Summary
Organizatörü ifade analizleri gen düzenlemesi anlayış ve hedef genlerin kronolojik zamanmekansal ifade geliştirmek için büyük önem taşımaktadır. Burada biz tanımlamak, ayırma ve bir bitki organizatörü klon için bir protokol mevcut. Ayrıca, ortak fasulye kıllı kökleri nodül özgü organizatörü karakterizasyonu açıklar.
Abstract
Gen dizileri kodlama ters yönde dizisi organizatörü sırası olarak denir. Organizatör ifade şekillerinin eğitim gen düzenlemesi ve kronolojik zamanmekansal ifade desenleri hedef genlerin anlamakta çok önemli. Öte yandan, organizatörü değerlendirme araçları ve hızlı, verimli ve tekrarlanabilir genetik dönüşüm teknikleri kurmak için önemlidir. Bu çalışmada, biz Phaseolus vulgaris rhizobial sembiyoz özgü nodül kuruluşundan (NIN) organizatörü transgenik kıllı kökleri kronolojik zamanmekansal ifade desenini araştırdık. Bitki genom veritabanları ve biz tespit, analiz araçları kullanmak izole ve P. vulgaris NIN organizatörü chimeric gazeteciye transkripsiyon bir füzyon klonlanmış β-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Ayrıca, bu iletişim kuralı bir hızlı ve çok yönlü sistem indüklenen Agrobacterium rhizogenes kıllı kökleri kullanarak P. vulgaris genetik dönüşümünün açıklar. Bu sistem, 10-12 gün sonra dönüştürme ≥2 cm kıllı kökleri oluşturur. Daha sonra aşı Rhizobium kıllı kökleri sonrası aşılama belirli aralıklarla NIN organizatörü kronolojik zamanmekansal ifade değerlendirildi. GUS etkinliği tarafından tasvir bizim sonuçlar NIN organizatörü nodulation işlemi sırasında etkin gösterir. Birlikte, mevcut iletişim kuralı tanımlamak, ayırma, klon ve ortak fasulye kıllı kökleri bir bitki organizatörü karakterize gösterilmiştir. Ayrıca, bu iletişim kuralı olmayan uzman laboratuvarlarda kullanımı kolay.
Introduction
Organizatör ilgi genlerin ifade Yönetmeliği anlamada önemli bir rol oynamak önemli moleküler biyolojik araçlardır. Organizatör akıntıya karşı bulunan DNA dizileri vardır çeviri başlama kodonu gen dizileri ve gen; Merkezi düzenleyici bilgi taşırlar Bu nedenle, onların doğru ek açıklama ve karakterizasyonu gen işlevini anlamak için çok önemlidir. İfade desenleri bağlı olarak bitki rehberleri bünye, doku özgü veya geliştirme aşamasında özel ve indüklenebilir1sınıflandırılır. Transcriptomic teknolojileri, Bilgisayar modellemesi gelişmeler ve artan sayıda genom dizileri farklı bitki türü için kullanılabilirlik gelişmeler organizatörü dizileri2büyük ölçekli tahmin kolaylaştırdı.
