Summary
El ensayo de un híbrido de levadura modificado descrito aquí es una extensión del ensayo clásico de levadura híbrida (Y1H) para estudiar y validar la interacción heteromérica de complejo de proteína-ADN en un sistema heterólogo para cualquier estudio de genómica funcional.
Abstract
A lo largo de los años, el ensayo híbrido de levadura ha demostrado ser una técnica importante para la identificación y validación de interacciones físicas entre proteínas tales como factores de transcripción (TFs) y su diana de ADN. El método presentado aquí utiliza el concepto subyacente de la Y1H pero se modifica adicionalmente para estudiar y validar los complejos de proteínas que se unen a su ADN diana. Por lo tanto, se denomina el ensayo de hibridación de hongo de levadura modificado (Y1.5H). Este ensayo es rentable y puede realizarse fácilmente en un entorno de laboratorio regular. Aunque utilizando un sistema heterólogo, el método descrito podría ser una valiosa herramienta para probar y validar el complejo de proteína heteromérica que se une a su (s) diana (s) de ADN para genómica funcional en cualquier sistema de estudio, especialmente genómica de plantas.
Introduction
En general, para comprender las interacciones proteína-ADN, el ensayo Y1H es el sistema preferido utilizado con éxito en un entorno de laboratorio 1 . El ensayo Y1H básico implica dos componentes: a) un constructo reportero con ADN de interés clonado con éxito aguas arriba de un gen que codifica una proteína reportera; Y b) un constructo de expresión que generará una proteína de fusión entre el TF de interés y un dominio de activación de transcripción de levadura (AD). El ADN de interés se conoce comúnmente como "cebo" mientras que la proteína de fusión se conoce como "presa". En años anteriores, se han desarrollado versiones múltiples del ensayo Y1H para adaptarse a necesidades específicas con sus propias ventajas 2 . El ensayo Y1H existente puede implementarse con éxito para identificar y validar la interacción de una proteína a la vez con su cebo de ADN, pero carece de la capacidad para identificar interacciones heterodiméricas o multiméricas de proteína-ADN.
El método descrito aquí es una versión modificada del Y1H existente que permite a los investigadores estudiar simultáneamente múltiples proteínas que se unan a su secuencia o secuencias de ADN diana El objetivo de este ensayo es expresar la proteína de interés con un dominio de activación (pDEST22: TF) y evaluar la activación de las regiones de ADN candidatas fusionadas a un reportero en presencia y / o ausencia de la pareja de proteínas que interactúa (pDEST32ΔDBD-TF) en el sistema de levaduras.Este ensayo nos permitirá determinar si la interacción entre estos dos Proteínas es necesario para la activación de la diana.Este es un sistema compatible con la clonación GATEWAY y por lo tanto viable para su uso en un laboratorio regular.Este protocolo se basa en la transformación directa, que proporciona la facilidad de co-transformación de diferentes TFs en un sistema de levadura Por lo tanto, es una estrategia ventajosa para validar los complejos de proteínas vinculante a sus posibles dianas de ADN para validación molecular y funcional in vitro fO cualquier sistema. Las técnicas actuales, tales como los métodos Tandem de purificación de afinidad (TAP), son costosas y requieren mucho trabajo, pero permiten la detección de hetrocomplexos de proteínas a gran escala 3 , 4 , 5 . Este híbrido de levadura modificado se puede llevar a cabo con éxito en un laboratorio regular a pequeña escala ( Figura 1 ) y también es rentable. El ensayo de Y1.5H puede facilitar a los investigadores de toda la comunidad para probar y validar su hipótesis hacia la definición del papel de complejo de proteínas multiméricas vinculante a una diana común de ADN utilizando un sistema heterólogo. En base a los hallazgos, la hipótesis podría ser validada in vivo en el sistema de estudio preferido. Recientemente, hemos utilizado este enfoque para definir el papel de un TF y su modo de acción para regular la floración en Arabidopsis [ 6] .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Construir y preparar la preparación del plásmido
- PCR amplificar las regiones promotoras / fragmentos (preferiblemente ~ 250-500 pb) del ADN diana para ser analizados para la clonación adicional en el vector de entrada usando E. coli (TOP10).
