Summary
Den modificerede gær-en-hybrid-analyse beskrevet her er en forlængelse af den klassiske gær-en-hybrid (Y1H) -assay for at studere og validere den heteromere proteinkompleks-DNA-interaktion i et heterologt system til enhver funktionel genomisk undersøgelse.
Abstract
Gennem årene har gær-et-hybrid-analysen vist sig at være en vigtig teknik til identifikation og validering af fysiske interaktioner mellem proteiner som transkriptionsfaktorer (TF'er) og deres DNA-mål. Metoden, der præsenteres her, anvender det underliggende koncept for Y1H, men modificeres yderligere for at studere og validere proteinkomplekser, som binder til deres mål-DNA. Derfor er det omtalt som den modificerede gær-en-hybrid (Y1.5H) -assay. Dette assay er omkostningseffektivt og kan let udføres i en regelmæssig laboratorieindstilling. Selvom der anvendes et heterologt system, kunne den beskrevne metode være et værdifuldt værktøj til at teste og validere den heteromeriske proteinkompleksbinding til deres DNA-mål (er) for funktionel genomik i ethvert system af undersøgelse, især plantegenom.
Introduction
Generelt for at forstå protein-DNA-interaktioner er Y1H-assayet det foretrukne system med succes anvendt i en laboratorieindstilling 1 . Det basale Y1H assay involverer to komponenter: a) en reporterkonstruktion med DNA af interesse med succes klonet opstrøms for et gen der koder for et reporterprotein; Og b) en ekspressionskonstruktion, som vil danne et fusionsprotein mellem TF af interesse og et gærtranskriptionsaktiveringsdomæne (AD). DNA'et af interesse betegnes almindeligvis som 'agn', mens fusionsproteinet er kendt som 'bytte'. I de forløbne år er flere versioner af Y1H-analysen udviklet til at passe specifikke behov med deres egne fordele 2 . Det eksisterende Y1H assay kan med succes implementeres for at identificere og validere interaktion af et protein ad gangen med dets DNA agn, men mangler evnen til at identificere heterodimere eller multimere protein-DNA-interaktioner.
"> Den her beskrevne metode er en modificeret version af den eksisterende Y1H, der muliggør forskere til samtidig at studere flere proteiner, der er bindende til deres mål-DNA-sekvens (er). Målet med dette assay er at udtrykke proteinet af interesse med et aktiveringsdomæne (pDEST22: TF) og evaluere aktiveringen af kandidat-DNA-regionerne fusioneret til en reporter i nærvær og / eller fravær af den interaktive proteinpartner (pDEST32ΔDBD-TF) i gærsystemet. Denne analyse vil tillade os at bestemme, om interaktionen mellem disse to Proteiner er nødvendige for aktivering af målet. Dette er et GATEWAY-kloningskompatibelt system og er derfor muligt at anvende i en regelmæssig laboratorieindstilling. Denne protokol er baseret på direkte transformation, hvilket giver den lette co-transformation af forskellige TF'er i et gærsystem . Det er således en fordelagtig strategi at validere proteinkomplekserne, der binder til deres mulige DNA-mål for in vitro molekylær og funktionel validering fEller ethvert system. Nuværende teknikker såsom Tandem affinitetsrensning (TAP) metoder er dyre og arbejdskrævende, men tillader påvisning af protein hetrokomplekser i stor skala 3 , 4 , 5 . Denne modificerede gær-en-hybrid kan med succes udføres i en regelmæssig laboratorieindstilling i lille skala ( figur 1 ) og er også omkostningseffektiv. Y1.5H-analysen kan lette forskere på tværs af samfundet til at teste og validere deres hypotese til at definere rollen som multimere proteinkompleksbinding til et fælles DNA-mål ved anvendelse af et heterologt system. Baseret på resultaterne kunne hypotesen valideres in vivo i det foretrukne studieprogram. For nylig har vi brugt denne tilgang til at definere rollen som en TF og dens virkemåde til at regulere blomstringen i Arabidopsis 6 .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konstruer og reporter plasmidpræparation
- PCR amplificerer promotorregionerne / "fragmenterne" (fortrinsvis ~ 250-500 bp) af mål-DNA'et, der skal analyseres for yderligere kloning i indgangsvektoren under anvendelse af E. coli (TOP10).
