Summary
تستخدم نظم فيديوميكروسكوبي لدراسة الخصائص الفنية للشرايين الأنسجة الدهنية معزولة في الاستجابة للمحفزات الفسيولوجية والدوائية. يمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة ميكروفاسكولار تعمل في مجالات مختلفة من الأنسجة الدهنية في البشر يعانون من السمنة المفرطة.
Abstract
في حين أن السمنة ترتبط ارتباطاً وثيقا بتطور المرض الأيضي والقلب والأوعية الدموية، يعرف الكثير عن الآليات التي تحكم هذه العمليات. هو الافتراض بأن الوسطاء المحترفين atherogenic صدر من الأنسجة الدهنية لا سيما بالاشتراك مع أديبوسيتي الوسطى/الحشوي قد تعزز التغييرات الأوعية الدموية المسببة للأمراض محلياً وعناصره، والفكرة أن أمراض القلب والأوعية الدموية قد تكون نتيجة للخلل في الأنسجة الدهنية لا تزال تتطور. وهنا يصف لنا طريقة فريدة من فيديوميكروسكوبي الذي ينطوي على تحليل لردود وعائي ومضيق للأوعية الشرايين البشرية الصغيرة سليمة إزالتها من مستودع الدهنية لمعيشة البشر. يتم استخدام فيديوميكروسكوبي لدراسة الخصائص الفنية من ميكروفيسيلس معزولة في الاستجابة للمحفزات الدوائية أو الفسيولوجية باستخدام نظام ضغط الذي يحاكي في فيفو الظروف. هذا الأسلوب هو نهجاً مفيداً فهم الفيزيولوجيا المرضية والآليات الجزيئية التي تسهم في ضعف الأوعية الدموية محلياً داخل الوسط الأنسجة الدهنية. وعلاوة على ذلك، ارتبطت أيضا تشوهات في ميكروفاسكولاتوري الأنسجة الدهنية مع الأمراض الجهازية. قمنا بتطبيق هذا الأسلوب لدراسة استجابات الأوعية الدموية الخاصة بمستودع في أشخاص يعانون من السمنة المفرطة. قمنا بتقييم البطانة تعتمد على توسع الأوعية لزيادة تدفق واستيل في الشرايين الدهنية (50-350 ميكرون قطرها الداخلي، 2-3 مم في الطول) المعزولة من مستودعين الدهنية مختلفة أثناء جراحات من الفرد نفسه. أظهرنا أن الشرايين من الدهون الحشوي يحمل البصر من توسع الأوعية البطانة تعتمد على مقارنة بالسفن معزولة من مستودع تحت الجلد. وتشير النتائج إلى أن المكروية الحشوي يرتبط بخلل وظيفي غشائي الأوعية الدموية التي قد تكون ذات صلة بالملاحظة الإكلينيكية ربط adiposity الحشوي زيادة آليات الأمراض الجهازية. يمكن استخدام هذا الأسلوب فيديوميكروسكوبي لفحص الأوعية الدموية تعمل من مخازن الدهون المختلفة، فضلا عن مقارنة النتائج بين الأفراد بدرجات مختلفة من السمنة والخلل الأيضي. يمكن أيضا استخدام الأسلوب دراسة استجابات الأوعية الدموية طوليا ردا على التدخلات السريرية.
Introduction
فيديوميكروسكوبي تقنية مفيدة تستخدم لفحص وظيفة الشرايين الصغيرة إزالة من معيشة البشر السابقين فيفوفاسوموتور. لدينا مختبر ركز على تشريح خارج ميكروفيسيلس صغيرة من حجرات مختلفة من الأنسجة الدهنية لوصف آثار ميكرونفيرونمينتس الدهنية المختلفة على ميكروفاسكولاتوري. وميزة رئيسية لهذا الأسلوب هو أن إزالتها من جسم الإنسان الأوعية الدموية تبقى وظيفية ويمكن فحص سهولة في غضون دقائق إلى ساعات بعد خزعة. هي تحاكي الظروف الفسيولوجية وثابت الضغط ترانسمورال في الفضاء intraluminal عبر cannulas الزجاج الصغير الذي الخص العديد من الخصائص في فيفو . 1 , 2 بالإضافة إلى ذلك، يسمح إنشاء فيديوميكروسكوبي موثوق بها مع برامج الكشف عن حافة الآلي لتقييم النوعية والكمية على حد سواء تعتمد على البطانة-المستقلة وعائي ومضيق للأوعية قدرة ومعزولة سفن في التقييم الفيزيولوجي السريع في الوقت الحقيقي، والسماح في الاستجابة للمحفزات المادية والدوائية. 3 تقنيات microvascular أخرى متاحة أيضا مثل سلك ميوجرافي الذي يميل إلى أن يكون أقل استهلاكاً للوقت وقياس استجابات التوتر ليضع مختلف بواسطة محول قوة.