Öte yandan, organizatörü değerlendirme araçları ve hızlı, verimli ve tekrarlanabilir genetik dönüşüm teknikleri kurmak için önemlidir. Diğer model bitkilerin esas Phaseolus sp. istikrarlı genetik dönüşümü için inatçı doğası gereği ortak fasulye baklagil (P. vulgaris) gen işlevsel karakterizasyonu engellemiştir. Geçici dönüşüm sistemleri hızlı gen işlevsel karakterizasyon çalışmaları3için bir alternatif olarak hizmet vermektedir. Baklagil sembiyoz araştırmada, baklagil ana bitki ve rhizobial bakteri arasındaki etkileşimi nodül özel genler ve organizatörü çalışmaların fonksiyonel analiz için en uysal modeli sistemlerinden biridir. Şimdiye kadar bu symbioses ilgili birkaç baklagil rehberleri-si olmak be karakterize, sırasıyla, Medicago truncatula PT4'ü4, SWEET115, Lotus japonicus Tepegöz, UBQ6, VAG17, Glycine max PT5 8, Exo70J9, P. vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, TOR15, vs. CIS öğeleri doğrudan gen düzenlemesi etkiler. Transkripsiyon faktörü ENBP1A bir CIS düzenleyici bölgenin erken nodulin VfENOD12 için (−692 bp) bağlar ve bu nodül primordia Vicia faba16bir muhabir gen ifadesinin kolaylaştırır. CIS düzenleyici bölgeleri değiştirme (−161 −48 bp için) nodül özgü düzenleyicinin leghemoglobin GLB3 kapaklı ile kesilmiş rehberleri δ-p35S ve δ-pNOS, nodül özgüllük kaybına neden ve organizatörü faaliyet17 azaltılmış .
Önceki raporlar NIN kök saç hücreleri rhizobial enfeksiyonu başlatılması için gerekli olduğunu ve aynı zamanda nodül organogenesis L. japonicus18için gerekli transkripsiyon faktörü gösterin. Bu da çalışmanın, bir protokol tanıma, yalıtım, klonlama ve nodül özgü organizatörü ortak fasulye kıllı kökleri karakterizasyonu açıklar. Bunu başarmak için biz P. vulgaris rhizobial bir sembiyoz özgü NIN organizatörü seçili ve transkripsiyon bir füzyon chimeric gazeteciye GUS enhanced::GFP klonlanmış. Ayrıca, bu iletişim kuralı bir hızlı ve çok yönlü sistem indüklenen A. rhizogenes kıllı kökleri kullanarak P. vulgaris genetik dönüşümünün açıklar. Bu sistem dönüştürme sonra 2 haftadan az kıllı kökleri oluşturur. Son olarak, boyama GUS tarafından kolonize rhizobia kök nodüller NIN organizatörü kronolojik zamanmekansal ifade değerlendirilir.
Burada açıklanan yordamı sadece nodulation ve mycorrhization11 baklagil bitkilerin incelenmesi, ancak aynı zamanda organizatörü ifade desenleri kökleri19çalışma için yararlı olabilir. Ayrıca, bu iletişim kuralı olmayan uzman laboratuvarlarda kullanımı kolay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kimlik, yalıtım ve P. Vulgaris NIN organizatörü klonlama
- Gen ilgi için organizatörü sırasını tanımlayın. Orada birkaç genom veritabanları ve analiz araçları için bitkiler gibi Phytozome, Ensembl bitkiler, NCBI, vb A baklagil organizatörü P. vulgaris NIN (PvNIN; Phvul.009G115800) bu çalışma20dakika içinde kullanıldı.
- Tasarım oligos için ağ geçidi veya geleneksel restriksiyon enzimi vektör sistemine bağlı olarak klonlama (şekil 1A) kullanılır.
Not: Standart (25-35 bp), desalted astar iş para cezası. Organizatörü ve gen arasında sarmayı ters oligo dizileri tavsiye vardır. - PvNIN organizatörü bölge (veya gen ilgi organizatörü bölge) taze izole P. vulgaris yükseltmek genomik DNA organizatörü özgü oligo seti kullanarak. Yüksek sadakat polimeraz ile aşağıdaki PCR koşullar kullanın: 95 ° C 5 dakika; 30 döngüsü (95 ° C 30 s, 30 55 ° C s, 1 dk 72 ° C); ve 5 min için 72 ° C.
- % 1'özel jel 60 V 7 x 10 cm jel tepside güçlendirilmiş parçası çalıştırın ve karşılık gelen amplicon elute (700 bp, şekil 1B) ve üreticinin yönergelerine göre pENTR/D-TOPO vektör içine klon.
