Summary
Dit protocol bevat instructies voor negatieve kleuring virusmonsters die gemakkelijk in BSL-2, -3 of -4 laboratoria kunnen worden gebruikt. Het omvat het gebruik van een innovatieve verwerkingscapule die het transmissie-elektronenmicroscopie rooster beschermt en de gebruiker makkelijker in de meer turbulente omgevingen in biocontainer vergemakkelijkt.
Abstract
Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) wordt gebruikt om de ultrastructuur van virussen en andere microbiële pathogenen met nanometeroplossing in acht te nemen. De meeste biologische materialen bevatten geen dichte elementen die elektronen kunnen verstrooien om een beeld te creëren; Daarom is een negatieve vlek die dikke zware metalen zouten rond het monster plaatst nodig. Om virussen in suspensie onder de TEM te visualiseren, moeten ze toegepast worden op kleine roosters die bedekt zijn met een doorzichtig oppervlak dat alleen nanometer dik is. Vanwege hun kleine grootte en breekbaarheid zijn deze roosters moeilijk te hanteren en gemakkelijk verplaatst door luchtstromen. Het dunne oppervlak is gemakkelijk beschadigd, waardoor het monster moeilijk of onmogelijk is om de afbeelding te maken. Infectieuze virussen moeten in een biosafety-kabinet (BSC) worden behandeld, en sommige hebben een biocontainende laboratoriumomgeving nodig. Staining virussen in biosafety niveaus (BSL) -3 en -4 is bijzonder uitdagend omdat deze omgevingen meer turbulent zijn en technici nodig zijn tO Persoonlijke beschermende uitrusting dragen (PPE), wat de handigheid vermindert.
In deze studie hebben we een nieuw apparaat geëvalueerd om te helpen bij negatieve kleuringvirussen in biocontainment. Het apparaat is een capsule die werkt als een gespecialiseerde pipettip. Zodra grids in de capsule zijn geladen, aspireert de gebruiker simpelweg reagentia in de capsule om het virus en vlekken aan het ingekapselde rooster af te leveren, waardoor gebruikersbehandeling van roosters wordt verwijderd. Hoewel deze techniek speciaal is ontworpen voor gebruik in BSL-3 of -4 biocontainment, kan het monsterbereiding in elke laboratoriumomgeving vergemakkelijken door makkelijk negatief kleuring van het virus mogelijk te maken. Dezezelfde methode kan ook toegepast worden om negatieve gekleurde TEM-monsters van nanodeeltjes, macromoleculen en dergelijke exemplaren op te stellen.
Introduction
Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is een effectief instrument om de morfologie en ultrastructuur van biologische monsters te zien die te klein zijn om te zien in een traditionele lichtmicroscoop 1 , 2 , 3 , 4 . TEMs schiet elektronen door een zeer dun specimen dat een hogere resolutie beeld produceert, omdat elektronen een veel kortere golflengte hebben dan licht. Regio's van de steekproef die elektronen buigen of blokkeren, verschijnen donker, terwijl gebieden die elektronenlucent zijn, wit verschijnen.
Gebrek aan elektronen dichte materie maakt virussen moeilijk om te zien onder een TEM omdat ze elektronen niet kunnen verstrooien. Negatieve kleuring is de meest voorkomende methode voor het maken van contrast en het bekijken van virussen met een TEM. De eerste negatieve kleurprocedure werd in 1959 door Brenner en Horne voorgesteld, gebaseerd op een experiment waar Hall (1955) en Huxley (1957) observerenBij het verschijnen van biologische structuren in omgekeerd contrast wanneer ze gedompeld worden in een elektrondichte stof 5 . Het proces van negatieve kleuring is in de afgelopen halve eeuw vrijwel ongewijzigd. Negatieve kleuring houdt kort in het toepassen van een zware metalen zoutoplossing op een monster op een TEM-raster in een poging om het virus te omringen met dicht materiaal zonder het virus te infiltreren 6 . Dit creëert een donkere grens en onthult de vorm 5 van het deeltje. In deze studie worden twee reagentia gebruikt voor negatieve kleuring, uranylacetaat (UA) en kaliumfosphotungsticzuur (PTA). Beide deze vlekken worden vaak gebruikt om kleine biologische monsters te negeren, zoals virussen, eiwitcomplexen en nanodeeltjes 7 , 8 , 9 .
