Neuroscience

Ca المتقدرية^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات المقايسة و Ca^{2 +}--تسبب تورم المتقدرية الإنزيم

Published: May 1, 2018 doi: 10.3791/56236

¹Department of Neurology, Qilu Hospital of Shandong University, ²Department of Neurology, Qingdao Municipal Hospital, ³Brain Research Institute, Qilu Hospital of Shandong University

Summary

يهدف هذا البروتوكول إلى وصف طريقة لفحص Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات و Ca^{2 +}--أثارت الخلايا المتقدرية تورم في الميتوكوندريا المعزولة من ش SY5Y خطوة بخطوة.

Abstract

إنتاج ATP من الفسفرة هي المهمة الرئيسية الميتوكوندريا. الميتوكوندريا في حقيقيات النوى أعلى أيضا المشاركة في سيتوسوليك Ca^{2 +}التخزين المؤقت، وإنتاج ATP في الميتوكوندريا يمكن أن توسط إينتراميتوتشوندريال Ca^{2 +} تركيز مجاناً. يمكن اعتبار Ca^{2 +} الاحتفاظ بقدرة قدرة الميتوكوندريا على الاحتفاظ بالكالسيوم في مصفوفة المتقدرية. ووصف المتراكمة داخل الخلايا Ca^{2 +} يؤدي إلى نفاذية غشاء الميتوكوندريا الداخلية، افتتاح نفاذية المتقدرية الانتقال المسامية (mPTP)، مما يؤدي إلى تسرب جزيئات مع الجزيئية وزن أقل من 1.5 كاتشين. Ca^{2 +}--تسبب تورم يستخدم للإشارة إلى افتتاح mPTP الميتوكوندريا. هنا، يمكننا وصف فحوصات اثنين لدراسة Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات و Ca^{2 +}-تسبب تورم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة. بعد كميات معينة من Ca^{2 +} يتم إضافتها، يمكن الانتهاء في يوم واحد جميع الخطوات ومسجل من قبل قارئ ميكروسكوبية. وهكذا، يمكن اعتماد هذه اثنين من فحوصات بسيطة وفعالة لتقييم Ca^{2 +}-المتقدرية المهام ذات الصلة.

Introduction

الميتوكوندريا هي الأجهزة الخلوية الرئيسية لإنتاج ما يقرب من 95 في المائة ATP تستخدمها الفسفرة في خلايا الثدييات. وأفيد أن يلتقيه micromolar تركيز Ca^{2 +} من الميتوكوندريا، ووجود ADP والفوسفات غير العضوية يمكن أن فوسفوريلاتي ADP إلى ATP توليف¹. عندما يذهب تركيز Ca سيتوسوليك^{2 +}عتبة، الميتوكوندريا يمكن امتصاص Ca^{2 +} سرعة وافلوكس ذلك ببطء. وهكذا، يمكن الميتوكوندريا الأداء تدفق زيادة سيتوسوليك Ca^{2 +}. لا صلة لها بالمشاركة في الفسفرة، كاليفورنيا المتقدرية^{2 +} أيضا المشاركة في إشارات الكالسيوم سيتوسوليك وتنشيط إليه apoptotic الميتوكوندريا بحمل فتح مبتب في الداخلية المتقدرية غشاء². وقد اعترف على نطاق واسع أن ارتفاع غير طبيعي في كاليفورنيا داخل الخلية^{2 +} يمكن أن تحدث تورم المتقدرية الضخمة عن طريق فتح مبتب³. وهكذا، وهذا البروتوكول يهدف إلى تقييم الوظيفة المتقدرية بقياس المتقدرية Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات و Ca^{2 +}-تسبب تورم المتقدرية.

Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات هو قياس قدرة الميتوكوندريا على امتصاص الكالسيوم سيتوسوليك. يمكن المخزن المؤقت الكالسيوم الحر سيتوسوليك الميتوكوندريا وتنظيم العمليات الخلوية المعتمدة على الكالسيوم عن طريق امتصاص الكالسيوم في شكل رواسب غير نشط. يحدث البصر Ca^{2 +} القدرة على الاحتفاظ في الإجهاد الظواهر المرتبطة بالحد من الطاقة والأعصاب حتى الأمراض⁴^،⁵. الميتوكوندريا المعزولة أو الخلايا بيرميبيليزيد ديجيتونين يمكن استخدامها لتحديد Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرة، وقدرة مرتفعة على تراكم Ca^{2 +}من الميتوكوندريا المعزولة مع غلوتامات الإضافي ومآلات لا يتم عزل المتقدرية الداخلي⁶. ينبغي استخدام كمية معاير من ديجيتونين بيرميبيليزي في الأغشية البلازمية من أنواع مختلفة من الخلايا. ملح هيكسابوتاسيوم Ca^{2 +}-ملزمة صبغة الفلورسنت الخضراء، Ca^{2 +}-خلية إيمبيرمينت الحساسة تظهر مؤشر الضوء منفعل، كانت تستخدم على نطاق واسع⁷. Ca^{2 +}-ملزمة الخضراء صبغة الفلورسنت هو مؤشر تقارب منخفضة وتستخدم لإظهار أن داخل الخلايا الحرة Ca^{2 +}تركيزات يواصل الارتفاع خلال فترات طويلة (5 دقائق) التحفيز⁸. هذا الأسلوب هو أقل حساسية من تقنية تصفية المشعة ولكن تم تبسيطها إلى حد كبير. Ca إضافية^{2 +}يرفع fluorescence الكالسيوم الأخضر وترجع Ca^{2 +}امتصاص الميتوكوندريا الأسفار لخط الأساس. وقدمت إضافات متتالية من Ca^{2 +} حتى الميتوكوندريا فشل في امتصاص اكستراميتوتشوندريال Ca^{2 +} ⁹. يمكن استخدام قارئ ميكروسكوبية الأسفار لتقرير الأسفار الكالسيوم الخضراء باستمرار.

بعد Ca^{2 +}تراكم، depolarized الميتوكوندريا، إصدار Ca^{2 +} في المتوسط، وبدأ الإنتفاخ. Ca^{2 +}--تسبب تورم يستخدم للإشارة إلى افتتاح mPTP الميتوكوندريا. المجهر الإلكتروني، والانخفاض في امتصاص الضوء في 540 نانومتر يمكن استخدامها لقياس Ca^{2 +}-تسبب تورم المتقدرية¹⁰^،¹¹. يمكن تحديد حجم الميتوكوندريا مباشرة بواسطة زاوية الأمام تشتت الضوء¹²، حيث تعكس انخفاض امتصاص سلبية تورم المتقدرية المصفوفة.

هنا، نحن توضيح المنهجية لدراسة المتقدرية Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات و Ca^{2 +}-تسبب تورم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة من الخلايا SH-SY5Y.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-عزل الميتوكوندريا

ملاحظة: جميع الحلول والمعدات ينبغي أن بريكوليد إلى 0-4 درجة مئوية وأبقى على الجليد.

البذور حوالي 3 × 10⁶ش-SY5Y الخلايا الواحدة 10 سم خلية الثقافة الطبق. تعديل الخلايا الثقافة في دولبيكو الجلوكوز عالية متوسطة النسر مع 10% مصل بقرى الجنين، البنسلين (100 U/mL)-ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل). الحفاظ على 37 درجة مئوية في حاضنة الذي يحتوي على 5% CO₂ بين عشية وضحاها.
ملاحظة: هناك حاجة على الأقل 1-2 × 10⁷ش-SY5Y الخلايا للمقايسة عزل كل.
إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع حوالي 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة الجليد في طبق ثقافة خلية 10 سم 3 مرات.
إضافة جديد 1 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني في الطبق ثقافة الخلية 10 سم وكشط الخلايا ملتصقة في أنبوب 1.5 مل جديدة. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
أثناء الطرد المركزي، إعداد 5 مل العزلة المتقدرية المخزن المؤقت (250 ملم السكروز، 10 مم حبيس (حمض اثانيسولفونيك-(2-hydroxyethyl)-1-الببرازين 4)، 10 مم بوكل، 1.5 مم مجكل₂، يدتا 1 مم) وتستكمل مع 50 ميكروليتر من الأسهم مثبطات البروتياز الحل (100 x تركيز؛ 1 قرص خالية يدتا حله في 500 ميليلتر من ddH₂س).
إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع 1 مل من العزلة المتقدرية المخزن المؤقت. احتضان أنبوب 1.5 مل على الجليد لمدة 30 دقيقة.
الخلايا مع وقف التنفيذ مع الخالطون زجاج (15-25 السكتات الدماغية) صعودا وهبوطاً يدوياً على الجليد.
ملاحظة: تأكد من هناك لا فقاعات عندما يتم تجانس خلايا. حساب عدد الخلايا سليمة ونوى البارد بالمجهر بصريا، والتأكد من أن > حدث الكسر الخلية 90%.
نقل هوموجيناتي إلى أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية لإزالة الأنقاض (الأنوية والخلايا المتبقية سليمة).
نقل المادة طافية في أنبوب 1.5 مل الجديدة وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق 4 درجات مئوية.
نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 14,000 س ز 4 درجات مئوية.
إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه المحتوية على الميتوكوندريا مع 1 مل من العزلة المتقدرية المخزن المؤقت.
الطرد المركزي الحل لمدة 15 دقيقة في س 14,000 ز 4 درجة مئوية التعجيل في الميتوكوندريا.
بيليه الميتوكوندريا الناتجة عن ذلك يجب أن أبقى على الجليد وحراكه في 50-100 ميكروليتر بوكل الوسائط (125 ملم بوكل 2 مم ك₂هبو₄، 1 مم مجكل₂، 20 مم حبيس، غلوتامات 5 مم، مالات 5 مم، و 2 ميكرومتر والروتينون، درجة الحموضة 7.4) وفقا لحجم بيليه قبل أي الحمار المنعم يوسف.
استخدام 5 ميكروليتر من حل المتقدرية لقياس تركيز البروتين المتقدرية بمقايسة اتفاق التعاون الأساسي القياسية، قياس OD562 باستخدام قارئ لوحة¹³.