- Tepki yetkili Escherichia coli içine 2 µL dönüştürmek lysogeny kardeşim (LB) 50 mg/L sefaloridin (Kan50) ile desteklenmiş üreticinin yönergeleri ve plaka 150 µL dönüştürme karışımı kullanarak hücreleri. 37 ° C'de kaplama hücreleri gecede büyümek.
- 3-6 kolonileri ve onları Kan50 içeren LB ortamda gecede kültür seçin. Plazmid DNA seçtiğiniz yöntemi kullanarak yalıtmak ve plazmid tarafından PCR vektör belirli M13 oligos kullanarak çözümleyebilirsiniz. PCR, plazmid, 0 pm 3, oligos, kullanım 100 ng için 10 PCR arabellek, 0.5 U Taq DNA polimeraz ve 10 mM dNTPs X.
- Aşağıdaki PCR güçlendirme koşullar kullanın; 3 min için 95 ° C; 30 döngüsü (95 ° C 30 s, 30 58 ° C s, 75 72 ° C s); ve 7 dk. 72 ° C % 1'özel jel PCR ürünlerde görselleştirin. Doğru eklemeleri 1.024 bp ve vektörler ekler olmadan bir 324 bp grup (şekil 1 c) sahip bir band olduğundan emin olun.
- LR tepki bir giriş vektör (pENTR/D-TOPO-PvNIN) ve üreticinin yönergelerine göre ticari enzim karışımı kullanarak hedef vektör pBGWFS7.021 arasında gerçekleştirin.
- LR tepki yetkili E. coli içine 2 µL dönüşümü üreticinin yönergeleri ve plaka 150 µL dönüştürme karışımı 100 mg/L Spektinomisin (Spe100) ile desteklenmiş LB açıklandığı gibi standart yöntemlerle hücreleri. 37 ° C'de kaplama hücreleri gecede büyümek.
- Yaklaşık 5 kolonileri alın ve onları bir gecede Spe100 içeren LB ortamda kültür. Plazmid DNA seçtiğiniz yöntemi kullanarak yalıtmak ve plazmid tarafından PCR organizatörü özgü oligos kullanarak çözümleyebilirsiniz.
- PCR koşulları adım 1.3 kullanın. Amplifikasyon onaylamak için % 1'özel jel PCR ürünlerde görselleştirin. Amplicons olan 700 bp.
- Pozitif plazmid pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (şekil 1 d) ekleme orijinalliğini doğrulamak için organizatörü özgü oligos ile sıra.
- Plazmid ( A. rhizogenes diğer suşların ancak, kullanılabilir) A. rhizogenes süzün K599 dönüşümü. Aşağıdaki ayarlarla electrocompetent hücreleri ve electroporate 1 mm küvet içinde 50 µL plazmid hazırlık 2 µL ekleyin: 1.8 kV, 25 µF ve 200 Ω.
- Hücreleri kurtarmak ~ 500 µL SOC orta ve 28 ° c için 2 h. LB-Spe100 tabağa sallamak ve 28 ° C de 2 gün büyümek.
- 1.7. adımda belirtildiği gibi koloni tarama gerçekleştirmek ve PCR koşulları adım 1.3 olduğu gibi kullanın. Gliserol hisse senetleri olumlu klonları yapamaz ve stok onları içinde-80 ° C.
- A. rhizogenes kültür negatif kontrol olarak boş pBGWFS7.0 vektör yataklık kullanın.
2. A. Rhizogenes kıllı kökleri ortak Bean dönüştürdü
- Fasulye (P. vulgaris cv. zenci Jamapa) tohumları (yaklaşık 20) 50 ml % 96 etanol 1 dk. için sterilize ve etanol atın; daha sonra sabit bir laminar akış mahallede karıştırma ile 10 dakika, 50 mL % 20 çamaşır suyu (sodyum hipoklorit) ekleyin. Çamaşır suyu kaldırmak ve 3 kat fazla steril suda yıkayın.