De conventionele negatieve kleuringstechniek is de handmatige druppel negatieve kleuringstechniekNique 7 . Deze methode vereist nauwkeurige behandeling van kleine, breekbare TEM-rasteren met pincet om kleine hoeveelheden virusmonster, vlek en spoelwater toe te passen. Het typische voorbereidingsprotocol omvat het aanbrengen van een druppel monsterophanging op het oppervlak van een filmomhulde TEM-rooster ( Figuur 1A ). Na het aanbrengen van het monster op het filmoppervlak wordt het rooster afgespoeld om niet-bijhanden virus te verwijderen en gedurende enkele seconden tot een minuut met ofwel UA of PTA gekleurd, afhankelijk van het type monster. Overmatige vloeistof is slecht weg van het raster door een stuk filterpapier aan de rand van het raster aan te raken.
De handmatige druppelmethode vereist dat elk raster individueel gemaakt wordt. Als het niet zorgvuldig wordt behandeld, kunnen de gecoate TEM-roosters gemakkelijk worden gebogen, gebogen of besmet. Het verwerken van meerdere monsters kan leiden tot problemen bij het bijhouden van de roosters en het verzekeren van consistente kleuring voor elk monster. Deze handleiding kleuring procedure is veel meer dEfficiënt wanneer uitgevoerd in biosafety-niveau (BSL) -3 en -4 biocontainerlaboratoria, vanwege de benodigde persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE) die nodig zijn voor deze omgevingen. PPE is omslachtig en de biocontainermilieu is veel turbulent in vergelijking met een regulier laboratorium. Personeel in BSL-3 biocontainerlaboratoria moet 2 paren handschoenen dragen en in een biosafety-kast (BSC) werken. Deze dubbele laag handschoenen vermindert de gevoelige gevoeligheid en beperkt de fijne motorbeweging. De luchtstroom van het BSC dat de gebruiker beschermt en de verontreiniging van het monster voorkomt, kan ervoor zorgen dat de monsters en vlekken te snel drogen, waardoor de vlekkwaliteit wordt beïnvloed. De sterke turbulente luchtstroom in het BSC kan ook snel een raster dat niet goed beveiligd is, wegblazen. In BSL-4 biocontainende laboratoria zijn er extra veiligheidseisen. Personeel moet een positief drukpak dragen, waardoor de fysieke beweging verder wordt beperkt en het vermogen om duidelijk te zien en te manipulerenUlate grids. De technicus die in BSL-4 werkt, draagt ook minimaal 2 paar handschoenen, waarbij het buitenste paar een dikke handschoen is die de handvaardigheid en tactiele sensatie aanzienlijk vermindert. Tenslotte zijn de pinnen die gebruikt worden om TEM-rasters aan te pakken scherp, waardoor de technicus een risico oplevert vanwege hun vermogen om handschoenen te punken. Met capsules die roosters bevatten, zijn er geen tanggen nodig, waardoor een veilig, pincetvrij alternatief voor het manipuleren van roosters in biocontainering is. Tenslotte bieden de capsules ook een effectieve manier om rasters op te slaan tijdens de verwerking, de ontsmetting van osmiumdampen en tijdens de opslag; Waardoor de roosters georganiseerd en veilig zijn tegen schade.
In dit rapport introduceren we een nieuwe methode voor negatieve kleuring TEM-rasteren in biocontainerlaboratoria die mPrep / g capsules, een capsule-based apparaat voor roosterbehandeling en kleuring 10 , 11 , 12 gebruiken . De capsule komt erbijModelleert twee TEM-rasters, minimaliseert directe handhaving en vermindert het potentieel voor roosterschade. De capsule hecht direct op een enkel- of multikanaalspipet op dezelfde manier als een pipettip, waardoor de toepassing van verschillende vloeistoffen op rasters in de binnenkant mogelijk is. Dit maakt het gelijktijdig mogelijk om meerdere monsters met dubbele rasters te maken ( figuur 1B ). Naar negatieve vlekken met capsules wordt het virusmonster in de capsule gesuspendeerd en 10 minuten gehouden om de virussen op de gridoppervlakken te adsorberen. De roosters met geadsorbeerd virus worden vervolgens gewassen met gedeïoniseerd (dl) water en gedurende enkele seconden tot 1 minuten met enten UA of PTA gekleurd. Dit proces maakt gebruik van dezelfde protocol stappen en reagentia als de handmatige druppel methode; Het verschil is dat alle werkzaamheden binnen de capsule optreden zonder fysieke hantering van de roosters. ( Figuren 1C , 1D ).
