Summary
Uma nova geração de plataformas de transcrição-tradução livre de célula foi projetada para construir sistemas bioquímicos em vitro através da execução de circuitos de gene. Neste artigo, descrevemos como bacteriófagos, como MS2, ΦΧ174 e T7, são sintetizados a partir de seu genoma usando um Escherichia coli célula livre todos os sistema de TXTL.
Abstract
Uma nova geração de sistemas sem célula transcrição-tradução (TXTL), projetado para ter uma maior versatilidade e modularidade, fornecer novos recursos para executar ciências básicas e aplicadas em reações de tubo de ensaio. Na última década, sem célula TXTL tornou-se uma técnica poderosa para uma ampla gama de biologia relacionados quantitativa e sintético de pesquisa multidisciplinar romance áreas. As novas plataformas TXTL são particularmente úteis para construir e interrogar os sistemas bioquímicos através da execução de circuitos de gene sintético ou natural. In vitro TXTL provou conveniente rapidamente elementos reguladores do protótipo e redes biológicas, bem como para recapitular molecular auto-montagem mecanismos encontraram em sistemas vivos. Neste artigo, descrevemos como infecciosos bacteriófagos, tais como MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) e T7 (dsDNA), são sintetizados inteiramente do seu genoma em um pot-reações usando um todos Escherichia coli, célula livre sistema TXTL. Síntese dos três coliphages é quantificada utilizando o ensaio da chapa. Mostramos como o rendimento do fago sintetizado depende das configurações bioquímicas das reações. Apinhamento molecular, emulado por uma concentração controlada de PEG 8000, afeta a quantidade de fago sintetizado por ordens de magnitude. Descrevemos também como amplificar os fago e como purificar seus genomas. O conjunto de protocolos e resultados apresentados neste trabalho deve ser de seu interesse multidisciplinares pesquisadores envolvidos em Bioengenharia e biologia sem célula sintética.
Introduction
Na última década, a tecnologia de célula livre expressão foi projetada para aplicações de romance endereço em biologia relacionadas a sintética e quantitativos de investigação multidisciplinar emergente áreas. Originalmente usado para expressar proteínas independentes de um organismo vivo, novos sistemas TXTL sem célula foram desenvolvidos para ambas as ciências básicas e aplicadas1,2, ampliar consideravelmente o alcance desta tecnologia. A nova geração de plataformas TXTL foi projetada para ser amigável, mais eficiente (atingindo 2 mg/mL de síntese de proteínas em modo de lote3), a mais versátil a nível de transcrição4e modular para integram facilmente romance natural ou funções sintéticas expandir as capacidades existentes sistemas biológicos5,6. Em particular, sistemas TXTL sem célula tornaram-se útil para a prototipagem rápida de programas genéticos, tais como elementos reguladores ou pequenos circuitos genéticos7,8,9, reduzindo o projeto-compilação-teste a alguns dias do ciclo. Notavelmente, os novos sistemas TXTL também são capazes de processar grandes programas de DNA como a síntese completa de coliphages10,11, demonstrando forte suficiente performances para apoiar a reconstituição da genômica ativo DNA codificado entidades vivas.
Sistemas TXTL apresentam muitas vantagens técnicas em relação ao tradicional em vitro construtivo ensaios bioquímicos. TXTL sem célula vincula o processo de expressão gênica ao produto final em um ambiente aberto e reduzido, em oposição ao complexo citoplasma de uma célula viva. TXTL usa DNA para reconstruir sistemas bioquímicos em vitro, que, com modernas técnicas de montagem de DNA, é acessível e rápido além de não exigir etapas de purificação de proteínas fastidioso. Expressão sem célula fornece acesso direto a maioria dos componentes nas reações bioquímicas, permitindo assim uma dissecação mais profunda das interações moleculares12. Em uma reação TXTL, um pode alterar as configurações de bioquímicas e biofísicas à vontade, que é quase impossível em uma célula viva. Dadas essas vantagens e melhorias recentes, a tecnologia TXTL está se tornando cada vez mais popular como uma plataforma alternativa para a biologia sintética e quantitativa. Enquanto a comunidade de pesquisa usando TXTL está crescendo rapidamente e TXTL está se tornando uma tecnologia padrão em bioengenharia, é essencial para entender como usar tais plataformas a fim de desenvolver práticas adequadas relacionadas com a execução de reações TXTL e para a interpretação dos resultados.
Neste artigo, descrevemos como usar um sistema TXTL de e. coli todos para sintetizar, em um pot-reações, bacteriófagos de seu genoma11, tais como MS2 (RNA, 3,4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5,4 kb) e T7 (dsDNA, 40 kb). Mostramos como a quantidade do fago sintetizado as alterações em relação a algumas das configurações de bioquímica das reações (concentração de magnésio e potássio). Apinhamento molecular, emulado por uma gama de PEG 8000 concentrações, tem um efeito dramático na síntese do fago sobre várias ordens de grandeza. A realização desses grandes sistemas bioquímicos em reações de único tubo de ensaio que recapitular simultaneamente os processos de transcrição, tradução e self-assembly, é interessante para abordar questões básicas relacionadas com a biologia e biofísica 10 (regulação gênica auto-montagem), bem como para desenvolvimento de aplicações, tais como a redefinição de funções do fago para construir novas nanoestruturas13. Além de um prático em TXTL, nós fornecemos métodos para amplificação do fago, extração de genoma e purificação e quantificação do fago por ensaio da chapa. Os métodos apresentados neste manuscrito são adequados para os investigadores que utilizam sistemas de célula livre extrato com base em Escherichia coli e estão interessados em bacteriófagos.