Not: Diğer P. vulgaris çeşitlerin kıllı kök indüksiyon için kullanılabilir. - Steril filtre kağıtları Broughton ile nemlendirilmiş sterilize tohumlar çimlenme & Dilworth (B & D) çözüm22 (Tablo 1) içinde belgili tanımlık karanlık 28 ° C'de 2 gün
- Dönüşüm önceki gün birini hazırlayın:
- A. rhizogenes kültür (1.13 ve 1.14 adımlarda hazır) ikili vektör yataklık 150 µL dışarı katı LB Spe100 üzerinde çizgi ve 28 ° C'de gecede büyümek.
- 15 mL tüp B ile doldurmak & D çözüm ve Değiştir çift katmanlı alüminyum folyo ile vidalı kapak. B 10 mL içeren bir 22 cm cam tüp monte & D çözüm (şekil 2C) ve basınçlı kap onu.
- Dönüşüm günü, laminar akış hood aşağıdaki steril malzemeler montajı: germinated tohum kimden adım 2.2, adım 2.3.1, adım 2.3.2 tüpler, steril Çift Kişilik distile su (10 mL), Pipetler ve pipet ipuçları, steril forseps, kültür plaka ve 3 mL şırınga.
- Bükülmüş bir 200 µL ipucu plaka A. rhizogenes hücrelerden microcentrifuge tüpüne scrape ve 1 mL çiftli steril su resuspend için kullanın. Benzer şekilde, ayrı ayrı vektör kontrol hücreleri hazırlayın.
- Yavaşça resuspend hücrelere karıştırın. Değil girdap yapmak.
- Tüpler alüminyum folyo adım steril pipet ucu kullanarak 2.3.2 üzerinde 3 mm delik açın.
- Adım 2.5 şırınga hücreleri (organizatörü ya da vektör kontrolü) toplamak ve biraz hypocotyls iğne ucu (Şekil 2 g) ile germinated tohum dikmek.
Not: iğne nüfuz eder (4 - 6 kat) damar dokusu emin olun ve küçük enjekte (~ 5 µL) hücre hypocotyl etrafında farklı pozisyonlarda yaranın üzerine düşer. - Dikkatle sokmak enjekte fidan köklerinin B içeren 15 mL tüp 3 mm delik & D çözüm. Tüm kurulum 22 mL cam tüpler dönmek ve onları nem korumak için mühür.
- 16 h ışık: 8 ile 28 ° C'de tutulan bir büyüme odası tüplerde kuluçkaya s karanlık photoperiod.
Notlar: 3-4 gün sonra kuluçka, 22 mL cam tüpler azına kadar bitkiler büyümek.
Not: B sağlamak önemlidir & D sürekli plastik ve cam tüpler çözümde.
3. organizatörü analizi: NIN organizatörü ifade ortak Bean Rhizobial nodüller
- Kök nodüller indüksiyon için aşılamak Rhizobium tropici veya (ortak fasulye uyumlu olan) Dana eti tas Rhizobium 700 mM CaCl2 ve 20 mg mL– 1 ile desteklenmiş PY orta (0.5 g pepton, 0.3 g maya özü) 100 ml nalidixic asit. 24 h 30 ° C'de 300 devir / dakikada sallayarak ile kuluçkaya.
Not: Belirli herhangi bir antibiyotik transgenik Rhizobiumsöz konusu olduğunda kullanılabilir. - 2.800 x g oda sıcaklığında, 3 dk santrifüj hücrelerde cips ve 10 mL 10 mM MgSO4resuspend. 0,6 OD600 hücrelere OD seyreltme 10 mM MgSO4ile ayarlayın.
- 1-2 mL (3.2 adımından hazır) kültür kıllı kökleri üzerinde nodül büyümesini teşvik için bitki (organizatörü ve vektör kontrolü) başına aşılamak. B bitkilerle sulama & nodulation tanıtmak için sınırlı azot (2 mM KNO3) ile D çözüm.
- Deneysel ihtiyaç bağlı olarak, farklı zaman noktalarda kıllı kökleri toplamak. 3-5 gün arasında enfeksiyon konu çalışmak için toplama örnekleri aşılama (dpi) sonrası.
