Summary
Arrangøren uttrykk analyser er avgjørende for å bedre forståelsen av genet regulering og spatiotemporal uttrykk for målet gener. Her presenterer vi en protokoll for å identifisere, isolere og klone en plante promoter. Videre beskriver vi karakterisering av nodule-spesifikke arrangøren i vanlige bønne hårete røttene.
Abstract
Oppstrøms sekvenser av genet koding sekvenser er betegnet som formidler sekvenser. Studere uttrykk mønstre av arrangørene er svært viktig i å forstå gen regulering og spatiotemporal uttrykk mønstre av målet gener. På den annen side, er det også viktig å etablere promoter evaluering av verktøy og genetisk transformasjon teknikker som er rask, effektiv og reproduserbar. I denne studien undersøkte vi spatiotemporal uttrykksmønster av rhizobial symbiose-spesifikke nodule begynnelse (NIN) arrangøren av Phaseolus vulgaris i transgene hårete røttene. Bruk anlegget genomet databaser og analyseverktøy vi identifisert, isolert og klonet P. vulgaris NIN selskapet i en transcriptional fusion til chimeric reporteren β-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Videre, denne protokollen beskriver en rask og allsidig system av genetisk transformasjon i P. vulgaris bruker Agrobacterium rhizogenes indusert hårete røtter. Dette systemet genererer ≥2 cm hårete røtter på 10 til 12 dager etter transformasjon. Neste, vi vurdert spatiotemporal uttrykket NIN formidler i Rhizobium inokulert hårete røtter ved periodiske intervaller av etter vaksinering. Våre resultater avbildet av GUS aktivitet viser at NIN arrangøren var aktiv under prosessen med nodulation. Sammen, demonstrerer nåværende protokollen hvordan å identifisere, isolere, Klon og karakterisere en plante promoter i vanlige bønne hårete røttene. Videre er denne protokollen enkel å bruke i ikke-spesialiserte laboratorier.
Introduction
Arrangører er viktig molekylære biologiske verktøy som spiller en avgjørende rolle i å forstå regulering av uttrykket av gener av interesse. Arrangører er DNA-sekvenser ligger oppstrøms av oversettelsen innvielsen codon av genet sekvenser og de sentrale juridisk informasjon av gener; Derfor er deres riktig merknader og karakterisering avgjørende for å forstå gen funksjon. Avhengig av uttrykket mønstre, er plante arrangører klassifisert som konstituerende, vev-spesifikk, eller utvikling-scene-spesifikk og induserbart1. Fremskritt innen transcriptomic teknologier, forbedringer i datamodellering og tilgjengeligheten av økende antall genomet sekvenser for forskjellige plantearter har tilrettelagt store prediksjon av arrangøren sekvenser2.
På den annen side, er det også viktig å etablere promoter evaluering av verktøy og genetisk transformasjon teknikker som er rask, effektiv og reproduserbar. I motsetning til de andre modellen plantene, er funksjonelle karakterisering av felles bønne Belgfrukt (P. vulgaris) gener forhindret hovedsakelig på grunn av gjenstridige natur Phaseolus sp. for stabil genetisk transformasjon. Forbigående transformasjon systemer tjene som et alternativ for rask genet funksjonell karakteristikk studier3. I Belgfrukt symbiose forskning er samspillet mellom Belgfrukt verten anlegget og rhizobial bakterie en av de mest tett modell systemene for funksjonell analyse av nodule-spesifikke gener og promoter studier. Så langt, flere Belgfrukt arrangører knyttet til disse symbioses har vært preget, nemlig, Medicago truncatula PT44, SWEET115, Lotus japonicus Cyclops, UBQ6, VAG17, glysin max PT5 8, Exo70J9, P. vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, TOR15, osv. CIS elementer direkte påvirke genet regulering. Den transkripsjon faktoren ENBP1A binder til en Cis regulatoriske region (−692 bp) av tidlig nodulin VfENOD12, og dette forenkler uttrykket med et reporter i nodule primordia vikker faba16. Utskifting av Cis regulatoriske regioner (−161 til −48 bp) til nodule-spesifikke promoter leghemoglobin GLB3 med de heterologous avkortet arrangører ses-p35S og ses-pNOS, resulterte i tap av nodule spesifisitet og redusert promoter aktivitet17 .
