 µ l/pozzetto di 5% latte diluito in 1X PBS e incubare le piastre a temperatura ambiente per 1 h.
- Aggiungere 100 µ l di anticorpo anti-influenzale un anticorpo primario nucleoproteina (NP) diluito 1:2,000 1 x PBS/1% albumina di siero bovino (BSA) e incubare le piastre a temperatura ambiente per 1 h.
Nota: Per i virus dell'influenza B, un anticorpo di anti-NP specifici virus di riossidazione B deve essere utilizzato. - Lavare le piastre con PBS 1X tre volte.
- Aggiungere 100 µ l di anticorpo coniugato con perossidasi (HRP) di streptavidina - rafano diluito 1:3,000 1 x PBS/1% BSA e incubare le piastre a temperatura ambiente per 1 h.
- Lavare le piastre con 200 µ l di PBS 1X tre volte.
- Reagente substrato HRP a 100 µ l/pozzetto ed incubare al buio a RT.
Nota: Il tempo di incubazione deve essere ottimizzato prima dell'aggiunta del buffer arresto acide (sotto). In linea generale, è sufficiente da 15 a 30 min. - Placare la reazione con 50 µ l/pozzetto di 5 M HCl.
Attenzione: 5m HCl è un reagente altamente corrosivo che possa danneggiare gli occhi, pelle e membrane mucose. Aggiunta di questo reagente deve essere effettuato sotto un cappuccio ventilato con dispositivi di protezione personale. - Leggere le piastre a 492 nm e sottrarre i pozzi di sfondo (cellule non infette).
- Calcolare l'inibizione percentuale con la seguente formula:
- se un anticorpo ha attività di neutralizzazione (e nessuna attività HI), procedere al passaggio 2.2.
Nota: Gli anticorpi che mancano in vitro attività di neutralizzazione mancheranno attività HI.
- piastra Madin Darby canino rene (MDCK) ad una densità di 2 x 10 4 cellule/pozzetto in una coltura di tessuti trattati piastra a 96 pozzetti e incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 per 17 a 19 h .
2. Generazione di fuga mutante varianti
Nota: anticorpi neutralizzanti che hanno o la mancanza di attività HI sono ulteriormente analizzati con i protocolli specifici descritti di seguito.
- Protocollo n. 1: gli anticorpi HI-positivo/neutralizzazione-positivo ( Figura 3A )
- preparare un brodo di virus di 10 6 placca formando unità/millilitro (PFU/mL) in PBS 1X in un volume di 400 µ l.
- Preparare quattro diluizioni dell'anticorpo di interesse in aumento delle concentrazioni (ad esempio, 0, 0.5, 0,05 e 0,005 mg/mL) in PBS 1X in un volume di 100 µ l per diluizione.
Nota: Virus Wild-type dovrebbe essere attraversate sempre in parallelo e in assenza di anticorpo. Le sequenze di questi virus secondarie verranno assisterà nella distinzione fra adattamento a condizioni di coltura di cella e la fuga mutazioni. - Mix 100 µ l di 10 6 PFU/mL di virus con 100 µ l di ciascuna diluizione di anticorpo o 100 µ l di PBS 1X.
- Incubare per 1 h in un incubatore a 37 ° C (con 5% CO 2). Vortice brevemente. Iniettare 200 µ l di ciascuna miscela di uova di gallina per specifici-patogeno gratis (SPF) embrionate.
- Incubare le uova a 37 ° C (senza CO 2) per h. 40-44
- Sacrificare le uova embrionate infettati virus incubando a 4 ° C per un minimo di 6 h.
- Raccolto il liquido allantoico dalle uova, come descritto in precedenza 24 , 25.
- Eseguire il test di emoagglutinazione, come descritto sopra 24 , 26. Se tutti i preparativi di liquido allantoico non hanno titoli emagglutinazione, ripetere dal passo 2 con diluizioni di anticorpo che vanno da 0,005 mg/mL a 0,00005 mg/mL.
Nota: Una concentrazione di saturazione di un anticorpo HI-positivi può neutralizzare tutte le particelle di virus presenti. Di conseguenza, può essere necessario diminuire la quantità di anticorpi presenti nel passaggio. - Confermare le varianti di fuga eseguendo l'HI dosaggio 24 (punto 1.1).