Not: İlkel nodül ve genç nodüller 6-9 dpi ve 10-12 gün dpi, sırasıyla ele. Son olarak, olgun ve fonksiyonel nodüller, 14-21 dpi ve senesced nodüller, okudu > 28 dpi. - Kök/nodüller reporter genler (GUS veya GFP) etkinlik için işlem. GUS etkinlik Jefferson23tarafından açıklanan protokolüne göre analiz. GFP floresan mikroskop altında gözlemlemek. GFP floresan mavi argon iyon lazer ile tahrik (488 nm) ve verilmiş Floresans 510 toplamak için 540 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmanın amacı nodül özel P. vulgaris NIN kronolojik zamanmekansal ifade desenini değerlendirmek için yapıldı. Bunu yapmak için çeviri başlama kodonu NIN gen, akıntıya karşı 700 bp bölge seçildi ve birtakım oligos şekil 1A' tasvir gibi tasarlanmıştır. Yüksek sadakat polimeraz kullanarak NIN organizatörü parçası güçlendirilmiş, (şekil 1B) izole ve transkripsiyon bir füzyon oluşturmak için bir ağ geçidi yaklaşımla hedef ikili vektör pBGWFS7.0 (şekil 1 c) klonlanmış GUS gelişmiş GFP (pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP) chimeric muhabir. PBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP vektör yapı tipik olarak bağımsız klonlar yüzlerce üretir. PCR tarafından koloni tarama gene özgü oligos ile kolayca doğru klonlar (şekil 2B) tanımlar. PCR olumlu plazmid Sanger organizatörü özgü oligos ile INSERT orijinalliğini doğrulamak için sıralı yapıldı.
Deneme boyunca yüksek nem Bakımı Kallus ve kıllı kökleri indüksiyon için gereklidir. Yaralama sitede, Çallı genellikle gözlenen 5-7 gün (şekil 2J) ve ≥ 2 cm kıllı kökleri, 10-12 gün sonra dönüştürme gözlenir. A. rhizogenes çoğunluğu kıllı kökleri 2 hafta (Şekil 2 K) tarafından başarılı bir şekilde üretmek için bitkiler dönüştürdü. Ancak, numarası ve kıllı kökleri uzunluğu değişken olabilir. Bu nedenle, çözümleme ve daha fazla deneyler için en şiddetle büyüyen kökleri seçin. Birincil kök kök kıllı kökleri aşağıda 2 cm kesim tarafından tüketim ve onları hidroponik sistem veya steril vermikülit (Şekil 2 L) içeren tencere içine nakli.
Nodül özgü NIN organizatörü kronolojik zamanmekansal ifade çalışmaya, kıllı kökleri R. tropiciile aşılanmış ve GUS etkinlik, periyodik aralıklarla sonrası aşılama deneysel ihtiyaç bağlı olarak gözlendi. R. tropici ile aşı rhizobia ortak fasulye (şekil 3A) NIN ifadesinde indükler gösteren transgenik kökleri güçlü GUS ifadede indüklenen. Ayrıca, 6-9 GUS ifade Rhizobium enfekte kök saç hücreleri (3B rakam) gösterdi dpi örnekleme. Phaseolus nodül primordium ve genç ve olgun nodüller de NIN ifade (şekil 3 c) gösterdi. Nodulation her aşamasında böyle bir GUS ifade vektör kontrol kökleri (şekil 3D, 3E, 3F) görüldü.