- Efter sekventeringsbekræftelse subklone den positive klon i en kompatibel pGLacZi ekspressionsvektor 7 som tidligere beskrevet 8 , 9 , 10 , 11 .
- Transform gærstammen for promotorintegration (YM4271) ved homolog rekombination af pGLacZi til dannelse af gærreporterstamme som beskrevet tidligere 12 , 13 . Transformations- og bekræftelsestrin for gærstammen med DNA-regionen sammen med opskrift af mediet er ikke beskrevet her, da trinene ligner klassisk Y1H-protokolAss = "xref"> 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . PEXP-AD502-kontrolplasmidet kan anvendes til normaliseringsformål under kvantificering af p-galactosidaseaktivitet som tidligere beskrevet 8 .
- Klone TF eller protein af interesse og efterfølgende klone den interaktive proteinpartner i ekspressionsvektorer pDEST22 og pDEST32ΔDBD (pDEST32 minus DNA Binding Domain). De transformerede gærpromotorfragmenter og TF-klonerne anvendes efterfølgende yderligere i protokollen.
2. Ændret Y1.5H-protokol
- På dag 1 (eftermiddag) starter man med 5 ml kultur i SD-Ura fra en petriskål eller glycerolmasse og inkuberes natten over i en 30 ° C ryster.
BEMÆRK: Denne kultur kan startes fra en nystribet plade eller direkte fra en 25% eller 30% glycerolbestand af gærenKlon med DNA fragmentet. - På dag 2 (eftermiddag) inokuleres 10 ml YPDA-medier med 500 μl af natten over kulturen og inkuberes natten over i en 30 ° C rystemaskine.
- Dag 3 (tidligt om morgenen og hele eftermiddagen): Forbered kompetente celler (tidligt om morgenen).
- Inokulere 100 ml YPDA-medier med 2 ml af natten over kulturen og inkuber i en 30 ° C ryster. Voks denne friske kultur, indtil OD 600 når 0,4-0,8 (3-5 timer).
BEMÆRK: Kontroller OD 600 af overnatningskulturen og sørg for at startpunktet OD 600 for dette trin er 0,1 - 0,2. Anvendelse af over- eller undervokst kultur kan forlænge eksperimentet. - Centrifuge i 5 minutter ved 1000 xg og 21 ° C. Kassér supernatanten.
- Rekonstituer pellets i 10 ml sterilt vand ved hjælp af hvirvel eller pipetter op og ned.
- Centrifuge i 5 minutter ved 1000 xg og 21 ° C. Kassér supernatanten.
- ReconstituTe-pellets i 2 ml Tris-ethylendiamintetraeddikesyre (TE) / lithiumacetat (LiAc) ved anvendelse af en hvirvel eller pipettering op og ned.
BEMÆRK: Se opskriften til TE / LiAc i tabel 1 . - Centrifuge i 5 minutter 1000 xg og 21 ° C. Kassér supernatanten.
- Re-suspend pellet i 4 ml TE / LiAc + 400 μL laksesperm DNA (10 mg / ml) pipettering op og ned og fortsæt til næste trin.
- Inokulere 100 ml YPDA-medier med 2 ml af natten over kulturen og inkuber i en 30 ° C ryster. Voks denne friske kultur, indtil OD 600 når 0,4-0,8 (3-5 timer).
- Co-transformation: Varme choker cellerne (sent på eftermiddagen)
- Fordel 20 μl celler pr. Brønd i en 96-brønds blandeplade (U-bund).
- Tilsæt 150 ng (~ 1,5 μL) hvert af pDEST22: TF-plasmidet, pDEST32ΔDBD: TF-plasmidet og pEXP-AD502 plus pDEST32ΔDBD: TF (normaliseringskontrol) til brøndene.
BEMÆRK: Optimale resultater forventes med ~ 150 ng hver af pDEST22: TF og pDEST32ΔDBD: TF-plasmidet til vellykket samtransformation. Kan variere med konstruktion og plasmidudtryk, såledesSkal optimeres med hvert forsøg. En anden kontrol pDEST22-TF plus pDEST32deltaDBD kan også medtages efter brugerens skøn. - Tilsæt 100 μl TE / LiAc / polyethylenglycol (PEG) pr. Brønd ( bland 3 gange ).
