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Developmental Biology

Le c. elegans Excretory Canal comme modèle pour la morphogenèse Lumen intracellulaire et In Vivo polarisé la biogenèse membranaire dans une seule cellule : étiquetage de GFP-fusions, Arni Interaction écran et imagerie

Published: October 3, 2017 doi: 10.3791/56101
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3, 1, 1
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children, Harvard Medical School, 2College of Life Sciences, Jilin University, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

Le canal excréteur de c. elegans est un modèle unique de cellules individuelles pour l’analyse visuelle in vivo de la biogenèse membranaire de novo polarisé. Ce protocole décrit une combinaison de génétique/Arni standard et approches, adaptables pour l’identification et la caractérisation des molécules diriger tubulogenèse unicellulaires et apicale biogenèse membranaire et lumen d’imagerie.

Abstract

Les quatre canaux excréteurs de c. elegans sont des tubes étroits étendus sur toute la longueur de l’animal d’une seule cellule, avec presque aussi beaucoup étendu endotubes intracellulaires qui génèrent et stabiliser la lumière avec une membrane et submembraneous cytosquelette des caractères apicale. La cellule excrétrice élargit sa longueur environ 2 000 fois pour générer ces canaux, rendant ce modèle unique pour l’évaluation in vivo de la biogenèse membranaire de novo polarisé, morphogenèse lumen intracellulaire et unicellulaires tubulogenèse. Le protocole présenté ici montre comment combiner la norme d’étiquetage, gain et perte de-fonction génétique ou l’interférence ARN (ARNi)-et des approches microscopiques d’utiliser ce modèle pour disséquer visuellement et fonctionnellement analyser ces processus au niveau moléculaire. Comme exemple d’une démarche d’étiquetage, le protocole décrit la production d’animaux transgéniques avec des protéines de fusion fluorescent pour analyse en direct tubulogenèse. Comme un exemple d’une approche génétique, il met en évidence les points clés d’un visuel d’Arni interaction écran visant à modifier un phénotype de gain de fonction canal cystique. Les méthodes spécifiques décrites sont Comment : étiqueter et visualiser les canaux en exprimant des protéines fluorescentes ; construire une bibliothèque de RNAi ciblée et élaborer des stratégies RNAi de dépistage pour l’analyse moléculaire de la morphogenèse du canal ; évaluer visuellement les modifications des phénotypes de canal ; marquer en disséquant la microscopie de fluorescence ; caractériser les composants subcellulaires canal à résolution plus élevée par microscopie confocale ; et de quantifier les paramètres visuels. L’approche est utile pour le chercheur qui s’intéresse en profitant du canal excréteur c. elegans pour identifier et caractériser des gènes impliqués dans les processus phylogénétiquement conservées de lumen intracellulaire et unicellulaires tube de morphogenèse.

Introduction

Tous les organes internes sont composés de tubes, cruciales pour leurs nombreuses fonctions différentes, tels que le transport et l’échange de gaz, les liquides et les nutriments et l’excrétion des déchets métaboliques. Leur caractère polarisé, avec les membranes apicales et lumière distinctes, est adaptée à ces fonctions spécifiques, et les défauts dans la biogenèse des systèmes endo - et la membrane plasmique sont une cause fréquente de maladie humaine1,2. La plupart des tubes du système vasculaire et des organes internes est pluricellulaire et forme une lumière entre les cellules ; Cependant, tubes unicellulaires qui forment la lumière dans les cellules, peuvent, par exemple, représenter autant que 30 à 50 % des humains lits capillaires2. Les membranes polarisées de multi - tubes et unicellulaires sont semblables dans la composition, bien que leur microdomaines peuvent différer basé sur la fonction spécifique du tube (p. ex., les canalicules de canal excréteur versus microvillosités intestinales dans Caenorhabditis elegans; Voir document d’accompagnement sur c. elegans tubulogenèse intestinale)3. Les principes de la biogenèse membranaire polarisée et tubulogenèse sont conservés chez les métazoaires, et un mécanisme moléculaire similaire leur ordonne1,2,4.

Le système excréteur de c. elegans est constitué de cinq cellules : la cellule excrétoire (EC), cellule canaliculaire (DC), pores cellulaires (PC) et deux cellules de la glande. Ablation des EC, DC ou PC provoque l’accumulation de liquide dans la cavité du corps et l’animaux meurent à un début de stade larvaire5. Curieusement, ces trois tubes unicellulaires créer leurs lumières de trois manières différentes : par cellule évidement (EC) ; habillage de cellule couplée avec la formation de jonctions autocellular (PC) ; et de l’enveloppe cellulaire couplé avec autofusion (DC) ; différents mécanismes de la morphogenèse de lumen qui sont toutes conservées phylogénétiquement6,7. La Communauté européenne, située sur le côté latéral gauche du bulbe pharyngé postérieur, envoie deux extensions latérales qui ramifient les quatre canaux d’étendre vers l’avant et vers l’arrière (sur le côté droit et gauche) jusqu'à l’extrémité du nez du ver et la queue , respectivement (Figure 1)5,6,8. La Communauté européenne s’étend d’environ 1 µm à 2 x 1 000 µm, ce qui en fait la plus grande cellule chez l’animal. Au niveau intracellulaire, le canal excréteur est un simple tube, généré à partir d’une membrane basale orientée vers le pseudocoelome et en tunnel par une membrane de lumière (endotube). La membrane de lumière canal relie à la membrane de lumière conduit à sa jonction intercellulaire seulement ; les canaux sont par ailleurs BostonMD le long de leur longueur (Figure 1). La membrane de lumière de canal excréteur et son cytosquelette submembraneous sont apicales, définies par leur composition moléculaire qui ressemble à la composition de la membrane apicale et submembraneous cytosquelette des tubes multicellulaires, tels que l’intestin, et d’autres épithéliums (p. ex., plat). Organites cytoplasmiques, y compris les endosomes vésiculaires et autres (p. ex., appareil de Golgi) endomembranes sont distribuées le long du canal. En outre, plusieurs vésicules canaliculaires - soit reliée à la membrane de lumière, et/ou reliées entre elles ou isolé - sont filetés sur le canal cytoplasme7,8,9,10 . Cette connexion plasma-membrane/canaliculaire dynamique plus développe le système membranaire du canal et contribue aux deux lumen morphogenèse et l’osmorégulation10. Le canal excréteur ainsi se compose presque entièrement de l’endo - et les membranes plasmiques, fournissant un excellent modèle pour l’analyse de la biogenèse membranaire polarisée et la régulation de l’endo-interface membrane plasmique. L’expansion spectaculaire de la membrane apicale au cours de la morphogenèse de canal - dans ce système monocellulaire qui coïncide avec l’extension lumen – permet également d’analyser les problèmes architecturaux qui découlent de la nécessité de stabiliser et de centrer une membrane intracellulaire de lumière . Ce protocole met l’accent sur l’analyse de la morphogénèse structurale du canal tube et de lumen et la dynamique de la membrane intracellulaire ce choix plutôt que sur les signaux qui dirigent les mouvements cellulaires générant la position de la Communauté européenne dans le système excréteur et construire ses liens complexes avec les autres éléments cellulaires (évaluées à6).

Un autre avantage du système c. elegans unicellulaires canal pour l’analyse de membrane polarisée et biogenèse lumen intracellulaire est sa capacité à séparer, à travers le temps du développement, la production des différentes composantes de ses membranes et jonctions. La ce est né au moment de la fermeture ventrale et s’installe en ventro-latéral du pharynx pendant milieu embryogenèse5,6,8, au cours de laquelle le branchement et prorogation du délai canal latéral se produisent. Il est suivi par extension antéro-postérieur canal durant l’embryogenèse fin, un processus qui se poursuit dans le stade larvaire L1 (Figure 1). Dans une larve nouvellement éclose, l’embout canalaire postérieur atteint approximativement au milieu du ver, entièrement s’étendant jusqu'à la queue à la fin de la phase L1, période après laquelle le canal s’allonge avec le ver8. Croissance de canal active à une vitesse dépassant celle de la croissance de l’animal ainsi se termine au premier stade larvaire, cependant, plus la croissance se produit parallèlement à la croissance de l’animal entier pendant les stades larvaires supplémentaires (L2-4). Ce paramètre fournit l’occasion d’analyser les différentes étapes de la biogenèse de membrane de novo polarisé, indépendamment de la division cellulaire polarisée ou migration. De plus, il permet la séparation de ce processus de l’assemblage des jonctions (qui se produisent chez l’embryon avant l’initiation de lumen) ; leurs besoins exacts en polarisation de la membrane est toujours une question ouverte dans le domaine de la polarité. Enfin, elle sépare uniquement apicale de l’expansion de la membrane basale, ce dernier procédé qui précède le premier dans les canaux excréteurs10. Le modèle de canal excréteur de c. elegans est donc un complément particulièrement instructif au modèle intestinal qui partage un certain nombre de ces avantages pour l’analyse de la biogenèse membranaire polarisée, mais l’exécute dans un contexte multicellulaire (voir le livre qui l’accompagne sur intestinale tubulogenèse3).