- Tras la confirmación de la secuenciación, subclona el clon positivo en un vector de expresión pGLacZi compatible 7 como se describió anteriormente 8 , 9 , 10 , 11 .
- Transformar la cepa de levadura para la integración del promotor (YM4271) por recombinación homóloga de pGLacZi para generar la cepa informador de levadura como se describió anteriormente 12 , 13 . Los pasos de transformación y confirmación de la cepa de levadura con la región de ADN junto con la receta de los medios no se describen aquí, ya que los pasos son similares al protocolo Y1H clásicoAsno = "xref"> 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . El plásmido de control pEXP-AD502 se puede usar con fines de normalización mientras se cuantifica la actividad de β-galactosidasa como se ha descrito anteriormente 8 .
- Clonar el TF o la proteína de interés y posteriormente clonar el compañero de la proteína interactuante en los vectores de expresión pDEST22 y pDEST32ΔDBD (pDEST32 menos ADN). Los fragmentos de promotor de levadura transformados y los clones de TF se utilizan subsiguientemente más en el protocolo.
2. Protocolo Y1.5H modificado
- El dıa 1 (tarde), comienza con 5 ml de cultivo en SD-Ura de una placa de Petri o material de glicerol y se incuba durante la noche en un agitador a 30 ◦ C.
NOTA: Este cultivo puede iniciarse a partir de una placa recién chapada o directamente de un stock de glicerol al 25% o 30% de la levaduraClon con el fragmento de ADN. - En el día 2 (tarde), inocular 10 ml de medio YPDA con 500 μl del cultivo durante la noche e incubar durante la noche en un agitador a 30ºC.
- Día 3 (temprano en la mañana y toda la tarde): Prepare células competentes (temprano en la mañana).
- Inocular 100 ml de medio YPDA con los 2 ml del cultivo durante la noche e incubar en un agitador a 30ºC. Cultivar este cultivo fresco hasta que la DO 600 alcance 0,4-0,8 (3-5 h).
NOTA: Compruebe la DO 600 del cultivo durante la noche y asegúrese de que el punto de inicio OD 600 para este paso sea de 0,1 - 0,2. El uso de cultivo excesivo o insuficiente puede prolongar el experimento. - Centrifugar durante 5 min a 1000 xg y 21 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Reconstituya los gránulos en 10 ml de agua estéril usando un vórtice o pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Centrifugar durante 5 min a 1000 xg y 21 ° C. Deseche el sobrenadante.
- ReconstituirTe pellets en 2 mL de Tris-Ethylenediaminetetraaceticacid (TE) / acetato de litio (LiAc) usando un vórtice o pipetando arriba y abajo.
NOTA: Consulte la receta de TE / LiAc en la Tabla 1 . - Centrifugar durante 5 min 1000 xg y 21 ° C. Deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender la pastilla en 4 mL de TE / LiAc + 400 μl de ADN de esperma de salmón (10 mg / mL) pipeteando hacia arriba y hacia abajo y continúe con el paso siguiente.
- Inocular 100 ml de medio YPDA con los 2 ml del cultivo durante la noche e incubar en un agitador a 30ºC. Cultivar este cultivo fresco hasta que la DO 600 alcance 0,4-0,8 (3-5 h).
- Co-transformación: Choque térmico de las células (tarde por la tarde)
- Distribuir 20 μL de células por pocillo en una placa mezcladora de 96 pocillos (fondo en U).
- Añadir 150 ng (~ 1,5 μl) de cada uno de los plásmidos pDEST22: TF, pDEST32ΔDBD: plásmido TF y pEXP-AD502 más pDEST32ΔDBD: TF (control de normalización) a los pocillos.
NOTA: Se esperan resultados óptimos con ~ 150 ng de cada uno de los plásmidos pDEST22: TF y pDEST32ΔDBD: TF para una co-transformación exitosa. Puede variar con las expresiones constructo y plásmido, asíNecesitan ser optimizados con cada experimento. Otro control pDEST22-TF más pDEST32deltaDBD también se puede incluir a discreción del usuario. - Añadir 100 μl de TE / LiAc / polietilenglicol (PEG) por pocillo ( mezclar tres veces ).
