Summary
Komplekse bevægelse i naturalistiske miljøer, der kræver omhyggelig koordinering af lemmerne indebærer regioner af parietal cortex. Følgende protokol beskriver brugen af reversibel køling-induceret inaktivering at demonstrere af parietal område 5 i hukommelse-styrede hindring unddragelse i den omvandrende kat rolle.
Abstract
På komplekse, naturalistiske terræn, kan sensoriske oplysninger om en miljømæssig hindring bruges hurtigt justere bevægeapparatet bevægelser til at undgå. For eksempel, i kat, kan visuelle oplysninger om en forestående hindring modulere stepping for unddragelse. Bevægeapparatet tilpasning kan også opstå uafhængigt af vision, som pludselig taktile input til benet af en forventet hindring kan ændre intensivering af alle fire ben for unddragelse. Sådanne komplekse bevægeapparatet koordinering indebærer supraspinal strukturer, såsom den parietale cortex. Denne protokol beskriver brugen af reversibel, køling-induceret kortikale deaktivering at vurdere parietal cortex bidrag til hukommelse-styrede hindring bevægelse i katten. Lille afkøling sløjfer, kendt som cryoloops, er specielt formet til at deaktivere diskrete områder af interesse at vurdere deres bidrag til en åbenlys adfærd. Sådanne metoder har været anvendt til at belyse rollen af parietal område 5 i hukommelse-styrede hindring unddragelse i kat.
Introduction
På naturalistiske, ujævnt terræn, kan sensoriske oplysninger om en hindring, som kan erhverves via vision eller touch, hurtigt ændre bevægelse for at undgå. Denne omhyggelig koordinering af stepping bevægelser indebærer flere kortikale regioner1,2. For eksempel, har områder af motoriske cortex3,4 og parietal cortex5,6,7 været impliceret i komplekse bevægeapparatet opgaver såsom hindring unddragelse. Quadrupedal dyr udvides trin modulationer kræves for hindring unddragelse til at omfatte både forben og hindlegs. Forsinkes fremadrettet bevægelse mellem de forben og hindleg hindringsfrihed, (der kan opstå som et dyr slidbaner omhyggeligt gennem en kompleks, naturalistiske miljø stalking bytte), er oplysninger om hindring vedligeholdes i hukommelsen brugt til at guide hindleg hen over forhindringen en gang gå CV'er.
Eksperimentelle teknikker har til formål at deaktivere diskrete kortikale områder kan bruges til at studere kortikale bidrag til hukommelse-styrede hindring locomotion. Køling-induceret kortikale deaktivering giver en reversibel, pålidelig og reproducerbar metode til vurdering af kortikale bidrag til en åbenlys adfærd8. Cryoloops fremstillet af rustfri stålrør er formet præcis det kortikale område af interesse, at sikre yderst selektiv og diskrete deaktivering af loci. Når implanteret, kølet methanol pumpes gennem lumen af en cryoloop køler regionen i cortex direkte under loop til < 20 ° C. Under denne kritisk temperatur hæmmes synaptisk transmission i regionen i cortex direkte under sløjfen. Sådanne inaktivering kan vendes ved blot at ophøre med strømmen af methanol. Denne metode har været brugt til at studere kortikale bidrag til sensoriske forarbejdning og adfærd9,10,11,12,13,14,15 , 16 , 17, samt motorstyring saccadic øje bevægelser18 og hukommelse-styrede hindring locomotion19.
Formålet med denne protokol er at bruge reversible køling-induceret deaktiveringer for at vurdere inddragelse af de parietale kortikale områder for bevægeapparatet koordinering i katten. Specifikt, blev hukommelse-styrede hindring bevægelse undersøgt med eller uden aktive parietal cortex. Disse metoder har været anvendt med held påvise rolle af parietal område 5 i hukommelse-styrede hindring unddragelse i den omvandrende kat19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev gennemført i overensstemmelse med National Research Council's Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr (ottende udgave, 2011) og den canadiske Rådet på Animal Care's Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr (1993), og blev godkendt af University of Western Ontario animalske brug underudvalget Universitet Rådets Animal Care.
Følgende procedure kan anvendes til eksperimenter studerer kortikale bidrag til bevægeapparatet kontrol i den omvandrende kat.
1. apparater
- Konstruere de apparater, der anvendes til at vurdere hindring hukommelse.