Os protocolos apresentados neste trabalho podem ser resumidos como segue: amplificação do fago 1) (1 dia: preparar inoculação células, dia 2: única placa, o crescimento do fago, múltiplas e concentração e dia 3: purificação do fago), 2) extração de DNA dupla-hélice do genoma (extração fenol/clorofórmio) e 3) sem célula reação do fago e experimento de título (1 dia: células hospedeiras da placa e fazer placas de ágar, dia 2: reação celular livre e anfitrião de células pré-cultura e dia 3: título de cultura e do fago de célula hospedeiro).
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Protocol
Nota: as seguintes etapas de amplificação e método de extração são amplamente generalizáveis para muitos do fago de DNA dupla-hélice, por exemplo, do bacteriófago T7, enterobactérias do fago T4 ou enterobactérias do fago λ (L). Eles são predominantemente utilizados para um phage cujo genoma não está prontamente disponível para a compra de fontes comerciais.
1. amplificação do fago
Nota: A único-placa, ciclo multi fago (SPMC) produção técnica é bem descrita para o phage T4 em Chen, et al 14 a seguir amplificação do fago e DNA método de extração é uma generalização para uso com fago de DNA de dupla-hélice de Escherichia coli, por exemplo, T7, T4 ou L. O sucesso final do protocolo depende fortemente da estirpe de célula de host selecionado ' s capacidade para suportar condições de superinfeção. Se as células hospedeiras são instáveis sob superinfeção, ou superinfeção nunca é alcançada, e lise nunca é atingida durante esta fase crítica, é melhor proceder com um protocolo de Lise confluente. Isso inclui separando os restos celulares através de centrifugação de alta velocidade e do fago granulação em velocidades de ultracentrifugação. Todas as condições e parâmetros seguintes destinam-se como ponto de partida geral. As melhores condições para uma linha de celular de host local podem ser diferentes; determinar e aderir às condições adequadas.
- Preparar células de inoculação
- inocular 10 mL mídia Luria-Bertani (LB) em um tubo de cultura 15 mL com células hospedeiras de Escherichia coli, por exemplo, B ou K12.
- Lugar em um shaker conjunto para 250 rpm e 37 ° C. deixar durante a noite para crescer a saturação.
- Single-placa bacteriana, crescimento do fago ciclo multi e concentração
- para preparar um prato de placas competentes do fago, aquecer várias placas LB-ágar a 37 ° C, durante 1 h, ou durante a noite.
- Preparar várias diluições do estoque do fago (por exemplo, T7, T4 ou L) de concentração conhecida na mídia LB, apontando para 3 de 2 -10 ~ 10 fago/mL.
- Adicione 100 µ l de crescimento durante a noite concentrado das células do hospedeiro para cada placa.
- Volumes de escolha do preparado de diluições de fago correspondente a um intervalo de 10-100 do fago/placa. Adicionar o volume necessário de diluições de fagos de cada placa (por exemplo, 100 µ l de 3 do fago/10ml; isto deve produzir placas ~ 100). Incubar as placas a 37 ° C e iniciar uma contagem (+ 0 h). Incubar durante 4-5 h.
- Preparar a mídia de 49 mL LB em um balão de 250 mL e o lugar em agitador rotativo definido como 250 rpm e 37 ° C.
- Em + 2,5 h, diluir as células x 50, adicionando 1 mL de cultura celular saturada de crescimento durante a noite para um balão previamente aquecido, contendo meio de 49 mL LB. Uma vez que as células de alcançar crescimento de log (+ 4-5h), medir a absorvância a 600 nm (OD 600). Determinar a concentração de células usando a conversão OD 600 de 1.0 = 8 x 10 8 células/mL.
- Dilua a 2 x 10 7 células/mL usando a mídia de crescimento adicional LB. Remova a placa de ágar contendo as placas do fago da incubadora. Imediatamente use o final de uma pipeta Pasteur estéril do núcleo e remover uma placa única. Sopre as células diluídas a placa e incubar a 37 ° C para um adicional 2 h (+ 6-7 h).
- Teste para infecção completa retirando uma amostra de 500 µ l em um tubo de 1,5 mL, adicionar 10 µ l clorofórmio (CHCL 3) e imediatamente num Vortex em alta velocidade. Observe se clarificou a solução. Uma vez que as células são totalmente infectadas, incubar por outro 2 h (+ 8-9 h).
Nota: Se as células são totalmente infectadas, eles serão rapidamente lyse (< 2 min) e esclarecer a solução. Outros resultados são considerados na discussão seção abaixo. As células vão ser superinfected, mas não serão lyse até este ponto. Se lise começa, a adição de DNase e colheita por centrifugação deve começar imediatamente evitar a degradação do fago. - Células de DNase adicionar de 5 µ g/mL e centrifugar a 8.000 x g a 4 ° C, a pelota. Desprezar o sobrenadante. Ressuspender o pellet em 10 mL de 1 x TRIS de cloreto de magnésio (TM) (50 mM Tris pH 7,8, 10 mM MgCl 2) buffer com 5 µ g/mL DNase. Adicione 500 µ l de CHCL 3 e vórtice em alta velocidade para lisar as células. Esclarecer por centrifugação a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C. decantar o sobrenadante para um tubo cônico de 15 mL e loja em 4 ° C.