وطبق لدينا مختبر فيديوميكروسكوبي دراسة العلاقة بين السمنة وخلل الأوعية الدموية، مع التركيز على آثار مجالات مختلفة من الأنسجة الدهنية على المفرج. أديبوسيتي المركزية مع تراكم الدهون داخل البطن الحشوي ارتبط أوثق لإنتاج أديبوسيتوكيني والخلل في التمثيل الغذائي وخطر كارديوميتابوليك. قد افترض أن خلل الأنسجة الدهنية مع الإفراط في إنتاج التقلبات السيتوكينات وأديبوكيني برو atherogenic متورطة بشدة في هذه العمليات، ولكن تبقى الجزيئات تنظيمية محددة وأهداف العلاج إلى حد كبير غير المكتشفة. وربطت 4 علاوة على ذلك، على الصعيد المحلي الأنسجة الدهنية، الاستنفاد الشعرية وضعف التروية بسيودوهيبوكسيا الأنسجة الدهنية والتقلبات الأيضية. وتتطور الفرضية القائلة بأن أمراض القلب والأوعية الدموية قد يكون نتيجة للخلل في الأنسجة الدهنية. تشجيع الوسطاء المحترفين atherogenic صدر من الدهون، ولا سيما بالاشتراك مع أديبوسيتي الوسطى/الحشوي، يحتمل الخلل بطانية وتغييرات الأوعية الدموية المسببة للأمراض التي يمكن أن تكون المجاهرة محلياً في المفرج الدهنية والكشف عن استخدام هذه الوثيقة وصف للمنهجية. 5
هو الوظيفية تقييم الشرايين الأنسجة الدهنية معزولة نهجاً مفيداً فهم الفيزيولوجيا المرضية والآليات الجزيئية التي تسهم في ضعف الأوعية الدموية في السمنة البشرية. للتحقيق في الآليات التي تسهم في الدهون الخاصة بمستودع الخلل، قمنا بتطوير أساليب لدراسة تعتمد على البطانة-والمستقلة ردود فاسوديلاتوري ميكروفاسكولاتوري، وتقييم التعبير عن مختلف التنظيمية المرشحين في إقران الحشوي وتحت الجلد (SC) الأنسجة الدهنية العينات التي تم الحصول عليها من أشخاص يعانون من السمنة في الوقت لجراحات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
البروتوكول والأمثلة المذكورة هنا قد أقر "بوسطن جامعة مدرسة من الطب المؤسسية استعراض المجلس" (مجلس الهجرة واللاجئين، بروتوكول #H-25644) وأجريت وفقا "إعلان هلسنكي". جميع المواضيع المقدمة الموافقة الخطية قبل المشاركة-
1-إعداد الحلول والزجاج الصغير Cannulas
- تحضير الحل 4-2-هيدروسيثيل-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك المالحة الحمضية (حبيس). حل للأم 1، ز 8.059 كلوريد الصوديوم، 0.298 ز بوكل، ز 0.296 مجسو 4 • 7 ح 2 س، ز 0.235 كاكل 2 • 2 ح 2 س، ز 0.16 خ 2 ص 4، ز 0.01 يدتا و 1.081 ز د-الجلوكوز 2.383 غ حمض حبيس في 950 مل من منزوع المياه. تشكل وحدة التخزين إلى 1 لتر مع المياه. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. يمكن تخزين المخزن المؤقت هيبيس إلى 7 أيام في 4 ° C.
- إعداد 20 x المخزون الاحتياطي الملح. بالنسبة ل 1، إضافة ز 143.8 كلوريد الصوديوم وز 7.0 بوكل، غ 5.9 مجسو 4، ز 7.4 كاكل 2 • 2 ح 2 س إلى 900 مل ماء المقطر. تشكل وحدة التخزين إلى 1 لتر مع المياه. تخزين حل الأسهم في 4 ° C.
- إعداد 20 x المخزون الاحتياطي. L 1، إضافة غ 26.8 ناكو 3 و 0.2 غ EDTA·2H 2 س إلى 900 مل مياه. تشكل وحدة التخزين إلى 1 لتر مع المياه. تخزين حل الأسهم في 4 ° C. إعداد
- "الحل كريبس" لاستخدامها أثناء التجارب الفسيولوجية. للأم 1، إضافة 900 مل مياه، 50 مل من 20 x المخزون الاحتياطي، 50 مل من 20 x "الملح المخزن المؤقت الحل"، 0.99 غ د-الجلوكوز و 0.16 ز خ 2 ص 4. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4 استخدام HCl. يحرك باستمرار وتغطي مع البارافين أو فقاعة باستمرار للحفاظ على درجة الحموضة من المخزن المؤقت،.
- الاختيار درجة الحموضة كل 20 دقيقة تجعل الحل كريبس الطازجة يوميا.
- جعل cannulas الزجاج الصغير مع قطرها داخلي من 40 240 ميكرومتر استخدام ساحبة متاحة تجارياً إبرة/ماصة. يتم تحديد حجم cannulas الزجاج بحجم القطر الداخلي من الأوعية الدموية المعزولة (50 350 ميكرومتر). بدلاً من ذلك، شراء cannulas الزجاج الصغيرة الحجم سلفا.