Tidligere rapporter viser at transkripsjon faktoren NIN kreves for oppstart av rhizobial infeksjon i roten hårcellene og er også viktig for nodule organogenesen L. japonicus18. I studien beskriver vi en protokoll for identifikasjon, isolasjon, kloning og karakterisering av nodule-spesifikke arrangøren i vanlige bønne hårete røttene. For å oppnå dette, vi valgte en rhizobial symbiose-spesifikke NIN promoter av P. vulgaris og klonet i en transcriptional fusion til chimeric reporteren GUS-enhanced::GFP. Videre, denne protokollen beskriver en rask og allsidig system av genetisk transformasjon i P. vulgaris bruker A. rhizogenes indusert hårete røtter. Dette systemet genererer hårete røtter i mindre enn 2 uker etter transformasjon. Til slutt, vi vurdert spatiotemporal uttrykket NIN formidler i rhizobia kolonisert rot knuter av GUS flekker.
Fremgangsmåten som er beskrevet her kan være nyttig ikke bare for studier av nodulation og mycorrhization11 Belgfrukt-planter, men også for studier av arrangøren uttrykk mønstre i røtter19. Videre er denne protokollen enkel å bruke i ikke-spesialiserte laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. identifikasjon, isolasjon og kloning av P. Vulgaris NIN arrangøren
- Identifisere promoter rekkefølgen for genet av interesse. Det er flere genomet databaser og analyseverktøy tilgjengelig for planter som Phytozome, Ensembl planter, NCBI, etc. A Belgfrukt promoter P. vulgaris NIN (PvNIN; Phvul.009G115800) ble brukt i denne studien20.
- Design oligos for Gateway eller tradisjonelle begrensning enzym kloning rarpd vektor brukes (figur 1A).
Merk: Standard (25-35 bp), avsalte grunning fungerer fint. Omvendt oligo sekvenser som flanken mellom selskapet og genet er tilrådelig. - Forsterke PvNIN promoter område (eller arrangøren område av genet av interesse) fra ferske isolert P. vulgaris genomisk DNA med arrangøren-spesifikke oligo sett. Bruke en høy kvalitet utvalg med følgende PCR: 95 ° C i 5 min; 30 sykluser (95 ° C for 30 s, 55 ° C for 30 s, 72 ° C i 1 min); og 72 ° C i 5 minutter.
- Kjør forsterket fragmentet på 1% agarose gel på 60 V på et 7 x 10 cm gel brett, og elute den tilsvarende amplicon (700 bp, figur 1B) og klone til pENTR/D-TOPO vektor i henhold til produsentens instruksjoner.
- Transformere 2 µL av reaksjonen til kompetent Escherichia coli celler med produsentens instruksjoner og plate 150 µL av transformasjon blandingen på lysogeny bror (LB) med 50 mg/L kanamycin (Kan50). Vokse belagt cellene på 37 ° C over natten.
- Velg 3-6 kolonier og kultur dem over natten i LB medium som inneholder Kan50. Isolere plasmider DNA ved hjelp av metoden valgfrihet og analysere plasmider av PCR bruker vektor bestemt M13 oligos. For PCR, bruk 100 ng av plasmider, 0 3 pm av oligos, 10 X PCR buffer, 0,5 U Taq DNA utvalg og 10 mM dNTPs.
- Bruk følgende PCR forsterkning betingelsene; 95 ° C i 3 min; 30 sykluser (95 ° C for 30 s, 58 ° C for 30 s, 72 ° C i 75 s); og 72 ° C i 7 min. visualisere PCR produktene på en 1% agarose gel. Kontroller at riktig innsettinger har et band på 1024 bp og vektorer uten setter vil ha en 324 bp band (figur 1 c).
- Utføre LR reaksjonen en oppføring vektor (pENTR/D-TOPO-PvNIN) og destinasjon vektor pBGWFS7.021 bruker en kommersiell enzym blanding i henhold til produsentens instruksjoner.