2. Purificação do fago
Nota: purificação da sacarose é largamente dependente do tamanho do fago. Considerações para a massa do fago isolados terão de ser feitas e os ajustes para condições de gradiente feitos. Uma concentração viral final de mais de 10 13 fago/mL é facilmente atingível com este método.
- Preparar 12 mL de sacarose de 5% e 45% p/v em TM tampão 1x.
- Prepare 4 x 5-45% gradientes de sacarose por pipetagem 2,5 mL de 45% de sacarose em 4 tubos de se. Top com ~ 2,6 mL de 5% de sacarose, parando quando o líquido atinge 2 mm da borda do tubo.
Nota: Coloque a ponta da pipeta em contacto com a superfície da solução de sacarose e dispensar muito lentamente o líquido. A solução de sacarose a mais leve flutua em cima de mais pesados, formando um limite distinto. Uma solução corretamente em camadas terá interface de ~ 1 mm se mantido contra a luz de fundo. - Misture os gradientes por rotação do tubo de inclinação usando um gradiente formando o instrumento para 43 s 86 ° a 23 rpm. Se não imediatamente necessário, cubra com filme de parafina e armazene a 4 ° C.
- Remover 500 µ l da parte superior de cada preparado gradiente de sacarose com uma pipeta de 1 mL e equilíbrio para dentro de ± 0,002 g.
- Suspensões de fago piscina de todos os tubos (etapa 1.2.9). Utilizando uma pipeta de 1 mL, adicione 500 µ l da suspensão, trazendo a ponta em contacto com a superfície líquida e muito lentamente, dispensando o volume na parte superior do gradiente de sacarose, tomando cuidado para não misturar através de pipetagem rápida. Centrifugar a 70.000 x g por 20 min a 4 ° C.
Nota: Saldo os gradientes preparados para dentro fago menor de ± 0,002 g. podem demorar até 1 h. - Remover as bandas do fago, usando uma seringa estéril e cânula romba.
Nota: Quando visto de lado, a banda do fago vai ser grossa e leitosa em comparação com os arredores, a cerca de 5 mm de altura e situado a meio caminho para baixo o tubo de centrifugação.- Submergir uma cânula romba na solução até que a ponta esteja centrada na borda muito superior da banda do fago. Remover a banda desenhando-se sobre o êmbolo da seringa até que a maioria da banda do fago foi removida.
- Adicionar o volume de sacarose com o fago suspenso para tubos de se 3-4. Adicione a não mais de 1,5 mL/tubo. Preenchimento de ~ 3-4 mm do topo do tubo com frio 1 x TM. Cubra com filme de parafina e inverter para misturar. Lugar em um se e girar a 145.000 x g, durante 1 h a 4 ° C a pelota. Fago menor pode demorar até 2 h.
- , Rapidamente, decantar o sobrenadante e escorrer de cabeça para baixo em lenços descartáveis. Limpe o interior do tubo com cotonete estéril para remover o excesso sobrenadante.
- Dividir 200-400 µ l frio 1x TM em todas as pelotas e ressuspender a noite a 4 ° C; nenhum tremor é necessária.
Nota: Se o sedimento não é limpo, por exemplo, Barbantinho pedaços de membrana, DNA, etc, piscina e realizar centrifugação adicional numa microcentrifuga em 17.000 g. x - o dia antes de fazer títulos, preparar uma cultura de células hospedeiras de Escherichia coli em meio de crescimento de 10 mL LB e deixar em uma incubadora tremendo conjunto para 250 rpm e 37 ° C durante a noite. Incubar a quantidade adequada de placas de cultura a 37 ° C pelo menos 1h antes de fazer uma concentração de estoque o fago.
Nota: O número de placas para incubar depende do número de diluições do estoque do fago para ser chapeado: cada diluição original de estoque do fago requer duas placas de cultura (por exemplo, quatro diferentes diluições do estoque do fago exigem oito placas de cultura). - Preparar 100 mL de ágar top adicionando 2,5 g LB e 0,6 g bacto ágar para um frasco de 100 mL. Dissolva os sólidos em água desionizada, num volume de 100 mL e autoclave. Depois da autoclave, lentamente inverta o frasco 6 - 8 vezes para homogeneizar o ágar-ágar em toda a solução. Coloque o frasco num banho de água de 45 ° C por 15-20 min equilibrar a temperatura .
- Preparar diluição serial das existências do fago com a solução LB.
- µ L 990 adicionar LB-10 ações de fago µ l para uma diluição de 100 vezes. Vórtice para homogeneizar. Para um fator de diluição de 10, adicionar 100 µ l de estoque do fago para µ l 900 lb. Vortex para homogeneizar.
- Repetir a série de diluição acima quantas vezes for necessário para obter um número contável de placas (placas de 10-100).
Nota: Para conseguir isso, dilua o estoque do fago 2-3 ordens de magnitude menor que o rendimento esperado do fago em termos de reação do fago/mL. Por exemplo, se um estoque particular do fago contém 11 infecciosas do fago/10ml, placa o estoque do fago em um 10 8-fold ou 10 9-dobre diluição.
- Preparar uma área para títulos do fago pela montagem de tubos de cultura de 14 mL (o número de tubos de cultura é igual ao número de diluições de estoque do fago para ser chapeada). Colocar as amostras de estoque do fago diluídos da etapa 2.12 e as células bacterianas hospedeiras da etapa 2.10 na Ice.