Nota: HI-anticorpi bloccano HA fidanzamento di acido sialico motivi sulle cellule bersaglio. Di conseguenza, un virus in presenza di relativo anticorpo cognata perde la capacità di agglutinare i globuli rossi (presenza di pellet RBC). Teoricamente, fuga varianti di HI-anticorpi ancora possono associare acido sialico motivi anche in presenza di relativo anticorpo cognata e così possono agglutinare globuli rossi (no pellet RBC). Se l'HI dell'anticorpo di interesse è ancora rilevabile, ripetere il protocollo dal punto 2.1.2 con una maggiore concentrazione di partenza dell'anticorpo.
- Protocollo n. 2: gli anticorpi HI-negativo/neutralizzazione-positivo ( Figura 3B )
Nota: al fine di generare varianti di fuga contro neutralizzando gli anticorpi che mancano HI attività, il virus deve essere attraversato in presenza di quantità crescenti di anticorpo.- Cellule MDCK piastra in una piastra a 6 pozzetti ad una densità di 1 x 10 6 cellule/pozzetto e incubare per un minimo di 4 h in un incubatore a 37 ° C (con 5% CO 2).
- Diluire lo stock di virus a 10 6 PFU/mL o il virus dal precedente passaggio in 1 x MEM con TPCK-trattata tripsina (1 µ g/mL) in un volume di 500 µ l.
- Preparare una diluizione singola dell'anticorpo (0,02 mg/mL per il passaggio originale o superiore per tutto il seguente passaggi) in 1 x MEM con tripsina TPCK-trattati in un volume di 250 µ l.
- Mix 250 µ l di virus diluito con 250 µ l di anticorpo diluito (+ anticorpo) o 250 µ l di 1 x MEM (nessun controllo dell'anticorpo).
- Incubare la miscela di virus-anticorpo per 30 min in un incubatore a 37 ° C (con 5% CO 2).
- Aspirato il supporto utilizzando un bicchiere Pasteur pipetta e lavare il monostrato di cellule con 1 mL di PBS 1x 1.
- Aggiungere 500 µ l delle miscele nei pozzetti e incubare in un incubatore a 37 ° C (con 5% CO 2) per 1 h.
- Dopo 1 h, integrare i pozzetti con 2 mL di 1 x MEM con tripsina TPCK-trattati (1 µ g/mL).
- Controllare le cellule alle 48h post-infezione per segni di effetto citopatico (CPE) il microscopio o eseguire un'analisi di emagglutinazione per rilevare la crescita virale 26.
- Se c'è lordo CPE nelle culture completate con l'anticorpo, raccogliere il surnatante in multiple cryo-tubi, etichetta con il numero di passaggio e conservare a -80 ° C.
- Salvare 100 µ l del surnatante per infettare un monostrato fresco di MDCKs con 2 mL di 1x MEM completati con TPCK-tripsina e l'anticorpo. Ricordati di non includere un nessun controllo dell'anticorpo per ogni passaggio.
Nota: Aumentare la concentrazione dell'anticorpo di duplice (o, a discrezione del ricercatore) nel passaggio successivo (ogni due giorni). - Aumentare la concentrazione dell'anticorpo in ogni passaggio successivo fino a quando la crescita del virus è ancora praticabile anche con una concentrazione finale di 0,6 mg/mL di anticorpo. Congelare le fiale multiple del surnatante di ogni passaggio e conservare a -80 ° C.
Nota: Nessun controllo anticorpo è cruciale nel verificare la crescita del virus da un passaggio a altro. Se c'è lordo CPE in nessun controllo dell'anticorpo, ma nessun CPE nella + gruppo di anticorpo, questo indica che la concentrazione dell'anticorpo era troppo alta e nessuna variante di fuga sono stata generata. Se c'è lordo CPE in nessun controllo dell'anticorpo, ma solo moderata CPE nella + gruppo di anticorpo, ciò indica la presenza di potenziali varianti di fuga. Nel passaggio successivo, aumentare il volume di passaggio a 200 µ l del surnatante e mantenere la concentrazione dell'anticorpo per aumentare la probabilità di generare varianti fuga.
3. Isolamento di varianti di fuggire attraverso placca purificazione
- cellule MDCK piastra in una piastra a 6 pozzetti ad una densità di 1 x 10 6 cellule/pozzetto e incubare per un minimo di 4 h in un incubatore a 37 ° C (con 5% CO 2).
