本方案描述了一种新型的三维 体外 模型，其中角膜基质细胞与分化后的神经元细胞共同培养，以协助研究和理解这两种细胞类型之间的相互作用。
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摘要
摘要
组织工程因对人角膜替代物的高需求而受到广泛关注，全球约有1000万人因角膜病变导致视力丧失1。为满足对可存活人角膜的需求，三维（3D）组织工程已取得显著进展2,3,4。这些角膜模型从简单的单层系统发展到多层结构，进而构建出三维全层角膜等效物2。
然而，在三维组织工程角膜的应用背景下 体外 迄今为止研究的疾病模型均未能模拟多层三维角膜组织结构、功能以及不同类型细胞间的网络相互作用。即神经、上皮、间质和内皮2,3此外，对 体外 角膜组织模型的应用日益增加，旨在减少药物产品开发中的动物实验。因此，需要更复杂的模型以更好地满足人体生理需求，建立更贴近患者群体的模型势在必行。鉴于多种角膜细胞类型会受到圆锥角膜、糖尿病性角膜病变和福克斯角膜内皮营养不良等疾病和营养不良的影响，本模型包含来自健康供体的原代人角膜成纤维细胞（HCFs）与SH-SY5Y细胞系来源神经元的三维共培养体系。这使我们首次能够在人角膜组织环境中研究这两种细胞类型之间的相互作用。我们认为，该模型有望解析与表现出神经损伤的角膜疾病中基质-神经相互作用相关的基本机制。该三维模型模拟了角膜组织基本的解剖和生理特性 体内 并可在未来作为研究角膜缺陷以及在动物实验前筛选各种药物疗效的工具。
引言
在人体中，角膜是神经支配最密集的组织。这些神经负责多种感觉功能，如触觉、痛觉和温度觉，同时在伤口愈合、眨眼反射、泪液生成与分泌中也发挥着重要作用5,6,7。角膜中的基质神经干起源于角膜缘丛，并以放射状进入周边角膜基质。基质神经的排列与胶原板层平行，并在向浅层基质延伸过程中进一步分支为更小的神经束5,8。神经纤维进一步穿透上皮层，从而使神经支配广泛分布于整个角膜上皮和基质中。因此，神经支配在角膜的正常生理状态和疾病状态下均具有关键作用。在本实验方案中，我们介绍了一种新型的三维体外（in vitro）模型的建立进展，该模型是首个能够模拟体内（in vivo）基质-神经相互作用的模型。本研究采用了SH-SY5Y细胞系，因为它是研究神经元生长最常用且特征最明确的细胞系之一。已有文献报道，SH-SY5Y细胞系可产生贴壁生长的基质型（S-type）细胞和具有神经母细胞特性的（N-type）细胞，并能发生转分化9。因此，尽管该细胞系来源于N型细胞的三次连续亚克隆筛选，但仍含有少量S型细胞，可在维甲酸和脑源性神经营养因子的作用下分化为神经元
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方案
本方案遵循俄克拉荷马大学健康科学中心/机构审查委员会（IRB #4509）的指南。本方案的所有部分均符合《赫尔辛基宣言》的原则。角膜样本来自国家发育与研究研究所（NDRI）和俄克拉荷马州狮子会眼库。
1. 原代细胞的分离
- 收到人角膜组织样本后，将组织转移至含有 2 mL 无菌 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）(1x) 的 21.5 cm2 培养皿中。
- 将角膜隆起面朝上放置，刮除并去除角膜上皮。为确保完全去除，使用刀片以 45° 角彻底刮除上皮层。随后将角膜隆起面朝下翻转，用刀片以 45° 角彻底刮除基质层上的内皮细胞，以确保完全去除。用 DPBS 清洗基质组织。
- 使用 10 号手术刀片将基质组织切成小块，在操作过程中始终用 DPBS 保持组织湿润。用无菌镊子夹取基质小块，放入不含培养基的 T25 培养瓶中（每瓶放置 4 至 5 块 2 × 2 mm 的组织）。
- 将组织块置于 37 °C 条件下，使其贴附于培养瓶底部，约需 30–40 分钟。待组织块贴壁后，缓慢加入含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗生素/抗真菌剂的 Eagle 最低必需培养基（EMEM），避免扰动组织块。
- 轻柔地将培养瓶放入 37 °C、5% CO2 的培养箱中。保持组织块不受干扰，直至细胞开始从组织块中分离并迁移。大约 2–4 周后，细胞应达到 ....