- Prepara uma mistura de mestre pipetando agar top de 5,25 mL (passo 2.11), 220 µ l diluídos amostras do fago (etapa 2.12), e 50 µ l bacteriana células hospedeiras (passo 2.10) para uma cultura de 14 mL tube. Tampa do tubo de cultura e o vórtice em alta velocidade.
- Armazenar o restante da solução do fago em 4 ° C.
- Recuperar duas placas de cultura (passo 2.10) da incubadora a 37 ° C. Adicione 2,5 mL de mistura de mestre lentamente para o centro da primeira placa (sem bolhas). Rode suavemente a placa manualmente para distribuir uniformemente a mistura de mestre, para que abrange a placa toda a cultura. Repita com o segundo prato. Espere 20 min para garantir a solidificação do ágar superior. Incubar as placas a 37 ° C para 4-7 h.
- Contar as placas e determinar a concentração do fago para cada amostra de reação.
Nota: Placas aparecerá como círculos clara de 1-2 mm no tapete opaco das células do hospedeiro. Veja a Figura 1 para obter resultados representativos. Uma produção de sucesso do fago resultará em concentrações finais de 12 -10 13 fago/10ml.
3. Extração de DNA do genoma de dupla-hélice
Nota: diluição, tremendo, e etapas de centrifugação devem ser otimizadas para desenvolver uma camada de limite de proteína espessa, sólida entre as fases aquosas e fenol. Isso gera os genomas de pureza maiores que estão livres de contaminantes de proteína. A diluição inicial é dependente do título final do fago. Um estoque de fago concentração extremamente elevada (≥ 10 13 fago/mL) pode ser necessário uma diluição de 10-20-fold antes de extração, enquanto ações de baixo título (~ 10 10 -10 11 do fago/mL) podem precisar de apenas um 2 vezes ou nenhum. Se é difícil formar uma camada de proteína sólida em etapas subsequentes ou a suspensão aquosa é muito pegajosa para ser praticável devido a alta concentração de DNA, considere uma maior diluição das existências do fago antes de continuar a extração. Durante qualquer etapa de manipulação de genoma, é importante utilizar pontas de pipetas de largo diâmetro quando Pipetar qualquer fases aquosas. Muitos genomas do fago são bastante grandes e facilmente fragmentada através de pipeta tosquia. Além disso, qualquer utilização do Vortex deve ser expressamente evitada como isto será severamente distorcer os genomas.
- Diluir uma parte do estoque do fago de passo 2.9 a 400 µ l com tampão de TM em um tubo 1,5 mL 1x.
- Adicionar um volume igual de Tris:Phenol:Chloroform para a diluição. Agitar a mistura suavemente sobre um roqueiro de laboratório, ou à mão, por 5 min. centrifugar a emulsão resultante a 17.000 x g em uma centrífuga de bancada de 5-10 min.
Nota: Uma camada de proteínas distintas, branco na superfície da fase de fenol subjacente está presente. - Remover a fase aquosa superior para um tubo novo, tomando cuidado para não perturbar o limite de interfase.
- Repita etapas 3.2-3.3 adicional 2 vezes para um total de 3 extracções de fenol. Transferir a fase aquosa para um novo tubo e adicionar um volume igual de CHCl 3. Agitar e centrifugar (passo 3.2). Transferir a amostra de DNA aquosa para um tubo limpo.
- Estimar o volume de DNA purificado. Adicione 0,4 volumes de acetato de sódio 3M (CH 3 COONa) e 3 volumes de 95% de etanol (EtOH). Coloque no congelador-20 ° C para a precipitação durante a noite. Centrifugar a 17.000 x g em uma centrífuga de bancada de 10-15 min.
Nota: O DNA imediatamente desidrata-se e tornar-se visível como uma massa em suspensão no tubo. O sedimento resultante adequado é branco e bem embalado contra o fundo do tubo. - Remover e descartar o sobrenadante por decantação ou pipetagem. Adicionar 500 µ l 70% EtOH e agite suavemente o tubo até que o sedimento flutua livre do fundo do tubo. Centrifugar a 17.000 x g, durante 5 min. remover e descartar EtOH, tomando cuidado para não perturbar o sedimento.
- Repeat passo 3.6. Ar seco a pelota na bancada de 30-60 min. Adicionar 50 µ l do ddH 2 O ao pellet e incubar durante 1 h no RT ou durante a noite a 4 ° C para ressuspender. Determinar a concentração de DNA usando medidas de absorção em 280 nm.
Nota: As concentrações esperadas são 0.5-5 µ g / µ l, usando esta técnica. Dividir pelo total peso molecular genômico para determinar a concentração de genoma final.
4. Sem célula Phage reação e Phage Titer experimento
- preparar meio LB de 25 g e 15 g-bacto ágar sólido, despeje em uma garrafa de 1 L e adicionar água desionizada para 1 L. Autoclave.
- Após a esterilização, inverta o frasco lentamente de 6 - 8 vezes tendo o cuidado para evitar a formação de bolhas. A inversão da garrafa irá homogeneizar o ágar sólido em toda a solução de 1 L. Colocar o frasco em um banho de água de 58 ° C por 20 min antes do fornecimento em placas de cultura.