- Diluire gli anticorpi in 1 x MEM con tripsina TPCK-trattati a partire da 300 µ g/mL in un volume di 250 µ l e mix con 250 µ l di corrispondente virus mutante di fuga. Attraversate in assenza di anticorpi del virus dovrebbe anche essere placca purificata.
- i media dalle celle di aspirare, lavare con PBS 1X tre volte e aggiungere l'intero 500 µ l della miscela virus-anticorpo (punto 3.2).
- Incubare le piastre per 1h in un incubatore a 37 ° C (con 5% CO 2) facendo attenzione a oscillare avanti e indietro ogni 10 min per evitare l'essiccazione di strato monomolecolare.
- Aspirare le miscele virus-anticorpo e riempire i pozzetti con agarizzati di sovrapposizione che contengono gli importi corrispondenti dell'anticorpo (300 µ g/mL; passo 3.2).
- Incubare la piastra per 40-44 h in un incubatore a 37 ° C (con 5% CO 2).
- Cerchio le placche visibili con un indicatore di colore blu o nero per facilitare il prelievo di placca.
- Fuga pick quattro placche per ciascuna combinazione di anticorpo del virus mutante, come pure i virus di tipo selvatico che erano attraversate in cellule MDCK o uova in assenza di anticorpo.
- Risospendere la placca in 100 µ l di PBS 1X.
- Iniettare l'intero 100 µ l di virus mutante di placca fuga purificata in uova di pollo embrionate SPF 10 - vecchie giorno.
- Incubare le uova per 40-44 h in un incubatore a 37 ° C (senza 5% CO 2).
- Eseguire un'analisi di emagglutinazione per confermare la presenza di virus (punto 1.1).
4. Estrazione di RNA virale e variazione di sequenza analisi di HA
- estratto il RNA virale da 200 µ l di liquido allantoico virus mutante di fuga con una soluzione mono-fasico di fenolo e guanidina isotiocianato.
Attenzione: Il fenolo è un reagente liquido volatile che può causare tosse, respiro affannoso e moderatamente irritante per la pelle dal contatto. - Amplificare il segmento HA da RNA virale con l'uso di una trascrittasi inversa e gli iniettori di gene-specific per l'influenza A HA segmento 27.
Nota: I primer universali per i virus di riossidazione B descritto in tabella 2 amplificano entrambi l'HA (~ 1.800 bp) e il NA (~ 1.500 bp) 28. - Risolvere il prodotto di RT-PCR in un gel di agarosio all'1% e tagliare fuori la banda correttamente dimensionata (~ 1.800 bp).
- Gel estratto il prodotto PCR utilizzando una procedura di purificazione silice-membrana basata e inviare il cDNA per la sequenziazione.
- Identificare il residuo dell'amminoacido richiesto per un legame anticorpale differenziando le mutazioni trovato su varianti di presunta fuga e attraversate virus wild-type a causa di adattamento di coltura delle cellule o selezione immunologica.
- Clone del prodotto PCR contenente wild-type o fuggire variante HA in un vettore di espressione pCAGGs (NotI e NheI).
- Legame dell'anticorpo per la variante di fuga HA può essere valutata con una delle due opzioni (o entrambi) descritto di seguito.
5. Anticorpo associazione analisi di fuga varianti
- piastra di immunofluorescenza 293T cellule ad una densità di 2 x 10 4 cellule/pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e incubare nell'incubatore 37 ° C (con 5% CO 2) per 24 h.
- Transfect le cellule con 0.10 µ g/pozzo dei plasmidi pCAGGS codifica il mutante di fuga HA, virus attraversate ettari ed ettari di selvaggio-tipo (unpassaged) con l'uso di un reagente di transfezione.
- Incubare le piastre a 96 pozzetti per 48 h in incubatore a 37 ° C (con 5% CO 2).
- Fix con 100 µ l di 0,5% paraformaldeide per 15 min a RT.
Attenzione: Paraformaldeide è un reagente liquido volatile che può causare tosse, respiro affannoso e moderatamente irritante per la pelle dal contatto. È stato designato come un potenziale cancerogeno per l'uomo. Aggiunta del reagente dovrebbe essere fatto in una cappa chimica con spacchetti. - Lavaggio con PBS 1 x tre volte. Blocco con 5% di latte in PBS 1X per 1h a RT.
