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Developmental Biology

角膜组织工程: 人角膜间质神经相互作用的体外模型

Published: January 24, 2018 doi: 10.3791/56308
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1,2
1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology/Dean McGee Eye Institute, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Physiology, Harold Hamm Diabetes Center, University of Oklahoma Health Sciences Center

Summary

本议定书描述了一个新的三维的体外模型, 其中角膜基质细胞和分化的神经细胞被培养在一起, 以协助检查和理解两种细胞的相互作用。

Abstract

组织工程学得到了大量的承认, 由于对人类角膜置换的高需求, 估计全世界有1000万人患有角膜视力损失1。为了满足对生存的人眼角膜的需求, 三维 (3D) 组织工程已取得重大进展2,3,4。这些角膜模型范围从简单单层系统到多层模型, 导致3D 全厚度角膜等效物2。

然而, 使用3D 组织工程角膜的环境中的体外疾病模型研究迄今缺乏相似的多层3D 角膜组织结构, 功能, 和网络的不同类型的细胞 (即, 神经,上皮, 基质, 和内皮)2,3。此外, 对体外角膜组织模型的需求也有所增加, 试图减少对药物产品的动物试验。因此, 更复杂的模型需要更好地匹配系统, 以人体生理需求, 和发展一个模型, 这是更相关的病人人口是绝对必要的。鉴于角膜中的多种细胞类型受疾病和营养的影响, 如圆锥、糖尿病角膜和福斯, 该模型包括一个由健康捐献者和神经元组成的人角膜成纤维细胞 (HCFs) 的3D 共培养模型。SH-SY5Y 细胞系。这让我们第一次研究人类角膜组织内两种细胞之间的相互作用。我们认为, 这种模式可能会解剖的基础机制与神经间相互作用的角膜疾病, 表现出神经损害。该3D 模型反映了角膜组织的基本解剖和生理特性在体内, 可以作为一种工具, 用于研究角膜缺损以及在动物试验前筛选各种药物的功效。

Introduction

在人体内, 角膜是最浓密的支配组织。神经是负责的各种感觉, 如触摸, 疼痛, 温度, 也有一个重要的作用, 伤口愈合, 眨眼反射, 撕裂生产, 并分泌5,6,7。在角膜中, 基质神经树干从角膜缘丛中产生, 并放射状地进入周围的角膜基质。基质神经组织是平行的胶原片, 他们进一步分支成更小的束簇, 因为他们走向表面基质5,8。神经纤维进一步穿透上皮层, 从而在角膜上皮和基质中广泛分布。因此, 神经支配在角膜的健康和患病状态中起着至关重要的作用。在这个协议中, 我们揭示了一个新的 3D体外模型的进展, 这是它的第一种模仿体内间质神经相互作用。这项研究使用了 SH-SY5Y 细胞系, 因为它是研究神经元生长的最成熟、最有特征的线之一。SH-SY5Y 细胞线已被描述产生两个基体附着物 (S 型) 和 neuroblastic (N 型) 细胞, 可以接受转分化9。因此, 即使这一细胞线是从三个连续的 N 型细胞克隆的选择, 它也包含了少量的 s-型细胞能够通过使用维甲酸和脑衍生的分化成神经元神经营养因子9。这提供了一个工具, 可能会导致更好地了解与糖尿病视网膜病变 (DM) 和其他眼部疾病相关的角膜并发症。由于与眼部疾病患者获得和培养神经元有关的困难, 这一3D 的体外模型在研究神经元相互作用和与角膜基质的信号传递方面具有重要的意义。