2. إعداد الكواشف
- تحضير أستيل (منظمة العمل ضد الجوع، 10 -2 م، وحل الأسهم). حل ز 18.29 في منزوع 10 مل من الماء. تخزين مختبرين 1 مل من حل الأسهم (10 -2 م) في-80 درجة مئوية. في يوم التجربة تمييع متسلسل للحصول على تركيز العامل التالية: 10 -5، 10 -6، 10 -7، 10 -8، 10 -9 م. إعداد
- بابافرين (2 × 10 -2 م، حل الأسهم). حل ز 0.07517 بواسطة 10 مل من الماء. إعداد 10 ميليلتر مختبرين لحل الأسهم ومخزن في-80 ° "جيم متسلسل" تمييع للحصول على 10 -4، 10 -5، 10 -6، 10 -7، 10 -8 متر في يوم التجربة- إعداد
- endothelin-1 (ET 1، 2 × 10 -5 م، حل الأسهم). حل 50 ميكروغرام endothelin-1 في 1 مل 1% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني. تخزين مختبرين 1 مل من حل الأسهم (2 × 10 -5 م) في-80 درجة مئوية. في يوم التجربة مخفف للحصول على تركيز عامل 10 -10 M في يوم التجربة-
- تخزين الكواشف في أما-20 درجة مئوية أو تصل إلى-80 درجة مئوية تبعاً لنوع الثلاجة متاحة، ولكن ليس أطول من 6 أشهر.
3. جمع الأنسجة الدهنية وإعداد السفينة
- مجند يعانون من السمنة المفرطة الرجال والنساء (مؤشر كتلة الجسم (BMI) ≥ 35 كغم/م²، وعمر ≥ 18 عاماً) المسجلين في برنامج جراحات في بوسطن الطبي مركز (BMC). مجموع المواضيع 40 شاركوا في هذه التجارب-
- جمع عينات الأنسجة الدهنية تحت الجلد والبطن خلال جراحات المخططة بالجراح القيام بالعملية.
- الحصاد تحت الجلد الأنسجة الدهنية من جدار البطن السفلي والبطن الدهون من الثرب الكبرى، على التوالي. يختلف حجم عينة نموذجية من الأنسجة الدهنية من 3-10 مغ أنسجة. الأنسجة
- المكان فورا في حبيس الباردة المخزن المؤقت الحل مع الرقم الهيدروجيني 7.4 ومخزن عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 h.
ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، الدهنية الشرايين ويمكن الحصول من الأفراد الهزيل، وكذلك خلال أنواع أخرى من العمليات الجراحية مثل إصلاح فتق أو الجراحة التجميلية، ويمكن أيضا فحص من مستودع تحت الجلد عن طريق خزعة ترانس-الجلدي وسادة الدهون البطن < سوب الطبقة = "xref" > 6-
- بعناية باستخدام مجهر تشريح الأنسجة، والصغرى-المقص والملقط الصغير، إزالة الدهون والنسيج الضام المحيطة من الشرايين الدهنية الصغيرة (قطرها intraluminal ميكرومتر 50-350، 2-3 مم في الطول)-
- التعادل إيقاف جميع الفروع في الشرايين استخدام صغيرة من النايلون أو خيوط الحرير قبل كانولاتينج على الماصات الشعرية الزجاج. تشريح في الشرايين بعناية نظراً لأضرار طفيفة حتى الجدار arteriole يسبب تغييرات وظيفية كبيرة.
- تصغير السفينة التعرض للضوء والحرارة كما أنها قد تسبب توسع الأوعية. نظراً لأنها يمكن أن تكون في بعض الأحيان صعبة لتمييز الشرايين عن الأوردة، تحديد لهجة العضلات الملساء وحجم السفن بوأد نصائح السفن. الشرايين هي عادة أصغر وإظهار لهجة أكبر مقارنة بالاوردة.
- إعداد قاعة الجهاز. ملء الزجاج الماصات الشعرية والأنابيب المطاطية ببطء مع كريبس الحل باستخدام حقنه 10 مل.
- حالما يتم تعبئة أنابيب المطاط والزجاج الماصات الشعرية مغمورة في حل كريبس داخل قاعة الهيئة، كانولاتي الشرايين بشكل أمن على الماصات المضمون وربط طرفي أرتيريولي مع النايلون أو الحرير عقده خياطة الجروح بعناية.
- تملأ قاعة الجهاز مع الحل كريبس يصل إلى 2 مل.
- تأمين قاعة الهيئة الساحة مع المجهر المقلوب (التكبير 10 ×/0.25 الهدف) وكاميرا فيديو-
- قم بتشغيل برنامج الكشف عن حافة التدفق في الوقت الحقيقي بمعدل أخذ عينات من 1 كيلو هرتز (الإطار 1/s)- الاتصال
- جانب واحد من أنابيب الضغط الحل كريبس الضغط تملأ الخزانات خالية من ميكروبوبليس، كما الفقاعات يمكن أن يعرض الخطأ التجريبي. الاتصال الجانب الآخر من أنابيب الضغط إلى الدائرة الجهاز.