- , Uma vez que a temperatura da solução LB-ágar tem incubado, preparar uma chama junto as placas de cultura para esterilizar o ambiente de perto as placas de cultura aberta. Mantenha o frasco de 1 L o banho de água para evitar a solidificação do ágar, tornando as alíquotas. Adicione 25 mL em uma placa de cultura de 100 x 15 mm. 1 L produzirá 40 placas de cultura.
- Uma placa de cultura de lado e deixe solidificar durante pelo menos 1 h no RT; esta placa será usada para chapeamento as células hospedeiras. Deixe as outras placas de 39 cultura solidificam durante 2 dias na loja RT. a 4 ° C ou usá-lo imediatamente para fazer títulos.
- Placa as células hospedeiras por estrias a estirpe bacteriana apropriada (por exemplo, anfitrião B para T7) que foi armazenado a-80 ° C, em placa de cultura LB-ágar. Raia ao lado de uma flama aberta para evitar contaminação ambiental. Incubar durante uma noite a 37 ° C. As células hospedeiras não tem nenhuma resistência aos antibióticos por trabalhar em um ambiente estéril é essencial.
- Reação de célula livre
Nota: As reações de TXTL livre de célula são compostas de 33% bruto Escherichia coli extrair (proteína 8,9-9,9 mg/mL) com os outros 67% compostos de genoma de buffer e fago de reação. O extrato cru é preparado como anteriormente descrito, 15 , 16. Condições da reação final são: proteína 8,9-9,9 mg/mL (a partir de extrato bruto), 3-6 mM Mg-glutamato, 40-100 mM K-glutamato, 2-4% PEG 8000, 3 a 4 mM de cada aminoácido, preparado como descrito anteriormente, 17 e uma solução de mistura de energia, descrito anteriormente 15, composto de 3,33-0,33 mM DTT, 50 mM HEPES, 1,5 mM de ATP e o GTP, com 0.9 mM CTP e UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, acampamento de 0,75 mM, ácido folínico de 0,068 mM, espermidina 1 mM e 30 mM 3-PGA. DNA-tipo fago exige concentrações de genoma de 0.5-10 nM e RNA-tipo fago uma faixa de 50-150 nM. As concentrações finais de reação são exclusivas para o fago particular sintetizado e cairão dentro das escalas acima descritas. Para oxigenação ideal das reações, volumes de reação final devem ser entre 10 a 20 µ l. Existem pequenas variações no protocolo de reação, que dependem da forma da molécula de genômica. Por exemplo, moléculas de genoma linear exigem um componente adicional na reação para inibir a digestão de pedaços de DNA lineares pela enzima recBCD presente no extrato bruto.- Complete o " detalhes da reação " seção na tabela 1 (PhageTXTL_JOVE), digitando o número total de reações e o volume final da reação.
- Desenha o experimento determinando os componentes constantes e variáveis componentes da reação. Digite a porcentagem do volume fracionário da mistura mestre, qual é a relação entre o volume total dos componentes de reação constante para o produto do volume final de reação e número de amostras. Digite o estoque e as concentrações finais dos reagentes na reação a " Master Mix reação receita " seção em PhageTXTL_JOVE. Entrar no estoque e concentrações finais dos termos variáveis a ser testado.
Nota: Os volumes dos componentes de reação serão automaticamente calculados com base no volume mestre mistura e o volume final de cada reação individual. - Remover a quantidade necessária de tubos (indicado na " tubos para descongelar " seção de PhageTXTL_JOVE.xlsx) do extrato bruto de celular, mistura de reserva de energia e aminoácidos mistura de-20 ° C ou -80 ° C e degelo na Ice.
Nota: Uma vez descongelado, combinar várias alíquotas de como componentes (se necessário). - Alíquota do volume indicado do crude extrair, 33% do volume final da reação, em um tubo de microcentrifugadora.
- Preparar a mistura mestre conforme tabela 1. Homogeneizar todos os componentes sob " Master Mix reação receita " vortexing. Adicionar o volume apropriado de cada componente para o extrato bruto.
- Se trabalhando com um fago com genoma de DNA linear (por exemplo, T7), adicionar 1 µM da proteína do lambda do bacteriófago gam para a reação de 11. Vórtice para homogeneizar a solução e coloque a reação no gelo por 5 min. Isto inibe a digestão das peças DNA lineares pelo complexo, o recBCD que é endógena no extrato bruto.
- Depois de adicionar o último componente conforme tabela 1, homogeneizar a reação vortexing. Dividir a mistura mestre nos tubos de microcentrifuga n.
Nota: O volume de cada divisão é o produto da porcentagem do volume de mistura mestre fracionário e o volume final da reação. Por exemplo, para uma porcentagem do volume de mistura mestre fracionária de 90% e o volume final de reação de 12 µ l, o volume de cada divisão é 10.8 µ l. - Adicionar os volumes indicados dos componentes variáveis para a matriz de mistura mestre (ver tabela 1). Adicione água para cada reação para atingir o volume final de reação desejada. Homogeneizar a cada reação vortexing. Incubar os tubos microcentrifuga a 29 ° C, durante pelo menos 8 h ou durante a noite.
- Pré-cultura celular de host
Nota: A pré-cultura durante a noite é diluído 50: 1 para garantir que as células hospedeiras, usadas para o experimento de título estão em fase de registro médio, que aumenta a eficiência da infecção. As células de mid log são então re-concentradas por 10-fold e armazenadas no gelo.- Usando uma ponta de pipeta estéril, inocular um tubo de cultura de 5 mL LB com 3 a 5 colônias de célula hospedeiro saudável. Trabalho ao lado de uma flama aberta para evitar contaminação.