Bien que les canaux de type sauvage est ultra-minces tubules dans ce tout petit ver, leurs lumières peuvent être visualized directement par optique Nomarski chez cet animal transparent. En fait, les morphologies mutant canal cystique peuvent être caractérisés chez les animaux non étiquetés à l’aide de faible grossissement dissection microscopie, qui a été utilisé à bon escient en avancer les écrans génétiques pour identifier les gènes impliqués dans la tubulogenèse11. Meilleure visualisation de la morphologie des canaux et la distinction de leurs membranes polarisées, composants du cytosquelette, différents organites intracellulaires et autres structures subcellulaires, cependant, exige que l’étiquetage et de puissance plus élevée fluorescentes microscopie confocale et de dissection. Bien que la structure fine des canaux pose un certain nombre de difficultés pour l’étiquetage et la microscopie, membranes et composants subcellulaires peuvent être distinguées par les molécules spécifiques propres à chaque compartiment et animaux peut être montés en toute sécurité pour la microscopie si certaines précautions sont prises pour éviter d’introduire des artefacts (voir protocole et Discussion). L’étiquetage peut être fait par immunohistochimie dans échantillons fixés ou en générant les vers transgéniques exprimant des protéines de fusion fluorescent sous le contrôle de leurs propres ou des promoteurs spécifiques canal excréteurs pour l’imagerie in vivo . Ce protocole décrit la technique de marquage ce dernier (voir le document ci-joint tubulogenèse intestinale des anticorps coloration3).

La possibilité de combiner les études in vivo perte ou gain de-fonction avec in vivo imaging analyse à la seule cellule de niveau tout au long du développement rend le canal excréteur de c. elegans un modèle particulièrement fort pour le moléculaire et analyse cellulaire de tubulogenèse unicellulaires. Écrans génétiques avant ou arrière peuvent être effectuées en commençant par un animal transgénique sauvage ou étiqueté pour identifier les phénotypes de la morphogenèse de canal (par exemple, kystes) et ses défauts de gène sous-jacent. Sinon, ces écrans peuvent commencer avec un phénotype mutant (par exemple, un canal cystique) et identifier les suppresseurs ou exhausteurs de ce phénotype pour identifier les gènes qui interagissent sur le plan fonctionnel avec le gène qui cause le phénotype mutant. L’anomalie génétique provoquant le phénotype mutant peut induire une perte (par exemple, par délétion de gène) ou un gain (par exemple, via une mutation activatrice ou via l’introduction de copies du gène excès) de la fonction étudiée. Transmettre par mutagénèse ou RNAi systématique écrans sont sans a priori sur la fonction des gènes et permettent l’identification objective des gènes impliqués dans la fonction d’intérêt. Compte tenu de la disponibilité de l’ARNi pangénomique alimentation bibliothèques, presque chaque gène peut être facilement renversé par ARNi chez c. elegans, telle qu’un seul gène d’intérêt ou d’un groupe de gènes (par exemple, dans les écrans ciblés) peut également être rapidement sondé par son effet dans une approche de génétique inverse. Afin de démontrer une combinaison possible des approches, nous décrivons ici un écran d’interaction ciblé Arni, commençant par un mutant de gain de fonction kystique canal excréteur, marquées avec la protéine fluorescente verte cytoplasmique canal (GFP). Le phénotype mutant a été généré par la surexpression de MCE-1, un hautement conservée de c. elegans orthologues de la famille de l’éditeur de liens de membrane-actine Ezrin-radixine-moésine (MCE), qui a été impliquée dans la morphogenèse de lumen et membrane Organisation de nombreuses espèces12. C. elegans MCE-1 se localise aux membranes de lumière des organes internes, tels que le canal excréteur et l’intestin et est nécessaire pour la formation de lumière dans les deux13. ERM-1 surexpression recrute excès actine et vésicules de la membrane de lumière de canal, augmentant le flux dans la lumière et de générer un canal cystique court et une membrane de lumière sertie avec l’actine épaissie sous-poil9. Le protocole décrit comment générer des souches transgéniques avec canal excréteur-exprimés étiqueté protéines fusion (ou autres protéines) ; Comment réaliser des écrans de RNAi ciblées à partir de ces souches, d’identifier les modificateurs d’un phénotype de canal ; et comment analyser visuellement les résultats de ces écrans dissection et confocale en microscopie par fluorescence, y compris des moyens simples pour quantifier les phénotypes tubulogenèse instructif. Alternative étiquetage techniques ainsi que les détails de l’ARNi, ajusté aux gènes tubulogenèse souvent mortels, se trouvent dans le document qui l’accompagne sur intestinale tubulogenèse3. Toutes les méthodes peuvent être utilisées dans des combinaisons variées pour enquêter sur d’autres questions sur le canal tubulogenèse.

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Protocol

1. étiquetant le c. elegans Excretory Canal par des protéines de Fusion fluorescentes 14

Remarque : Voir le document ci-joint sur tubulogenèse intestinale 3 pour l’étiquetage par in situ les anticorps adaptable au canal excréteur de procédures de coloration. Voir le tableau 1 pour des exemples de molécules sont avérées utiles pour la visualisation de c. elegans canal excréteur endo - et les membranes plasmiques, tableau 2, pour obtenir des exemples de promoteurs conduite expression du canal excréteur, et Tableau 3 ressources pour les collections plus complètes des marqueurs et des promoteurs, y compris les références discuter le choix des différents fluorophores.