- Transformere 2 µL av LR reaksjon i kompetent E. coli celler ved hjelp av som beskrevet i produsentens instruksjoner og plate 150 µL av transformasjon blanding på LB supplert med 100 mg/L av spectinomycin (Spe100). Vokse belagt cellene på 37 ° C over natten.
- Plukk ca 5 kolonier og kultur dem over natten i LB medium som inneholder Spe100. Isolere plasmider DNA ved hjelp av en metode for valg og analysere plasmider av PCR bruker arrangøren-spesifikke oligos.
- Bruk PCR betingelsene i trinn 1.3. Visualisere PCR produktene på en 1% agarose gel å bekrefte forsterkning. Amplicons er 700 bp.
- Sekvens av positiv plasmider pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (figur 1 d) med arrangøren-spesifikke oligos å verifisere ektheten av sette.
- Forvandle plasmider A. rhizogenes belastning K599 (men noen andre stammer av A. rhizogenes kan brukes). Legge til 2 µL plasmider prep 50 µL av electrocompetent celler og electroporate i 1 mm søppel med følgende innstillinger: 1,8 kV, 25 µF og 200 Ω.
- Gjenopprette celler i ~ 500 µL av SOC medium og riste på 28 ° C i 2 h. Plate LB-Spe100 og vokse på 28 ° C i 2 dager.
- Utføre kolonien screening som nevnt i trinn 1,7 og bruker PCR betingelsene som i trinn 1.3. Gjør glyserol aksjer fra positiv kloner og lagre dem i-80 ° C.
- Bruk A. rhizogenes kultur skjuler tom pBGWFS7.0 vektor som kontrollen negative.
2. A. Rhizogenes forvandlet hårete røtter av felles Bean
- Sterilisere bønne (P. vulgaris cv. Negro Jamapa) frø (ca 20) i 50 mL av 96% etanol for 1 min og kast av etanol; deretter legge til 50 mL av 20% blekemiddel (natriumhypokloritt) for 10 min, med konstant blande i laminær strømning hette. Fjerne blekemiddel og vask i overflødig sterilt vann 3 ganger.
Merk: Andre P. vulgaris kultivarer kan brukes til hårete rot induksjon. - Spire sterilisert frø på sterilt filter papir fuktet Broughton & Dilworth (B & D) løsning22 (tabell 1) for 2 dager i mørket på 28 ° C.
- Dagen før transformasjon klargjør følgende:
- Strek ut 150 µL av A. rhizogenes kultur skjuler binære vektoren (forberedt i trinn 1.13 og 1.14) på solid LB Spe100 og vokse på 28 ° C over natten.
- Fylle en 15 mL tube med B & løsning og erstatt skrukork med dobbel lagdelt aluminiumsfolie. Samle dette til 22 cm røret som inneholder 10 mL av B & løsning (figur 2C) og autoklav det.
- På dagen for transformasjon, montere følgende sterile materialet i laminær strømning hette: spirer frøene fra trinn 2.2, kultur plate fra trinn 2.3.1, rør fra trinn 2.3.2, sterile dobbel destillert vann (10 mL), Pipetter og pipette-spisser, sterile tang, og 3 mL sprøyter.
- Bruk et bøyd 200 µL tips å skrape A. rhizogenes celler fra platen inn i et microcentrifuge rør og resuspend i 1 mL av det doble sterilt vannet. Tilsvarende forberede vektor kontroll celler separat.
- Bland cellene forsiktig å resuspend. Gjør ikke vortex.
- Lage en 3 mm hull på aluminiumsfolie av rørene fra trinn 2.3.2 bruker et sterilt pipette tips.
- Samle cellene (arrangøren eller vektor kontroll) fra trinn 2.5 med sprøyten og litt stikk hypocotyls av spirer frøene med pinne-spissen (figur 2 g).
Merk: Kontroller at nålen trenger (4 - 6 ganger) vascular vevet og injisere liten (~ 5 µL) dråper cellene i såret forskjellige posisjoner rundt på hypocotyl. - Nøye inn i røttene av den injiserte seedlings 3 mm hullet av 15 mL tube med B & løsning. Tilbake hele oppsettet i det 22 mL BILLEDRØR og forsegle dem for å opprettholde fuktighet.