- Lavaggio con PBS 1X tre volte. Incubare con 5 µ g/mL di anticorpo di interesse per 1h a RT.
- Incubare con 100 µ l di anticorpo secondario (anti-umano o anti-topo Alexa 488) ad una diluizione di 1:2,000 1 x PBS/1% BSA per 1 h a temperatura ambiente al buio.
- Lavaggio con PBS 1X tre volte. Osservare le cellule su un microscopio a fluorescenza per colorazione positiva o negativa.
- Fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento (FACS)
- cellule 293T piastra ad una densità di 2 x 10 5 cellule/pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare a 37 ° C (con 5% CO 2) per 24 h.
- Transfect le cellule con 0,50 µ g/pozzetto con plasmidi pCAGGS codifica il mutante di fuga HA, virus attraversate solo ettari ed ettari di selvaggio-tipo con l'utilizzo di un reagente di transfezione.
- Incubare le piastre a 6 pozzetti per 48 h a 37 ° C (con 5% CO 2).
- Dopo 48 h, aspirare il crescita media e lavare con PBS 1X due volte delicatamente (assicurandosi che il monostrato è indisturbato).
- Raccogliere le cellule 293T trasfettate con 500 µ l di tampone di FACS (1 x PBS/2% siero fetale di vitello).
Nota: FACS buffer deve essere pre-refrigerati a 4 ° c prima dell'uso. - Centrifugare le cellule 293T raccolto a 300 x g per 5 min a 4 ° C.
- Aspirare il buffer di FACS e risospendere con 200 µ l di tampone di FACS contenente anticorpi monoclonali di interesse (concentrazione finale di 1 a 5 µ g/mL). Incubare a temperatura ambiente per 20 min.
- Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min a 4 ° C. lavare due volte con 500 µ l di tampone di FACS. Aspirare con cura con un vetro pipetta Pasteur per non disturbare il pellet.
- Risospendere con 200 µ l di tampone di FACS contenente anticorpo secondario coniugato di Alexa 488 (diluizione finale di 1:1, 000). Incubare al buio a 4 ° C per 20 min.
- Centrifugare le cellule a 300 g per 5 min a 4 ° C. lavare due volte con 500 µ l di tampone di FACS e aspirare accuratamente il tampone di lavaggio.
- Risospendere in 500 µ l di tampone di FACS e valutare l'associazione di anticorpi monoclonali o policlonali sieri di cellule trasfettate con HA da FACS.
Nota: Ricordarsi di includere un nessun controllo del mAb/policlonali sieri, nonché un campione untransfected nell'esperimento.
Representative Results
In precedenza abbiamo usato variazioni di questo metodo per generare varianti di fuga di anticorpi monoclonali umani e murini indotta dal vaccino contro il virus dell'influenza stagionale, H7N9 vaccinazione o sequenziale HA DNA/ricombinante proteina vaccinazione4,5 ,6,7. Come descritto sopra, gli anticorpi sono stati caratterizzati in primo luogo utilizzando le analisi HI e microneutralization al fine di informarci del quale protocollo specifico di continuare con il prossimo4,5. Gli anticorpi 07-5D 03, 07-5F01, 07-5G 01, 07-4B03, 07-4E02 e 07-4D 05 sono stati trovati per avere attività HI e neutralizzazione contro l'aviaria H7N9 virus (A/Shanghai/1/2013) (tabella 1), e così è stato utilizzato il protocollo n. 1 (punto 2.1). Per mAbs con che attività di HI, come 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 e S6-B01 (tabella 1), la mancanza di neutralizzazione protocollo 2 (punto 2.2) è stato utilizzato per generare varianti di fuga. Il tracciato mutante fuga ha rivelato che molti degli anticorpi riconoscono residui critici in luoghi diversi sul virale HA4,5 (Figura 4). Mentre la maggior parte degli anticorpi HI-positivi hanno fuga mutante residui vicino precedentemente segnalati siti antigenici di H7 HA, gli anticorpi di HI-negativi generati mutanti di fuga con mutazioni puntiformi in fusti regione4,5 .