NOTA: Consulte la receta de TE / LiAc / PEG en la Tabla 1 . - Cubrir la placa con un sello transpirable e incubar durante 20 - 30 min (puede ser más largo) a 30 ° C (sin agitación necesaria).
- Calor durante 20 min ( precisamente ) a 42 ° C.
- Placa las células.
- Centrifugar durante 5 min a 1000 xg y 21 ° C. Eliminar el sobrenadante usando una pipeta multicanal. Añadir 110 μL de TE y mezclar.
- Centrifugar durante 5 min a 1000 xg y 21 ° C. Eliminar 100 μL del sobrenadante usando una pipeta multicanal. Vuelva a suspender el pellet con el puncher.
- Transferencia de células en placas de agar SD-Trp-Leu . Incubar las placasA 30 ° C hasta la siguiente etapa.
- Día 5 (tarde): Transferir las células en placas nuevas usando un replicador de perforador / microplaca.
- Llene una placa de mezcla de 96 pocillos estéril (fondo en U) con 50 μl de TE usando una pipeta multicanal. Pre-humedezca el puncher en TE.
NOTA: El perforador o el replicador de microplacas deben esterilizarse antes de este paso y posteriormente posteriormente en el protocolo. Se puede aplicar la forma común de esterilizar el punzón tal como sumergirlo en etanol (100%, no grado de biología molecular) y luego quemarlo a la llama. Espere 1 minuto para enfriar los punzones.
Precaución: Si realiza la esterilización en el banco; Asegúrese de que el banco esté previamente limpiado con etanol y libre de cualquier material combustible alrededor. Use equipo de protección personal adecuado (PPE). - Perforar las colonias y volver a suspender en la placa llena de TE.
NOTA: Si hay un crecimiento suave en la placa, las colonias pueden ser perforadas directamenteA la placa llena de TE o, alternativamente, una colonia única (en el caso de colonias múltiples) debe recogerse usando un palillo de dientes esterilizado a la placa llena de TE y posteriormente se puede usar un punzón para la siguiente etapa. - Transferirlos en las nuevas placas de agar SD-Trp-Leu para una cobertura de superficie óptima. Incubar las placas a 30 ° C hasta el siguiente paso.
- Llene una placa de mezcla de 96 pocillos estéril (fondo en U) con 50 μl de TE usando una pipeta multicanal. Pre-humedezca el puncher en TE.
- Día 7 (tarde): Iniciar el cultivo para medir la actividad de la β-galactosidasa.
- Llenar una placa de mezcla estéril de 96 pocillos (fondo en U) con 50 μl de medio SD-Trp-Leu usando una pipeta multicanal.
- Llene un bloque estéril de 96 pocillos con 180 μL de medio SD-Trp-Leu usando una pipeta multicanal.
- Pre-humedezca el puncher en los medios y transfiera las colonias de la placa a los 50 μL de medio.
- Transferir 20 μL de levadura a los 180 μL de medio SD-Trp-Leu y sellar el bloque con un sello transpirable. IncubarDurante 36 h a 30 ° C.
- Día 9 (mañana): Iniciar el cultivo para la medición enzimática.
- Transferir 100 μl de cultivo a 500 μl de medio YPDA en un bloque de 96 pozos profundos esterilizados.
- Cubrir la placa de pozo profundo esterilizada con un sello transpirable e incubar durante 3 - 5 h a 30 ° C con agitación a 200 rpm (hasta OD 600 0.3-0.6).
- Re-suspender el cultivo y transferir 125 μL usando una pipeta multicanal en una placa de espectrofotómetro (medida OD 600 ).
NOTA: Precaución: No dispensar la última gota para evitar burbujas, si la OD 600 está por debajo de 0,3 - 0,6, incubar las células restantes durante 1 - 2 h más sobre la base de la lectura. El cultivo de 125 μL utilizado en este paso puede ser desechado o transferido de nuevo al bloque de pozo profundo original a discreción del usuario. - Centrifugar las células restantes en el bloque de pozos profundos durante 10 min a 3000 xg y 21 ° C. Eliminar supernatanT por inversión.
- Añadir 200 μl de Z-buffer y vórtice.
NOTA: Consulte la receta del buffer Z en la Tabla 1 . - Centrifugar durante 5 min a 3000 xg y 21 ° C. Retirar el sobrenadante invirtiendo.