BEMÆRK: Se opskriften til TE / LiAc / PEG i tabel 1 . - Dæk pladen med en åndbar tætning og inkuber i 20-30 minutter (kan være længere) ved 30 ° C (ingen omrøring nødvendig).
- Varmestød i 20 minutter ( præcist ) ved 42 ° C.
- Plader cellerne.
- Centrifuge i 5 minutter ved 1000 xg og 21 ° C. Fjern supernatanten ved hjælp af en flerkanalspipette. Tilsæt 110 μL TE og bland.
- Centrifuge i 5 minutter ved 1000 xg og 21 ° C. Fjern 100 μl af supernatanten ved anvendelse af en flerkanalspipette. Genopløs pelleten med puncheren.
- Overfør celler på SD-Trp-Leu agarplader. Inkubér pladerVed 30 ° C til næste trin.
- Dag 5 (eftermiddag): Overfør cellerne på nye plader ved hjælp af puncher / microplate replicator.
- Fyld en steril blandingsplade med 96 brønde (U-bund) med 50 μl TE ved anvendelse af en flerkanalspipette. For-våd puncheren i TE.
BEMÆRK: Puncheren eller mikroplatteplikatoren skal steriliseres før dette trin og senere senere i protokollen. Den almindelige måde at sterilisere puncher på, såsom at nedsænke den i ethanol (100%, ikke molekylærbiologisk kvalitet) og derefter brænde den til flammen, kan anvendes. Vent i 1 minut for at afkøle puncherstifterne.
Forsigtig: Ved udførelse af steriliseringen på bænken; Sørg for, at bænken er forrenset med ethanol og fri for brændbart materiale rundt. Brug egnede personlige værnemidler (PPE). - Punch kolonier og suspendere i TE-fyldt plade.
BEMÆRK: Hvis der er en jævn vækst på pladen, kan kolonierne stanses direkteTil den TE-fyldte plade eller alternativt bør enkeltkoloni (i tilfælde af flere kolonier) vælges ved anvendelse af en steriliseret tandstikker til den TE fyldte plade, og efterfølgende kan puncher anvendes til det næste trin. - Overfør dem på nye SD-Trp-Leu agarplader for optimal overflade dækning. Inkubér plader ved 30 ° C indtil næste trin.
- Fyld en steril blandingsplade med 96 brønde (U-bund) med 50 μl TE ved anvendelse af en flerkanalspipette. For-våd puncheren i TE.
- Dag 7 (eftermiddag): Start kultur for at måle β-galactosidase aktivitet.
- Fyld en steril blandingsplade med 96 brønde (U-bund) med 50 μl SD-Trp-Leu- medier ved anvendelse af en flerkanalspipette.
- Fyld en steril 96-dyb brøndblok med 180 μl SD-Trp-Leu medier ved hjælp af en flerkanalspipette.
- Forsvid puncheren i medier og overfør kolonier fra plade til 50 μl medier.
- Overfør 20 μl gær til 180 μl SD-Trp-Leu medier og forsegl blokken med en åndbar tætning. inkuberI 36 timer ved 30 ° C ryster.
- Dag 9 (morgen): Start kulturen til enzymatisk måling.
- Overfør 100 μl kultur til 500 μl YPDA medier i en steriliseret 96 dyb brønd blok.
- Dæk den steriliserede dybe brøndplade med en åndbar tætning og inkuber i 3-5 timer ved 30 ° C med omrøring ved 200 omdr./min. (Indtil OD 600 0,3-0,6).
- Genopløs kultur og overfør 125 μL ved hjælp af en flerkanalspipette på en spektrofotometerplade (mål OD 600 ).
BEMÆRK: Forsigtig: Afgiv ikke det sidste dråbe for at undgå bobler, hvis OD 600 er under 0,3 - 0,6, inkubér de resterende celler i 1 - 2 timer mere baseret på læsningen. Den 125 μl kultur, der anvendes ved dette trin, kan kasseres eller overføres tilbage til den oprindelige dybbrøndblok efter brugerens skøn. - Centrifug de resterende celler i den dybe brøndblok i 10 minutter ved 3000 xg og 21 ° C. Fjern supernatanT ved at vende.
- Tilsæt 200 μL Z-buffer og hvirvel.
BEMÆRK: Se opskriften til Z-buffer i tabel 1 . - Centrifuge i 5 minutter ved 3000 xg og 21 ° C. Fjern supernatanten ved invertering.