  1. Construction des plasmides de marqueurs fluorescents spécifiques de tissus par enzyme de restriction basée clonage 15
    Remarque : Voir la Discussion pour les autres techniques de construction protéines de fusion fluorescent.
    1. Identifier la séquence du promoteur (pour les fusions de transcriptionnelles) ou du gène entier d’intérêt avec son promoteur (pour les fusions de traduction) dans WormBase 44.
      Remarque : pour les promoteurs, environ 1 – 3 kilobases (kb) est suffisant pour la plupart des gènes de c. elegans. Protéines de fusion translationnelle peuvent également être construits en plaçant un gène d’intérêt sous un promoteur spécifique de canal excréteur (voir tableau 2).
    2. Conception et inverses des amorces pour l’amplification du promoteur (pour les fusions de transcriptional) et/ou un gène complet avec le promoteur (pour les fusions de traduction). Ajouter des lieurs d’enzyme de restriction au 5 ’ et 3 ’ extrémités des amorces.
      Remarque : Choisissez des enzymes de restriction qui sont présents dans le vecteur plasmidique (p. ex., pPD95.79) 16. Pour les fusions de traduction, les 3 ’ l’éditeur de liens doit être conçu de sorte qu’après digestion d’enzymes de restriction et ligature avec le vecteur, l’armature de codon insert sera continue avec les codons du fluorophore, par exemple, GFP. On peut avoir besoin d’ajouter 1 ou 2 bases plus à l’enzyme de restriction typique linkers 14 ; prendre soin de ne pas pour créer un codon stop.
    3. Perform polymérase réaction en chaîne (PCR) pour amplifier le promoteur ou le gène pleine longueur à l’aide de vers vivants ou l’ADN génomique de type sauvage ou cDNA comme modèle 15.
      Remarque : Lorsque vous utilisez vers en tant que modèle, tout d’abord se lysent worms en lysis buffer (tampon PCR plus protéinase K) 17. Vers stade mixte peuvent être utilisés en tant que modèle. Vers après le jeûne peuvent être utilisés pour éviter la contamination avec de l’ADN bactérien.
      4. Électrophorèse sur les produits PCR pour identifier la taille correcte du produit amplifié d’en
    4. Perform agarose (1 %).
      Remarque : Si la taille de la bande est correcte, passez à l’étape suivante. Si les bandes multiples sont générées, améliorer les conditions de l’amplification pour produire la bande unique. Si cela ne fonctionne pas, couper la bande de fréquences correcte du gel et purifier l’ADN par des méthodes standard 15 et puis passez à l’étape suivante.
    5. Sommaire de restriction d’effectuer sur le produit de la PCR et le plasmide vecteur qui contient le fluorophore (p. ex., pPD95.79) dans des tubes distincts par des méthodes standard 15.
    6. Séparer l’ADN digérés par électrophorèse sur gel et éluer le produit PCR et vecteur de bandes d’ADN dans des tubes distincts.
    7. Purifier l’ADN de tranches de gel par des méthodes standard 15. Mesurer la concentration d’ADN de spectrophotomètre.
    8. Ligaturer le produit PCR et vecteur d’ADN par les méthodes usuelles et transformer l’ADN recombinants en cellules capables de méthodes standard 15.
    9. Répandre 10 μL, 50 μL et 100 μL des cellules transformées sur trois plaques individuelles de bouillon Luria (LB) complétés avec de l’ampicilline 50 μg/mL.
      Remarque : Étaler des quantités différentes de cellules dans des assiettes différentes pour un spectre d’efficacité de transformation. Par exemple, placage trop dense ne peut pas permettre l’isolement des colonies si transformation efficace.
    10. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit. Le lendemain matin, sortez les plaques de l’incubateur.
      Remarque : Si les colonies sont très petites, incuber pendant plusieurs heures.
    11. Prepare plasmide DNAs des colonies individuelles par des méthodes standard 15. Mélanger l’ADN modèle et amorces et envoyons pour séquençage (généralement effectué dans un centre de service de base).
      12. Lire les séquences et vérifier l’intégrité de la construction de la fusion de
    12. .
      Remarque : critique : confirmer le cadre codon correct entre le gène inséré et gène marqueur fluorescent pour les fusions de traduction. Idéalement, séquence du gène entier pour confirmer qu’aucune mutation a été introduite au cours de procédures PCR et ligature.
    13. Générer plus l’ADN plasmidique (avec étape 1.1.11) pour injection pour l’étape 1.2.
  2. Production d’animaux transgéniques par microinjection de DNA pour la transformation de la lignée germinale 18
    Remarque : Voir la discussion sur les techniques alternatives pour l’introduction de transgènes. Les procédures décrites peuvent être utilisés pour générer des animaux transgéniques qui transportent une protéine de fusion de fluorescence ou toute autre protéine d’intérêt. Par exemple, une protéine exogène peut être nouvellement introduites (par exemple, un orthologues hétérologue) ou une protéine endogène peut être réintroduite (p. ex., son correspondant mutant de lignée germinale pour sauvetage) ou surexprimée pour générer un phénotype (p. ex., injection erm - 1 a été utilisé pour générer le phénotype du canal cystique surexpression qui sert de cible pour modification par l’ARNi interaction écran décrit ci-dessous).
    1. Mix construct ADN (1 – 50 ng/μL) avec marqueur l’ADN plasmidique (typiquement 100 ng/μL), par exemple le marqueur dominant rol-6 (su1006) (voir 1.2.3 pour options de marqueur).
      Remarque : critique : Concentration de l’ADN injecté doit être déterminée empiriquement afin d’éviter l’introduction des phénotypes artéfactuelles (kystes, défauts de l’extension, la létalité) quelle exprimant des gènes dans les canaux excréteurs qui sont particulièrement sensible à l’expression des transgènes. On peut, par exemple, faire plusieurs mélanges de plasmides à des concentrations de 1 ng/μL, 10 ng/μl, 50 ng/μL et 100 ng/μL, avec 100 ng/μL rol-6(su1006) pour tester une gamme de concentrations pour la génération d’une souche viable avec les expression voulue ou phénotype (concentrations élevées risquent d’être non spécifiquement toxiques pour la morphogenèse de canal et peut être mortelles).
    2. Filtrer le mélange de l’ADN sur un filtre à tube 0,22 μm (micromètre) pore taille spin-x centrifugeuse.
      Remarque : Ne laissez pas le couvercle du tube ouvert pour éviter la poussière qui peut bloquer les aiguilles de microinjection.
    3. Microinject plasmides recombinants dans la gonade de worms sauvage ou mutants par des méthodes normalisées pour la transformation de la lignée germinale (voir référence 18 pour plus de détails de procédure).
      Remarque : Les plasmides marqueur Standard sont, par exemple : rol-6(su1006), dpy-20, unc-119, pha-1. Transgènes dominantes comme rol-6(su1006) sont introduits dans les vers de type sauvage, alors que le sauvetage de transgènes sont introduits dans leurs mutants respectifs. Marqueur plasmides sont injectées conjointement pour un entretien facile des lignées transgéniques depuis extrachromosomiques transgènes sont perdus au hasard pendant la division cellulaire (voir 1.2.8). Lors de l’injection de gènes codant pour les fusions de fluorophore, on peut aussi utiliser le fluorophore, GFP, lui-même en tant que marqueur. ROL-6 induit vers rouler autour d’eux qui est souvent avantageux pour l’évaluation des phénotypes de morphogenèse.
    4. Transfert injecté vers sur Escherichia coli graines plaques de nématode à croissance moyenne (NGM) (p. ex., vers 5/plaque) (voir référence 19 pour standard c. elegans la culture et l’entretien et Table des matières).
    5. Incuber les boîtes et laisser les descendants à se développer à 20 ° C, pendant environ 3 d.
    6. Examiner la progéniture F1 sous le microscope à dissection pour Rol (roulement) vers (ou tout autre injection spécifique marqueur, par exemple, GFP) et choisir des rouleaux tles différentes plaques o.
    7. Sélectionner les plaques avec des animaux de F2 et confirmer la présence de fluorescence sous un microscope à fluorescence dissection (généralement tous les animaux de rouleau sont GFP positif).
      Remarque : F2 rouleaux indique la génération réussie d’une lignée transgénique. Les lignes individuelles peuvent être différentes, par exemple, en ce qui concerne les taux de transmission de transgene. Il est donc utile conserver et stocker plusieurs lignes.
    8. Maintenir les lignées transgéniques en l’enrichissant de nouvelles plaques pour animaux séropositifs au marqueur.
      Remarque : L’ADN injecté est intégré dans la lignée germinale sous forme de tableau extrachromosomique. Taux de transmission pour les tableaux extrachromosomiques sont variables mais généralement autour de ~ 50 %. Pour ne pas perdre la souche, il est donc essentiel d’enrichir manuellement des lignes avec des marqueurs dominants (p. ex., lignes non garantis par une sélection négative).
    9. Geler des lignées transgéniques par des techniques de congélation standard pour le stockage à long terme à-80 ° C 19.
      Remarque : Transgènes sur baies extrachromosomiques peut également être intégré dans la lignée germinale par irradiation UV dans une étape supplémentaire pour produire des lignes homogènes 18. Par exemple, MCE-1 a été intégrée dans la lignée germinale par irradiation UV pour obtenir la souche MCE-1 [++] fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006)] où chaque animal porte le transgène, une exigence pour son utilisation dans l’ARNi écran d’interaction décrite ci-dessous. Cette souche a été en outre marquée par canal excréteur cytoplasmique GFP par passage dans une souche contenant un vha - 1P :: GFP transgène (générés par les mêmes procédures décrites ci-dessus ; voir référence 20 pour basic génétique procédures telles que la Croix) et est dénommé MCE-1 [++] ; VHA - 1P :: souche GFP ci-dessous.

2. Construction d’une bibliothèque de RNAi ciblés et conception d’un écran d’Interaction Arni pour modifier un phénotype de Canal

Remarque : un écran de l’interaction génétique ciblée reposant sur l’ARNi est décrite qui utilise un phénotype de canal cystique de la surexpression de recherche de gènes de la morphogenèse de canal excréteur interactifs. La souche MCE-1 [++] (Voir l’étape 1.2.9) sert d’exemple 9. Cette approche ne présente qu’une des nombreuses approches possibles pour l’analyse génétique de la morphogénèse de lumen de canal excréteur (voir Présentation et Discussion des autres approches génétiques). Voir le document ci-joint tubulogenèse intestinale 3 et références 17 , 21 , 22 pour le fond sur l’ARNi, détails de l’ARNi procédures, modulation de la force de RNAi (ajustée pour les gènes tubulogenèse souvent mortels) et discussion des problèmes techniques reliés à Arni. Voir référence 19 pour la culture de ver standard, maintenance et Table des matières.