Het doel van deze studie was om capsules te evalueren alsEen nieuwe methode voor negatieve kleuring van virusmonsters in biocontaineromgevingen. In deze studie werd ook gekeken naar de kwaliteit van TEM-beelden die zijn geproduceerd uit twee verschillende virusinactivatieprocedures: 1) snelle inactivering, 1% osmiumtetroxide-damp en 2) een 24 uur inactivatie met 2% glutaraldehyde. Beide deze werden uitgevoerd met behulp van de capsules. Tenslotte hebben we twee vaak gebruikte negatieve vlekken, UA en PTA geëvalueerd voor gebruik in de capsule. 13
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Experimentvoorbereiding in een BSL-2 omgeving voorafgaand aan het werken met de virusmonsters
- Bereid of koop Formvar- en koolstofcoated TEM-koperroosters, meestal 200-400 mesh.
- Plaats de gecoate TEM-roosters in capsules.
- Gebruik een vergrootglas om dit proces makkelijk te maken. Een of twee roosters kunnen in elke capsule worden ingebracht. Voorgeladen capsules kunnen worden gekocht om deze stap te elimineren, indien gewenst.
- Vervang de capsules met ingebouwde TEM-bekledingsroosters, samen met andere benodigdheden en reagentia, naar biocontainers waar de virussen negatief worden gekleurd.
2. De Capsule Methode voor Negatief Staining in Biocontainment Met Waterig Glutaraldehyde En 1% Osmium Tetroxide Damp Inactivering
- In het biocontainer BSC aspireren 40 μl virus suspensie in de capsule die aan een pipet is bevestigd.
OPMERKING: De pipet blijft vast aan de aansluitingE capsule tot het proces is voltooid. Viruspreparatie is volgens onze vorige publicatie 14 . - Plaats de pipet aan de zijkant gedurende 10 minuten met horizontale grids. Dit is een even verspreiding van virusdeeltjes op de gecoate grids te bevorderen.
- Inactiveer het virus binnen de capsule binnen het biocontainer BSC.
- Pak de pipet op en druk de plunjer om de virusoplossing in een afvalcontainer af te geven.
- Aspireren 40 μL 2% glutaraldehyde fixatief in de capsules.
Let op: Glutaraldehyde is een gevaarlijke chemische stof en vereist een passende bescherming. Glutaraldehyde kan voor korte perioden in een normaal BSC worden gebruikt, maar uitgebreid open reagens vereist werk in een BSC of chemische dampkap. - Plaats de pipet voor 20 minuten aan de zijkant. Dit zorgt ervoor dat monsters goed vast zijn.
- Verwijder de fixatie en haal 40 μL dl water in de capsules naar wVerwijder de fixatie weg. Herhaal deze wasstap voor in totaal 3 spoelcycli.
- Aspireren 40 μL van 1% uranylacetaat (UA) of 1% kaliumfosphotungsticzuur (PTA) in de capsules en laat 30 s zitten.
OPMERKING: De staining time kan variëren van 10 s tot 1 min op basis van het virusmonster.
Let op: UA is een alfa-emitter, en een cumulatief toxine. Hanteer het met passende bescherming. - Verwijder de capsule uit de pipet en maak de netjes droog door een stuk filterpapier aan de rand van de roosters te raken, terwijl de roosters binnen de capsule blijven.
- Osmium Tetroxide Damp Inactivatie Procedure.
- Plaats de capsule met het deksel open in een 50 ml centrifugebuis met filterpapier die in een 1% osmiumtetroxideoplossing is gedrenkt.
Let op: Osmiumtetroxide is extreem giftig met lage dampdruk. Het moet gebruikt worden in een BSC of chemische dampkap. Hanteer het met passende bescherming. Bericht waarschuwingInformatie in het werkgebied. - Verzegel de 50 ml centrifugebuis gedurende 1 uur om volledige permeatie van de osmiumtetroxide-damp toe te laten. Vervolgens ontdoen en verplaats de buis vervolgens de biocontainer naar de BSL-2 EM-faciliteit.
- Plaats de capsule met het deksel open in een 50 ml centrifugebuis met filterpapier die in een 1% osmiumtetroxideoplossing is gedrenkt.