患病的情况往往会影响到身体的各种组织, 在很大的规模, 导致生活质量受损。眼部营养是常见的并发症, 往往与系统性疾病, 导致视力丧失, 甚至永久视力丧失。综合研究往往是必要的, 以更好地了解疾病的情况, 以及在基础细胞水平的影响。为了研究这些疾病的影响, 在组织工程应用的帮助下, 开发了各种体内和体外模型。角膜组织工程应用已在科学的各个领域获得了极大的兴趣10,11,12,13,14, 但仍然有主要的限制实际应用, 包括角膜移植排斥, 感染, 和疤痕10,11,12,13,14。有几项研究已经成功地开发和建立了各种体外模型3、15、16、17、18、 19,20,21,22,23,24,25,26。3D体外模型是最有希望和最具科学意义的。3D 模型可以更好地反映在纤维化和伤口愈合过程中至关重要的体内细胞和生理事件15、27、28、29。这些体外模型在寻找治疗不同疾病 (包括角膜并发症) 的新治疗方法方面起到了不可或缺的作用。尽管神经支配在角膜功能中起着至关重要的作用, 但在角膜组织工程结构中, 几乎没有为促进外周神经元增殖而做出努力2,3。然而, 建议的 3D体外细胞构造模拟目标组织, 以达到所需的组织功能。

虽然糖尿病角膜是一个明显的应用, 在这里所描述的模型, 由于神经元缺陷, 有几个其他的角膜疾病, 可以受益于人类的体外模型, 包括圆锥和福斯营养。我们的3D 模型从这一前景中产生, 并提出了一个体外的角膜组织的表征, 以评估新药的交付和新的眼科药物的安全性。

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Protocol

本议定书遵循俄克拉荷马州健康科学中心/机构审查委员会 (IRB #4509) 的指导方针。《议定书》的所有部分都符合《赫尔辛基宣言》的原则。角膜标本取自国家发展和研究所 (第九) 和俄克拉何马州狮子眼银行。

1. 分离原细胞

  1. 在收到人类的角膜组织样本后, 将组织转移到21.5 厘米的2培养皿中, 其中含有2毫升的无菌 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) (1x)。
  2. 通过定位角膜圆顶面来刮除角膜上皮。为了确保完全去除, 用刀片在45°角上彻底刮掉上皮层。接下来, 翻转角膜圆顶面朝下, 彻底刮掉从基质中的内皮细胞与一个45°角刀片, 以确保完全清除。用 DPBS 冲洗基质组织。
  3. 将基质组织切成小块, 使用10号手术刀片, 用 DPBS 将基质片保持湿润。用无菌镊子和无培养基的 T25 培养瓶中挑选基质片 (每瓶4或5片 2 x 2 毫米的组织)。
  4. 允许外植体粘附在37° c 的烧瓶底部约 30-40 分钟。一旦加入, 慢慢添加鹰的最低基本培养基 (EMEM) 含有10% 胎牛血清 (FBS) 和1% 抗生素/抗的瓶子, 而不干扰外植体。
  5. 轻轻地将烧瓶放在37° c, 5% CO2的孵化器中。让外植体保持不受干扰直到细胞开始分离并在烧瓶中迁移。在大约 2-4 星期以后, 细胞应该到达100% 汇合。在100% 汇合处, 通过去除组织培养介质和用 DPBS 洗涤细胞, 通过细胞。
  6. 将胰蛋白酶添加到细胞中, 然后在37° c 孵育。在大约5分钟后, 查看细胞在光显微镜下, 以确认他们已经分离, 然后通过添加新的媒体停止蛋白水解。
  7. 将细胞悬浮液转化为15毫升的锥形管, 用于离心 1000 x g. 在不干扰颗粒的情况下, 小心去除上清, 并在新鲜 EMEM 10% FBS 1% 抗生素中悬浮细胞。计算细胞和种子大约 1 x 106细胞在 T75 培养烧瓶进一步扩展与新鲜 EMEM 1% FBS 1% 抗生素。