  1. Molécules interagissants recherchez MCE-1 (ou un autre gène d’intérêt) dans les bases de données et articles parus.
    Remarque : Potentiel MCE-1 Interactiens comprendrait toutes les molécules qui ont été expérimentalement démontrés que fonctionnellement, génétiquement ou physiquement interagir avec des protéines de MCE dans n’importe quelle espèce et/ou ont été prédites par n’importe quel in silico, haut débit ou biologie des systèmes approche (voir tableau 3 pour des exemples de bases de données et ressources).
  2. Génère une liste de tous les gènes et trouver des homologues chez c. elegans lorsqu’elle est exigée.
    Remarque : Pensez à allonger la liste des gènes identifiés aux classes de gènes, qui prend en compte la fonction du gène d’intérêt et d’élargir le filet pour identifier les Interactiens (p. ex., pour l’éditeur de liens de membrane-actine MCE-1, sélectionnez tous les actines et molécules d’actine liées).
  3. Identifier l’ARNi correspondant alimentation clones dans disponibles dans le commerce tout le génome bactérien Arni bibliothèques pour tous les gènes bactérien (p. ex., Ahringer génomique c. elegans Arni alimentation bibliothèque 21 ; Table des matières)
  4. Génère une feuille de calcul pour tous les gènes et leur plaque de RNAi correspondante et le nombre bien.
  5. Pick et ensemencer ~ 50 clones d’Arni sur plaques/LB/ampicilline (choix de l’antibiotique est déterminée par la construction de la bibliothèque) par jour et continuer jusqu'à ciblées Arni bibliothèque est générée.
    Remarque : Selon la taille de la bibliothèque et projection de flux de travail, omettez générant une bibliothèque complète et procéder directement à l’analyse de lots. Plaques peuvent être conservés à 4 ° C, pendant pas plus de 2 semaines environ (le cas échéant, réensemencer sur les nouvelles plaques après cela). À l’inverse, un peut générer des grandes bibliothèques congelés dans des formats de 96 puits ou 384 puits répétées pour entreposage à long terme à -80 ° C.
  6. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit. Le lendemain matin, enlever les plaques de l’incubateur et magasin à 4 ° C.
  7. Pick Arni bactéries d’une plaque par un cure-dent stérile, mélanger des bactéries avec 600 μL bouillon (50 ng/μL) LB/ampicilline dans des microtubes de 1,5 mL, incuber les tubes à 37 ° C, agiter pendant 6 h.
    Remarque : Ensemencer Arni bactéries dans le bouillon en frottant le pick (pointe d’un cure-dent ou une micropipette) le long du côté du microtube.
  8. Semences 70 μL de culture de bactéries dans chaque puits de 6 plats Arni dans les jeux en doubles ou en triple. Incuber les plaques d’Arni à 22 ° C jusqu’au lendemain.
    Remarque : Arni plaques sont générés par des procédures standard (Table des matières et références 3 , 17 , 21) et utilisés ici dans un tissu de 6 puits format de plaque de culture pour une approche de débit plus élevée permettant encore d’évaluation microscopique de la morphogénèse de canal dans les animaux vivants sur les plaques.
  9. Prochain matin, pick 3 L4 stade MCE-1 [++] ; VHA - 1P :: GFP worms sur chaque puits des plaques Arni.
    1. Pour éviter la contamination avec des bactéries OP50 (voir référence 19) qui interfèrent avec l’ARNi tout d’abord les vers sur une plaque de NGM sans bactéries de graines et de laisser les animaux ramper pendant environ 10 min. N’utilisez que des animaux sains non pauvre.
  10. Incuber les boîtes à 22 ° C pendant 3 jours permettre aux animaux produire la progéniture.
  11. Examiner les phénotypes de canal dans la progéniture F1 sous le microscope de fluorescence dissection.

3. In Vivo Imagerie du c. elegans Excretory Canal par microscopie de Fluorescence de dissection et notation des phénotypes tubulogenèse

  1. préparer une feuille de notation de phénotype (exemple illustré au tableau 4 et Figure 5 ).
  2. Placer la gélose avec worms directement sous le dissectin de fluorescencemicroscope de g, ouvrez le couvercle de la plaque pour l’évaluation, utiliser un grossissement inférieur à se concentrer.
    Remarque : Ce protocole décrit l’utilisation d’une portée de 1. 5 X et 10 X objectifs et une plage de zoom de 3.5 à 45 (Table des matières).
  3. Évaluer les animaux en se concentrant sur chaque bien séparément, en commençant par 1 bien et travailler vers le bas de la plaque.
    Remarque : Commencez toujours par l’évaluation des contrôles. Par exemple, une maquette (vecteur vide) contrôle (ARNi HT115 bactéries (voir références 17 , 21) sans ou avec une insertion de gènes indépendants) négatif et échéant positive de contrôles, par exemple, dans Cet écran d’interaction, MCE-1 Arni (supprime le phénotype MCE-1 [++]) et sma-1 / spectrine Arni (améliore le phénotype de canal MCE-1 [++]).
  4. Examiner tout d’abord, les phénotypes généraux visibles sous une lumière vive (par exemple : Let/létale, Clr/clear, Emb/embryonnaire létal, Ste ou stérile, Unc/non coordonnée, Dpy/boulotte, etc.), quantifier le phénotype en comptant le nombre total d’animaux et de nombre des animaux avec le phénotype, enregistrer les numéros (voir tableau 4).
    Remarque : Pour passes rabattues de gènes causant des défauts qui peuvent influer sur l’évaluation des phénotypes de canal (p. ex., Emb, Ste), envisagez de répétition de l’expérience avec le conditionnel, post embryonnaire Arni (voir complémentaires papier pour procédures 3 ).
  5. Deuxièmement, examiner des phénotypes de canal excréteur sous lumière fluorescente, marquer des phénotypes quantifiables (par exemple, longueur du canal, largeur de la lumière, kystes), enregistrer les numéros et décrire les phénotypes sur une feuille de notation (voir le tableau 4, < classe forte = « xfig » > Figure 5).
    Remarque : Un grossissement supérieur avec plage de zoom est tenu d’évaluer plusieurs phénotypes canal subtil. Mouvement de va-et-vient entre haut et bas de grossissement d’évaluer soigneusement le canal ’ s longueur et la largeur et toute autre phénotype de la morphogenèse de canal. Pour la quantification ou semi-quantification des phénotypes simples, compter 100 animaux (p. ex., L4s dans cet écran de RNAi ciblé ; phénotypes : canal de longueur de 1/4, 1/2, 3/4 et full extension des canaux postérieure et diamètre du lumen de canaux postérieure, petit kystes (< 1/3 de la largeur de l’animal), gros kystes (> 1/3 de la largeur de l’animal) ; Voir le tableau 4).
  6. Images d’acquérir des phénotypes prédominants au moins 3 animaux différents par un microscope monté caméra numérique dispositif à couplage de charge (CCD) et le logiciel d’imagerie correspondant (voir Table des matières)
    1. d’acquisition d’images, tout d’abord allumer la caméra tourner sur ordinateur relié, double-cliquez sur l’icône de logiciel de capture image, concentrer une zone de la plaque de ver manuellement sous faible grossissement et ouvrir l’obturateur de la caméra.
    2. Cliquez sur le “ aperçu en direct ” icône de logiciel de capture d’image sur l’écran de l’ordinateur pour visualiser les vers sur l’écran d’ordinateur, régler la netteté manuellement pour bien visualiser les vers sur l’écran, puis cliquez sur le “ snap ” icône, puis Cliquez sur le “ Economie ” icône.
      Remarque : Animaux se déplacera plus rapidement sous lumière fluorescente, donc garder une main sur souris d’ordinateur prêt tout en déplaçant la plaque dans la zone d’intérêt avec l’autre main. Puis rapidement, cliquez sur le “ snap ” icône d’acquérir l’image. Il est généralement possible d’acquérir une bonne image avec plusieurs essaies.
    3. Enregistrer les images acquises avec un nom de fichier appropriée (inclure la souche Arni clone nom et date).
      Remarque : Plus rapide mouvement vers sauvage avec canaux de fines et longues sont plus difficiles à l’image que les mutants. Mutants dont les canaux cystiques et/ou autres phénotypes vont probables se déplacer lentement, facilitant ainsi l’imagerie. Plasmides de marqueurs tels que Rol peuvent être utiles pour l’imagerie en gardant des animaux “ sur place ” plutôt que de déplacer vers l’avant et peut aussi fournir une vue améliorée sur le phénotype l’animal rouler autour de soi.