- Verwijder EM roosters uit de capsule.
- Verwijder de capsule van de centrifugebuis in de BSL-2 EM-installatie en plaats deze op een pipet.
- Aspireer 40 μl dl water in de capsule en doseer het water drie maal in een afvalcontainer.
- Verwijder de capsule uit de pipet en doe de roosters uit met behulp van filterpapier om de rand van de roosters aan te raken.
- Na het drogen van de lucht, sla de roosters op voor de volgende TEM-beeldvorming.
3. De Capsule Methode voor Inactivering in Biocontainment Met 2% Glutaraldehyde, gevolgd door Negatief Staining in een BSL-2 Laboratorium
- Virus inactivatie procedure.
- Inactiveer virussen met fixatief gedurende minimaal 24 uur voor verpakking, ontsmetting en overdracht naar de BSL-2 EM faciliteit.
OPMERKING: dit bevordert een gelijkmatige verdeling van virusdeeltjes op de TEM-rasteren.
OPMERKING: De kleurtijd varieerde van 10 s tot 1 min op basis van het virusmonster.
Let op: UA is een alfa-emitter, en een cumulatief toxine. Hanteer het met passende bescherming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De capsule methode produceert goede kwaliteit negatieve kleuring voor TEM beeldvorming:
Ten eerste evalueren we de kwaliteit van beelden die gegenereerd worden door gebruik te maken van zowel de handmatige druppelmethode als de capsulemethoden voor negatief kleuring van Zaire ebolavirus. Ebolavirussen zijn lid van de familie Filoviridae , samen met Marburg-virus. Ebolavirus is typisch 80 tot 100 nm in diameter en kan meer dan 1000 nm zijn. Ebolavirus moet worden behandeld in een BSL-4 biocontainermilieu. Figuur 2 toont afbeeldingen die zijn gegenereerd met behulp van de handmatige druppelmethode en de capsule methode voor negatieve kleuring. Figuur 2A (handmatige druppelmethode) en Figuur 2B (capsule methode) tonen ebolavirusmonsters die duidelijk gedefinieerde details hebben met nucleocapsidstructuren in het midden van de virion, en zichtbaar ebolavirusglycoproteïneS op het oppervlak. Zo hebben zowel de capsule- als druppelmethoden de mogelijkheid om vergelijkbare TEM-afbeeldingen te produceren.
Vergelijk en evalueer de EM beeldkwaliteit na snelle inactivering met waterig glutaraldehyde en 1% osmiumtetroxide damp versus 24 uur inactivering met 2% waterig glutaraldehyde, met behulp van de capsule methode:
We hebben de kwaliteit van TEM-beelden geëvalueerd van twee verschillende methoden van monsterinactivatie met behulp van Chikungunya-virus beoordeeld. Chikungunya virus is een lid van het genus Alphavirus in de familie Togaviridae . Het is bolvormig met een diameter van 60-70 nm. De virion bevat een envelop die rijk is aan glycoproteïnen die trimerische spikes op het virale oppervlak vormen. Chikungunya virus moet in BSL-3 worden behandeld. Snelle inactivatie wordt bereikt met behulp van 2% glutaraldehyde gedurende 20 minuten gevolgd door een 1 uur blootstelling aan 1% osmiumtetroxide damp, met de gehele negAtief kleuringsproces dat voorkomt in een capsule binnen een BSC in het biocontainerlaboratorium ( Figuur 1C ). Bij gebruik van 2% glutaraldehyde gedurende 24 uur om het virus te inactiveren, vindt de inactivatie plaats in een biocontaineromgeving, maar de 1% UA negatieve vlekprocedure wordt uitgevoerd met behulp van de capsule methode in een BSL-2 laboratorium ( Figuur 1D ). Deze inactiveringsprocedures produceren niet dezelfde kwaliteitbeelden ( Figuur 3 ). Uit fig. 3 blijkt dat fixatie in glutaraldehyde zonder aanwezigheid van osmiumtetroxide ( Figuur 3A , 3B ) meer ultrastructuraal detail toont dan monsters die zijn bereid met glutaraldehyde en osmiumtetroxide ( Figuur 3C , 3D ).
De capsule werkwijze werkt goed met behulp van Uranyl acetaat (UA) en fosfOtungsticzuur (PTA) als negatieve vlekken voor aldehyde vaste monsters.