Bemærk: Apparatet består af en 2.43 m lang, 29 cm bred gangbro omsluttet af 18 cm høj klar akryl vægge (figur 1). En smal slot halvvejs langs apparatet giver en 25,8 cm bred x 3 mm tyk hindring at være rejst til eller fjernes fra gangbro ved hjælp af et håndtag monteret nedenunder den omvandrende overflade. - For at sikre, at opmærksomhed af dyret fastholdes på spiser, undgå at bruge hånden til at hæve eller sænke hindring. I stedet, hindring kan hæves eller sænkes ved hjælp af eksperimentatorens ben til at flytte håndtaget nedenunder gangbro, tillader eksperimentatoren at fortsætte fodring af dyr.
- Ordentligt vedligeholde løftestang system for at sikre at forhindringen kan hævet eller sænket soundlessly.
- Bruge en lille ophøjet platform (23 cm lang x 23 cm bred x 16 cm høje) efter som blød mad er placeret, for at guide bevægelser af dyret.
- Optage alle forsøg ved hjælp af et Ethernet-kamera (54 rammer/s) monteret på et stativ 1.85 m væk fra midterlinjen af gangbro.
2. uddannelse procedurer
Bemærk: For vellykket dataopsamling, en periode med træning forud for adfærdsmæssige test sikrer, at hvert dyr er ordentligt akklimatiseret på test-og apparater. Gentagen udsættelse for en roman miljø vil støtte i at reducere overraskende eller andre stressende adfærd. Akklimatisering kan variere mellem dyr og kan kræve 1-2 måneders træning. Indledende acclimation sessioner kan være op til 5 min i længde afhængig af fokus og motivation af dyr at spise. Efterfølgende sessioner bør sigte mod at øge varigheden af tid, at dyret er motiveret til at arbejde (typisk omkring 20-25 min).
- Erhverve ældre (> 6 måneder) indenlandske kort hår katte fra en kommerciel laboratorium opdrætter af vægt eller sex.
Bemærk: Motivation til at arbejde for mad og en kooperativ disposition omfatter udvælgelseskriterierne, når man overvejer, hvilke dyr bør indgå i undersøgelsen. - Acclimate hvert dyr til at bære en sele, som 1 m lang snor er tilknyttet. Anker snor til en hylde over gangbroen over midtpunktet af gangbro.
Bemærk: Det tillader dyret at gå langs den centrale del af apparatet uden nogen form for spænding, således at tilskynde dyr skal forblive inden for denne del af apparatet. Om oprettelse af sådanne afgrænsninger er nyttigt til at arbejde med en omflytning testen sag. - Placere dyr på den gangbro, gør det muligt at spise fra den platform, hvorpå blød mad er placeret.
Bemærk: Et af målene med denne grunduddannelse er at sikre, at dyret let følger mad platform når rykkede fremad, og kan gå komfortabelt med sele og snor. Brugen af blød mad som positiv forstærkning fremmer dyret til at forblive fokuseret hele hver uddannelse eller test session, og fremmer et behageligt arbejdsmiljø. - Sikre, at dyret er behageligt med håndtering, herunder tilfælde, hvor dyret skal være flyttet til startområdet af gangbro.
3. behavioral uddannelse og eksaminering protokol
Bemærk: Hindring hukommelsen er vurderet i to paradigmer: en visuelt-afhængige hindring hukommelse opgave, og en taktil-afhængige hindring hukommelse opgave. Begge paradigmer bør anvendes under grunduddannelse og efterfølgende test.
-
Visuelle hindring hukommelse
- For at vurdere den visuelle hindring hukommelse, øge hindring på gangbro (figur 2A). Sted platform på den anden side af hindring. Placere dyret i startområdet i gangbro.
- Tillad dyret at nærme sig maden, stepping over forhindringen med kun dens forben for at spise fra platformen.
- Da dyret fortsætter med at spise, sænke hindring, således at det bliver flugter med gangbro til at forebygge enhver yderligere visuel eller taktile input.
- Efter en variabel forsinkelsesperiode, flytte mad fremad igen for anspore dyret til at genoptage gå; denne forsinkelse kan være mindre end 1 s til op mod 2 min.
- Vigtigere, udføre forsøg, hvor forhindringen er fraværende for at undgå tilvænning til hindring og udvikling af en lærd undgåelse svar. I sådanne visuelle hindring-fraværende forsøg, sikre at forhindringen ikke er rejst ind på gangbro før placere dyret i startområdet i gangbro.
- Observere hindleg træde i hindring-nutid og hindring-fraværende forsøg at kontrollere typisk bevægeapparatet adfærd og intakt visuelle hindring hukommelse inden køling. Sikre, at dyret kan rydde hindring uden kontakt, og at træde af alle fire ben er betydeligt forhøjet i hindring-nuværende forsøg.
Bemærk: Se videoer af uddannelse forsøg kan hjælpe i denne kontrol.