4. Imagerie du c. elegans Excretory Canal à haute résolution par microscopie confocale à balayage Laser

  1. montage animaux vivants
    1. placer une petite quantité de graisse ou de la vaseline à l’extrémité d’un coton-tige ou à la pointe de la doigt de l’index et étendre la graisse pour générer un cercle ultramince avec un diamètre de ~ 6 – 8 mm au milieu d’une lame de verre propre.
    2. Place 6 μl solution 5 % lidocaïne (anesthésique) dans le cercle par une micropipette.
      Remarque : On peut faire une solution mère de lidocaïne, en dissolvant la poudre de lidocaïne dans l’eau. Diluer à 5 % avec M9 tampon 19 (Table des matières). Il est essentiel pour l’analyse du canal excréteur pour éviter l’immobilisation des solutions communes (comme l’azoture de sodium) qui provoque des kystes à la rupture et qui induisent des phénotypes canal.
    3. Choisir plusieurs animaux à partir d’une plaque de RNAi et placez-les dans la solution de lidocaïne par tourbillonnement le ver pick 19 dans la solution.
      Remarque : Choisir préférence animaux spécifiques au stade qui faciliteront le montage même par une épaisseur uniforme. Animaux vous présélectionnez le microscope de fluorescence dissection.
    4. Placer une lamelle de 22 x 22 mm sur la lame de verre, laissez-le déposent doucement sur le cercle de la graisse.
      Remarque : Ne pas appliquer une pression physique sur la lamelle couvre-objet qui pourrait endommager le canal morphologie, surtout chez les mutants ou RNAi traité vers avec canal et éventuellement d’autres phénotypes. Il est donc important d’éviter un cercle de la graisse épaisse ; Idéalement les animaux est doucement en sandwich entre lame et lamelle.
    5. Écrivez le nom de l’échantillon du côté de la lame de verre dépoli. Prendre immédiatement la lame de microscope confocal pour l’analyse du phénotype de canal et d’acquérir des images.
      Remarque : Retards peuvent endommager des kystes du canal ou changement dans la morphologie lumen canal.
  2. Images confocales absorbante
    1. Placer la lame sur la scène de l’échantillon du microscope confocal, concentrer les vers à faible grossissement (10 X).
    2. Vue et sélectionnez animaux sous 60 X ou 100 X objectifs, examiner le canal excréteur ’ cellulaire s et phénotypes subcellulaires, par exemple, forme de lumen et diamètre, taille et forme des kystes ; ou les composants subcellulaires étiquetés pour analyse, par exemple, la membrane basale, cytoplasme, endosomale versus vésicules canaliculaires, membrane apicale/lumière, autres organites (voir Discussion Figure 2 et Figure 4).
    3. D’acquérir des images du phénotype spécifique d’intérêt.
      Remarque : Ce protocole décrit l’utilisation d’un laser scanning microscope confocal (Table des matières). Pour résoudre les composants subcellulaires le c. elegans de minces canaux excréteurs, objectifs de grossissement plus élevés (60 X à 100 X) est nécessaires. Un microscope confocal de filature-disque peut être utilisé pour acquérir des images mais offre moins confocalité (voir Discussion).
      1. Pour acquérir les images confocales, allumez l’ordinateur, cliquez deux fois sur le logiciel de microscope confocal et sélectionnez le laser en cliquant sur une icône spécifique laser.
      2. Cliquez le “ scan ” icône pour visualiser le ver ciblé sur l’écran d’ordinateur, régler l’intensité des laser à travers le logiciels et cliquez à nouveau sur “ scan ” icône pour arrêter le scan, puis cliquez sur “ capture ” icône pour capturer une image, puis cliquez sur “ enregistrer ” icône.
      3. Enregistrer des images avec le nom de fichier appropriée et comprennent des Arni clone souche nom et date de.
        Remarque : Les Images peuvent être acquises comme unique et plusieurs sections (par exemple, 10 – 15 sections le long de l’axe z). La section permet la visualisation 3D. Acquisition d’images de projection et enregistrer séparément si nécessaire (en fonction de microscope). Pour une résolution optimale, utilisez les paramètres laser avec un faible gain, ne pas trop ouvrir le trou d’épingle et ajouter plusieurs titrant image (voir références 23 , 24 pour discussion générale d’imagerie confocale). Prendre soin d’acquérir des images à une luminosité niveau de saturation afin de permettre la modification par logiciel d’imagerie si nécessaire (préférence utiliser tels quels des images).
      4. Acquisition d’images de double - ou multiplier les canaux marqués (par exemple vert, rouge et bleu) de la même façon, en cliquant sur les icônes multiples de laser, mais utiliser scanner séquentiellement pour éviter cordeau entre canaux (critique d’études co-localisation).
        Remarque : On peut avoir besoin de prendre en considération le temps nécessaire pour scanner séquentiellement (ce qui entraîne un correspondant augmente également photo de blanchiment) et modifier les paramètres du scanner. Ne pas analyser les animaux d’une diapositive pendant plus de 30 min de maximale afin d’éviter les effets non spécifiques sur la morphologie du canal. Monter la nouvelle diapositive si numérisation plus long est nécessaire.
      5. Acquérir optique d’interférence différentielle correspondant (DIC) / images de Nomarski, particulièrement si la quantification canal diamètre longueur et lumen en ce qui concerne le ver ’ s longueur et diamètre. Superposition de fluorescence et Nomarski images en cliquant sur “ superposition ” icône de démontrer les points de repère ( Figure 1 et Figure 4 a – D).
    4. Pour la quantification, mesurer l’intensité de la fluorescence d’un composant étiqueté d’intérêt par ImageJ logiciel 25 ( Figure 5).

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Representative Results

Ce protocole décrit comment utiliser les canaux excréteurs de c. elegans visuellement et moléculairement analyser tubulogenèse unicellulaires et morphogenèse lumen intracellulaire dans une seule cellule. Pendant leur extension depuis le moment de Mid-l’embryogenèse à l’âge adulte, les quatre canaux excréteurs continuent d’accroître leur basolatérale et membranes apicales/lumière avec leur système endomembranaire canaliculaire et endosomes, offrant un modèle unique pour l’analyse in vivo de novo polarisé biogenèse membranaire (Figure 1). Composants subcellulaires tels que les membranes apicales, le cytoplasme et endosomale versus canaliculaires vésicules peuvent être visualisées par exprimant des protéines de fusion fluorescent spécifique (décrits dans le protocole 1 de l’article), et ils peuvent être distingués les uns des autres par double ou triple étiquetage chez un seul animal transgénique (Figure 2). Un phénotype unique canal excréteur (Figure 3 a– B) généré par surexprimant une molécule de la membrane apicale associée (MCE-1), est utilisé pour démontrer comment effectuer un écran Arni ciblé afin d’identifier les gènes de fonctionnement dans la membrane apicale et biogenèse Lumen ; Ceci est un exemple d’une analyse moléculaire et visuel de la biogenèse membranaire polarisée dans ce modèle (décrite dans le protocole 2 de l’article). Ce phénotype de canal MCE-1 [++] sert à démontrer comment évaluer visuellement et suppression de partition (Figure 3-D) et mise en valeur (Figure 3E– F) en disséquant la microscopie de fluorescence (décrite dans le protocole 3 de l’article) . Phénotypes de canal induits par une modulation des niveaux de MCE-1 servent à montrer comment résoudre des défauts au niveau subcellulaire par microscopie confocale (Figure 4) (décrits dans le protocole 4 de l’article) et quantifier les phénotypes de canal simple (longueur du canal et kyste taille) et de la membrane apicale biogenèse des défauts (Figure 5).