- Tilsæt 20 μl Z-buffer og hvirvel.
- Dæk pladen med forseglingsfolie, som kan modstå fryseoptøningscykler. Udfør 4 cykler med frysning / optøning ved hjælp af flydende nitrogen i en dampkoge og derefter 42 ºC i et vandbad (2 min hver).
- Tilsæt 200 pi Z-buffer / beta-mercaptoethanol (β-ME) / Ortho-nitrophenyl-β-galactosid (ONPG) (12 ml, 21 pi, 8,4 mg henholdsvis vil udbytte 20 ml opløsning; altid forberede friske).
BEMÆRK: ONPG vil tage nogen tid til at opløse ordentligt, så klargør løsningen en time før dette trin nås. ONPG tjener som substrat til måling af p-galactosidaseaktivitet. - Inkuber op til 17 - 24 timer ved 30 ° C (check ind mellem, hvis farve udvikler tidligere prGå videre til næste trin).
- Dag 10 (morgen): Stop reaktionen og måle.
- Tilføj 110 pi 1M Na 2CO 3 for at standse reaktionen og rekordtid.
- Vortex og centrifuge i 10 minutter ved 3000 xg og 21 ° C.
- Tag 125 μL supernatant ved anvendelse af multikanal og mål OD 420 .
BEMÆRK: Forsigtig, dispensér ikke det sidste dråbe for at undgå bobler. - Beregn β-gal aktivitet: 1000 x OD 420 / (tid (min) x volumen (mL) x OD 600 i et regneark.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den generelle pladeopsætningsfremgangsmåde til co-transformation af DNA-regioner i gærcellerne med protein af interesse ( figur 2 ). Pladesætningen kan modificeres i overensstemmelse med behovet for eksperimentet og antallet af testede DNA-regioner / fragmenter. Efter dag 5 i protokollen skal en velopbygget og positiv plade være synlig som i figur 3 . I vores undersøgelse blev promotorregionen på 2600 bp opstrøms fra starten af transkriptionsstartstedet segmenteret i seks regioner eller fragmenter (FR 1-6) 6 . I det repræsentative tal ( Figur 3 ) viser DNA-regionerne 1 og 4 positiv interaktion med protein A- og B-komplekset. Ved måling af β-galactosidaseaktivitet ( Supplerende Tabel 1 ) viser kun fragment-1 firefoldsinduktion af reportergenaktiviteten, mens fragmentet 4 ikke passerede vores inteTærsklen på ≥ to gange.
Figur 1: En oversigt over den modificerede gær-en hybrid (Y1.5H) assay. Layoutet beskriver trin for trin procedure for analysen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: En forenklet repræsentation af pladeopsætningen til co-transformation af gærcellerne med protein (TF) af interesse. Ved en generel forsøgsopsætning kan pladen anbringes som vist i figuren. Kombinationen af konstruktioner og kontroller kan ændres efter behov og er helt efter brugerens skøn.
Figur 3: Et repræsentativt billede af den positive plade (SD-Trp-Leu) for replikat 1 efter vellykket co-transformation. Lignende resultat bør observeres med flere replikater. Fragment 1-6 repræsenterer DNA-region; Intet fragment er en negativ kontrol.
| TE buffer 10X (10 ml) | |
| ønskeligt | Fra lageret |
| 100 mM Tris-Cl (pH 8,0 | 1 ml Tris 1M |
| 10 mM EDTA (pH 8,0) | 200uL EDTA 0,5M |
| Fyld op med vand | |
| TE / LiAc (10 ml) | |
| Fra lageret | |
| 1X | 1m TE 10X |
| 0,1 M LiAc | 1 ml LiAc 1M |
| Fyld op med vand | |
| TE / LiAc / PEG (50 ml) | |
| ønskeligt | Fra lageret |
| 1X | 5 ml TE10X |
| 0,1 M LiAc | 5 ml LiAc 1M |
| 40 ml PEG3350 50% | |
| Z-buffer (1 L) pH 7,0 | |
| Na 2 HPO 4 16,1 g heptahydreret eller 8,52 g vandfri | |
| NaH 2 PO4 5,5 g af hydratiseret eller 4 g vandfrit | |
| KCI 0,75 g | |
| MgSO 4 0,246 g hydratiseret eller 0,12 g vandfri | |
| Vedligehold pH med HCL | |
| Bemærk: | |
| Alle soultioner sterliseres før brug. | |
| Medier og agarplader anvendt i protokollen (YPDA, SD-Ura; SD-Trp-Ura og SD-Trp-Ura agarplader) følger samme opskrift som i Y1H | |
Tabel 1: Opskriften på løsninger, der anvendes i protokollen. Tabellen giver opskriften til lager- og arbejdsløsninger af de vigtigste buffere, der anvendes i analysen.