-
Taktile hindring hukommelse
- For at vurdere den taktile hindring hukommelse, sikre at forhindringen ikke er rejst ind på gangbro før placere dyret i startområdet i gangbro (figur 2B).
- Tillad dyret at gå mod mad platform placeret på den anden side af slidsen hindring.
- Som dyret spiser, hæve hindring på gangbro under mad skål, forhindrer enhver visuelle input af forhindringen.
- Da maden er flyttet fremad, Bemærk at dyret skal kontakte hindring med deres forbenene før hen over det.
- Tillad dyret at fortsætte spise mens skrævende hindring mellem deres fore- og hindlegs. I løbet af denne tid, sænke hindring således at det bliver flugter med gangbro til at forebygge enhver yderligere visuel eller taktile input.
- Efter en variabel forsinkelsesperiode, flytte mad fremad igen at tilskynde dyret til at genoptage gå.
- Vigtigere, udføre forsøg hvor forhindringen er fraværende og ingen kontakt med forben sker for at forhindre tilvænning til hindring og udvikling af en lærd undgåelse svar.
- I disse taktile hindring-fraværende forsøg, har den animalske tilgang og spise fra mad-platform, som beskrevet i trin 3.2.1. Dog hæve og sænke hindring (trin 3.2.2) før du flytter mad frem i skridt 3.2.3. Sikre, at en lignende forsinkelsesperioden hvor dyret får lov til at fortsætte med at spise (trin 3.2.4) går forud for den endelige fortsættelse af locomotion (trin 3.2.5).
- Observere hindleg træde i de hindring-nutid og hindring-fraværende forsøg at kontrollere normale bevægeapparatet adfærd og intakt visuelle hindring hukommelse inden køling.
4. video analyser
Bemærk: For at vurdere hindring hukommelse, analyser under grunduddannelse og efterfølgende test efter afkøling loop implantation indebærer kvantificere trin tophøjde, trin clearance og den vandrette afstand mellem tå og hindring på toppen af hvert trin for både visuelle og taktile paradigmer (figur 2 c).
- Analysere videoer ved hjælp af brugerdefinerede skriftlige scripts.
- For hvert forsøg, spor hver fod ved at markere placeringen af tåen tættest på kameraet hele hvert trin.
- Mål trin tophøjde som den vinkelrette afstand mellem tåen og overfladen af gangbro på det højeste punkt i hvert skridt bane (figur 2 c).
- I hindring-nuværende forsøg, måle trin clearance som trinhøjde direkte over slidsen hindring trækkes af højden på forhindringen.
- Derudover mål den vandrette afstand mellem tåen og hindring på toppen af hvert trin i hindring-nuværende forsøg.
- Bekræfte, at hindring hukommelse kapaciteter er intakt inden køling loop implantation ved at verificere, at trin tophøjde er forhøjet i hindring-nuværende forsøg i forhold til intensivering i hindring-fraværende forsøg.
5. køling Loop (Cryoloop) Implantation
- Implantat cryoloops bilateralt over områder 5 og 7 efter tidligere rapporteret kirurgiske procedurer8 (figur 3).
- Kort sagt, for hver halvkugle, udføre en kraniotomi og durotomy fra Horsley-Clarke koordinaterne20 A15 til A25 at udsætte skillevej af den ansate og laterale sulci.
- Position enkelte køling sløjfer formet fra 23-gauge rustfrit stål subkutan slanger med sløjfe i direkte kontakt med den kortikale overflade af parietal område 5 eller 7.
- Secure base af hver cryoloop til kraniet med dental akryl forankret til rustfri skruer.
- Luk craniotomies med yderligere dental akryl; udarbejde hud margener akryl kanter og sutur sammen.
6. kortikale køling protokol
-
Eksperimentel opsætning
Bemærk: Før du bringer dyret i den test værelse, afkøling kredsløbet forberedes og testet. Den kølende kredsløb består af en methanol reservoir med en indtagelse røret (3,2 mm OD, 1,6 mm I.D.), en frem-og tilbagegående stempelpumpe og tøris bad forbundet via polytetrafluorethylen slanger (1,6 mm OD, 0,5 mm I.D.; Figur 4). Et digital termometer kræves.- Tilføje 500 cc tøris til 200 mL methanol i iskarret. Fit slanger enderne stramt over ind- og udløb af en dummy cryoloop at fuldføre afkøling banen.
- Tillægge en digital termometer for kontinuerlig temperatur overvågning ved hjælp af et kabel, der består af to mandlige termoelement stik og et termoelement wire termoelement plug. Sikre, at længden af dette kabel er tilstrækkelige til at nå hovedet af dyret, når ene ende er sat i termometeret.
- Tænde stempelpumpe ved hjælp af parameteren.