- Incubar o tubo de cultura numa incubadora agitando a 37 ° C e 250 rpm para 16 h ou durante a noite. Células podem chegar a fase de saturação no dia seguinte.
- Host celular cultura e amostra preparação para título do fago
- dispensar 50 mL LB em um frasco de Erlenmeyer de 500 mL e cubra com papel alumínio. Aquecer o balão a 37 ° C por 20 min.
- Alíquota 1 mL do anfitrião durante a noite pré-cultura de células para o pré-aquecido lb. incube durante 3-4 h a 37 ° C e agitação a 250 rpm.
- Centrifugar a cultura de pilha de anfitrião de 50ml durante 10 minutos a 5.000 g. x descartar o lb.
- Resuspenda o pellet com frio (4 ° C) 5ml LB e manter na Ice.
- Uma hora antes de iniciar o experimento de título, incubar as placas de cultura em 37 ° C.
Nota: Cada reação do fago exclusivo (e fator de diluição correspondente) irão utilizar duas placas. Além disso, incube 4 placas para controles experimentais (ver Figura 1 para representante controles positivos e negativos). - Preparar 100 mL de ágar superior (etapa 2,11).
- Preparar uma diluição serial da reação com solução LB sem célula conforme descrito na secção 2.12.
- Título do fago
Nota: Começar a placa depois de pratos de cultura têm incubadas durante pelo menos 1 h e o ágar superior foi num banho de água a 45 ° C por 15-20 min após a remoção do autoclave.- Solução de reação-LB titer a célula final-livre conforme descrito na seção 2, passos 2.14-2.16.
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Representative Results
Vamos mostrar quatro resultados representativos. Na Figura 1, apresentamos um conjunto de controles negativos para garantir que o sistema TXTL livre de célula e as existências de ADN do fago não estão contaminadas com vivos células de Escherichia coli . Verificamos que o sistema TXTL sem célula é livre de intacto Escherichia coli célula contaminação por chapeamento uma solução não incubados e incubadas reação vazio de DNA genômico (Figura 1A e Figura 1B). Se o sistema TXTL sem célula estava contaminado com células de Escherichia coli , seria observado na placa de crescimento. Além disso, podemos verificar que a reação sem célula e, portanto, não as células de possíveis contaminantes, são responsáveis pela síntese do fago por chapeamento reações não incubados e incubadas com o genoma do fago (Figura 1C e Figura 1D). A placa com a reação não incubados (Figura 1C) mostra zero placa enquanto a placa com a reação incubada (Figura 1D) mostra a placa, indicando que o sistema TXTL sem célula foi responsável por fago síntese.
Na Figura 2, comparamos uma homogênea versus ensaio da chapa não homogênea. Figura 2 B ilustra um gradiente de densidade da placa em toda a placa de cultura, que está abaixo do ideal em comparação com uma densidade homogênea placa a placa na Figura 2. A fonte disto viu resultado da refrigeração rápida de mestre mistura de top agar, amostra e host as células bacterianas quando dispensadas em uma placa de cultura durante a parte do título do fago do experimento... Para evitar uma propagação homogênea de placas do fago, certifique-se de que as placas de cultura são incubadas a 37 ° C antes de iniciar o experimento de título do fago.
Um passo crítico para contar corretamente fago é diluir a solução do fago suficientemente para obter entre 50 e 200 placas por placa (Figura 3). Abaixo desse intervalo, é difícil determinar as estatísticas de verdadeiras, e acima desta faixa, as placas se sobrepõem, impedindo a contagem exata. O número do fago sintetizado em TXTL depende das configurações bioquímicas, tais como a concentração de sais (potássio e magnésio), de crowders moleculares e de genomas. Na Figura 4, mostramos alguns exemplos de testes para os fago T7 e ΦΧ174. Para um fago que Replica seu DNA, tais como T7, observamos uma alta eficiência de síntese do fago na reação de célula livre: três fago infeccioso é sintetizado por molécula do genoma na reação. Pode-se esperar uma menor eficiência da reação de um fago que não Replica seu DNA, tais como ΦΧ174: a relação do fago infecciosa sintetizada, a molécula do genoma é de 1:5.