Voorbeelden van UA- en PTA-negatieve kleuring onder toepassing van de capsule werkwijze worden getoond in Figuur 4 op aldehyde-gefixeerde virusachtige deeltjes (VLP's). De VLP's zijn eiwitten samengevoegd in virusachtige structuren, maar bevatten geen virale genetische materialen. Ze worden meestal gebruikt bij vaccinontwikkeling en voor basis virale onderzoek. Negatieve kleuring is een waardevol instrument om VLP assemblage en morfologie te evalueren. We hebben zowel UA als PTA gebruikt voor negatieve kleuring van VLP's met de capsule methode. Beide vlekken tonen hoge kwaliteit resultaten met zichtbare en duidelijk omschreven grenzen van de Ebola nano-VLP's 15 ( Figuur 4A , 4B ) en Murine Leukemia VLP's 16 ( Figuur 4C , 4D ).
Figuur 1: Negatieve Verfmethoden Overzicht. ( A ) Handmatige druppelmethode wordt uitgevoerd door opeenvolgende bewegende TEM-roosters van de druppel naar de druppel van het monster, spoelen en vlekken. ( B ) De capsule methode instellen met roosters en toepassing van monster suspensie. ( C ) Typische procedure met behulp van de capsule methode bij biocontainering met korte-termijn inactivatie met 1% osmiumtetroxide damp. ( D ) Aanbevolen procedure met behulp van de capsule methode bij biocontainment met langdurige inactivering met 2% glutaraldehyde. Figuur is eerder gepubliceerd en opnieuw gebruikt met machtigingen van referentie 13 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vergelijking van 1% PTA Negatieve Stained Ebolavirus Particles. ( A ) Negatief gekleurd met de handmatige druppelmethode. ( B ) Negatief gekleurd met behulp van de capsule methode. Figuur is eerder gepubliceerd en opnieuw gebruikt met machtigingen van referentie 13 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: 1% UA Negatief Staining Met De Capsule Methode Van Chikungunya Virus Met Different Inactivation Procedures. ( A , B ) inactivering gedurende minimaal 24 uur met slechts 2% glutaraldehyde. ( C ,D) Snelle inactivatie met 2% glutaraldehyde en 1% osmiumtetroxide damp. Figuur is eerder gepubliceerd en opnieuw gebruikt met machtigingen van referentie 13 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voorbeelden van Phosphotungsticzuur (PTA) en Uranylacetaat (UA) Negatief Stained Virus-Like-Particles (VLP's) met behulp van de Capsule Method. ( A ) Laag vergrotingsoverzicht van 1% PTA-gekleurde ebola nano-VLP's. ( B ) TEM-afbeelding met hoge vergroting met structurele details van PTA-gekleurde ebola nano-VLP's. ( C ) Laag vergrotingsoverzicht van 1% UA-gekleurde Murine Leukemia VLPs. ( D ) TEM-beeld met hoge vergroting met structuurstructuurAils van UA gekleurde Murine Leukemia VLPs met ebolavirus glycoproteïne op hun oppervlak. Figuur is eerder gepubliceerd en opnieuw gebruikt met machtigingen van referentie 13 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Negatieve kleuring is een waardevolle TEM-techniek voor het evalueren en sorteren van virussen, eiwitcomplexen en nanodeeltjes. Druppelbereiding van deze monsters door het handmatig verplaatsen van grids van reagens tot negatieve vlekken is het klassieke protocol voor meer dan een halve eeuw. Het is een simpel proces, maar vereist expertise opgedaan door opleiding voor succesvolle afronding. Uitstekende negatieve kleuring wordt nog steeds beschouwd als een state-of-the-art vaardigheidsset en zeer gewenst in veel TEM labs. De capsule methode heeft verschillende voordelen ten opzichte van de handmatige druppelmethode, vooral in biocontainerlaboratoria. Ten eerste vereist de handmatige druppelmethode aanzienlijke training en ervaring voordat het succesvol kan worden uitgevoerd, terwijl het makkelijk om de capsule methode te gebruiken kan worden bereikt door technici op het niveau van de techniek door middel van eenvoudige pipettering. De grootste uitdaging met de handmatige druppelmethode is de succesvolle afhandeling van de TEM-rasteren met tang in BSL-3 en BSL-4 PPE als gevolg van tO de sterk verminderde tactiele sensatie en behendigheid Fragiele gecoate TEM roosters worden gemakkelijk door pincet beschadigd of gebogen. Schade aan het gecoate TEM-raster wordt vaak niet geopenbaard totdat het met een TEM wordt bekeken. Een tweede voordeel van capsules is dat TEM-roosters alleen direct worden behandeld als ze in capsules worden geplaatst en wanneer ze worden verwijderd voor inbrengen in de elektronenmicroscoop. Of het nu gaat om bioscooplaboratoria of in de BSL-2 EM-faciliteit, is er geen directe netbehandeling. Een derde voordeel van de capsule methode is dat beide zijden van het rooster zijn bedekt met virussen en vlekken. Dit kan handig zijn als de concentratie van het monster laag is; Dit kan echter te veel monster veroorzaken als de concentratie hoog is of resulteert in verdunning van het monster voor gebruik.
