Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige dreidimensionale in-vitro- Modell, wo Stromazellen Hornhautzellen und differenzierten neuronalen Zellen zusammen kultiviert werden, bei der Untersuchung und das Verständnis der Wechselwirkungen der beiden Zelltypen zu unterstützen.
Abstract
Gewebetechnik hat erhebliche Anerkennung aufgrund der hohen Nachfrage nach Ersatz der menschlichen Hornhaut mit schätzungsweise 10 Millionen Menschen weltweit leiden an Hornhaut Vision Verlust1gewonnen. Um der Nachfrage nach tragfähigen menschlichen Hornhaut, erhebliche Fortschritte im dreidimensionalen (3D) Gewebe erzielt Engineering2,3,4. Diese Hornhaut Modelle reichen von einfachen Monolage Systeme zu vielschichtigen Modelle, 3D Full-dicke Hornhaut äquivalente2.
Jedoch die Verwendung der 3D Tissue-Engineering Hornhaut im Zusammenhang mit der in-vitro- Krankheitsmodelle bis Datum fehlt Ähnlichkeit mit der vielschichtigen 3D Hornhautgewebe Struktur, Funktion und die Vernetzung der verschiedenen Zelltypen (z.B. Nerven, studierte Epithel, Stroma, Endothel)2,3. Darüber hinaus stieg die Nachfrage nach in Vitro Hornhaut Gewebemodelle in einem Versuch zur Verringerung von Tierversuchen für pharmazeutische Produkte. So, anspruchsvollere Modelle sind erforderlich, um Systeme zu menschlichen physiologischen Bedürfnissen besser zu entsprechen, und ist die Entwicklung eines Modells, die mehr für das Patientenkollektiv ist absolut notwendig. Angesichts der Tatsache, dass mehrere Zelltypen in der Hornhaut Krankheiten und Dystrophien, wie z. B. Keratokonus, diabetische Keratopathie und Fuchs betroffen sind, enthält dieses Modell ein 3D Kokultur Modell der primären menschlichen Hornhaut Fibroblasten (Treibgasen) von gesunden Spendern und Neuronen aus die SH-SY5Y-Zell-Linie. So können wir zum ersten Mal um die Wechselwirkungen zwischen den beiden Zelltypen innerhalb der menschlichen Hornhaut Gewebe zu untersuchen. Wir glauben, dass dieses Modell könnte potenziell sezieren die zugrunde liegenden Mechanismen zugeordnet die stromale Nerv Interaktionen von Erkrankungen der Hornhaut, die Nerven Schäden aufweisen. Dieses 3D Modell spiegelt die grundlegende anatomische und physiologische Natur des Hornhautgewebes in Vivo und in Zukunft als Instrument für Hornhaut Mängel zu untersuchen sowie die Wirksamkeit der verschiedenen Akteure vor Tierversuchen screening einsetzbar.
Introduction
Im menschlichen Körper ist die Hornhaut das am dichtesten innervierten Gewebe. Die Nerven sind verantwortlich für verschiedene Empfindungen wie Berührung, Schmerz, Temperatur und haben auch eine wesentliche Rolle bei der Wundheilung, blinken Reflexe, tear, Produktion und Sekretion5,6,7. In der Hornhaut stromale Nerven Stämme ergeben sich aus der limbischen Plexus und geben Sie die periphere Hornhaut Stroma radial. Die stromale Nerv Organisation ist parallel zu der Kollagen-Lamellen und verzweigen sie weiter in kleinere Hefte wie sie in Richtung der oberflächlichen Stroma5,8 gehen. Die Nervenfasern weiter dringen die Epithelschicht und somit Innervation ist weit verbreitet über die Hornhaut-Epithel und Stroma. Daher hat die Innervation eine wesentliche Rolle bei der gesunden und kranken Zustand der Hornhaut. In diesem Protokoll zeigen wir die Weiterentwicklung eines neuartigen 3D in-vitro- Modells, das erste seiner Art, die in Vivo Stromazellen Nerv Interaktionen zu imitieren. Die SH-SY5Y-Zell-Linie wurde für diese Studie verwendet, da es eines der etabliertesten, gut charakterisierten Linien verwendet, um neuronale Wachstum zu untersuchen ist. Die SH-SY5Y-Zell-Linie wurde beschrieben, beide Substrat haftend (S-Typ) zu produzieren und neuroblastic (N-Typ) Zellen, die Transdifferenzierung9durchlaufen kann. Infolgedessen, obwohl diese Zelllinie aus einer Auswahl von drei aufeinanderfolgenden Subclone N-Typ-Zellen abgeleitet ist, enthält es auch eine kleine Anzahl von S-Typ-Zellen in der Lage, einer Differenzierung in Neuronen durch den Einsatz von Retinoic Säure und Gehirn abgeleitet neurotrophen Faktor9. Dies bietet ein Werkzeug, das zu einem besseren Verständnis der Hornhaut Komplikationen im Zusammenhang mit diabetischer Retinopathie (DM) und anderen okulären Erkrankungen führen kann. Aufgrund der Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Erlangung und Kultivierung Neuronen von Patienten mit okulärer Erkrankungen bietet dieses 3D in-vitro- Modell erhebliche Auswirkungen auf die Untersuchung der neuronalen Wechselwirkungen und Signalisierung mit der Hornhaut Stroma.