- Añadir 20 μL de tampón Z y vórtice.
- Cubra la placa con una lámina de sellado que pueda resistir los ciclos de descongelación por congelación. Realice 4 ciclos de congelación / descongelación utilizando nitrógeno líquido en una campana de humos y luego 42 ºC en un baño de agua (2 min cada uno).
- Añadir 200! L Z-buffer / beta-mercaptoetanol (β-ME) / Ortho-nitrofenil-β-galactósido (ONPG) (12 ml, 21 ml, 8,4 mg, respectivamente, dará lugar a 20 ml de solución; siempre preparar fresco).
NOTA: La ONPG tardará algún tiempo en disolverse correctamente, así que prepare la solución una hora antes de llegar a este paso. La ONPG sirve como sustrato para la medición de la actividad de la β-galactosidasa. - Incubar hasta 17 - 24 h a 30 ° C (comprobar entre si, si el color se desarrolla antes prPaso al siguiente paso).
- Día 10 (mañana): Detener la reacción y medir.
- Añadir 110! L 1 M Na 2 CO 3 para detener el tiempo de reacción y registro.
- Vórtice y centrifugue durante 10 min a 3000 xg y 21 ° C.
- Tomar 125 μL de sobrenadante usando multicanal y medir OD 420 .
NOTA: Precaución, no dispensar la última gota para evitar burbujas. - Calcular la actividad β-gal: 1000 x OD 420 / (tiempo (min) x volumen (ml) x DO 600 en una hoja de cálculo.
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Representative Results
El procedimiento general de preparación de la placa para la co-transformación de regiones de ADN en las células de levadura con la proteína de interés ( Figura 2 ). La configuración de la placa puede modificarse de acuerdo con la necesidad del experimento y el número de regiones / fragmentos de ADN probados. Después del día 5 del protocolo, una placa bien crecida y positiva debe ser visible como en la Figura 3 . En nuestro estudio, la región promotora de 2600 pb aguas arriba desde el inicio del sitio de inicio de la transcripción se segmentó en seis regiones o fragmentos (FR 1-6) 6 . En la figura representativa ( Figura 3 ), las regiones de ADN 1 y 4 muestran una interacción positiva con el complejo de proteína A y B. Mediante la medición de la actividad de β-galactosidasa ( Tabla Suplementaria 1 ) sólo el fragmento 1 muestra cuatro veces la inducción de la actividad del gen informador mientras que el fragmento-4 no pasó nuestro inteUn umbral medio de ≥ dos veces.
Figura 1: Una visión general del ensayo híbrido de levadura-un híbrido modificado (Y1.5H). El diseño describe el procedimiento paso a paso del ensayo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Una representación simplificada de la disposición de la placa para la co-transformación de las células de levadura con la proteína (TF) de interés. En un montaje experimental general, la placa se puede disponer como se muestra en la figura. La combinación de construcciones y controles se puede modificar según la necesidad y es completamente a discreción del usuario.
Figura 3: Una imagen representativa de la placa positiva (SD-Trp-Leu) para la replicación 1 después de una co-transformación exitosa. Un resultado similar debe observarse con más repeticiones. El fragmento 1-6 representa la región de ADN; No Fragmento es un control negativo.
| TE buffer 10X (10 ml) | |
| Deseable | De la población |
| Tris - Cl 100 mM (pH 8,0 | 1 ml de Tris 1M |
| EDTA 10 mM (pH 8,0) | 200 mu l de EDTA 0,5 M |
| Completar el volumen con agua | |
| TE / LiAc (10 ml) | |
| De la población | |
| 1X | 1mL TE 10X |
| 0.1M LiAc | 1mL LiAc 1M |
| Completar el volumen con agua | |
| TE / LiAc / PEG (50 ml) | |
| Deseable | De la población |
| 1X | 5 mL TE 10X |
| 0.1M LiAc | 5 mL LiAc 1M |
| 40 ml de PEG3350 50% | |
| Z-buffer (1L) pH 7,0 | |
| Na _ { 2} HPO _ { 4} 16,1 g de heptahidratado o 8,52 g de anhidro | |
| NaH _ { 2} PO _ { 4} 5,5 g de hidratado o 4 g de anhidro | |
| KCl 0,75 g | |
| MgSO $ ₄ $ 0,246 g de hidratado o 0,12 g de anhidro | |
| Mantenga el pH con HCL | |
| Nota: | |
| Todas las almas son esterilizadas antes de su uso. | |
| Los medios y las placas de agar utilizadas en el protocolo (placas de agar YPDA, SD-Ura, SD-Trp-Ura y SD-Trp-Ura) siguen la misma receta que en Y1H | |
Tabla 1: La receta para las soluciones usadas en el protocolo. La tabla proporciona la receta para las soluciones madre y de trabajo de los principales tampones usados en el ensayo.