Resim 1 : Ana hatları P. vulgaris NIN Gen yapısı ve klonlama. Gösterilen 5' UTR (yeşil) NIN gen yapısı, 4 ekzonlar, 3 intron ve 3' UTR (kırmızı) sayısına Kromozom 9 P. vulgaris(A) A şematik gösterimi. NIN çeviri başlama kodonu ATG, hangi oligos bir organizatörü bölge tasarlanmıştır gösterileri için ters yönde. FO, ileri oligo; RO, ters oligo; ATG, başlama kodonu; TAA, kodonu. (B) PvNIN organizatörü bölge üzerinden taze güçlendirilmiş organizatörü özgü oligo kümesini kullanarak P. vulgaris genomik DNA izole. M, 1 Kb merdiven; 1, PCR reaksiyon amplicon boyutu 700 gösterilen gDNA ile kan basıncı; GDNA 2, PCR reaksiyon (-ve denetim). (C) pENTR/D-TOPO-PvNIN plazmid tarafından vektör belirli M13 oligos kullanarak PCR testi ile taranması. Doğru eklemeler var 1.024 bp (lane 3-6) ve vektörel çizimler bir band ekler 324 bp müzik grubunuz mu var olmadan (lane 1 - 2). (D) organizatörü Mevcut çalışmada, pBGWFS7.0 vektör gösteren PvNIN organizatörü Fusion GUS ve GFP ile kullanılan ifade ikili vektör harita. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: A. rhizogenes kıllı kökleri ortak Bean değiştirdi. (A) steril tohumları P. vulgaris cv. zenci Jamapa steril filtre kağıdına takımıdır. (B) tohumları, kat kaldırıldı. (C) tüp kıllı kök indüksiyon için kurulum. (D) A. rhizogenes kültür kazıma (PNIN & denetim). (E) A. rhizogenes kültür içinde steril resuspended distile su. (F, G) Bakteri hücreleri hypocotyles enjekte ediliyor. (H) tüp kurulum bakteri hücreleri enjekte Phaseolus fidan ile. (Ben, J) Çallı yaralı sitesinde kurulan 5-7 dpi. Dokunun kökleri kıllı kök indüksiyon sitenin altındaki 2 cm bilincin (K) kıllı kökleri 15 dpi (L). (M) bileşik bitkiler steril vermikülit nakledilen R. tropiciile aşılanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Organizatörü analizini P. vulgaris NIN içinde transgenik P. vulgaris kökleri. GUS bir substrat olarak ile inkübe transgenik kıllı kökleri bir promoterNIN::GUS-GFP inşa tarafından ortaya NIN ifade kayma ve temporal deseni. PvNINoptik mikroskop görüntüleri: GUS:(a)kökleri aşısını R. tropici, (B) GUS ifade kıvrılmış kök tüyleri ve (C) genç nodüller ile. (D) kökleri R. tropiciile aşılanmış böyle GUS ifade gösteren görüntüler denetiminin (boş vektör), (E) kök tüyleri ve (F) genç nodüller kıvrılmış. RH, kök saç. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sırasında fonksiyonel analiz genlerin çalışma gen ifade kalıplarının genler vivo içindekayma ve temporal Yönetmeliği anlamada önemli bir rol oynar. Gen ifade desen çalışması için iyi bilinen bir yöntem gen düzenleyici bölgesi faiz, clone etmektir muhabir genlerle floresan marker gen (GFP, RFP, vb) veya β-glucuronidase gibi ters yönde. Burada, kök nodül sembiyoz (RNS) belirli bir gen, P. vulgaris spatio-temporal ifade desenleri RNS sırasında çalışmaya NIN, organizatörü bölgenin seçtiniz. Seçili organizatörü sıra akıntıya karşı bir organizatörü ifade vektör ağ geçidi yöntemini kullanarak GFP::GUS gazeteciler için klonlanmış.
Biz sembiyoz belirli promotor kıllı kök sisteminde ifade tarif var P. vulgaris. Kıllı kök sistemi yaygın genler fonksiyonel karakterizasyonu için kullanılan, dahil RNAi gen yıkmak, genlerin Ektopik kurucu ifade, organizatörü ifade ve protein yerelleştirme inatçı bitkileri aracılı. Bu kolay, tekrarlanabilir, güvenilir ve aynı zamanda yoğun emek değil sistemin başlıca avantajları şunlardır. Kıllı kök sistemi başarıyla içinde G. maksimum24, M. truncatula25, L. japonicus26,27, domates28, vb, gibi diğer ürün baklagiller ile kabul edilmiştir gerekli değişiklikleri yaparak.... Ayrıca, aracın diğer baklagil ve baklagil olmayan türler için uygun A. rhizogenes optimize zaman içinde kabul edilebilir zorlanma, aşılama ve büyüme koşulları yöntem.