Figura 1: Controles de ensaio de placa bacteriana e produção bem sucedida do fago infecciosas, usando um sistema de reação sem célula (CFR). (A) nenhum genoma foi adicionada e realizou-se sem incubação (0 min como tempo de incubação) do CFR. A reação foi chapeada então sem acolhimento Escherichia coli. O resultado não mostra nenhum host viável contaminação de célula de CFR. (B) nenhum genoma foi adicionada e CFR foi incubado 12 h a 29 ° C e chapeado sem acolhimento Escherichia coli. Os resultados não mostram nenhum host viável contaminação celular do CFR, mesmo após a incubação. (C) 1 nM genoma acompanha sem incubação do CFR (0 min como tempo de incubação) e chapeado com host Escherichia coli. O resultado não mostra nenhuma contaminação do fago da solução do genoma. (D) 1 genoma nM incluído e CFR incubados 12 h a 29 ° C. e chapeado com host Escherichia coli. Resultados mostram a replicação do fago infecciosas bem sucedida no CFR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Homogênea versus heterogênea propagação da reação do fago durante o experimento título. Um possível efeito da execução de um título do fago em placas de cultura não incubadas a uma temperatura de 37 ° C é a propagação não homogênea da reação do fago uma placa de cultura. Um bom resultado, exibindo uma propagação homogênea da reação do fago é mostrado em (A), onde as placas são distribuídas uniformemente em toda a superfície da placa. Um resultado sub-ótimo é mostrado em (B), onde as placas estão concentradas na parte inferior esquerda da placa de cultura. Isso pode ocorrer com o top-ágar, reação do fago e anfitrião célula mestre mix são distribuídos em uma placa de cultura que não é a uma temperatura de 37 ° C. A maioria do mestre mix solidifica-se na região inferior esquerdo, e um spread homogêneo não é possível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Definindo um factor de diluição adequada para uma concentração de uma reação do fago sem célula. (A), esta placa exibe um número razoavelmente contável de placas. O fator de diluição usado para a parte do título do experimento diluído o rendimento da reação do fago suficiente para deixar um número contável de placas na chapa. Inversamente em (B) o factor de diluição foi muito baixo em relação ao rendimento do fago sintetizado e precisa ser ajustada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Caracterização da célula livre síntese do fago ΦΧ174 e T7. (A) número de ΦΧ174 sintetizado e fago T7 (PFU/mL: plaquunidades de formação e por mililitro) como uma função de PEG 8000 concentração na reação sem célula, medido após 16 h de incubação a 29 ° C. (B) número de ΦΧ174 sintetizado e fago T7 em função da concentração de magnésio-glutamato, na reação de célula livre, medido após 16 h de incubação a 29 ° C. (C) número do fago ΦΧ174 sintetizado em função da concentração de genoma de DNA ΦΧ174 na reação sem célula, medido após 16 h de incubação a 29 ° C. (D) número de sintetizado do fago T7 em função da concentração de genoma de DNA T7 na reação sem célula, medido após 16 h de incubação a 29 ° C. Todas as barras de erro exibidas são desvios-padrão dos três ensaios repetidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: composição de reação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Seguindo a técnica em Chen, et al 14 para SPMC, um passo crítico é atingido quando determinar condições adequadas para o superinfeção. O parâmetro que controla a capacidade de uma estirpe hospedeiro para resistir a superinfeção mais estreitamente com frequência é a concentração inicial do fago infectante. As células hospedeiras devem estar em fase de crescimento logarítmico antes da infecção inicial, com uma pequena quantidade do fago. Eventualmente, a Praga também alcançará crescimento logarítmico e o objetivo é permitir que os números do fago superar rapidamente a contagem de células, permitindo várias cópias do fago em cada célula do hospedeiro. Isto força a célula em um estado quase estável onde ele não passará por Lise. Se este estado não for atingido, as células passam por lise em cascata, confluente e liberar sua carga viral. Se superinfeção não pode ser alcançada usando as concentrações virais iniciais acima, diminuir a multiplicidade inicial da infecção por um fator de dez, antes de fazer uma tentativa subsequente. Se as células hospedeiras lyse antes da colheita e superinfeção não for atingida, imediatamente com um processo de purificação separado. Adicionar DNase I 5 µ g/mL e 500 µ l CHCl3 para finalizar a lise celular tudo. Continue a agitar por um adicional 5 min e em seguida centrifugar a 10.000 g x para remover restos celulares. Decantar e centrifugar o sobrenadante a 75.000 x g, durante 1-2 h para a praga de pelotas e ressuspender a noite no buffer de TM total 1 x 1 mL a 4 ° C, sem tremer. Durante o teste de superinfeção usando um pequeno volume de células, é possível avaliar o quão perto células são a Lise por quão rapidamente eles lyse quando expostas o adicionado clorofórmio. Se as células lyse e a solução esclarece quase instantaneamente, as paredes celulares são muito instáveis e células devem ser colhidas imediatamente para evitar a lise de cascata em grande escala. Se o teste de Lise dentro de 1-3 min, os volumes maiores podem continuar a superinfect para até 2 h, dependendo da local estirpe de e. coli em uso. Se as células não lyse dentro de 5 min, o crescimento do fago não travou para o crescimento de Escherichia coli e incubação primária deve continuar. Execute o teste novamente em 30-60 min.
Quando purificante do fago em um gradiente de sacarose preparada, o phage aparecerá como uma banda muito grossa, perolada, entre um terço e dois terços do caminho para baixo do tubo. Assumindo uma lise relativamente bem sucedida e a etapa de purificação celular remanescente, pode haver outros bandos luz mas nenhuma de tamanho ou densidade semelhante. A banda grande, opaca contém o fago e é para ser removido da solução com uma seringa estéril e cânula romba.
Quando começar a terceira seção do protocolo, a reação celular livre e título do fago, é melhor usar placas de cultura fresco (menos de uma semana de idade) para a placa de bactérias do anfitrião (da etapa 3.5) e, também, as placas de cultura, usadas para a análise do título (da etapa 3.21). Isto promoverá mais forte crescimento de células de bactérias hospedeiras e maior eficiência de infecção para o título do fago. Placas de cultura do fago devem ser pré-incubadas a 37 ° C por um período mínimo de 1 h antes de iniciar a parte do título do fago do protocolo. Sem pré-incubação das placas de cultura de fago, a solução top-ágar (contendo a cultura de pilha do fago e host sintetizada) não irá distribuir homogeneamente em toda a superfície da placa de cultura. Em vez disso, a solução top-ágar solidify homogeneamente na superfície (Figura 2b). Isto aumenta a probabilidade do fago múltiplos, localizando-se no mesmo ponto, que pode causar uma subestimativa de rendimento do fago na reação de célula livre.