Tabla 1 suplementaria: medición de la actividad de la β-galactosidasa. La hoja de hoja de cálculo presentada aquí puede usarse como una plantilla para la medición de la actividad de β-galactosidasa usando la fórmula dada en el protocolo. El combinLa modificación de las construcciones puede modificarse según la discreción del usuario. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El procedimiento estándar de Y1H existente es adecuado para identificar una presa de proteína única que se une a su cebo de ADN. Con varias modificaciones técnicas, el sistema existente ha sido aprovechado para definir las redes reguladoras transcripcionales. Sin embargo, se sabe que los TF funcionan como una parte de complejos que implican dos o más TF o proteínas, con sólo algo de TF capaz de unirse al ADN. Las proteínas o TFs que poseen sólo los dominios de unión a proteínas y carecen de la capacidad para unirse al ADN son más propensos a trabajar en un complejo, preferiblemente con un TF que es capaz de unirse al ADN. Las pantallas de alto rendimiento que utilizan el Y1H tradicional ocasionalmente pierden esas interacciones biológicamente importantes. Por lo tanto, es imprescindible adaptar el ensayo Y1H para detectar interacciones heteroméricas proteína-ADN.
El método presentado aquí es una de tales adaptaciones con la capacidad de detectar interacciones proteína-ADN que implican más de una proteína o TF. El único fDel método descrito es la transformación de la levadura mediante co-transformación, que permite la integración de diferentes TF en un sistema de levadura y se aplica adicionalmente para ensayar la unión del complejo a las regiones de ADN diana. Un mérito significativo de este método es su capacidad para probar dos proteínas con su cebo de ADN. Este método no proporciona la información de sitios diana (promotor) específicos, sino que proporciona información para las regiones de ADN. Al mismo tiempo, el uso de este método sólo se recomienda después de la confirmación de la interacción proteína-proteína propuesta. Basándose en los hallazgos, se deben realizar experimentos adicionales tales como ensayo de cambio de movilidad electroforético (EMSA) o ensayo de inmunoprecipitación con cromatina (ChIP) u otros ensayos adecuados para el sistema de estudio para identificar los sitios diana, preferiblemente in vivo si es deseable. La aplicación de la medición basada en ONPG de la actividad β-galactosidasa proporciona una mejor confirmación que la X-gal aDigo Sin embargo, los requisitos experimentales generales y las propiedades de la (s) proteína (s) a ensayar deben tenerse en cuenta cuando sea necesario. La aplicación del método descrito para la pantalla a gran escala, utilizando más de dos socios de proteínas con dianas de ADN diferente necesita ser probado. El ensayo Y1.5H es un método rentable, que puede realizarse a pequeña escala en un laboratorio regular. Tal vez, este ensayo podría realizarse con el uso de otros sistemas vectoriales, pero el protocolo debe optimizarse si no se utiliza el sistema de clonación compatible con gateway.
El protocolo presentado para el Y1.5H es una estrategia ventajosa para validar complejo (s) de proteínas con su cebo de ADN para cualquier sistema de estudio; Plantas o mamíferos. Este método es muy útil para estudiar la genómica de plantas donde la validación in vivo podría ser desafiante dado el nivel de ploidía de la planta y el tiempo y los procedimientos de transformación de mano de obra intensiva. Así, el uso de este mEthod puede acelerar la prueba de hipótesis al menos en un sistema heterólogo.
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Disclosures
Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Damos las gracias a SS Wang, M. Amar y A. Galla por la lectura crítica del manuscrito. La investigación informada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio RO1GM067837 y RO1GM056006 (a SAK). El contenido es exclusivamente responsabilidad de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
References
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