| Anticorpo | Ciao attività | NEUT attività |
| 03. 07-5D | + | + |
| 07-5F01 | + | + |
| 07-5G 01 | + | + |
| 07-4B03 | + | + |
| 07-4E02 | + | + |
| 07-4D 05 | + | + |
| 41-5E04 | - | + |
| 045-051310-2B06 | - | + |
| 042-100809-2F04 | - | + |
| S6-B01 | - | + |
Tabella 1: Tabella di attività dell'anticorpo di neutralizzazione e HI. Dieci mAbs H7 specifiche isolato da individui vaccinati con un vaccino sperimentale H7N9 esibiscono diversi in vitro attività antivirali5.
| Forward Primer (5' a 3') | Reverse Primer (5' a 3') | Condizioni di Thermocylcer | ||||||||
| IAV | TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG | ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT | 42 ° c per 60 min, 94 ° c per 2 min/5 cicli di 94 ° c per 20 s, 50 ° c per 30 s e 68 ° c per 3 min 30 s, seguiti da 40 cicli di 94 ° c per 20 s, 58 ° c per 30 s e 68 ° c per 3 min 30 s con un tempo di estensione finale a 68 ° c per 10 min | |||||||
| IBV | GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC | CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC | 45 ° c per 60 min, 55 ° c per 30 min, 94 ° c per 2 min/5 cicli di 94 ° c per 20 s, 40 ° c per 30 s e 68 ° c per 3 min 30 s, seguiti da 40 cicli di 94 ° c per 20 s , 58 ° c per 30 s e 68 ° c per 3 min 30 s con un tempo di estensione finale a 68 ° c per 10 min | |||||||
Tabella 2: degli iniettori del virus influenzale universale. Coppie di primer per l'amplificazione dei segmenti HA di riossidazione A27 e B28 virus e loro condizioni rispettive termociclatore.
Figura 1: test HI. (A), A schema per l'allestimento di un test di HI verificare l'attività di due mouse H1 specifiche mAbs 7B2 (testa-specifico) e 6F12 (gambo-specifico) utilizzando una piastra a 96 pozzetti fondo V e (B), un esempio dei risultati di un test di HI23. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: analisi di Microneutralization. Uno schema per l'impostazione di un saggio di microneutralization verificare l'attività di due anticorpi monoclonali umani 4 055 e CR911417. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: generazione di mutanti di fuga. La metodologia suggerita sarà dipenda l'HI e l'attività di microneutralization hanno esibito dall'anticorpo. La generazione di mutanti di fuga contro (A) anticorpi neutralizzanti HI-positivi possono richiedere un singolo passaggio in uova, mentre anticorpi neutralizzanti di HI-negativo (B) possono comportare passaggi multipli con l'aumento della quantità di anticorpo in coltura del tessuto cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: esempio di una mappa di epitopo del romanzo aviaria H7N9 HA generato con varianti mutante fuga. Gli anticorpi indotti dal vaccino isolato da individui vaccinati con un candidato dell'influenza H7N9 un vaccino sono stati utilizzati per generare varianti mutanti di fuga. Ogni residuo indicato in rosso rappresenta la posizione di aminoacidi critici necessari per l'associazione efficiente di un mAb. I dati sono stati adattati da Dunand-Henry et al., 20154. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Anche se la maggior parte dei residui identificati tramite mutanti di fuga è stata accurata, una delle principali avvertenze di questo approccio è che mutazioni puntiformi di varianti di fuga necessariamente potrebbe non essere mappato all'interno l'impronta molecolare dell'anticorpo come determinato dal analisi strutturali. Ciò è dovuto la capacità di una mutazione ad un certo residuo di portare ad un cambiamento conformazionale distale alla posizione del residuo mutato, analogo a un effetto allosterico. Un'altra limitazione è che questa metodologia può essere implementata solo per neutralizzazione degli anticorpi; gli anticorpi che mancano in vitro pressione selettiva non porterà a fuggire mutanti. Tuttavia, questo limite può essere superato con l'uso di un panel di varianti di fuga generato dagli anticorpi neutralizzanti precedentemente caratterizzati. Tan et al. utilizzata una variante di fuga di un mAb neutralizzanti il virus H7N9 per mappare l'epitopo di un anticorpo neutralizzante non7.