2. تحديد قدرة المتقدرية Ca^{2 +} الاحتفاظ

تحضير الوسائط بوكل وإضافة Ca^{2 +}-ربط صبغة الفلورسنت الخضراء إلى تركيز 0.5 ميكرومتر قبل التجربة الأخيرة.
نقل 1 مل الميتوكوندريا المعزولة (0.4 ملغ/مل) في بوكل الوسائط التي تحتوي على 0.5 ميكرومتر Ca^{2 +}-ملزمة صبغة الفلورسنت الخضراء في كل لوحة 6-جيدا جيدا.
احتضان الميتوكوندريا و Ca^{2 +}-ملزمة صبغة الفلورسنت الخضراء في لوحة 6-جيدا في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء المحيط لمختبرين ميكروليتر 4 إضافة 1 كحد أدنى من 20 مم كاكل₂ الحل (20 مم كاكل₂، 127 مم بوكل، 1 مم مجكل₂ ، 20 مم حبيس، غلوتامات 5 مم، ومآلات 5 ملم، ودرجة الحموضة 7.4) لكل لوحة 6-جيدا جيدا باستخدام التلقائي الاستغناء عن الإعداد لإدخال 200 نمول Ca^{2 +}المتقدرية/mg بروتين.
استخدم مطياف الأسفار رصد التغيرات الأسفار كل 3 ثانية لمدة 2 دقيقة مع الطول موجي إثارة من 506 شمال البحر الأبيض المتوسط وطول موجي انبعاثات من 531 شمال البحر الأبيض المتوسط. اللوحة مجهز بالهز 600 لفة في الدقيقة ل 3 s بين القراءات التي تسيطر عليها البرمجيات (الشكل 1).
إضافة قاسمة ميكروليتر 4 إضافية من عيار 20 ملم كاكل₂ الحل لكل بئر ورصد التغييرات الأسفار كل 3 s للحد الأدنى 2 كرر هذه الخطوة حتى الأسفار يزداد مع الوقت.
ملاحظة: يتم تحدي الميتوكوندريا مع إضافة Ca^{2 +}المؤشرة fluorescence تسجيل زيادة. عندما يفتح مبتب، يزيد الأسفار مع مرور الوقت.
تفسير المبلغ الإجمالي من Ca^{2 +} إضافة حتى يفتح مبتب ك Ca^{2 +} الاحتفاظ بقدرة.