Cada chapa representa o evento de um fago sintetizado infectar uma célula hospedeira, replicação dentro da célula hospedeira e lise da célula hospedeira. Placas crescem em tamanho, durante o período de incubação da prole do fago infectante vizinho células hospedeiras do evento infecção inicial. Se não há placas são observadas, é possível que o factor de diluição feito no protocolo seção 4.6 é muito alto, resultando em uma baixa probabilidade de que qualquer sintetizado fago infecta uma célula hospedeira. Para corrigir isso, diminuir o factor de diluição de 3-4 ordens de magnitude (ou, se necessário) e repetir a experiência do título. Por outro lado, o factor de diluição pode ser muito alto, resultando em placas, abrangendo toda a superfície da placa de cultura, tornando-se impossível contar o rendimento do fago. Neste caso, aumente o fator de diluição de 3-4 ordens de magnitude (ou, se necessário). Para um bem caracterizadas do fago, o rendimento da reação sem célula será conhecido e fator de único diluição por ponto de reação será necessária para o experimento de título. Quando caracterizando um novo phage, é melhor incluir fatores de diluição diferente de 2-3 por ponto de reação, garantindo que uma das diluições trará uma placa contável (consulte a Figura 3 para as diferenças entre um número contável e incontável de placas na um prato).
Se nenhuma placa for observada depois de modificar o fator de diluição do título do fago, isso pode indicar que a célula livre reação teve sucesso em que a expressão do gene não ocorreu. Uma possível explicação para isso poderia ser danos estruturais de reagentes/fagos DNA devido a homogeneização da reação sem célula vortexing. Para corrigir esse problema, repita a reação e homogeneizar suavemente tocando o tubo de reação, cinco a sete vezes com um dedo, ou misturando lentamente a reação com uma pipeta de cinco a sete vezes.
O sistema de reação sem célula se origina de e. coli e endogenamente contém RNA polimerase de e. coli e o principal fator sigma, sigma 70, que se combinam para formar a holoenzima necessária reconhecer o consenso principal promotor sequências de genes de e. coli . Além disso, o sistema de reação sem célula pode recapitular o esquema de transcrição de todo fator sigma fornecendo exogenamente seis outros genes de fator sigma de e. coli sob a sequência do consenso de promotor do sigma 70. Isso permite que a capacidade de sintetizar todos os bacteriófagos cujas genomas são compatíveis com maquinaria de transcrição e tradução de e. coli. Isto deixa de fora um subconjunto do bacteriófago que não pode ser estudado ou sintetizado com o sistema de reação sem célula utilizado aqui.
A plataforma de transcrição/tradução livre de célula permite um impressionante nível de controle e flexibilidade das condições de reação, em comparação com métodos na vivo de estudo. Podemos ajustar finamente muitos componentes bioquímicos e genéticos de uma reação do fago e observar diretamente os efeitos em menos de 24h, conforme mostrado na Figura 4 para exclusão molecular. Os efeitos de crowders moleculares, tais como PEG, diante a auto-montagem de complexos macromoleculares sido teoricamente descrito e demonstrado em vitro18,19,20. Apinhamento molecular é uma entropia conduzido mecanismo que aumenta a constante de associação de estruturas grandes biomolecular. A abordagem sem célula permite que o pesquisador a sonda complicados processos biológicos como a Biofísica de auto-montagem com sistemas modelo, como os bacteriófagos, sem as limitações intrínsecas do trabalho na vivo .
Esta plataforma também permite a investigação da utilidade do fago em campos aplicados. Componentes do genoma do fago podem ser realocados e testadas rapidamente em um sistema de reação celular-livre com o objetivo de incorporação de resultados de nanoestruturas romance. Bacteriófagos podem ser modificados a fim de aumentar a seletividade de infecção de célula de acolhimento, o que promoveria a utilidade da terapia do fago como uma alternativa para as bactérias resistentes aos antibióticos.
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Disclosures
Os autores declaram o interesse financeiro concorrentes seguintes: laboratório de Noireaux recebe fundos de pesquisa do MYcroarray, um distribuidor do kit de expressão da proteína sem célula de MYtxtl.
Acknowledgments
Este material é baseado no trabalho suportado pelo escritório de pesquisa Naval prêmio número N00014-13-1-0074 (V.N.), o programa de ciência de fronteira humana conceder número RGP0037/2015 (a V.N.), e a Fundação científica Binacional conceder 2014400 (V.N.).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ultracentrifugation tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
Conical tubes | Falcon | 352070 | |
Gradient maker | BioComp Gradient Master | see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9. | |
Syringe and Blunt Cannula | Monoject | 8881513918 and 888202017 | |
Wide-bore pipette tips | Fischerbrand | 02-707-134 | |
Plaque counter | New Brunswik Scientific | Colony Counter Model C-110 | |
Culture tubes | Fischerbrand | 14-961-33 | |
Cell-free system | Mycroarray Inc | Mytxtl | |
BioComp Gradient Master | BioComp Instruments | Model 105ME | |
LB agar plate recipe | 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010). |
References
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