2. 主要 HCFs 文化和3D 建筑装配

  1. 从以前生长在 EMEM 10% FBS 1% 抗生素/抗, 通道和计数 HCFs 的外植体组装3D 结构。
  2. 种子大约 1 x 106细胞/主要 HCFs 在聚碳酸酯膜插入物与0.4 µm 孔从3D 构造, 连同1.5 毫升新鲜 EMEM 10% FBS 1% 抗生素/抗到结构的顶部。将同一介质的另 1.5 mL 添加到每个构造的底部。
  3. 在 24 h 细胞播种之后, 培养细胞与 EMEM 10% FBS 1% 抗生素或抗, 刺激与0.5 毫米 2 O α D-基 l-抗坏血酸 (维生素 C) 通过增加1.5 毫升在顶端和1.5 毫升在每个构造的底部。
  4. 保持培养在37° c, 5% CO2为3星期, 并提供新鲜的媒体每隔一天在整个研究期间的孵化器。不需要进一步的通道。

3. 细胞分化与共培养

  1. 3周后, 在先前组装的3D 结构的顶部添加 8 x 103细胞/SH-SY5Y 人神经母细胞瘤, 其中含有1.5 毫升的 EMEM 含有 10% FBS, 1% 抗生素/抗, 和0.5 毫米 2 O α-d-基-l--抗坏血酸酸 (维生素 C)。
    1. 在细胞分化之前, 允许 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞在角膜基质干细胞的顶端生长至少24小时。
  2. 启动 SH-SY5Y 细胞分化的刺激细胞与 EMEM 含有 1% FBS 和1.5 毫升的10µM 维甲酸的顶部的结构。添加1.5 毫升的 EMEM 10% FBS 1% 抗生素/抗0.5 毫米 2 O α-d-基, l-抗坏血酸 (维生素 C) 的底部的结构。请注意, 维甲酸的步骤应该在黑暗中进行。
    1. 继续培养这种分化介质中的细胞5天。
  3. 当细胞达到分化阶段, 将细胞转换为1.5 毫升无血清培养基, 其中含有 2 nM 脑源性神经营养因子 (BDNF) 和1% 抗生素/抗添加到 EMEM, 增加到该结构的顶部。添加1.5 毫升的 EMEM 10% FBS 1% 抗生素/抗0.5 毫米 2 O α-d-基, l-抗坏血酸 (维生素 C) 的底部的结构。注意, BDNF 的步骤应该在黑暗中进行。
  4. 在处理表 1中所示的任何进一步分析之前, 对单元格进行2天的培养。

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Representative Results

图 1是工作 3D体外模型的一步一步代表图像。第一步, 细胞与人类角膜隔绝。然后, 他们生长在聚碳酸酯膜和刺激与维生素 C 组装一个自分泌的3D 矩阵。这个3D 构造系统诱导了多层细胞在体内样基质基质的合成。此后, 神经母细胞瘤在基质细胞的顶端被播种, 然后启动神经细胞分化。这导致了角膜基质细胞和分化神经元细胞在 3D体外模型中的共培养。图 2是3D 自组装结构 (图 2A) 的高放大率透射电子显微镜 (TEM) 图像, 显示聚碳酸酯膜和在顶部播种的角膜基质细胞, 分泌自组装基质其次是 (图 2B) 在顶部有分化的神经元细胞, 显示了细胞间的神经元排列。图像中的箭头显示神经元细胞。鉴于角膜基质与神经细胞间的直接串扰, 我们相信影响角膜缺陷调节的关键因素存在于基质层。因此, 该模型提出了一个人的神经元体外模型, 将 SH-SY5Y 神经母细胞瘤干细胞与我们先前建立的3D 细胞外基质 (ECM) 培养模型相结合, 将其区分为可持续的神经元形态学。各种差异性因素。因此, 我们怀疑这个模型将使未来的研究的形态学和分子差异的健康和疾病 ECM。我们相信, 这本小说 3D体外模型将有助于解剖角膜基质神经相互作用与角膜病理学的关键方面, 为新疗法的发展铺平道路。

Figure 1
图 1: 在体外显示3D 的说明性图像合作文化模型以一种循序渐进的方式.这张图片显示了细胞从人类角膜的隔离, 和基质细胞种子的聚碳酸酯膜, 位于3D 结构, 培养在 EMEM 和刺激与维生素 C。此外, 分化神经元细胞被证明是在基质细胞的顶端播种。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 3D体外系统的高倍率 TEM 图像。() 在聚碳酸酯膜上排列的基质细胞.(B) 在基质细胞之上播种分化神经元细胞。缩放条形图 = 500 nm。请单击此处查看此图的较大版本.