Bemærk: Methanol bør drages af reservoiret, passerede gennem pumpen til tøris bad hvor den flydende methanol i slangen vil blive afkølet til-75 ° C. Den kølede methanol vil derefter afslutte iskarret og køre gennem den vedlagte cryoloop før han vendte tilbage til methanol reservoir. - Sikre, at pumpen indstilling, længden af slangen i iskarret og længden af slangen fra iskarret til dummy sløjfer er optimal, således at dummy cryoloop temperatur kan nå et steady state omkring-5.0 ° C.
Bemærk: Sådanne temperaturer opnået under denne indledende opsætning er ofte tilstrækkelig til at opnå test temperaturer på 3,0 ± 1,0 ° C når det samme system bruges til at køle en implanteret cryoloop. Svært ved at opnå tilstrækkelig køling kan løses ved at justere hastigheden af pumpen, øge længden af slanger neddykket i iskarret, og/eller minimere længden af slangen fra iskarret til cryoloop. - Eventuelt forlænge en sektion af rør ved threading slutningen af rør gennem en tube udgangen montering og flange enden af røret med en flanger værktøj. Fastgør slangen en ønskede længde med en tilsvarende flanger ende ved hjælp af et stik.
- Kontroller, at alle forbindelser er lun og ingen lækager er til stede. Når tilfreds med den første installation, sluk pumpen, og fjerne den dummy cryoloop; kredsløbet er nu parat til en test dyr.
-
Adfærdsmæssige test
- Placere dyret på den testapparater. Skub selen hen over hovedet og sikre rem LUN rundt om dyret. Knytte snor.
- Fjern beskyttelseshætten af de implanterede cryoloop at udsætte indsugnings- og udstødningsporte rør. Fit slange ender stramt over indsugnings- og udstødningsporte rør af cryoloop. Tilslut termoelement stikket til den digitale termometer.
- Begynde test session med en visuel (trin 3.1) eller taktile (trin 3.2) hindring hukommelse retssag. Følg med yderligere forsøg af alle fire typer (visuel hindring-stede, visuelle hindring-fraværende, taktile hindring-stede, taktile hindring-fraværende) i en tilfældig måde.
Bemærk: En typisk test session består af en 'varm' blok af forsøg, hvor hukommelse-styrede hindring unddragelse er observeret i manglen afkøling for at etablere baseline foranstaltninger. - Tænd stempelpumpe, og vente på cryoloop at nå en temperatur på 3,0 ± 1,0 ° C (1-2 min). Derefter køre en 'cool' blok af forsøg efter stempelpumpe har været tændt. Under denne blok af forsøg, hvis nødvendigt, vurdere bidragene fra den afkølede område til hukommelse-styret. Sikre, at temperaturen i cryoloop fastholdes på 3,0 ± 1,0 ° C overalt i hele blokken.
Bemærk: Alle fire retssag typer skal være tilfældigt afbrudt hele blokken. - Kører en final 'rewarm' blok af forsøg efter stempelpumpe har været slukket, og cryoloop er vendt tilbage til sin oprindelige temperatur.
Bemærk: Baseline stepping adfærd er genoprettet under denne blok. Igen, skal alle fire retssag typer tilfældigt spækket hele blokken.
-
Oprydning
- Når den adfærdsmæssige test er indgaaet, fjerne slangen fra indsugnings- og udstødningsporte rør. Være bevidst om resterende methanol, der kan dryppe fra slangen ender og kan irritere dyret.
- Sikre, at den beskyttende hætte er erstattet. Fjerne snor og sele før returnere dyret til kolonien. Trim slange ender (3-4 mm) ved hjælp af en slange cutter til at undgå utæt forbindelser på den næste teste dag.
7. kontrollere omfanget af køling
- I slutningen af adfærdsmæssige test, bekræfte, at omfanget af deaktivering er begrænset til regionen af cortex direkte under hver cryoloop ved hjælp af tidligere rapporteret teknikker8.
Bemærk: Det kan kontrolleres, med thermocline kortlægning12 eller med en termisk imaging kamera13,14,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol har held været anvendt til at undersøge parietal cortex bidrag til hindring hukommelse i den omvandrende kat19. I denne undersøgelse, cryoloops blev implanteret bilateralt over parietale områder 5 og 7 i tre voksen (> 6 måneder) kvindelig katte (figur 5A). Dyrene blev vurderet i den taktile hindring hukommelse paradigme i mangel af afkøling (varme, kontrol tilstand), eller når området 5 eller 7 var bilateralt deaktiveret.