- تتصل الضغط على المفاتيح مع أنابيب نظيفة خزانات الضغط الحل شغل كريبس.
- التحكم في التدفق داخل لومينال بتنظيم ارتفاع هذه الخزانات اثنين؛ وهكذا، عندما توضع الخزانات في نفس الارتفاع، وسوف يحدث أي تدفق داخل لومينال.
- مرة واحدة كل هذه العمليات بالكامل، قم بتشغيل تدفئة كتلة والبرمجيات وبرنامج للحفاظ على درجة الحرارة في 37 درجة "جيم باستمرار" نتخلل السفينة مع الحل كريبس وتهوية مع خليط غاز من 5% CO 2 و 21% O 2 و 74% N 2 7 ، 8 طوال الإجراءات التجريبية بأكملها.
- لتحقيق الضغط المطلوب المعهددي التجويف الأوعية معزولة تدريجيا بزيادة الضغط intraluminal (5 ملم زئبق، كل 5 دقائق) عن طريق وحدة مراقبة الضغط في لوحة واجهة ميو، القيام بذلك بمعدل بطيء لتجنب إتلاف طبقة البطانية.
ملاحظة: بمجرد الضغط الذي يصل إلى 60 ملم زئبق، مطلوب فترة الموازنة 20-30 دقيقة لتحقيق استقرار السفينة. يتم إجراء جميع الدراسات وظيفة الأوعية الدموية في 60 ملم زئبق و 37 درجة مئوية في درجة الحموضة 7.4. 7
4. تقييم "الدالة Microvascular الدهنية"
ملاحظة: وبصفة عامة، يمكن الحصول أرتيريولي الدهنية غشائي تعتمد على توسع الأوعية ردا على الفسيولوجية (الناجمة عن تدفق) والمنبهات الدوائية (التي يسببها Ach).
- من توسع الأوعية تدفق بوساطة، وتعتمد على بطانية في أعقاب الضغط، سجل قطر أرتيريولي الدهنية في بقية (دي). يشار إلى ذلك كالقطر الأساس يستريح.
- قبل انقباض الأوعية الدموية ~ 55 في المائة من قطر الأساس يستريح (Dp) بإضافة 1 ميليلتر endothelin-1 (ET-1، 10 − 10 م) مباشرة إلى الحمام والانتظار 5 دقائق للتأثير. كرر هذه العملية حتى تصل إلى % ~ 55 المطلوب قبل مقيدة الدولة.
- عقب ما قبل انقباض، حمل تدفق مستمر في الفضاء إينترالومينال من الأنسجة الدهنية الشرايين، في تكافؤ وعكس الاتجاهات حيث أنه يمكن تطوير فرق ضغط عبر السفينة دون تغيير الضغط إينترالومينال يعني من 60 ملم زئبق.
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان خزان واحد يتحرك من 10 سم في الارتفاع، واحدة أخرى يحتاج إلى نقلها إلى أسفل من 10 سم إلى تغيير التدرجات الضغط وهكذا تغير معدل التدفق إينترالومينال. إذا هي رغبت قياسات معدل تدفق أكثر دقة، يمكن تطبيق نظام مقياس تدفق كمية الإعداد التجريبية. - قياس التدفق بوساطة تمدد 3-5 دقائق بعد بدء التعريفي التدفق. يمكن أن تكون مستويات تدفق intraluminal (التدرجات الضغط) في نطاق 0-100 غروهارلم 2 سين زيادة كل زيادة في الضغط التدرج غروهارلم Δ10 2 س كل دقيقة 5-6، بحد أقصى قدرة 100 غروهارلم 2 أولمبيك
ملاحظة: من أجل حمل الاندفاق الصفحي مستقرة في التجويف، كلا أحجام نصيحة القنية زجاج الصغرى تحتاج إلى تكون جداً قريبة من القطر الداخلي للشرايين؛ وبخلاف ذلك، سوف تنتج تدفق المضطرب داخل التجويف والحث على أخطاء القياس غير المرغوب فيها. - عقب وساطة تدفق-التقييم تمدد، العودة خزانات الضغط إلى نفس الارتفاع (60 مم زئبق).
- أغسل أرتيريولي والدائرة بإزالة الحل فورا من دائرة ثم استبدال مع الطازجة كريبس الحل. ويتم ذلك مع توخي الحذر فيما يتعلق بعدم عرقلة arteriole علقت داخل الدائرة.
- تكرار هذه العملية 3-4 مرات لمدة 20-30 دقيقة، أو حتى سفينة معزولة يعود إلى القطر الأساس يستريح.
- توسع الأوعية أستيل بوساطة، بطانية المعتمدة،
- عند أرتيريولي الدهنية عاد إلى القطر الأساس يستريح، قبل انقباض سفينة ~ 55% من إدارة endothelin-1 (ET-1، 10 − 10 م) مباشرة إلى الحمام، كما هو موضح أعلاه في القسم 4.1.2.