Figure 1
Figure 1 : Morphogenèse des elegans de Caenorhabditis Excretory Canal et des Structures subcellulaires de Canal
(A) représentation schématique d’extension de canal excréteur (lignes bleues) au cours du développement de l’embryon et de la larve. La cellule excrétrice atteigne son emplacement définitif dans la partie ventro-latérale gauche du bulbe pharyngé postérieur au stade de l’embryon (non illustré) par des virgules. Que l’embryon s’allonge, il s’étend tout d’abord de deux bras latéralement vers la gauche et à droite ; Ensuite, chaque bras bifurque dans une branche antérieure et postérieure. Ces branches antérieures et postérieures s’étendent plus loin tout au long de l’élongation de l’animal au cours de quatre stades larvaires, tout d’abord rattraper la croissance de l’animal au stade L2, puis accompagner sa croissance, jusqu'à l’âge adulte. De novo polarisé membrane biogenèse prend en charge cette extension jusqu'à l’âge adulte. (B) chez l’animal adulte, les branches du canal antérieur atteint le bout du nez et les branches postérieures, la queue (lignes bleues). Le corps de cellules excrétrice s’affiche près de l’ampoule pharyngée postérieure (bleu). Domaines membranaires polarisées sont maintenues pendant l’âge adulte. (C) agrandie vues d’une partie de bras de canal. A gauche : vue 3D de la montre de canal : membrane basale (noire), cytoplasme (bleu), membrane lumenal (vert) et la lumière (blanc). A droite : vue du canal et de ses membranes interne : la membrane basale (noire), cytoplasme (bleu), endosomes (ovales jaunes), vésicules canaliculaires (sphères blanches, vésicules unique reliés à chaque autre, relié à la lumière ou isolé), membrane apicale (verte) et la lumière (blanc). (D) Confocal/DIC superposition micrographies de la cellule excréteur de l’embryon et les canaux excréteurs chez une larve, étiquetés par lumière versus cytoplasmique GFP, respectivement. Image de gauche : cellules excrétrices (flèche verte,) dans un embryon de 1,5 fois, avec lumen canal visualisée en exprimant apicale ERM-1::GFP par un promoteur de l’erm-1 . Image de droite : quatre excréteur canal branches (flèche verte,) chez les larves L3, visualisées par cytoplasmique vha - 1P:: GFP. Barreaux de l’échelle = 20 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Visualisation des composants subcellulaires dans les bras de Canal excréteur sauvage par un Double marquage avec des protéines de Fusion Fluorescent
(A) distinguer le cytoplasme de la membrane apicale. Expression de la GFP sous le promoteur sulp-5 visualise le cytoplasme de canal (vert, en haut) ; expression d’ERM-1::mCherry en vertu de son propre promoteur visualise la membrane apicale (rouge, milieu) ; la fusion de ces images (en bas) fait la distinction entre le cytoplasme et la membrane apicale qui serait autrement impossibles à distinguer par un marquage unique même à fort grossissement. Echelle = 5μm. (B) déterminer l’agencement des endosomes vésicules vers la lumière. Visualisation de la lumière par une protéine fusion apicale associées aux membranes GFP (pseudo coloré au rouge, en haut de la page) ; visualisation des vésicules endosomale en exprimant mCherry::RAB-7 (pseudo coloré en bleu, milieu) ; la fusion de ces images (en bas) montre la position spatiale relative des endosomes vésicules vers la lumière. Echelle = 5μm. (C et D) Régler les formes de tube de canal par rapport aux composants subcellulaires canal à différents grossissements. Le cytoplasme des larves L1 est étiqueté en exprimant GFP sous le promoteur sulp-5 et des vésicules cytoplasmiques canaliculaires en exprimant le chenal AQP-8::mCherry par un promoteur de l’aqp-8 . (C) les Images acquises à un grossissement inférieur résolvent un motif « perles-on-a-string » correspondant à des stades spécifiques varicosités (varicosités sont abondants dans les vésicules canaliculaires et autres composants nécessaires à sa croissance canal réservoirs), mais fait résout pas cytoplasmique AQP-8 punctums. (D) les Images acquises à un grossissement supérieur résolvent punctums AQP-8 dans le cytoplasme de canal, correspondant à des vésicules canaliculaires. Barreaux de l’échelle : 20 μm dans C et 5 μm de D. Tous les panneaux montrent les projections confocale de 10 – 15 sections chacun. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Notation Embellisseurs et suppresseurs d’un phénotype de Canal cystique (ERM-1[++]) en disséquant la microscopie
(A) MCE-1 [++] ; ROL-6(su1006) canaux excréteurs est visualisées en exprimant GFP dans un promoteur de vha-1 . Postérieur canaux s’étendent jusqu'à la vulve ou mi-corps de l’animal (flèches ; considéré comme extension 1/2) au plus faible grossissement (1,5 X objectif et zoom faible). (B) à fort grossissement, le canal serti petit kystique MCE-1 [++] de signature peut être résolu, avec l’extrémité des canaux postérieures (un bras de petite flèche) qui s’étend vers le haut de la vulve ou légèrement au-delà (canal vulve indiqué par la grande flèche ; Lumen en panneau D peut être considéré comme type sauvage pour la comparaison). (C) Suppression, faible grossissement : allongées et minces canaux Arni MCE-1 [++] animaux de traités. (D) à un grossissement supérieur, postérieur canaux peut être vu d’étendre presque entièrement à la queue (petites flèches comparer à celle des animaux parents, indiqués dans le tableau B) ; grande flèche indique la position de la vulve. (E) amélioration : outre raccourcie canaux avec plus gros kystes dans RNAi traités animaux MCE-1 [++] ; faible grossissement, pas de zoom. (F) à fort grossissement, extension du canal postérieur peut être déterminée comme étant inférieure à 1/2 (petite flèche) ou pas étendue jusqu'à la vulve (indiqué par la grande flèche) et la taille de kyste comme excédant 1/3 de la largeur de l’animal (plus large que celle de l’animal parent montré dans B). Barreaux de l’échelle = 400 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Analyse visuelle de la morphologie du Canal excréteur et composants subcellulaires Canal chez les animaux Mutant/Arni par microscopie confocale
(A à D) Distinguer un vacuolaire d’un phénotype du canal cystique (superposition de confocal/DIC micrographies sont affichées). (A) le cytoplasme d’un canal de type sauvage est visualisé en exprimant GFP sous le promoteur sulp-5 (Pseudo-coloré au bleu dans la distinction de la membrane apicale, étiquetage, illustré en vert dans le groupe B). (B) la membrane apicale d’un canal de type sauvage est visualisée en exprimant ERM-1::GFP ; Notez que lumen n’est pas visible à ce grossissement, et que seul l’étiquetage ne peut pas distinguer cytoplasmique de la membrane d’étiquetage. (C) phénotype canal excréteur induite par ARNi : marquage cytoplasmique ne peut pas distinguer vacuoles cytoplasmiques des kystes intralumenal. (D) phénotype canal excréteur induite par ARNi : ERM-1::GFP Apical étiquetage détecte l’accumulation de liquide à l’intérieur de la lumière, identification des kystes (lumière) plutôt que des vacuoles (cytoplasmiques) (cf. Figure 4I pour les vacuoles cytoplasmiques). Echelle = 40 μm de A à D, montré a. (E-J) analyse des effets de perte et de gain de-fonction sur composants subcellulaires canal (images confocales de bras de canal unique sont affichées). (E-G) Effet de MCE-1 Arni sur la localisation subcellulaire des canalicules. Cytoplasme de canal de type sauvage (E) ; Remarque indiquant lumen GFP exclusion. (F) sauvage cytoplasmique AQP-8::GFP punctums, correspondant aux vésicules canaliculaires. (G) cytoplasmiques et déplacement basale de AQP-8::GFP examen erm-1(RNAi) des animaux. Lumen discontinu (H) et le détail de la pathologie de pointe de lumen (curling et perte de lumen de centrage) en erm-1(mildRNAi) animal (voir3 pour moduler la force de l’ARNi) ; Notez que cytoplasme canal s’étend au-delà de l’extrémité de la lumière, témoigne ici de petits kystes. (I) les vacuoles cytoplasmiques dans corps de canal excréteur sans n’importe quelle extension de canal dans fortement affectée erm-1(RNAi) animaux3; Notez que loi-5::GFP n’est pas recruté à la lumière (sauf plusieurs petites taches autour des vacuoles). (J) recrutement des excès ACT-5::GFP et AQP-8::mCherry à la lumière en triple animal transgénique surexprimant MCE-1 (note épaisse ceinture de ACT-5::GFP et des touffes de AQP-8::mCherry qui se chevauchent autour de la lumière, kystique). Echelle = 5 μm pour E-J, montré dans E. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Exemples de Quantification des défauts de Canal par microscopie confocale et de dissection
(A) représentation schématique du type sauvage (du haut) et mutant kystique (panneaux inférieurs) des canaux excréteurs de quantification de longueur et kyste de la taille du canal. Longueur du canal postérieur est quantifiée en 0, 1/4, 1/2, 3/4 et 1. Longueur du canal "0" n’indique aucune extension et '1' extension pleine longueur. Taille de kyste est quantifiée en < 1/3 (petit) et > 1/3 (grand) du diamètre du corps. (B) la Quantification de la morphologie du canal brut chez les animaux témoins et ERM-1 [++](ARNi) par fluorescence, microscopie de dissection. Chez les animaux de simulacre(ARNi) MCE-1 [++], la longueur du canal postérieur est environ 1/2 prolongé chez les animaux de 95 % (image de référence, Figure 3 a– B). Chez les animaux de suppresseur de MCE-1 [++](ARNi) , longueur du canal postérieur est presque entièrement déployée dans 80 à 90 % d’animaux (image de référence, Figure 3-D). Chez les animaux de renforceur de MCE-1 [++](ARNi) , environ 60-70 % de canaux ont de gros kystes et longueur plus courte (< 1/2) (image de référence, Figure 3E– F). Les données présentées comme moyenne ± écart-type (n > 3). (C) la Quantification de l’intensité de la fluorescence du cytosquelette par ImageJ canal apical/lumière d’images confocales. Membrane apicale du canal est étiquetée par ACT-5::GFP, bras de canal de type sauvage s’est avéré le bras de canal gauche, MCE-1 [++], vers la droite. Panneaux à gauche : intensité de la loi-5::GFP dans la manche de membrane de type sauvage est d’environ 50 (gris valeur/membrane, indiqué par la flèche rouge et noire), tracé indiqué sous l’image. Panneaux à droite : intensité de ACT-5::GFP EUH-1 [++] est supérieur à 100 (valeur de gris de membrane dorsale est d’environ 110 (flèche noire), et de membrane ventrale est environ 140 (flèche rouge)), tracé indiqué sous l’image. Barreaux de l’échelle = 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : exemples de marqueurs pour la C. elegans , Système de Membrane de Canal excréteur
Nom de la protéine Void
localisation cellulaire Fonction Exemples de souches disponibles Références ERM-1 domaine apical éditeur de liens de membrane – cytosquelette VJ402 (fgEx13 [erm-1p::erm-1::gfp, rol-6p::rol-6(su1006)]) Réf (13) LOI-5 domaine apical actine apicalement localisée VJ268 (fgEx12[(act-5p::act-5::gfp) ; unc-119 (+) ; unc-119 (ed3) III]) Réf (13) ABTS-2 Basolatérale Transporteur d’anion/bicarbonate ABTS-2::GFP Réf (42) SULP-8 Basolatérale Sulfatepermease SULP-8::GFP Réf (42) VHA-1 vésicules canaliculaires V-ATPase VJ535 (fgEx35 (vha-1p::vha-1::gfp ; rol - 6P :: rol-6(su1006))) Réf. (9) VHA-5 vésicules canaliculaires V-ATPase ML846 (vha-5(mc38) IV ; mcEx337 [vha-5 (+) :: GFP + rol-6(su1006)]) Réf (10) AQP-8 vésicules canaliculaires Aquaporin, voie d’eau VJ533 (fgEx33 (aqp-8p::aqp-8::gfp)) Réf. (9) RAB-5 vésicules endosomale le trafic BK209 (qpIs99 (exc9p::mCherry::rab-5)) Réf (36) RAB-7 vésicules endosomale le trafic BK210 (qpIs100 [Pexc-9::mCherry::rab-7]) Réf (36) RAB-11 vésicules endosomale le trafic BK205 (qpIs97 (exc9p::mCherry::rab-11)) Réf (36) 1 Des exemples sont tirés de ressources répertoriées dans le tableau 3.