Repræsentative resultaterne fra denne undersøgelse viser, at når området 5 var bilateralt afkølet, hindleg stepping var betydeligt svækket i hindring-nuværende forsøg (fig. 5 d, blå). I varm tilstand var gennemsnitlig maksimal trinhøjde for indledende og afsluttende hindlegs 9,5 ±2.2 cm og 8,0 ±2.1 cm, henholdsvis. En envejs multivariat ANOVA afslørede, at når området 5 var afkølet, peak trinhøjde for indledende og afsluttende hindlegs blev væsentligt reduceret til 4,3 ±2.2 cm (p < 0,0001) og 3,4 ±1.4 cm (p < 0,0001), henholdsvis. Trin tophøjde af forbenene i hindring-nuværende forsøg eller nogen ben i hindring-fraværende forsøg blev ikke påvirket af område 5 deaktivering. På samme måde, peak trinhøjde for nogen ben i enten hindring-nuværende eller hindring-fraværende forsøg ikke afviger fra den varme betingelse når område 7 var deaktiveret.
Derudover var hindleg trin clearance ligeledes påvirkes, når området 5 var deaktiveret. I sammenligning med både varme og område 7 afkølet betingelser, trin clearance blev reduceret til 4,7 ±2.2 cm i den førende hindleg trin (p < 0,0001; Figur 5 g) og −5.6 ±1.4 cm i den efterfølgende hindleg trin (p < 0,0001). Derudover var trin bane af den afsluttende hindleg påvirket af område 5 deaktivering, som peak opstod før hindring, i modsætning til intensivering i både varmt og område 7 kølet betingelser (figur 5 g).
Helt, angives sådanne ændringer i peak trinhøjde, trin clearance og trin bane dyb hindring hukommelse underskud når område 5 var deaktiveret. Vigtigere, da området 5 deaktivering kun ændret Karakteristik af hindleg træde i hindring-nuværende forsøg og ikke forringer evnen til at gøre stepping bevægelser, afspejler disse observerede ændringer i bevægelse hukommelse, ikke motor underskud. Desuden bekræftede termisk imaging udføres ved afslutningen af adfærdsmæssige test, at køling var begrænset til området 5 eller 7, når hver løkke var individuelt afkølet for hver halvkugle (figur 6). Dermed samlet set viser disse resultater bidrag af parietal område 5 til hukommelse-styrede hindring bevægelse i katten.
Figur 1: Diagram skildrer kameraet, køleanlæg og gå apparater, der anvendes til at vurdere hindring hukommelse i kat En 2.43 m lang, 29 cm bred gangbro er omsluttet af 18 cm høj klar Plexiglas vægge. Halvvejs langs gangbro, en 25,8 cm bred 3 mm tyk hindring kan hæves på gangbro gennem en smal slot ved hjælp af et håndtag monteret nedenunder gangbro. For hvert forsøg, er dyret placeret et par skridt fra hindring i startområdet af gangbro. Fødevarer er placeret på en lille ophøjet platform (23 cm lang x 23 cm bred x 16 cm høj) på den anden side af slidsen hindring modsat startområdet. Alle forsøg registreres via en Ethernet-kamera monteret på et stativ og gemt på en bærbar computer. Dette tal er blevet ændret fra Wong et al. 19 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Diagram skildrer både visuelle og taktile hindring hukommelse opgaver og trin målinger bruges til at vurdere hindring hukommelse i den omvandrende kat (A) at vurdere visuelle hindring hukommelse, forhindringen er rejst på gangbro, som dyret nærmer sig mad platform. Efter at have trådt over forhindringen med kun dens forben, er dyret tilladt at spise fra platformen, som hindring er sænket skjulte bliver flugter med overfladen af gangbro. Efter en variabel forsinkelse, maden er flyttet fremad at tilskynde dyret til at genoptage gå. (B) at vurdere taktile hindring hukommelse, hindring er ikke rejst på gangbro, som dyret nærmer sig mad platform. Som dyret spiser, rejste hindring tavst på gangbro direkte under mad platform. Maden er flyttet fremad forårsager forben af dyret til at kontakte hindring før hen over det. Dyret er tilladt at fortsætte spise fra mad platform mens skrævende hindring mellem sine forben og hindlegs. I løbet af denne tid, er forhindringen skjulte sænket fra broerne. Maden er flyttet frem endnu en gang tilskynde dyret til at genoptage gå. Hindleg trin er målt til at vurdere hindring hukommelse. (C) styrkelse er vurderet i både visuelle og taktile hindring hukommelse paradigmer ved måling skridt tophøjde, trin clearance og den vandrette afstand mellem toppen af hvert trin og forhindringen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: skematisk af cryoloop. Cryoloop består af en beskyttende hætte, der passer over indsugnings- og udstødningsporte rør. Disse rør kører gennem en gevind post og danner den sløjfe, der sidder i direkte kontakt med den kortikale overflade over det pågældende område. En microthermocouple er loddet på union af løkken til at måle cryoloop temperatur. Dens ledninger køre tilbage gennem varme-shrink slangen, (som også wraps rustfri stålrør) og er knyttet til en stik. Hele forsamlingen er sikret til kraniet med dental akryl. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: køling kredsløbet. Den kølende kredsløb består af methanol reservoir, frem-og tilbagegående stempelpumpe, is bad, termometer og cryoloop. For at køle, trækker pumpen methanol fra reservoir gennem indtagelse røret (1,6 mm I.D.). Methanol udgange pumpe gennem polytetrafluorethylen slangen (0,5 mm I.D.) og pumpes gennem til tøris badet, hvor den flydende methanol i slangen er afkølet til-75 ° C. Den kølede methanol derefter afslutter iskarret og løber gennem den vedlagte cryoloop før han vendte tilbage til methanol reservoir. Denne cryoloop kan være en dummy løkke (ikke implanteret) anvendes under den indledende opsætning eller kan være en implanteret cryoloop i en test dyr. Cryoloop er også forbundet til et digital termometer til at registrere loop temperatur i hele adfærdsmæssige test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Vendbar, køling-induceret deaktivering af parietal område 5 resulterer i hindring hukommelse underskud. (A) Lateral syn på den rigtige hjernehalvdel kat cerebrum viser cryoloops implanteret direkte over parietale områder 5 (blå) og 7 (grøn) undersøgte i Wong et al. 19 D: dorsale, A: anterior. (B-E) Bar parceller skildrer betyde trin højde ± SD for hindring-stede (B, D) og hindring-fraværende forsøg (C, E) for forben (B, C) og hindlegs (D, E) til varme (røde), område 5 afkølet (blå), og området 7 kølet betingelser ( grøn). Trinhøjde blev reduceret betydeligt i både foranstillede og efterstillede hindlegs i hindring-nuværende forsøg, når området 5 var deaktiveret. (F) Bar plot skildrer gennemsnitlige hindleg trin clearance ± SD for hver afkøling betingelse. Område 5 deaktivering resulterede i nedsat clearance for både indledende og afsluttende hindleg trin. (G) Bar plot skildrer den gennemsnitlige vandrette afstand mellem toppen af hvert trin og hindring for hver afkøling betingelse. Når område 5 var afkølet, trin baner var mere variabel og afveg betydeligt fra varme og område 7 kølet betingelser. p < 0,005, **p < 0.0001, n.s.: ikke signifikant. Dette tal er blevet ændret fra Wong et al. 19 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: termisk imaging bruges til at bekræfte begrænset deaktivering af område 5 eller 7 under afkøling. (A) fotografi forestiller cryoloops kontakt med parietal områder 5 og 7 i den højre hjernehalvdel. Toppen er dorsale, højre forreste. Stiplet linje repræsenterer grænsen mellem parietale områder 5 og 7. (B-C) Termiske billeder af parietal kortikale overflade fotograferet når cryoloop over område 5 (B) eller område 7 (C) var afkølet til 3 ° C. Dette tal er blevet ændret fra Wong et al. 19 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne paradigme beskæftiger køling-induceret deaktiveringer af diskrete kortikale områder ved hjælp af cryoloop for at studere hukommelse-styrede hindring bevægelse i katten. Visuelle og taktile hindring hukommelse paradigmer er temmelig simpelt for dyr til at udføre som de udnytter naturalistiske bevægeapparatet adfærd, der opstår med en minimal indsats, når et dyr er motiveret til at følge en bevægende fødekilde. Størstedelen af uddannelsesperioden er således helliget acclimating dyret test værelse og køleanlæg. De fleste dyr kræver gentagen udsættelse for iført seletøjet og bliver tøjret via snor før gå behageligt og naturligt på apparatet. Desuden under testen, kan lyden af en stempelpumpe distrahere eller forskrække dyret. Fuldfører den afkøling kredsløb med dummy cryoloop og kører pumpen under grunduddannelsen kan tillade dyret til at acclimate til lyden af pumpen. På trods af tilstrækkelige uddannelsen inden prøvningen, vil der sandsynligvis være en begrænset tid til at teste før dyret bliver rastløs. Derfor rigelig tid er afsat til at sikre korrekt installation og fejlfinding inden bringer dyret i den test værelse vil optimere efterfølgende dataindsamling.