- عقب ما قبل انقباض، إدارة التتابع جرعات متزايدة (2 ميليلتر) من أستيل الذي تم وساطة مستقبلات، أكسيد النيتريك مؤثر (منظمة العمل ضد الجوع، 10 -9 إلى 10 -5 م) مباشرة إلى الحمام. سجل التغيير في قطر أرتيريولار 5 دقائق بعد كل جرعة.
- عندما وصلت السفينة إلى هضبة بعد جرعة Ach النهائي، يغسل السفينة 3-4 مرات مع الحل كريبس. تسمح 20-30 دقيقة للسفينة استردادها وإعادتها ليستريح قطرها خط الأساس. للمساعدة في الحفاظ على درجة الحموضة في الحدبة الجهاز، قم بتغيير كريبس حل كل 15 دقيقة
- احتضان arteriole مع ن ث-نيترو-l-ارجينين إستر الميثيل (L-الاسم، 10 -4 م)، ومثبط لأكسيد النيتريك synthase لمدة 30 دقيقة، وثم كرر 4.2.1 و 4-2-2 وصف المساهمة النسبية ل أكسيد النيتريك لتوسع الأوعية بوساطة منظمة العمل ضد الجوع-
- تقييم مستقلة عن البطانة توسع الأوعية (وظيفة العضلات الملساء والأوعية الدموية) وصلاحية السفينة الإدارة متسلسلة من جرعات متزايدة من بابافرين (10 -8 إلى 10 -4 م) مباشرة إلى الحمام. في حالة عدم العودة إلى قطر السفينة، أو يتجاوز قطرها خط الأساس (Di) يستريح في الاستجابة إلى بابافرين (أي توسع الأوعية المناسبة)، تنظر في السفينة غير قادر على الاستمرار وتجاهل نقاط البيانات.
5. تحليل البيانات وحساب
- حساب مفاعليه الأوعية الدموية. استخدام توسع الأوعية النسبة المئوية للتعبير البيانات لحساب الاختلافات الأساسية في قطر السفينة وحساب باستخدام المعادلة التالية:
% توسع الأوعية (DT-Dp/Di-Dp) × 100 =
حيث DT هو قطر مسجل في نقطة زمنية معينة (كحد أقصى قطر)، Dp هو قطر سجلت بعد إضافة عامل تضيق الأوعية (أي. ET-1 الناجم عن انقباض قطر)، وهو دي قطر تسجل فورا قبل إضافة عامل تضيق الأوعية (يستريح الأساس القطر). 9 - تحديد حساسية توسع الأوعية وتضيق الأوعية (الاستجابة للجرعة) إلى مؤثر كتركيز منظمة العمل ضد الجوع أو بابافرين ET-1 الذي يتسبب في 50% الاستجابة القصوى (50 من الجماعة الأوروبية) التي يمكن تعريفها بواسطة معلمة سيجمويدال والمرسومة، كما هو موضح سابقا. 10
ملاحظة: الدراسات إمكانية تكرار نتائج بين المراقبين من توسع الأوعية ميكروفيسيلس الدهنية لديها معامل الارتباط عالية (CC) من 0.99 (n = 10 سفينة التجارب) في المختبر.
6-"التحليل الإحصائي"
- إكسبرس مستمر القياسات كما يعني ± sem. هذه تميل إلى أن توزع عادة. تحليل مفاعليه الأوعية الدموية في الشرايين الدهنية بالتدابير المتكررة ANOVA ثنائي الاتجاه. بدلاً من ذلك، قارن
- المنطقة تحت المنحنى (AUC) من الأرض لتوسع الأوعية التراكمي للجرعة-الاستجابات بين مجموعات العلاج. وفي جميع الحالات، تنظر ف < ذات دلالة إحصائية 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مختبرنا استخدمت فيديوميكروسكوبي لدراسة تعتمد على البطانة-وتوسع الأوعية مستقلة، فضلا عن وظيفة فاسوكونتراكتيلي من الأنسجة الدهنية الشرايين المعزولة من الدهون تحت الجلد والأحشاء من البشر يعانون من السمنة المفرطة. يتم عرض الإعداد التجريبية المميزة في الشكل 1A. علقت بين اثنين الزجاج الماصات الشعرية الشرايين الأنسجة الدهنية والمضمونة في المكان مع خيوط داخل قاعة الجهاز كما هو موضح في الشكل 1 باء. كما هو موضح أعلاه في القسم 5.1، يمكن تقييم الاستجابات أرتيريولار ثم بفحص السفينة عند خط الأساس (الشكل 2A)، تليها انقباض قبل ET-1 ~ 55 في المائة من خط الأساس القطر (الشكل 2)، وثم فعل مؤثر توسع الأوعية والاسترخاء التجويف الأوعية الدموية كما هو معروض في الشكل 2.