- Inkuber rør i en vekst kammer opprettholdt på 28 ° C med 16 h lys: 8 h mørke fotoperiode.
Merknader: 3-4 dager etter inkubasjon planter-vokse opp til kanten av 22 mL glass-rør.
Merk: Det er viktig å opprettholde B & løsning stadig i både plast og glass rør.
3. Promotøren analyse: NIN Promoter uttrykk i Rhizobial knuter av felles Bean
- For induksjon av rot knuter, vaksinere Rhizobium tropici eller Rhizobium etli (som er kompatibel med vanlige bean) i 100 mL PY medium (0,5 g pepton, 0,3 g gjærekstrakt) med 700 mM CaCl2 og 20 mg mL−1 Nalidixic acid. Ruge på 30 ° C i 24 timer med skjelvende på 300 rpm.
Merk: Noen spesifikk antibiotika kan brukes ved transgene Rhizobium. - Pellets cellene i en centrifuge for 3 min 2800 x g ved romtemperatur og resuspend i 10 mL 10 mm MgSO4. Justere OD celleområdet til 0,6 på OD600 ved fortynning med 10 mM MgSO4.
- Vaksinere 1-2 mL kultur (forberedt fra trinn 3.2) per plante (både arrangøren og vektor kontroll) å indusere nodule vekst på hårete røttene. Vanne plantene med B & løsning med begrenset nitrogen (2 mM KNO3) å fremme nodulation.
- Den eksperimentelle trenger, samle hårete røttene på ulike tidspunkt. Samle eksempler for å studere infeksjon tråder mellom 3-5 dager legge inoculation (PPT).
Merk: Primordial nodule og unge knuter kan studeres på 6-9 dpi og 10-12 dager dpi, henholdsvis. Til slutt, modne og funksjonelle knuter kan studeres i 14-21 dpi, og senesced knuter på > 28 dpi. - Behandle rot/nodules for aktiviteten av reporteren gener (GUS eller GFP). Analyser GUS aktivitet i henhold til protokollen beskrevet ved Jefferson23. Observere GFP under fluorescens mikroskop. Opphisse GFP fluorescens med en blå argon ion laser (488 nm), og samle den slippes ut fluorescensen fra perioden 510 til 540 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med denne studien var å vurdere spatiotemporal uttrykk mønsteret av nodule-spesifikke P. vulgaris NIN. Gjør en 700 bp region oppstrøms av oversettelse innvielsen codon av NIN genet ble valgt og et sett med oligos var utformet som avbildet i figur 1A. Bruker en Hi-Fi-utvalg, NIN promoter fragmentet ble forsterket isolert (figur 1B) og klonet i destinasjon binære vektor pBGWFS7.0 (figur 1 c) gjennom en Gateway tilnærming til å generere en transcriptional blanding til den chimeric reporter GUS forbedret GFP (pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP). PBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP vektor Konstruer vanligvis genererer hundrevis av uavhengige kloner. Kolonien screening av PCR med gene-spesifikke oligos identifiserer enkelt de riktige Klonene (figur 2D). PCR positiv plasmider var Sanger sekvensielt med arrangøren-spesifikke oligos for å bekrefte ektheten av innsatsen.
Opprettholde høy luftfuktighet hele eksperimentet er nødvendig for induksjon av callus og hårete røtter. På stedet av såret, calli er vanligvis observert på 5 til 7 dager (figur 2J) og ≥ 2 cm hårete røtter er observert på 10 til 12 dager etter transformasjon. Flertallet av A. rhizogenes forvandlet planter er å produsere hårete røtter av 2 uker (figur 2 K). Imidlertid kan antall og varighet av hårete røtter være variabel. Derfor Velg mest kraftig voksende røttene for analyse og ytterligere eksperimenter. Avgiftsdirektoratet primære roten ved å kutte stammen 2 cm nedenfor hårete røttene og transplantere dem i potter som inneholder sterilt vermikulitt (figur 2 L) eller i et system hydroponics.