Birçok önemli parametre vardır. Düzenleyici bölgesi seçerken, hangi genlerin kodlama protein çeviri başlangıç sitein ters yönde bölgesinden başlayarak gerekli organizatörü öğeleri yükseltmek oligos tasarlamak için özen gösterilmelidir; organizatörü analiz düzenleyici bölgesine bağlama transkripsiyon faktörleri üzerinde bilgi toplamak için kullanılabilir yazılım kullanarak yapılmalıdır. Kıllı kökleri inducing dikkat çekmek: Fidan enjekte uygun aşamada; enjeksiyon sırasında iğne hypocotyle geçmek değil sağlamak; ve yüksek nemli koşulları sağlamak. Ayrıca, kıllı kökleri organizatörü ifade profillerinde okuyan, süre A. rhizogenes tarafından üretilen kıllı kökleri değil her zaman dönüştürülür ve bu nedenle GFP veya GUS gazetecilere önce kullanarak kökleri dönüştürülmüş doğası onaylamak önemlidir organizatörü ifade çalışmaları gerçekleştirme. Rhizobium uygun suşların seçilmelidir ve Rhizobium konsantrasyonları iletişim kuralında belirtilen şekilde ayarlanmalıdır. Uygun aşamalarında örnekleme sonrası aşılama organizatörü spatio-temporal ifade RNS farklı aşamalarında belgelenmesi için önemlidir.
Dönüştürülmüş A. rhizogenes kıllı kök üretim kompozit bitkiler P. vulgarisiçinde oluşturmak için en hızlı ve verimli alternatif yöntemler biridir. Bu bileşik bitkiler transgenik tohumlar üretemez ama transgenik kökleri bir kaç gün içinde üretebilir. Diğer yöntemleri29, aksine bu protokolü kapalı tüpler kıllı köklerine dpi'de 10 gün daha hızlı geliştirmek için sürekli yüksek nem korumak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser kısmen Dirección General de Asuntos del tarafından desteklenen kişisel Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (Hayır verin. IN219916 M.L ve IA205117 için M-K. A) ve Consejo Nacional de Ciencia y Tecnològia (CONACYT grant No 240614 M.L. için).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
References
- Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements. Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).
- Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement. Genetics Research International. , 684321 (2015).
- Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis. BMC Biotechnol. 16 (1), 53 (2016).
- Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).
- Kryvoruchko, I. S., et al. MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula. Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).
- Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response. Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).
- Suzaki, T., et al. Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus. Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).
- Qin, L., et al. The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean. Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).
- Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean. Sci Rep. 6, 32090 (2016).
- Montiel, J., et al. A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia. Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).
- Arthikala, M. K., et al. PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris. Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).
- Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization. New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).
- Barraza, A., et al. Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean. New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).
- Estrada-Navarrete, G., et al. An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi. Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).
- Nanjareddy, K., et al. A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development. Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).
- Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules. Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).
- Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5'-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants. Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).
- Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus. Nat Commun. 12, 1-10 (2010).
- Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development. Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).
- Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism. PLoS ONE. 12 (8), e0182328 (2017).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J.
- Jefferson, R. A. Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).
- Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode. Planta. 210 (2), 195-204 (2000).
- Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays. J. Vis. Exp. (49), e2633 (2011).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules. Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).
- Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. Hairy Root Transformation in Lotus japonicus. Bio-protocol. 3 (12), e795 (2013).
- Jacobs, T. B., Martin, G. B. High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots. J. Vis. Exp. (110), e53843 (2016).
- Estrada-Navarrete, G., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics. Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).