Svært ved at opnå tilstrækkelig køling kan løses ved at justere pumpens omdrejningstal. Dog burde være opmærksom det stigende pres, der kan følge med slangen tvinges ud i inlet eller outlet rør af cryoloop. Alternativt, længden af slangen neddykket i iskarret kan forhøjes for at aktivere mere tid til at chill strømmen af methanol i rørene. Derudover sikrer, at længden af slangen fra punktet af exit fra iskarret til cryoloop er så kort som muligt vil minimere tab af køling. Denne afstand skal også dog længe nok til at give tilstrækkelig vifte af bevægelse for en given adfærdsmæssige paradigme. Slangen kan være isoleret med fleksibelt skum indpakning til at optimere den afkøling effektivitet. Denne indpakning kan også forhindre dråber af kondens, der udgør omkring slangen fra falder på dyret, som kan irritere eller forskrække dyret. Under testen, at sikre en lun fit af slangen over fjorden og outlet rør af cryoloop kan gøre forbinder cryoloop vanskelig. Iført en nitril eller latex handske kan give et bedre greb af slangen. At sikre at dyret er behageligt og patienten mens eksperimentatoren lægger slangen er vigtigt. Mad kan bruges til at holde dyret stationære og indhold.
Cryoloops kan køles rutinemæssigt, giver meget reproducerbare ændringer i adfærd, når et bestemt område er deaktiveret. Ved at vurdere den samme opgave i tilstedeværelse og fravær af kortikale deaktivering inden for samme dyr, nedsættes det samlede antal dyr, der anvendes. Desuden kan omfanget af køling manipuleres til at yderligere for at specificere kortikale bidrag til en specifik funktionsmåde. For eksempel, kan både unilaterale og bilaterale deaktiveringer udføres i de samme dyr at undersøge mulige lateralization virkninger af en adfærd. Derudover kan graden af køling varieres for at undersøge laminar bidrag. Ved afkøling cryoloops på den kortikale overflade til 3,0 ±1.0 ° C, alle seks lag af cortex direkte under hver sløjfe er afkølet til < 20 ° C, hæmme neuronal spiking aktivitet22. Alternativt kan cryoloops være afkølet til 8,0 ±1.0 ° C, som selektivt køler kun supragranular kortikale lag under denne kritisk temperatur på 20 ° C. Vurdere adfærd med sådanne overfladiske kortikale deaktivering samt fuld kortikale inaktivering kan tillade translaminar dissociations af kortikal funktion21.
Trods sådanne alsidighed betragtes følgende begrænsninger under eksperimentelle design. Mens køling er en glimrende tilgang til deaktivering alle celletyper i en given kortikale region, kan det give et middel til deaktivering det cellulære specificitet, der kan opnås med optogenetic deaktivering teknikker. Derudover køling kræver et minimum af 45 s før cryoloop temperaturer stabilisere ved kritisk temperatur på 3.0 ±1.0 ° C for funktionel inaktivering. Således bør betragtninger for det tidsrum, der kræves for at opnå en funktionel inaktivering indarbejdes i forsøgsplan valg.
Samlet set kræver kølesystemet minimal vedligeholdelse. Slanger og stik af den afkøling kredsløb bør kontrolleres regelmæssigt for lækager. Methanol i reservoiret erstattes ugentligt for at sikre, at methanol er fri for partikler. Implanterede cryoloops også kræver minimal vedligeholdelse. Margenerne er renset med jævne mellemrum med en 3% opløsning af hydrogenperoxid efterfulgt af en kirurgisk krat løsning. Med korrekt anvendelse og pleje afkøles implanteret cryoloops rutinemæssigt i mange år. Disse kortikale afkøling procedurer kan tilpasses andre adfærdsmæssige paradigmer10,11,12 eller elektrofysiologiske optagelse præparater13,14 i alternative dyremodeller 15,17,18,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi anerkender taknemmeligt støtte fra den canadiske institutter for sundhedsforskning, naturvidenskab og Engineering Research Rådet i Canada (NSERC) og Canada Foundation for Innovation. C.W. blev støttet af en Alexander Graham Bell Canada Graduate stipendium (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | IDS Imaging Development Systems GmbH | Model: UI-5240CP-C-HQ | |
| Intake tubing | Restek | 25306 | Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump |
| Pump | Fluid Metering, Inc. | Model: QG 150 | |
| Nalgene Dewar vacuum flask | Sigma-Aldrich | F9401 | |
| Teflon tubing | Ezkem | A051754 | |
| Microprobe thermometer | Physitemp | Model: BAT-12 | |
| Flanged tube end fittings | Valco Instruments Co. Inc. | CF-1BK | Assorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings |
| Washers | Valco Instruments Co. Inc. | CF-W1 | Extra washers |
| Flanging kit | Pro Liquid GmbH | 201553 | |
| Tubing connector | Restek | 25323 | |
| Tubing cutter | Restek | 25069 | |
| Male thermocouple connector | Omega | SMPW-T-M | Used to make cable connection to thermometer |
| Thermocouple wire | Omega | PP-T-24S | Used to make cable connection to thermometer |
| MATLAB | MathWorks | n/a |
References
- Drew, T., Marigold, D. S. Taking the next step: cortical contributions to the control of locomotion. Curr. Opin. Neurobiol. 33, 25-33 (2015).