For å studere spatiotemporal uttrykk for nodule-spesifikke NIN arrangøren, hårete røtter ble inokulert med R. tropici, og GUS aktivitet ble observert ved periodiske intervaller etter vaksinering den eksperimentelle trenger. Kontaminert med R. tropici indusert en sterk GUS uttrykk i transgene røttene, som angir at rhizobia induserer NIN uttrykk i vanlig bean (figur 3A). Videre, prøvetaking med 6-9 PPT viste GUS uttrykk i Rhizobium infisert roten håret celler (figur 3B). Phaseolus nodule primordium og unge og eldre knuter også demonstrert NIN uttrykk (Figur 3 c). På alle stadier av nodulation sett ingen slike GUS uttrykk i vektor kontroll røttene (figur 3D, 3E, 3F).
Figur 1 : Oversikt over P. vulgaris NIN gene struktur og kloning. (A) A skjematisk fremstilling av NIN genet strukturen viser 5' UTR (grønn), 4 exons, 3 introns og 3' UTR (rød) på Kromosom nummer 9 av P. vulgaris. Overordnet for NIN oversettelse innvielsen codon ATG, viser et promoter område på hvilke oligos ble laget. FO, frem oligo; RO, omvendt oligo; ATG, start codon; TAA, stopp codon. (B) PvNIN promoter regionen ble forsterket fra ferske isolerte P. vulgaris genomisk DNA med arrangøren-spesifikke oligo sett. M, 1 Kb stigen; 1, PCR reaksjon med gDNA viser amplicon størrelsen på 700 bp; 2, PCR reaksjon uten gDNA (-ve kontroll). (C) Screening av pENTR/D-TOPO-PvNIN Plasmidene PCR bruker vektor bestemt M13 oligos. Riktig innsettinger har et bånd 1024 bp (lane 3-6) og vektorer uten setter inn har et 324 bp band (lane 1 - 2). (D) Promoter uttrykk binære vektorkart brukes i studien, pBGWFS7.0 vektor viser PvNIN selskapet i fusion GUS og GFP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: A. rhizogenes forvandlet hårete røtter av felles bønne. (A) den sterilisert frø P. vulgaris cv. Negro Jamapa Anskuelser på sterilt filter papir. (B) frø, pels fjernet. (C) Tube oppsett for hårete rot induksjon. (D) skrape ut A. rhizogenes kultur (pNIN & kontroll). (E) A. rhizogenes kultur resuspended i sterilt destillert vann. (F, G) Injisere bakterieceller i hypocotyles. (H) Tube oppsett av Phaseolus injisert med bakterielle celler. (Jeg, J) Calli dannet på såret området 5-7 PPT. (K) hårete røtter 15 dpi (L) excising trykk røttene 2 cm nedenfor stedet for hårete rot induksjon. (M) sammensatt planter transplantert inn i sterilt vermikulitt inokulert med R. tropici. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Promoter analyse av P. vulgaris NIN i transgene P. vulgaris røtter. Romlige og tidsmessige mønster av NIN uttrykk avslørt av en promoterNIN::GUS-GFP konstruksjon i transgene hårete røtter utviklet med GUS som et substrat. Optisk mikroskop bilder av PvNIN: GUS: (A) røtter inokulert med R. tropici, (B) GUS uttrykk i krøllet hår roten, og (C) unge knuter. Bilder av kontroll (tom vektor) viser ingen slike GUS uttrykk i (D) røtter inokulert med R. tropici, krøllet (E) hår roten, og (F) unge knuter. RH, rot hår. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under funksjonell analyse av gener spiller studiet av genet uttrykk mønstre en avgjørende rolle i å forstå romlige og tidsmessige regulering av gener i vivo. En velkjent metode å studere genet uttrykk mønstre er klone regionen genet arrangøren av interesse, oppstrøms til reporter gener som fluorescerende markør gener (GFP, RFP, etc.) eller β-glucuronidase. Her har vi valgt en promoter region av rot nodule symbiose (RNS) bestemte genet, NIN, å studere spatio-temporale uttrykk mønstre i P. vulgaris under RNS. Valgte promoter sekvensen er blitt klonet oppstrøms til GFP::GUS journalister med metoden Gateway til en promoter uttrykk vektor.