Negatieve kleuring van meerdere roosters met behulp van de handmatige druppeltegniek is tijdrovend, omdat elk monster individueel bereid en gekleurd moet worden. Dit leidt tot problemen obtaiConsistente, reproduceerbare kleuring. Bovendien is het volgen van veel individuele roosters altijd een uitdaging. Elke capsule bevat twee roosters en meerdere capsules kunnen aan een multikanaalspipet worden bevestigd, waardoor het proces stroomlijnt. Daarom zorgen de capsules ervoor dat roosters worden gevlekd met behulp van een zeer vergelijkbaar proces, onder constante monstervoorwaarden en tegelijkertijd. De capsules kunnen geëtiketteerd worden om organisaties te helpen, waardoor het potentieel voor het mengen of misidentificeren van roosters wordt verminderd. Een ander veel voorkomend probleem bij het gebruik van de handmatige druppelmethode is gridverontreiniging. Dit kan optreden wanneer de roosters te lang in de open lucht worden gelaten of worden gedaald. De capsule beschermt de TEM-roosters uit de open lucht en houdt ze stevig vast zodat ze nooit worden gedaald. Capsules bieden grotere experimentele controle en herhaalbaarheid bij het bereiden en negatieve kleuring omdat de capsule een meer gecontroleerde omgeving is.
De capsules kunnen vooraf worden gekocht als deverwekt. Handmatig laden van roosters in de capsules is een beetje praktisch om ervoor te zorgen dat roosters niet beschadigd raken. De capsule methode vereist ook een beetje meer monster en vlek dan de handmatige druppelmethode. De capsule methode vereist minstens 40 μL monster, in vergelijking met de handmatige druppelmethode, die kan worden uitgevoerd met zo weinig als 8 μL.
Virus-inactivatie is een belangrijk onderdeel van negatieve kleuring in BSL-3 en BSL-4, omdat het het geïnactiveerde virus uit de bioconductie-laboratoria toelaat voor beeldvorming in de EM-faciliteit. Inactivatie met behulp van fixatiemiddelen heeft het bijkomende voordeel om het virus te bevestigen, waardoor de afbraak wordt voorkomen. Er zijn twee verschillende manieren om het virusmonster in te schakelen, die beide in deze studie werden onderzocht. De eerste hecht het virus aan gecoate TEM grids, fixeert de virussen gedurende 20 minuten in een 2% glutaraldehyde oplossing, gevolgd door 1 uur blootstelling van het rooster aan osmiumtetroxide damp ( Figuur 1C ). Dit inactiverenIon-methode is voordelig omdat het tijd bespaart door het mogelijk te maken dat het monster na 1 uur en 20 minuten uit biocontaineringslaboratorium wordt verwijderd. Het voorkomt ook verdunning van virus voor aanbrengen op het gecoate TEM-rooster, dus het kan nodig zijn voor monsters die vermoedelijk dicht bij de TEM-detectiegrens liggen. Echter, 1% osmiumtetroxide damp vermindert de kwaliteit van TEM beelden, aangezien het osmium het monster verder kan vlek ( Figuur 3 ). Vorige rapporten tonen een 5 min blootstelling aan osmium tetroxide damp levert goede resultaten bij negatieve kleuring; Echter, langer blootstelling vereist voor absolute virale deactivering veroorzaakte een mengsel van positieve en negatieve kleuring 17 . De tweede inactiveringsmethode houdt minimaal 24 uur in een 2% glutaraldehyde oplossing en vereist geen osmium tetroxide dampbehandeling ( Figuur 1D ). Deze tweede methode duurt langer om te voltooien, aangezien het monster niet uit het biocontainment labo wordt verwijderdRatory voor 24 uur, maar kan voordelig zijn omdat het de negatieve kleuring mogelijk maakt buiten biocontainering in een BSL-2 omgeving, en elimineert de noodzaak van gevaarlijk osmiumtetroxide. Onze resultaten tonen aan dat 24 uur glutaraldehyde-inactivering hogere kwaliteit TEM-beelden produceert dan wanneer monsters worden behandeld met osmiumtetroxide-damp ( Figuur 3 ).