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结果
图1 是工作中的3D设备的逐步代表性图像 体外 模型。第一步，从人角膜中分离细胞。随后，将细胞培养在聚碳酸酯膜上，并用维生素C刺激，以组装由细胞自身分泌的三维基质。该三维构建系统可诱导形成多层细胞结构。 体内类基质的三维基质中。随后，将神经母细胞瘤细胞接种于基质细胞之上，并诱导其向神经元细胞分化。由此实现角膜基质细胞与分化后的神经元细胞在三维环境中的共培养。 体外 模型 图2 是三维自组装结构的高倍透射电子显微镜（TEM）图像图2A) 显示聚碳酸酯膜及接种于其上的角膜基质细胞，细胞分泌出自组装基质，随后为 (图2B）接种于上层的分化神经元细胞呈现出基质-神经元细胞排列。图中箭头所示为神经元细胞。鉴于角膜基质与神经元细胞之间存在直接的相互作用，我们认为影响角膜缺损调控的关键因素存在于基.......
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讨论
已有若干研究致力于开发多种动物模型，以增进对角膜疾病的理解并探索治疗方法。然而，这些研究对人类的实际价值尚未得到证实。迄今为止，多种 体外 由于其显著的临床意义，相关模型已被广泛开发和研究。我们先前建立的3D 体外 模型是一种新型系统，为视觉研究领域的医学科学进步做出了重要贡献，并展现出完美重现相关生理或病理特征的能力 体内 事件 体外28,29,30本方案旨在开发下一代此类技术 体外 可用于研究与角膜疾病（如糖尿病性角膜病变、圆锥角膜和福克斯角膜内皮营养不良）相关并发症的细胞和分子机制的角膜模型。此类进展可为发现临床上亟需的新疗法奠定坚实基础。
该模型可能有助于识别糖尿病（DM）及其他角膜疾病中发生的各种结构和细胞改变，具有重要的应用前景，包括在疾病早期阶段进行筛查，从而有助于疾病的管理。本文提出的模型虽.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
我们衷心感谢 Ben Fowler 博士在透射电子显微镜实验中提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 健康角膜组织 | NDRI | 来自无眼部外伤或全身性疾病的供体的样本 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（1X） | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| 无菌镊子 | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand 解剖用超细尖镊子 |
| 单边剃须刀片 | Personna | 270100 | |
| 无菌外科手术刀片 No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
| Eagle’s 最低必需培养基 | ATCC | 30-2003 | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11550 | 培养基配制需添加10%胎牛血清 |
| 抗生素-抗真菌素（100X） | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 培养基配制需添加1%抗生素-抗真菌素 |
| 0.05% 胰蛋白酶 EDTA（1X） | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
| 带0.4-μm 孔径的聚碳酸酯膜插件 | Corning Costar | 3412 | |
| 2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸（维生素C） | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | 实验应使用0.5 mM的浓度 |
| 石蜡块 | VWR | 50-949-027 | |
| SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞 | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
| 维甲酸 | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | 终浓度需为10 μM |
| BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | 终浓度需为2 nM |
| 二甲基亚砜（DMSO） | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | 应使用超纯级无菌DMSO |
| Thermo Scientific Nunc 细胞培养处理EasYFlasks（T25） | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
| Thermo Scientific Nunc 细胞培养处理EasYFlasks（T75） | Fisher Scientific | 12-565-349 |
参考文献
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Rönkkö, S., Vellonen, K. -S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translat....
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