Tableau 2 : exemples de C. elegans Canal Excretory propres promoteurs
promoteurs Stade de l’expression
ERM-1 embryon stade virgule
sulp-5 embryon 3 voies
VHA-1 embryon 2 fois
VHA-5 embryon 2 fois
AQP-8 embryon 2 fois
GLT-3 embryon fin
1 Des exemples sont tirés de ressources répertoriées dans le tableau 3.

Tableau 3 : ressources
Ressources pour identifier des molécules spécifiques canal excréteur c. elegans, étiquetage des anticorps et réactifs/souches
1. Caenorhabditis Genetics Center (CCG)43 des souches et des réactifs disponibles
2. Wormbase44 pour plus d’informations sur des molécules spécifiques canal excréteurs, souches et anticorps
3. les informations sur des molécules spécifiques canal excréteurs : voir référence6
4. Transgeneome site45 pour des constructions de fusion de GFP translationnelles
5. C.elegans expression modèle46 pour des constructions de fusion de GFP transcriptionnelles
6. projet de BioResource national (NBRP)::C.elegans47 pour information sur les promoteurs et les mutants de c. elegans
7. Fluorophores : voir référence48,49
Ressources en ligne pour l’assemblage de molécules pour une bibliothèque de RNAi ciblée
1. GeneMANIA50
2. AceView51
3. iHOP52
4. Wormbase44
5. saccharomyces Genome Database53
6. Flybase54
7. souris Genome Database55
8. human Genome Database56
9. BLAST57

Tableau 4 : Exemple de phénotype Simple feuille de notation
Bibliothèque de l’ARNi Souche Général de phénotype (% total) Phénotype de canal
Longueur du canal < 1/2 (L4 %) Longueur du canal > 1/2 (L4 %) Autre phénotype Canal Nombre total d’animaux comptés
N° de plaque Nombre de puits
I-1 A1 ERM-1 [++] ; VHA - 1P:: GFP CLR (30) 80 20 100
X-5 B12 même aucun 30 70 100
III-10 C5 même UNC (54) 70 30 gros kystes 100

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Discussion

Polyvalence génétique c. elegans , transparence, plan simple corps et lignage cellulaire invariant rendent un excellent modèle pour l’analyse de la morphogénèse. Ce protocole décrit comment combiner des manipulations génétiques standards et imagerie études pour profiter de 2 micron minces canaux excréteurs c. elegans afin d’étudier la membrane polarisée et biogenèse lumen intracellulaire dans un tube de cellule unique.

L’étiquetage
Les canaux excréteurs de c. elegans peuvent être marqués par l’expression des protéines de fusion fluorescent, permettant l’analyse en direct (décrite ici), ou par les anticorps ou attaque chimique (voir le document d’accompagnement sur tubulogenèse intestinal pour la coloration des anticorps 3). l’expression de deux ou plusieurs fluorophores différents, ou la combinaison de ces différente techniques, l’étiquetage permet une dissection visuel de haute résolution de ces tubules minces (Figure 2). Protéines de fusion fluorescent dirigés vers les canaux par un promoteur spécifique de canal sont le premier choix pour l’étiquetage de canal excréteur pour plusieurs raisons, parmi eux : (1) les niveaux de faible expression de nombreuses protéines de canal et la structure fine (2) du canal qui est facilement accablé par coloration à l’extérieur des canaux où la protéine d’intérêt peut également être exprimée. En revanche, les canaux sont sensibles aux protéines exogènes et développer facilement des phénotypes non spécifiques (par exemple, extension congénitales et kystes ou même létalité) lorsque ces protéines sont fortement exprimés. Cela devrait peser dans la décision lors du choix entre différents moyens de production d’animaux transgéniques. En principe, transgènes peuvent être introduits sous forme de tableaux extrachromosomiques (p. ex., par injection directe de l’ADN de plasmide dans la gonade de transformation de la lignée germinale, comme décrit ici), qui génère généralement des baies numéros haute-copy (souvent avec la haute expression), ou intégrés dans le génome, généralement au nombre de copies basse ou unique (par exemple, par bombardement26 ou via Mos1 médiée par un seul exemplaire d’insertion [MosSCI]27). Tableaux de Extrachromsomal peuvent également être intégrées dans le génome dans un second temps (encore, cependant, à un nombre élevé de copies)18. En revanche, lorsqu’elle est injectée dans la lignée germinale à faible concentration (par exemple, 1 à 2 ng/µL ADN, combinée à une concentration plus élevée des marqueurs ADN), peu de copies (même seul) tableaux numéros peuvent être facilement généré28. Ce scénario a l’avantage que les concentrations d’ADN peuvent être modifiées, ce qui peut aider à trouver le meilleur niveau d’expression pour l’étiquetage de canal, ni trop faible ni trop élevé (toxique). La relation entre injecté niveau de concentration et d’expression de l’ADN dépend de multiples facteurs (p. ex., le promoteur) et doit donc être déterminée empiriquement. Par ailleurs, le gène d’intérêt peut être directement étiqueté avec un fluorophore dans la lignée germinale par groupés régulièrement entrecoupé court palindromique répète (CRISPR) basé étiquetage procédures29,30. Bien que cette approche place le fluorophore dans son contexte génomique plus physiologique, ce n’est pas toujours nécessaire ou même souhaitable (par exemple, lorsque la protéine est exprimée à des niveaux très faibles). Il peut, cependant, être la meilleure option, par exemple si le gène d’intérêt est très grand.

Visualisation de canal peut être accomplie en orientant les constructions de la transcriptionnelles dans le canal qui mettra en valeur le cytoplasme du canal par un fluorophore. En revanche, le marquage des composants subcellulaires canal requiert une fusion translationnelle où le gène pleine longueur est relié au cadre pour le fluorophore gène codant. Lorsque vous utilisez un promoteur spécifique de canal d’expression (plutôt que le promoteur du gène propre), son choix devrait se fonder sur la force du promoteur et, pour l’analyse du développement, le temps d’expression. De nombreux gènes spécifiques de canal excréteur n’expriment pas avant le stade larvaire quand fonction osmotique du canal devient critique ; trop tard pour l’analyse de sa phase d’extension active (MCE-1 et pros-1 sont des gènes exprimés au début)10,13. Exemples de marqueurs du canal excréteur endo - et les membranes plasmiques et de promoteurs spécifiques de canal sont indiquées dans les tableaux 1 et 2, respectivement et ressources pour trouver des molécules spécifiques canal supplémentaires dans le tableau 3. Ces ressources peuvent également être utilisés pour trouver une protéine de fusion fluorescent approprié déjà faits, qui peut-être être disponible par l’intermédiaire du centre de génétique de Caenorhabditis (CCG ; Voir également tableau 1). Pour construire des plasmides recombinants pour l’expression de ces fusions de protéine, on peut utiliser diverses méthodes de clonage, chacun avec des avantages et des inconvénients (discuté ailleurs14). Il s’agit d’enzymes de restriction conventionnelle basée approches, décrits ici le clonage, clonage modulaire utilisant le multisite portail système31, Gibson Assemblée32ou construction de gène de journaliste par la méthode « PCR stitching »14 ,,33. Ces différentes approches peuvent être adaptés à la méthode retenue pour leur introduction dans la lignée germinale et/ou à d’autres besoins spécifiques (par exemple, la passerelle polyvalente système facilite le brassage des promoteurs et des ADNc à plus grande échelle des approches d’étiquetage) . Soin doit être pris au choix du site d’insertion correcte pour le fluorophore (liant à la N-contre l’extrémité C-terminale de la protéine), en tenant compte de la fonction de la protéine d’intérêt.

Interférence avec la fonction du gène
Comme l’un des nombreux moyens possibles pour perturber la fonction du gène chez c. elegans, ce protocole décrit un écran d’interaction Arni ciblé visant à modifier un phénotype lumen canal cystique, induit par surexprimant un composant de la membrane lumenal. Dans ce cas précis, surexprimant une membrane apicale/lumière associées marqueur telles que ERM-1 a l’avantage d’orienter directement l’enquête à la cible souhaitée : l’analyse de la biogenèse intracellulaire membrane apicale/lumière. Un phénotype de gain de fonction généré par la surexpression offre également certains avantages lorsqu’il est combiné avec un écran d’interaction (ARNi) perte de fonction, telle que décrite ici (voir34 pour la discussion des analyses de perte et de gain-de fonction et la conception d’écrans génétiques). ERM-1 s’est d’ailleurs un bien étudiée « morphogénèse lumen » et la membrane apicale identité molécule12. Par conséquent, dans ce cas, un écran ciblé (plutôt que non biaisé) est susceptible d’être directement informatifs pour la morphogenèse de la lumière tout en même temps que de plus caractérisante ERM-1 spécifique fonction dans ce processus. Cependant, un écran indifférenciés impartial pourrait être réalisé de manière similaire, en commençant avec un animal sauvage, un animal transgénique avec fluorescently marquée des canaux excréteurs, ou avec n’importe quel mutant de canal. Le générales avantages et les inconvénients de l’ARNi (p. ex., versus la mutagénèse) permettant la génération des phénotypes de la perte de fonction, ainsi que la conduction des différents types d’écrans génétiques chez c. elegans sont traitées ailleurs 34. RNAi produit une gamme de phénotypes, y compris des phénotypes plus douces, un avantage spécifique pour l’analyse des gènes tubulogenèse souvent mortels. Ceci est décrit et examinée dans le document d’accompagnement sur intestinale tubulogenèse3. Des approches différentes pour générer le gain et perte de fonction des mutants et des procédures de génétiques classiques tels que Croix, sont détaillées et discutés dans la génétique générale Méthodes littérature20.