- Takakusaki, K. Neurophysiology of gait: From the spinal cord to the frontal lobe. Mov. Disord. 28, 1483-1491 (2013).
- Drew, T. Motor cortical activity during voluntary gait modifications in the cat. I. cells related to the forelimbs. J. Neurophysiol. 70, 179-199 (1993).
- Beloozerova, I. N., Sirota, M. G. The role of the motor cortex in the control of accuracy of locomotor movements in the cat. J. Physiol. 461, 1-25 (1993).
- McVea, D. A., Taylor, A. J., Pearson, K. G. Long-lasting working memories of obstacles established by foreleg stepping in walking cats require area 5 of the posterior parietal cortex. J. Neurosci. 29, 9396-9404 (2009).
- Lajoie, K., Andujar, J. -E., Pearson, K. G., Drew, T. Neurons in area 5 of the posterior parietal cortex in the cat contribute to interlimb coordination during visually guided locomotion: a role in working memory. J. Neurophysiol. 103, 2234-2254 (2010).
- Beloozerova, I. N., Sirota, M. G. Integration of motor and visual information in the parietal area 5 during locomotion. J. Neurophysiol. 90, 961-971 (2003).
- Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. The cryoloop: An adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function. J. Neurosci. Methods. 86, 179-194 (1999).
- Lomber, S. G., Cornwell, P., Sun, J., Macneil, M. A., Payne, B. R. Reversible inactivation of visual processing operations in middle suprasylvian cortex of the behaving cat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 2999-3003 (1994).
- Lomber, S. G., Payne, B. R. Contributions of cat posterior parietal cortex to visuospatial discrimination. Vis. Neurosci. 17, 701-709 (2000).
- Lomber, S. G., Malhotra, S. Double dissociation of 'what' and 'where' processing in auditory cortex. Nat. Neurosci. 11, 609-616 (2008).
- Lomber, S. G., Meredith, M. A., Kral, A. Cross-modal plasticity in specific auditory cortices underlies visual compensations in the deaf. Nat. Neurosci. 13, 1421-1427 (2010).
- Kok, M. A., Stolzberg, D., Brown, T. A., Lomber, S. G. Dissociable influences of primary auditory cortex and the posterior auditory field on neuronal responses in the dorsal zone of auditory cortex. J. Neurophysiol. 113, 475-486 (2015).
- Carrasco, A., Kok, M. A., Lomber, S. G. Effects of core auditory cortex deactivation on neuronal response to simple and complex acoustic signals in the contralateral anterior auditory field. Cereb. Cortex. 25, 84-96 (2015).
- Coomber, B., et al. Cortical inactivation by cooling in small animals. Front. Syst. Neurosci. 5, 53 (2011).
- Malmierca, M. S., Anderson, L. A., Antunes, F. M. The cortical modulation of stimulus-specific adaptation in the auditory midbrain and thalamus: a potential neuronal correlate for predictive coding. Front. Syst. Neurosci. 9, 19 (2015).
- Antunes, F. M., Malmierca, M. S. Effect of auditory cortex deactivation on stimulus-specific adaptation in the medial geniculate body. J. Neurosci. 31, 17306-17316 (2011).
- Peel, T. R., Johnston, K., Lomber, S. G., Corneil, B. D. Bilateral saccadic deficits following large and reversible inactivation of unilateral frontal eye field. J. Neurophysiol. 111, 415-433 (2014).
- Wong, C., Wong, G., Pearson, K. G., Lomber, S. G. Memory-guided stumbling correction in the hindlimb of quadrupeds relies on parietal area 5. Cereb. Cortex. , (2016).
- Horsley, V., Clarke, R. H. The structure and function of the cerebellum examined by a new method. Brain Behav Evol. 31, 45-124 (1908).
- Lomber, S. G., Malhotra, S., Hall, A. J. Functional specialization in non-primary auditory cortex of the cat: areal and laminar contributions to sound localization. Hear. Res. 229, 31-45 (2007).
- Johnston, K., Koval, M. J., Lomber, S. G., Everling, S. Macaque dorsolateral prefrontal cortex does not suppress saccade-related activity in the superior colliculus. Cereb. Cortex. 24, 1373-1388 (2014).