3-تحديد Ca ^{2 +}-الناجم عن تورم المتقدرية

تعد وسائل الإعلام بوكل قبل التجربة.
1. نقل 1 مل الميتوكوندريا المعزولة (0.4 ملغ/مل) في وسائل الإعلام بوكل في كل لوحة 6-جيدا جيدا.
إضافة 10 ميكروليتر من عيار 20 ملم كاكل₂ محلول مائي (500 مغ/نمول المتقدرية بروتين) في البروتين تؤدي إلى تورم المتقدرية mitochondrial.
تسجيل الانخفاض في امتصاص في 540 نانومتر كل 3 s على قارئ ميكروسكوبية التي تسيطر عليها برامج لمدة 10 دقائق (الشكل 2). بسبب التغييرات fluorescence تدفق الذوائب عبر الغشاء الداخلي المتقدرية.
ملاحظة: انخفاض امتصاص في 540 نانومتر يناظر الميتوكوندريا منتفخة. إذا كان القارئ لا نلاحظ انخفاض في امتصاص، يمكن اعتماد القراءة فاصل زمني أطول أو وقت القراءة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النتائج ممثلة Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرة على:
وأعرب عن النتائج كقيم الأسفار. مع البقول إضافية من Ca^{2 +} (بروتين نمولس/mg 200 mitochondrial) الأسفار زيادة مزدوجة فوق خط الأساس مع افتتاح مبتب. 5 ميكرومترات بونجكريكاتي (BKA)، المانع من Ca^{2 +}-الناجم عن فتح مبتب، أو أتراكتيلوسيدي 1 ميكرومتر (ATR)، منشط من Ca^{2 +}-الناجم عن فتح مبتب، وأضيفت في الميتوكوندريا المعزولة. المبلغ الإجمالي المضافة Ca^{2 +} حتى افتتاح mPTP أشارت إلى زيادة مزدوجة أعلاه fluorescence الأساس فسر Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات. لدينا بيانات أظهرت أن mitochondrial Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرة في علاج الجابري أعلى بكثير منه في المجموعة ATR. وأكدت هذه البيانات قياس مناسبة المتقدرية Ca^{2 +} القدرة على الاحتفاظ (الشكل 3).

النتائج ممثلة من Ca^{2 +}-الناجم عن تورم المتقدرية:
وأعرب عن النتائج كالتغيرات في النسبة المئوية في امتصاص في 540 نيوتن متر مقابل امتصاص الأولية خلال مدة 10 دقائق بعد إضافة كاكل₂. تسبب بإضافة Ca^{2 +}(بروتين نمول/mg 500 mitochondrial) امتصاص انخفاض رصدها في 540 نانومتر أشارت إلى تورمات المتقدرية. مع معاملة خبيرين أو أية تي آر، منحنى المعايرة وأظهرت انخفاضا طفيفا أو حاد مقارنة بامتصاص الأولية، تشير إلى أن الجابري يمكن أن تمنع mPTP فتح بينما يمكن تيسير ATR mPTP فتح (الشكل 4).

رقم 1: إعدادات البرامج المتقدرية Ca^{2 +} الاحتفاظ بقدرة الإنزيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2: إعدادات البرامج لكاليفورنيا المتقدرية^{2 +}-أثارت المقايسة تورم المتقدرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: قياس القدرة على Ca^{2 +} الاحتفاظ. إضافية المتقدرية Ca^{2 +} في الميتوكوندريا المعزولة وتم قياس فلوروميتريكالي مع Ca^{2 +}-ملزمة الخضراء صبغة الفلورسنت حضور 5 ميكرومترات بونجكريكاتي (BKA) أو 1 ميكرو أتراكتيلوسيدي (ATR) أو عنصر التحكم فارغاً (CON). وقيست آثار Ca^{2 +} الاحتفاظ بواسطة الميتوكوندريا المعزولة مع الجابري، وأية تي آر، ويخدع في 506 نانومتر (السابقين) و 531 شمال البحر الأبيض المتوسط (م) على قارئ ميكروسكوبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: القياس من Ca^{2 +}-الناجم عن تورم المتقدرية. Ca^{2 +}-أعرب تورم المتقدرية المستحث SH-SY5Y حضور 5 ميكرومترات بونجكريكاتي (BKA) أو 1 ميكرو أتراكتيلوسيدي (ATR) التحكم فارغة (CON) كمنحنى معايرة انخفاض النسبة مئوية لامتصاص الأولية في 540 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، يمكننا وصف بروتوكول بسيطة وفعالة المتقدرية Ca^{2 +} الاحتفاظ بقدرة التحليل و Ca^{2 +}-أثارت المقايسة تورم المتقدرية.

لعزل المتقدرية، تأكد من أن جميع المواد وأنابيب يتم على الجليد، لا سيما عند المجانسة الخلايا. 0.25% التربسين-يدتا يمكن أن تستخدم أيضا لفصل الخلايا من الطبق لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد 15-25 من السكتات الدماغية، من الضروري مراقبة سليمة غشاء الخلية تحت المجهر، وتجنب الكسر للغشاء الميتوكوندريا. ولكن الميتوكوندريا المعزولة التي حصلنا عليها الميتوكوندريا الخام والمنقى الميتوكوندريا يمكن الحصول عليها عن طريق 1.0 متر/1.5 مليون التدرج السكروز متقطع. الخصائص البيولوجية الميتوكوندريا في الخلايا الحية أكثر مثل تلك في فيفو مما في الميتوكوندريا المعزولة بسبب تركيزات المكونات المتوسطة التي تحيط الميتوكوندريا. المتقدرية Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرة أو Ca^{2 +}-مقايسة تورم المتقدرية المشغلة عازمة تحت ظروف تنشيط. لتحديد أداء الميتوكوندريا، يمكن إضافة 5 مم succinate كركائز الرئوي بدلاً من الجلوتامات ومآلات⁶.