نحن وآخرون قد لاحظ أن البطانة تعتمد على توسع الأوعية الردود إلى زيادة تدفق (إجهاد القص)11 ومنظمة العمل ضد الجوع12 كانت إلى حد كبير حدث في أحشاء مقارنة بالشرايين الدهنية تحت الجلد (الشكل 3 ألف، 3B ) في السمنة البشرية. ومع ذلك، توسع الأوعية البطانة المستقلة ردا على بابافرين لا تغير خلطات بين المستودعين (الشكل 3). معا، هذه النتائج تشير إلى أن الخلل في الأوعية الدموية في المجالات الحشوي إلى حد كبير نتيجة للخلل على مستوى البطانة، على الأقل في المراحل الأولى من المرض. هذا الأسلوب يسمح بتحليل منهجي للردود وعائي للشرايين البشرية الصغيرة سليمة ويمكن تطبيقها أيضا على مناطق أخرى موجوداً من المفرج البشرية. النظام السابقين فيفو يمكن التلاعب بها باستخدام الأساليب الدوائية العديدة مثل الاستجابة للأنسولين كفهرس للأوعية الدموية غشائي الأنسولين المقاومة6، أو دراسات الجرعة-الردود إلى نيتروغليسرين لاختبار العضلات الملساء والأوعية الدموية وظيفة الطبقة. 12 الأساليب البيولوجية مثل إسكات الجيش الملكي النيبالي يمكن أيضا أن إدخال13 يحتمل وضع أطر آليا لفهم المنظمين الحرجة التي تمنح خلل الأوعية الدموية تحت ظروف محددة من المرض.
رقم 1: إنشاء فيديوميكروسكوبي- (أ) الصورة التي تصور مكونات الدائرة الجهاز فيديوميكروسكوبي. تحميل الصورة (ب) أرتيريولي الدهنية البشرية بين اثنين الزجاج الماصات الشعرية في قاعة الهيئة. قطر السفينة والتغيرات في الاستجابة للمحفزات الفسيولوجية والدوائية التي يمكن دراستها وكمياً باستخدام برمجيات التحليل ومرفق كاميرا مقلوبة المتخصصة في النظام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: رسم توضيحي لتوسع الأوعية ميكروفاسكولار استخدام الضغط فيديوميكروسكوبي- (A) يستريح الأساس أرتيريولار القطر (قطر بعد الضغط أو لا مؤثر أو التحفيز: دي) قطرها مقيدة مسبقاً (ب) (بعد ET-1 التي يسببها القطر مقيدة: Dp)، ينفلمتوري فعل مؤثر (ج) قطر (بعد أن تمت إضافة منظمة العمل ضد الجوع: DT). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: توسع الأوعية تعتمد على البطانة، ومستقله في تحت الجلد مقابل الحشوي الشرايين الدهنية في البشر يعانون من السمنة المفرطة. البطانة-تعتمد على توسع الأوعية كان يخفف إلى حد كبير في البطن مقارنة بالانسجة الدهنية تحت الجلد الشرايين عند تقييم من قبل (أ) زيادة تدفق (إقران السفن تحت الجلد والحشوي، n = 20)، أو (ب) أستيل الجرعة الاستجابة مع/بدون اسم ل (إقران السفن تحت الجلد والحشوي، n = 16). (ج) البطانة مستقلة توسع الأوعية لم يتم تغييرها متفاوتاً بين الشرايين الحشوية وتحت الجلد عند تقييم استجابة جرعة بابافرين (إقران السفن تحت الجلد والحشوي، n = 8). * تشير إلى مجموعة الاختلافات بين المستودعات؛ †Denotes مستودع على حدة الخلافات بين أستيل مع اسم ل مقارنة أستيل وحدها؛ NS: ليس كبيرا. وترد البيانات mean± ووزارة شؤون المرأة، ف < 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تشريح والعزلة للشرايين الدهنية من الأنسجة المحيطة يمكن أن يكون عملية تستغرق وقتاً طويلاً وتتطلب عمالة مكثفة مع الحرص على الاهتمام بالتفاصيل والبروتوكول التقنية. يتطلب الإجراء ميكروديسيكتيون المهارات الدقيقة وأواني تشريح المتخصصة لمنع احتمال حدوث ضرر للعضلات الملساء أو غشائي خلية طبقات من ميكروفاسكولاتوري. يمكن منع ثقوب صغيرة حتى عرضي في الجدار أرتيريولار ذات إينترالومينال والنتائج في تجربة غير ناجحة. بالإضافة إلى ذلك، كانولاتيون لاستخدام خيوط الشرايين أمر حاسم لضمان الشرايين بين نصائح الماصة الشعرية الزجاج في نهاية كل من السفينة.