分析技术 潜在影响
定量实时聚合酶链反应 研究胶原蛋白标记物 (i、III 和 V)、纤维化标记的α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 和主要的调解人在 DM 包括胰岛素生长 factor-1 (IGF-1) 和它的受体 (IGF1-R)
透射电子显微镜 研究结构变化, 如胶原纤维和细胞 ECM 相互作用
荧光 用化学结合荧光染料的特异抗体研究细胞抗原

表 1: 分析技术。

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Discussion

有几项研究的重点是开发各种动物模型, 可以帮助人们更好地了解角膜疾病以及发现治疗方法。然而, 这些研究对人类的重要价值还没有得到证实。到目前为止, 由于其显著的临床意义, 各种类型的体外模型已经得到了发展和广泛的研究。我们以前建立的 3D在体外模型是一个新的系统, 大大有助于医学科学进步的视觉研究和显示完美的能力, 综述在体内事件在体外28,29,30. 本议定书的目的是开发下一代的这个体外角膜模型, 可用于研究与角膜疾病相关的并发症的细胞和分子机制, 如糖尿病角膜, 圆锥和福斯。这种进步可以为发现临床上急需的新疗法提供坚实的基础。

这个模型可以帮助确定在 DM 和其他角膜疾病中发生的不同的结构和细胞改变。这就提供了实质性的影响, 包括在最初阶段筛查这些疾病的可能性, 从而可能有助于疾病管理。本文所提出的模型简单, 但具有很高的创新性。其中一个最重要的优点是, 角膜基质细胞被允许分泌和组装自己的 ECM, 而不是被播种到人工环境。此外, 神经可以分化到更准确的模型角膜基质神经相互作用。因此, 该方法提供了研究人角膜基质和神经网络的能力, 以及在基质环境中居住的细胞。这个文化平台将允许对复杂的细胞细胞和细胞基质相互作用的未来的研究, 影响角膜的病态状态。这 3D的体外模型方法预计将提供改进和新的洞察疾病机制, 特别是当与现有的传统文化系统或动物模型相比。

这一 3D体外模型的描述将为未来的治疗和发现铺平道路。

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Disclosures

作者声明没有竞争的金融利益。

Acknowledgments

我们衷心感谢 Dr. 本. 福勒在 TEM 实验中的技术帮助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Healthy corneal tissue NDRI Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease
Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) Gibco by Life Technologies 14190-144
Sterile forceps Fischer Scientific 13-812-42 Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps
Single edge razor blades Personna 270100
Sterile surgical scalpel blades No.10 Feather Surgical Blade 2976#10
Eagle’s Minimum Essential Medium ATCC 30-2003
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550 10% FBS is required for media preparation
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco by Life Technologies 15240-062 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation
0.05% Trypsin EDTA(1X) Gibco by Life Technologies 25300062
Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores Corning Costar 3412
2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) Sigma-Aldrich SMB00390-14 A concentration of 0.5 mM should be used for the study
Wax block VWR 50-949-027
SH-SY5Y Neuroblastoma cells ATCC SHSY5YATCC CRL-2266
Retinoic Acid Sigma-Aldrich SRP3014-10UG Final concentration of 10uM needs to be used
BDNF Sigma-Aldrich R2625-100MG Final concentration of 2nM needs to be used
Dimethyl Sulfoxide(DMSO) VWR-Alfa Aesar 67-68-5 Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) Fisher Scientific 12-565-351
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) Fisher Scientific 12-565-349

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References

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发育生物学 问题 131 角膜 3D体外模型 人角膜成纤维细胞 共培养 神经细胞 维生素 C
角膜组织工程: 人角膜间质神经相互作用的<em>体外</em>模型
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Sharif, R., Priyadarsini, S., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea. J. Vis. Exp. (131), e56308, doi:10.3791/56308 (2018).

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