Ca^{2 +}-ملزمة صبغ الفلورية الخضراء (يربط Ca^{2 +} مع تقارب ± 4.29 0.67 ملم)، هو أكثر ملاءمة لقياس تركيزات micromolar Ca^{2 +} من أعلى النسب الأصباغ مثل fura-2 ⁷. بعد إضافة Ca^{2 +}-ملزمة صبغة الفلورسنت الخضراء، الحضانة يجب أن تكون أقل من 240 إضافات متتالية س. من Ca^{2 +} (تتراوح بين 25-200 نمول) تم حقن عند فواصل زمنية دقيقة 1-3. تظهر منحنيات المعايرة تركيزات Ca^{2 +}أن الميتوكوندريا غير قادر على تنحية، مشيراً إلى استيعاب المتقدرية البقول من Ca^{2 +}. وبخلاف ذلك، Ca^{2 +}-ملزمة الخضراء كما تم استخدام صبغة الفلورسنت في الكالسيوم مما يشير إلى التحقيقات، مثل Ca حرة داخل الخلية^{2 +} قياس تركيز Ca^{2 +} تدفق التالية والإصدار والإثارة مولتيفوتون التصوير من Ca^{2 +} في الأنسجة الحية.

لتحديد Ca^{2 +}-التي يسببها تورم المتقدرية، يمكن أيضا أن يتسبب تورم بالإضافة إلى 200 ملم ATR وكاكل₂. كعنصر تحكم، يمكن المحتضنة الميتوكوندريا مع 1 مم وكالة الفضاء الكندية لمدة 5 دقائق قبل القياس، التي منعت mPTP فتح. وأظهرت البحوث السابقة منحنيات المعايرة لامتصاص كدالة للنسبة المئوية من الميتوكوندريا منتفخة¹⁴. وأفيد أن 1 مم من وكالة الفضاء الكندية، أحمر الروثينيوم 0.1 ملم، ويمكن إضافة وحدة تخزين متساوية من الميتوكوندريا الطازجة (0.5 ملغ/مل) في رد الفعل عند تورم قد اكتمل. لأنه يمكن أن تمنع وكالة الفضاء الكندية وأحمر الروثينيوم mPTP فتح في الميتوكوندريا المضافة حديثا، تشير إلى منحنيات المعايرة كل من الميتوكوندريا منتفخة وغير منتفخة الميتوكوندريا¹⁵. بروتوكول تورم المتقدرية عند Ca^{2 +} التحميل الزائد أيضا قياس فعالة ومباشرة من Ca^{2 +}-الناجم عن فتح مبتب.

منذ اكتشاف النقل من Ca^{2 +} من الميتوكوندريا من الثدييات وغيرها من الفقاريات الأعلى منذ أكثر من 50 عاماً، كان هناك الكثير من البحث عن آليات ومهام efflux الكالسيوم mitochondrial وتدفق. تحتوي المتقدرية Ca^{2 +} استيعاب آليات المتقدرية Ca^{2 +}أونيبورتير، ووضع السريع أو ذاكرة الوصول العشوائي، و مستقبلات (مرير) ريانوديني¹⁶. فحوصات وصفناها أعلاه يمكن تقييم Ca^{2 +}-المتصلة بالوظيفة المتقدرية ببساطة وفعالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

عاشرا – الشمس الإشراف على التجارب. لي وي إجراء التجارب. تشانغ تشن وعاشرا الشمس كتب الورق.

Acknowledgments

وأيد هذه الدراسة المنح من المنح "المعلقة من عالم شاندونغ" (JQ201421) ومنحة من تشرف (81371226).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SH-SY5Y cell line	ATCC (The Global Bioresource Center)	ATCC Number: CRL-2266
Calcium green-5N	Life Technologies	c-3737	Ca²⁺-binding green fluorescent dye
complete protease inhibitors	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
glass homogenizer	Kimble Chase	9885303002
glutamate	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
malate	Sigma-Aldrich	46940-U
rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl₂	Sigma-Aldrich	00457
K₂HPO₄	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl₂	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan flash instruments	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium	Hyclone	SH30022	4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate
fetal bovine serum	Hyclone	SV30087
penicillin	Sigma-Aldrich	P3032
streptomycin	Invitrogen	11860-038
BCA assay kit	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm cell culture dish	NEST	704001