يمكن وضع البشرية المعزولة ميكروفيسيلس لهجة شذوذ عفوية بعد 30-40 دقيقة للضغط على 60 مم زئبق. ومع ذلك، وجدنا أن الشرايين الدهنية البشرية عموما الحجم 50-350 ميكرون قطر الداخلي لومينال صغيرة نسبيا مع طبقات متفرق من العضلات الملساء والأوعية الدموية، وتميل إلى عدم تطوير لهجة شذوذ كبيرة مقارنة بالهيكل العظمى والعضلات في الشرايين. وبالتالي نحن حمل قبل انقباض الشرايين الصغيرة هذه باستخدام ET-1 قبل التعرض إلى فاسوديلاتورس. ونجد أن تمارس ET-1 استجابة مضيق للأوعية أكثر قابلية للتنبؤ بها بينما في بعض الحالات قد يكون هناك تباين في الاستجابات ليضع مستقبلات ألفا مثل فينيليفريني. فمن الضروري اختيار يضع المناسبة للحث على انقباض قبل ~ 55% المطلوبة؛ ومع ذلك كما أنها حاسمة لتحديد المبلغ الصحيح لعامل يحد مسبقاً لمنع أكثر من الجرعة والسمية الأضرار بالسفينة. يمكننا تحقيق ذلك من خلال بدءاً بأقل جرعة النطاق والمعايرة يصل التأثير كما هو موضح في المقطع 4.1.2.
الشرايين في الأنسجة الدهنية حساسة للتغيرات في درجة الحموضة ودرجة الحرارة؛ 14 لذلك، من الأهمية بمكان رصد والتحكم في درجة الحموضة المناسبة (7.4) ودرجة الحرارة (37 درجة مئوية) أثناء عملية تجريبية. بينما فيديوميكروسكوبي نظام محكم تنظيم من درجة حرارة التي تسيطر، من الضروري رصد الرقم الهيدروجيني للحل كريبس طوال هذه التجربة لتجنب التحولات التي قد تحرف النتائج. محتدما المستمر الحل كريبس والاستعاضة عن حل كل 15 دقيقة أثناء الضغط والغسيل خطوات خفض تغيرات درجة الحموضة على مر الزمن.
بينما فيديوميكروسكوبي تقنية مفيدة لدراسة الخصائص الوظيفية ميكروفيسيلس، الأسلوب منحنى التعلم كبيرة وقد يكون العمل المكثف لا سيما خلال عملية عزل الأوعية الدموية. تبعاً لنوع النسيج الذي يتم فحص، أثبتت تجربتنا مع الأنسجة الدهنية ميكروفيسيلس أن الإجراء كانوليشن الذي قد يستغرق مقدار كبير من الوقت والصبر. بالإضافة إلى ذلك، هناك وقت الأصيل حساسية للتجارب كسفن خارج الجسم تميل إلى فقدان خصائصها الفسيولوجية والوظيفية على مر الزمن. وهكذا، تحتاج التجارب التي يتعين القيام بها داخل النافذة قابلة للاستمرار لسفن دقائق إلى ساعات بعد خزعة جراحية قبل اضمحلال النسيج في نهاية المطاف.
أهمية سريرية والأساس المنطقي لهذا النموذج التجريبي استخدام فيديوميكروسكوبي لدراسة الشرايين معتمد بقدرتنا على مباشرة التحقيق الفيزيولوجيا المرضية في قطاعات كاملة سليمة من الأوعية الدموية البشرية إزالتها من المواضيع الحية، التي لا يمكن النسخ المتماثل بتصوير غير الغازية. في الواقع، فإن قدرتنا على الوصول مباشرة وفحص الأوعية الدموية البشرية المختلة وظيفيا في، على سبيل المثال هيئة السمنة، يمكن أن توفر لنا فرصاً لاكتساب نظرة ثاقبة المسارات التي يتم تبديل متفاوتاً في ظروف المرض واكتشاف رواية الأهداف العلاجية. وعلاوة على ذلك، تبين أن السابقين فيفو التقييم لدالة أرتيريولار الدهنية يرتبط مع فيفو الاستجابات الدالة غشائي النظمية في أسرة أخرى الأوعية الدموية داخل فرد البيانات المنشورة من المختبر وغيرهم، ومعاون مع عوامل الخطر بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم، والتدخين، والسكري، والتهاب الأوعية الدموية. 12 , 15 , 16 كما نشرنا بيانات تدل على ارتباط كبير بين المناعي النتائج ذات الصلة للبيولوجيا أكسيد النيتريك في خلايا بطانية الدهنية الحشوي ومما يشير إلى توسع الأوعية بوساطة التدفق الشرياني عضدي شذوذ موازية في الدهنية والتداولات الجهازية. 17 نظراً للطابع النظمي للخلل في بطانية، نعتقد أن هذا الأسلوب يمثل نهجاً عمليا دراسة الأنسجة الوعائية لا البشرية فقط ولكن يحتمل أيضا أن استخدام هذا الأسلوب في الحيوانات والسريرية الدراسات الطولية إلى دراسة آثار العلاج. وتتوفر أيضا تقنيات أخرى للنظر في ميكروفاسكولاتوري مثل سلك ميوجرافي، الذي يميل إلى أن يكون أقل من الناحية الفنية من الصعب أداء ويسمح لتدابير التوتر متساوي القياس سفن منعزلة ليضع مختلف باستخدام محول قوة. بينما يوفر هذا الأسلوب أيضا المعلومات المتعلقة بالخصائص الفسيولوجية ميكروفيسيلس، لا تستخدم الإنشاء نظام ضغط داخل لومينال التي قد تجعله أقل عرضه إيجاز في فيفو الظروف. ميزة فيديوميكروسكوبي هو القدرة على حمل ضغط intraluminal ثابتة نسبيا التقليل من التغييرات في القص في التجويف. يمكن تطبيق الأسلوب إلى ميكروفيسيلس الحجم مماثلة في كل من البشر والحيوانات. 9 , 12 , 18 أخيرا، أنه ينبغي ملاحظة أن عددا من النظم المتاحة تجارياً فيديوميكروسكوبي متاحة للشراء والإعداد؛ ولكن المفاهيم الشاملة الفسيولوجية موحدة إلى حد ما عبر كافة الأنظمة الأساسية. 2 , 6 , 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا الكشف أو تضارب المصالح، إلى التقرير.