Ciò nonostante, chiarire gli epitopi degli anticorpi attraverso la generazione di varianti di fuga fornisce una valida alternativa alla microscopia cristallografia e cryo-elettrone, entrambi i quali richiedono un investimento ampio di attrezzature. Altre alternative sono per determinare la regione minima associazione di anticorpi monoclonali usando mutanti di scansione/troncamento di scansione o peptide alanina. Alanina mutagenesi di scansione può richiedere una notevole quantità di lavoro nel generare un gran numero di varianti durante lo screening29, durante la scansione del peptide limitata a epitopi lineari30. Il metodo descritto in questo protocollo non richiede attrezzature speciali o tecnica e, infatti, fa uso di esistente in vitro neutralizzazione saggi modificate per generare varianti di fuga degli anticorpi di interesse.
Il protocollo per generare varianti di fuga che richiedono più passaggi (ad esempio, gli anticorpi specifici del gambo) dipende fortemente dalla concentrazione iniziale di anticorpi nel passaggio 0. È meglio peccare per eccesso di cautela e avviare un registro per metà un registro inferiore la metà massima concentrazione inibitoria di un anticorpo e consentire la crescita robusta virus. Il ricercatore può speculare che una cultura di virus di alto titolo in presenza di bassa pressione immunologica avrà una grande variazione genetica nella popolazione virale. Varianti di fuga possono essere selezionati per aumentando gradualmente la concentrazione di anticorpi nei seguenti passaggi. Nel caso in cui la crescita di virus diminuisce, la quantità del surnatante virale può essere aumentata nel passaggio successivo, pur mantenendo la stessa quantità di concentrazione di anticorpi nel passaggio precedente.
L'obiettivo della maggioranza dei vaccini antinfluenzali per uso universale è quello di suscitare una risposta anticorpale robusto nei confronti della regione gambo l'HA. Le analisi delle varianti di fuga per gli anticorpi specifici del gambo sono importanti nel definire la relazione tra l'influenza virus fitness e pressione immunologica. Interessante, fuga virus mutanti derivanti da specifiche del gambo mAbs erano tutti attenuati in vivo in murino LD50 studi4. Questi studi forniscono un forte caso per piattaforme basate su fusti di vaccinazione. Inoltre, questo protocollo potrebbe essere utilizzato per identificare i mutanti di fuga ad altri composti anti-virale, come piccole molecole inibitrici. Infine, questa metodologia non è limitata alle glicoproteine di superficie di virus dell'influenza, ma può anche essere più ampiamente applicata per determinare gli epitopi di altre glicoproteine virali.
Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo progetto è stato finanziato in parte con fondi federali dal National Institute of Allergy e malattie infettive, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, sotto CEIRS contratto HHSN272201400008C (F.K.); NIH U19AI109946-01 (F.K.); e P01AI097092-04S1 (p.e.l.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid | Corning, Inc. | 353072 | Assay plate use for the microneutralization assay |
| Falcon 96-well clear V-bottom plate | Corning, Inc. | 353263 | Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay |
| 1X Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 11095080 | Infection medium |
| Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Cleaves immature HA0 to HA1 and HA2 |
| Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV) | EMD Millipore | MAB8258B | An antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses |
| Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV) | EMD Millipore | MAB8260B-5 | An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses |
| Streptavidin-HRP antibody | EMD Millipore | 18-152 | This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody |
| HRP substrate (SIGMAFAST-OPD) | Sigma-Aldrich | P9187-5SET | o-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP |
| 96-well V-bottom plate | Nunc | 249662 | Assay plate used for the hemagglutination assay |
| Chicken red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7201403 | Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate |
| TRIzol | Ambion | 15596026 | Extraction of RNA |
| Superscript III | Invitrogen | 12574018 | Reverse transcriptase |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Isolation of amplified PCR product |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Transfection reagent |
| Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11013 | Fluorescent secondary antibody for human antibodies |
| Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Fluorescent secondary antibody for murine antibodies |
| 6-well polystyrene microplate | Corning, Inc. | 353934 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Nalgene long term storage Cryo-tubes | ThermoFisher Scientific | 5012-0020 | Freezing of viral culture supernatant |
| reassortant A/California/04/09 (H1) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
| reassortant A/Shanghai/1/13 (H7) | Palese Laboratory | reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) | |
| Bovine serum albumin solution (35%) | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| Qiagen gel extration kit | Qiagen | 28704 | Silica-membrane-based purification of DNA fragments |
References
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