Vi har beskrevet uttrykk for den symbiose bestemte utbyggeren i hårete rot systemet av P. vulgaris. Hårete rotsystem har vært mye brukt for funksjonell karakteristikk av gener, inkludert RNAi mediert genet slå ned, ektopisk konstituerende uttrykket av gener, formidler uttrykk og protein lokalisering i gjenstridige avlinger. De viktigste fordelene med systemet er at det er lett, reproduserbare, pålitelig, og samtidig ikke arbeids intense. Hårete rotsystem har blitt vellykket adoptert i andre beskjære belgfrukter som G. maks24, M. truncatula25, L. japonicus26,27, tomat28, etc., med endringer. Videre verktøyet kan bli vedtatt i andre Belgfrukt og ikke Belgfrukt arter når optimaliseres for det passende A. rhizogenes press, vaksinering og vekst forhold.
Det er mange kritiske parametere. Mens du velger selskapet regionen, burde bekymre være tatt å designe oligos som ville forsterke nødvendig promoter elementene, begynner fra oppstrøms regionen oversettelse start sitein protein koding gener; Promotoren analyse bør utføres med tilgjengelig programvare for å samle informasjon om transkripsjonsfaktorer binding til regulatoriske regionen. Ta vare på stund inducing hårete røtter: injisere seedlings på det aktuelle stadiet; under injeksjon, sikre at nålen ikke går gjennom hypocotyle; og opprettholde høy fuktige værforhold. Videre mens han studerte promoter uttrykket profiler i hårete røtter, hårete røttene produsert av A. rhizogenes er ikke alltid transformert, og derfor er det viktig å bekrefte transformert natur røttene bruker GFP eller GUS journalister før utfører promoter uttrykk studier. Egnet stammer av Rhizobium bør velges og konsentrasjonen av Rhizobium bør justeres som angitt i protokollen. Prøvetaking på hensiktsmessige stadier er innlegget vaksinering avgjørende for å dokumentere spatio-temporale uttrykket formidler på ulike stadier av RNS.
A. rhizogenes forvandlet er hårete rot en av de raskeste og effektiv alternative metodene for å generere sammensatt planter i P. vulgaris. Disse sammensatt planter kan ikke produsere transgene frø, men kan produsere transgene røtter innen få dager. I denne protokollen, i motsetning til de andre metoder29, opprettholde lukket rør konstant høy luftfuktighet å fremme hårete røtter raskere med 10 dager PPT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av Dirección generelt de Asuntos del personlige Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (gi nei. IN219916 M.L og IA205117 til M-K. A) og Consejo Nacional de Ciencia y Tecnològia (CONACYT grant nr. 240614 til M.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
References
- Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements. Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).
- Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement. Genetics Research International. , 684321 (2015).
- Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis. BMC Biotechnol. 16 (1), 53 (2016).
- Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).
- Kryvoruchko, I. S., et al. MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula. Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).
- Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response. Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).
- Suzaki, T., et al. Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus. Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).
- Qin, L., et al. The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean. Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).
- Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean. Sci Rep. 6, 32090 (2016).
- Montiel, J., et al. A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia. Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).
- Arthikala, M. K., et al. PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris. Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).
- Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization. New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).
- Barraza, A., et al. Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean. New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).
- Estrada-Navarrete, G., et al. An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi. Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).
- Nanjareddy, K., et al. A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development. Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).
- Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules. Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).
- Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5'-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants. Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).
- Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus. Nat Commun. 12, 1-10 (2010).
- Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development. Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).
- Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism. PLoS ONE. 12 (8), e0182328 (2017).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J.
- Jefferson, R. A. Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).
- Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode. Planta. 210 (2), 195-204 (2000).
- Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays. J. Vis. Exp. (49), e2633 (2011).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules. Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).
- Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. Hairy Root Transformation in Lotus japonicus. Bio-protocol. 3 (12), e795 (2013).
- Jacobs, T. B., Martin, G. B. High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots. J. Vis. Exp. (110), e53843 (2016).
- Estrada-Navarrete, G., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics. Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).