La microscopie et l’évaluation des phénotypes tubulogenèse
Évaluer visuellement et marquant la modification d’un phénotype de canal bien définis sous un fluorescent binoculaire à l’aide des paramètres de cotation simples (par exemple canal longueur et lumen diamètre), comme décrit ici, peut être réalisé dans un court laps de temps même lors du traitement d’un plus grand nombre d’animaux dans une cible ou systématique génétique ou RNAi écran. En revanche, un écran similaire cherchez une phénotypes morphogenèse roman canal dans une souche qui est sauvage (à l’exception de son transgène canal-étiquetage), est plus beaucoup de temps, mais peut, en principe, être interprété de la même façon (que nous avons effectué tel un écran sur une base de Génome-large en plusieurs mois). Ces écrans permettra d’identifier plusieurs phénotypes différents canal (non illustrées ici) et donc doit développer parallèlement des paramètres de notation différents, par exemple, une classification qualitative (voir 9,11, 35,36,37,38 pour les différentes façons de marquer des phénotypes de canal en disséquant la microscopie). Lors de l’interprétation d’un phénotype de canal, il est crucial de garder à l’esprit que la formation des kystes peut être un effet non spécifique de nombreuses différentes insultes à cette structure tubulaire mince, et c’est souvent un phénotype terminal moins informatif. Taille du kyste et l’emplacement, en revanche, peuvent être instructifs, par exemple, un kyste à proximité de la cellule de canal (au début de l’extension de canal), kystes le long du canal ou kystes au conseils de canal, donnent des indices pour le mécanisme sous-jacent des défauts. Kystes de canal (définis ici comme intra-lumière sphéroïdes remplies de liquide entourées d’une membrane apicale/lumière) doivent être distinguées des vésicules (petit cytoplasmique lié à la membrane liquide rempli sphéroïdes) ou vacuoles (élargie cytoplasmique membranaires fluides sphéroïdes remplis), pas entourée par une membrane de lumière, qui peuvent tous l’air superficiellement identiques (Figure 4 a– D). Vacuoles cytoplasmiques peuvent même survenir secondairement, par exemple, par l’intermédiaire des effets toxiques des solutions (azoture de sodium) de montage. Les gros kystes et vacuoles cytoplasmiques peuvent prendre presque la taille de l’animal et besoin de distinguer davantage de la classique « effacer (Clr) » canal phénotype provoquée par une accumulation de liquide dans la cavité du corps. Enfin, longueur du canal est presque toujours secondairement compromise dans les canaux cystiques, donc un défaut d’extension de canal vrai doit être démontrée dans un cadre libre de kyste.

Malgré leurs petits diamètres, composants subcellulaires d’excréteur canaux, tels qu’apicale par rapport aux membranes basales, intracellulaires endosomale versus vésicules canaliculaires, organites intracellulaires et composants du cytosquelette, peut être visualisé par supérieur grossissement, par exemple, la microscopie confocale (Figure 2, Figure 4). Par imagerie confocale, un cytoplasme de canal positif de GFP seul est suffisant pour distinguer la lumière du cytoplasme de canal via une ligne non fluorescent (Figure 2 a, 4E de la Figure). L’identité des marqueurs contribue à résoudre canaliculaire des vésicules endosomale (aussi remarquablement différentes taille), bien que l’attribution définitive, il faudra immunoperoxydase39. Double et triple étiquetage peut déterminer la localisation subcellulaire d’une molécule d’intérêt et de la relation entre les composants subcellulaires les uns aux autres (Figure 2). Membranes de l’unique canal de lumière étiquetées produisent la même ligne double que le cytoplasme ou la membrane basale, mais se distingués par l’intermédiaire de double ou triple étiquetage. Pour l’analyse confocale, montage adéquat est important, étant donné la fragilité de la structure du canal, sa sensibilité aux changements osmotiques et la vulnérabilité de son phénotype kystique plus fréquent. Kystes éclatent facilement avec changements osmotiques ou pressions physiques, sont sensibles aux toxines de membrane comme l’azoture de sodium et sont également sensibles à certains anesthésiques utilisés pour l’immobilisation (qui peut aussi produire des vacuoles cytoplasmiques). Dans nos mains, lidocaïne 5 % dans un tampon M9 fonctionne le mieux pour des dosages de canal excréteurs plus. Procédures d’imagerie et toute manipulation doivent être douces, tel que décrit. Pour éviter les artefacts qui imitent les phénotypes (p. ex., des kystes et des vacuoles), il est préférable d’acquérir des images immédiatement après le montage. Si ce n’est pas possible, kyste images devraient être acquises tout d’abord, avant d’autres phénotypes d’imagerie. Ce protocole traite standard microscopie confocale qui fournit confocalité supérieure, par rapport à la filature de la microscopie confocale disque qui, au contraire, réduit la phototoxicité et la microscopie de choix pour l’analyse des changements dynamiques de composants subcellulaires au fil du temps. Ces questions sur subcellulaire dynamique peuvent également être adressées à l’aide de techniques de photoblanchiment ou marquage des protéines de fusion avec des fluorophores photo-commutable qui changent de couleur,40. Enfin, l’ordre de résolution peut être encore augmentée par l’ajout de microscopie électronique à transmission (TEM, fournissant la plus haute résolution structurale mais pas moléculaire), microscopie de Super-résolution (fournissant une résolution moléculaire dans la gamme nanomètre) ; ou immunoperoxydase (fournir des)39,41. Tomographie 3D peut être combinée avec des coupes sériées de TEM et est particulièrement utile pour l’analyse de l’interface canaliculaire-plasma-membrane de canaux excréteurs9,10. Techniques améliorées de ces différents types de microscopie et de combinaisons de ces différentes approches d’imagerie continuent à se développer.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Nous remercions M. Buechner (Université du Kansas, Kansas, USA), K. Nehrke (centre médical de l’Université de Rochester, Rochester, New York, é.-u.) et le centre de génétique de Caenorhabditis , financée par les National Institutes of Health, bureau de l’Infrastructure de recherche Programmes (P40 OD010440). Ce travail a été soutenu par subventions GM078653 NIH, HGM est 224570 et SAA 223809 à V.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cloning
Plasmid pPD95.75 Addgene Cat. No. 37464
PCR Kit Qiagen Cat. No. 27106
Ligation kit New England Biolabs Cat. No. E2611L
DNA marker Thermo Scientific Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade Fisher Scientific Cat. No. BP164-100
Competent cells New England Biolabs Cat. No. C2987H
Tris Fisher Scientific Cat. No. BP154-1
EDTA Sigma Cat. No. ED-1KG
Acetic acid Fisher Scientific Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide Fisher Scientific Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine  MJ Research Cat. No. PTG-200 
Centrifuge Eppendorf  Cat. No. 5415C
Water Bath Precision Scientific  Cat. No. 666A3 
Gel running instrument Fisher Scientific Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply Fisher Scientific Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System Bio-Rad Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific Cat. No. ND1000
C. elegans related1 1see reference19 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2 2see reference19 for protocols.
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Yeast Extract BD Biosciences Cat. no. 212750
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
Ampicillin Sigma Cat. no. A0116
Tetracycline Fisher Scientific Cat. no. BP912
M9 Medium2 2see reference19 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
Na2HPO4 Sigma Cat. no. S7907
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
NGM plates 2 2see reference19 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
RNAi plates3 3see reference21 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
IPTG  US Biological Cat. no. I8500
Carbenicillin Fisher Scientific Cat. no. BP2648
NaOH Fisher Scientific Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref21,58,59) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref60) Source BioScience
Imaging related
Lidocaine MP Biomedicals,LLG Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman Cat. no. 335148
Microscope slides  Fisher Scientific Cat. no. 4448
Tissue culture plate, 6 well  Corning Inc. Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)

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Biologie du développement numéro 128 tubulogenèse unicellulaires morphogenèse lumen intracellulaire seule cellule en vivo analyse génétique du développement dissection microscopie de fluorescence microscopie confocale
Le <em>c. elegans</em> Excretory Canal comme modèle pour la morphogenèse Lumen intracellulaire et <em>In Vivo</em> polarisé la biogenèse membranaire dans une seule cellule : étiquetage de GFP-fusions, Arni Interaction écran et imagerie
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Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56101, doi:10.3791/56101 (2017).

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