In dit experiment werden twee negatieve vlekken gebruikt: UA en PTA. Beide vlekken worden gebruikt als 1% oplossing. UA, het acetaatzout van uranium, werkt goed als een negatieve vlek omdat dichte uraniumatomen elektronen verspreiden 5 . PTA, een heteropolyzuur, werkt ook goed als een negatieve vlek door dichte wolfraamatomen 5 . PTA heeft soms voorkeur boven de UA, omdat het veel minder giftig is, en slechts een lichte irritatie bij inademing of in contact. Bij negatieve kleuring van onbepaalde monsters moet de lagere pH van UA overwogen worden, omdat het schade kan veroorzaken tO het monster De virussen die in dit experiment worden gebruikt, vereisen fixatie voor inactivering, zodat zowel UA als PTA vergelijkbare resultaten behaald hebben en geen duidelijk voordeel kon worden gedetecteerd voor beide vlekken. Beide vlekken zijn makkelijk mee te werken, en zij produceren beide soortgelijke TEM-afbeeldingen ( Figuur 4 ).
In het algemeen is de capsule methode makkelijker te gebruiken in een biocontainermilieu en kan gebruikt worden als alternatief voor de handmatige druppelmethode. Het gebruik van capsules vergemakkelijkt afwijkingen van het monster manipulatie en levert goede TEM beelden van goede kwaliteit. De afbeeldingen die geproduceerd worden met behulp van de capsule methode zijn vergelijkbaar met beelden geproduceerd met behulp van de handmatige druppel methode. Korte virusinactivatie met osmiumtetroxide verbetert de snelheid, maar moet alleen worden gebruikt als de verminderde beeldkwaliteit aanvaardbaar is of verdacht wordt dat het verdund het virus onder de TEM detectiegrens voor de procedure zal zetten. Zowel UA als PTA verschaffen vergelijkbare resultaten met de in dit onderzoek gebruikte vaste virusmonsters. hoWever, resultaten kunnen verschillend zijn wanneer onbeschadigde virussen worden gebrand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Meningen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen die in het artikel worden genoemd, zijn die van de auteurs en worden niet per se onderschreven door het Amerikaanse leger of het ministerie van defensie.
Acknowledgments
Dr. John Carra en Rowena Schokman willen ons danken en bedanken voor het leveren van gezuiverde Ebola nano-VLP's, Dr. Rajini Mudhasani voor het leveren van Chikungunya-virus en Dr Charles (Jason) Shoemaker voor het leveren van Murine Leukemia VLP's die Ebolavirus glycoproteïnen uitdrukken. Wij danken ook MAJ Carl Soffler voor het faciliteren van het Summer Internship Program (SIP) en het Science and Engineering Apprenticeship Program (SEAP) en Dr. Catherine Wilhelmsen voor de lab safety training.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formvar/carbon coated TEM grids | SPI | 3420C-MB | 200 mesh Cu Pk/100 |
| mPrep/g capsules | EMS | 85010-01 | box |
| mPrep/f couplers | EMS | 85010-11 | standard 16/Pk |
| glutaraldehdyde | EMS | 16320 | 50% solution, EM grade |
| Osmium Tetroxide | EMS | 19190 | 4% aqueous solution |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | powder |
| Potassium phosphotungstic acid | EMS | 19500 | powder |
| filter paper | Whatman | 1450-090 | size 50 |
| Tranmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1011 | TEM |
References
- Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
- Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
- Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37 (2), 91-106 (2006).
- Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).
- Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L.
- Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
- Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
- Bradley, D. E.
- Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).
- Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, Suppl 3. 721 (2015).
- Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).
- Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, Suppl 2. 174-175 (2011).
- Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
- Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).
- Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228 (2015).
- Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. , 403419 (2011).
- Barland,, Rojkind, M. Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).