Acknowledgments
المؤلف يود أن يشكر المتطوعين للمشاركة في هذه الدراسات وموظفي العمليات الجراحية في مركز بوسطن الطبي لتوفير خزعات الأنسجة الدهنية. جوكس الدكتور معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) منح HL081587 و HL114675 و HL126141. النمساوية الدكتور معتمد من قبل المعهد الوطني للصحة منح K23 HL135394.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical Name | |||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Endothelin-1 | Sigma Aldrich | E7764 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| Nw-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride | Sigma Aldrich | N5751 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Papaverine | Sigma Aldrich | P3510 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4) | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Forceps | Finescience tools | 15000-08 | |
| Inverted microscope | Zeiss Achromat | ||
| Laboratory tubing | Euro-Pharm | 250100306F999 | |
| Needle/pippette puller | David kopf instruments | 720 | |
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Surgical specialties | A7756N | |
| Scissors | Finescience tools | 150000-08 | |
| Vessel Chamber | DMT | VAS v.2.1 |
References
- Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96 (4), 313-326 (1999).
- Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J Vis Exp. (101), e50997 (2015).
- Gutterman, D. D., et al. The Human Microcirculation: Regulation of Flow and Beyond. Circ Res. 118 (1), 157-172 (2016).
- Fuster, J. J., Ouchi, N., Gokce, N., Walsh, K. Obesity-Induced Changes in Adipose Tissue Microenvironment and Their Impact on Cardiovascular Disease. Circ Res. 118 (11), 1786-1807 (2016).
- Farb, M. G., et al. Reduced adipose tissue inflammation represents an intermediate cardiometabolic phenotype in obesity. J Am Coll Cardiol. 58 (3), 232-237 (2011).
- Farb, M. G., et al. WNT5A-JNK regulation of vascular insulin resistance in human obesity. Vasc Med. 21 (6), 489-496 (2016).
- Durand, M. J., Phillips, S. A., Widlansky, M. E., Otterson, M. F., Gutterman, D. D. The vascular renin-angiotensin system contributes to blunted vasodilation induced by transient high pressure in human adipose microvessels. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307 (1), H25-H32 (2014).
- Farb, M. G., et al. Cyclooxygenase inhibition improves endothelial vasomotor dysfunction of visceral adipose arterioles in human obesity. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 349-355 (2014).
- Park, S. Y., et al. Impact of age on the vasodilatory function of human skeletal muscle feed arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (2), H217-H225 (2016).
- Ives, S. J., et al. Human skeletal muscle feed arteries studied in vitro: the effect of temperature on alpha(1)-adrenergic responsiveness. Exp Physiol. 96 (9), 907-918 (2011).
- Grizelj, I., et al. Reduced flow-and acetylcholine-induced dilations in visceral compared to subcutaneous adipose arterioles in human morbid obesity. Microcirculation. 22 (1), 44-53 (2015).
- Farb, M. G., et al. Arteriolar function in visceral adipose tissue is impaired in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (2), 467-473 (2012).
- Tanner, M. J., et al. Dynamin-Related Protein 1 Mediates Low Glucose-Induced Endothelial Dysfunction in Human Arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2016).
- Ives, S. J., et al. alpha1-Adrenergic responsiveness in human skeletal muscle feed arteries: the impact of reducing extracellular pH. Exp Physiol. 98 (1), 256-267 (2013).
- Dharmashankar, K., et al. Nitric oxide synthase-dependent vasodilation of human subcutaneous arterioles correlates with noninvasive measurements of endothelial function. Am J Hypertens. 25 (5), 528-534 (2012).
- Truran, S., et al. Adipose and leptomeningeal arteriole endothelial dysfunction induced by beta-amyloid peptide: a practical human model to study Alzheimer's disease vasculopathy. J Neurosci Methods. 235, 123-129 (2014).
- Karki, S., et al. Forkhead box O-1 modulation improves endothelial insulin resistance in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1498-1506 (2015).
- Shahid, M., Buys, E. S. Assessing murine resistance artery function using pressure myography. J Vis Exp. (76), (2013).