Supplerende tabel 1: β-galactosidaseaktivitetsmåling. Regnearket, der præsenteres her, kan anvendes som en skabelon til måling af β-galactosidaseaktivitet ved anvendelse af formlen angivet i protokollen. KombinationenKonstruktion kan ændres efter brugerens skøn. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den eksisterende Y1H-standardprocedure er egnet til at identificere en enkeltproteinbyttebinding til dens DNA agn. Med forskellige tekniske ændringer er det eksisterende system blevet udnyttet til at definere transkriptionelle regulatoriske netværk. TF'er er imidlertid kendt for at fungere som en del af komplekser involverende to eller flere TF'er eller proteiner, hvor kun nogle af TF'en er i stand til at binde til DNA'et. Proteiner eller TF'er, som kun har de proteinbindende domæner og mangler evnen til at binde til DNA, er mere tilbøjelige til at arbejde i et kompleks, fortrinsvis med en TF, der er i stand til at binde til DNA'et. High-throughput skærme bruger den traditionelle Y1H lejlighedsvis savner disse biologisk vigtige interaktioner. Det er således afgørende at tilpasse Y1H-analysen for at detektere heteromere protein-DNA-interaktioner.
Metoden præsenteret her er en sådan tilpasning med evnen til at detektere protein-DNA-interaktioner, der involverer mere end et protein eller TF. Den unikke fEatur af den beskrevne fremgangsmåde er transformationen af gæren via co-transformation, hvilket muliggør integration af forskellige TF'er i et gær-system og yderligere anvendt til at teste bindingen af komplekset til mål-DNA-regionerne. En væsentlig fordel ved denne metode er dens evne til at teste to proteiner med deres DNA agn. Denne metode giver ikke oplysninger om specifikke mål (promotor) sites, men vil give information til DNA-regionerne. Samtidig anbefales brug af denne metode kun efter bekræftelsen af den foreslåede protein-proteininteraktion. Baseret på resultaterne bør yderligere eksperimenter såsom elektroforetisk mobilitetsforskydningsassay (EMSA) eller chromatinimmunpræcipitations (ChIP) assay eller andre analyser, der er egnede til studiesystemet, udføres for at identificere målstederne, fortrinsvis in vivo, hvis det er ønskeligt. Anvendelsen af ONPG-baseret måling af β-galactosidaseaktivitet giver bedre bekræftelse end den klassiske kvalitative X-gal assay. Imidlertid bør de overordnede forsøgskrav og egenskaberne af proteinet / proteinerne, der skal testes, tages i betragtning efter behov. Implementeringen af den beskrevne metode til storskærmbilledet, der bruger mere end to proteinpartnere med forskellige DNA-mål, skal testes. Y1.5H-analysen er en omkostningseffektiv metode, som kan udføres i mindre skala i en regelmæssig laboratorieindstilling. Måske kan dette assay udføres ved brug af andre vektorsystemer, men protokollen skal optimeres, hvis den ikke bruger det gateway-kompatible kloningssystem.
Den præsenterede protokol for Y1.5H er en fordelagtig strategi til at validere proteinkomplekser med deres DNA agn for ethvert system af undersøgelse; Planter eller pattedyr. Denne metode er meget nyttig til undersøgelse af plantegenomik, hvor validering i vivo kan være udfordrende i betragtning af plantens niveau og tid og arbejdskrævende transformationsprocedurer. Brugen af denne mEthod kan accelerere hypotesetestningen i det mindste i et heterologt system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker SS Wang, M. Amar og A. Galla for kritisk læsning af manuskriptet. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under tildeling numre RO1GM067837 og RO1GM056006 (til SAK). Indholdet er udelukkende forfatterens ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
References
- Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
- Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Gavin, A. -C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
- Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
- Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
- Klein, P., Dietz, K. -J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
- Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
- Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
- Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).