Erkrankten Bedingungen betreffen häufig verschiedenen Geweben des Körpers zu einem sehr großen Maßstab, was zu einer kompromittierten Lebensqualität. Okuläre Dystrophien sind häufige Komplikationen, die oft im Zusammenhang mit systemischen Erkrankungen und zum Verlust der Sehschärfe oder sogar dauerhafte Sehverlust führen. Umfassende Studien sind oft unerlässlich für ein besseres Verständnis der Krankheitszustand sowie die Auswirkungen auf die basalen zellulärer Ebene. Um die Auswirkungen von Krankheiten zu untersuchen, wurden in Vivo und in Vitro -Modelle mit Hilfe des Tissue engineering-Anwendungen entwickelt. Hornhautgewebe Konstruktionsanwendungen haben großes Interesse in verschiedenen Bereichen der Wissenschaft,10,11,12,13,14sammelte, aber es gibt nach wie vor erhebliche Einschränkungen während konkrete Anwendung, einschließlich der Hornhaut Transplantat Ablehnungen, Infektionen und Narbenbildung10,11,12,13,14. Es gibt mehrere Studien, die erfolgreich entwickelt und hergestellt von verschiedenen in-vitro- Modelle3,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26. Die 3D in-vitro- Modelle sind die vielversprechendsten und von großem wissenschaftlichen Interesse. 3D Modelle sind dafür bekannt, die in Vivo zellulärer und physiologischer Ereignisse besser zu spiegeln, die sind kritische während Fibrose und Wunden heilenden15,27,28,29. Diese in-vitro- Modelle spielen eine wesentliche Rolle bei der Suche nach neuen Therapieansätzen für die Behandlung von verschiedenen Erkrankungen einschließlich der Hornhaut Komplikationen. Trotz der wichtigen Rolle der Innervation in Hornhaut Funktionen hat wenig Anstrengungen unternommen, Förderung der peripheren Nerven Verbreitung innerhalb der Hornhaut Tissue Engineering Konstrukten2,3. Allerdings imitieren die vorgeschlagenen 3D in-vitro- Zelle Konstrukte Zielgewebe um die gewünschte Gewebe-Funktionalität zu erreichen.
Während diabetische Keratopathie eine offensichtliche Anwendung für das Modell durch die neuronale Defekte hier beschrieben ist, gibt es mehrere andere Hornhauterkrankungen, die von einem menschlichen in-vitro- Modell einschließlich Keratokonus und Fuchs Dystrophien profitieren können. Unser 3D Modell ergibt sich aus dieser Perspektive und schlägt die Entwicklung einer in-vitro- Darstellung des Hornhautgewebe Drug-Delivery bewerten und neue ocular Arzneimittelsicherheit.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt den Richtlinien von der Universität von Oklahoma Health Sciences Center/Institutional Review Board (IRB #4509). Alle Teile des Protokolls erfüllt die Grundsätze der Erklärung von Helsinki. Hornhaut Proben stammen von der nationalen Entwicklung und Research Institute (NDRI) und die Oklahoma Lions Hornhautbank.
1. Isolation von Primärzellen
- Nach Erhalt der menschlichen Hornhaut Gewebeproben, die Gewebe in ein 21,5 cm2 Petrischale mit 2 mL sterile Dulbecco Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) übertragen (1 X).
- Kratzen Sie und entfernen Sie das Hornhaut-Epithel durch die Positionierung der Hornhaut Kuppel nach oben. Um vollständige Entfernung zu gewährleisten, die Epithelschicht gründlich mit einer Rasierklinge in einem 45°-Winkel abkratzen. Als nächstes drehen Sie die Hornhaut Kuppel verdeckt und kratzen Sie gründlich des Endothels aus dem Stroma mit einer Rasierklinge in einem 45°-Winkel zur vollständigen Entfernung zu gewährleisten ab. Waschen Sie die stromale Gewebe mit DPBS.
- Geschnitten Sie die stromale Gewebe klein, mit einer Nummer 10 chirurgische Klinge, halten die stromale Stücke nass zu aller Zeiten mit DPBS. Abholung Stromazellen Stücke mit sterilen Pinzette und Ort in einem T25-Kultur-Kolben ohne Medien (4 oder 5 Stücke von 2 x 2 mm Gewebe pro Flasche).
- Ermöglichen Sie die Explantaten an der Unterseite des Kolbens bei 37 ° C für ca. 30-40 min halten. Sobald eingehalten, langsam Hinzufügen des Adlers minimale wesentliche Medium (EMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Antibiotikum/Antimycotic in den Kolben ohne zu stören die Explantaten.
- Legen Sie den Kolben vorsichtig im Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2. Die Explantaten ungestört zu verlassen, bis die Zellen zu isolieren beginnen und die Migration in die Flasche. Nach ca. 2-4 Wochen sollten die Zellen 100 % Zusammenfluss erreichen. Bei 100 % Zusammenströmen Durchgang der Zellen durch das Entfernen der Zellkultur-Medien und waschen Sie die Zellen mit DPBS.
- Die Zellen Trypsin hinzufügen und sie dann bei 37° c inkubieren Sehen Sie nach ca. 5 min die Zellen unter Lichtmikroskopie zu bestätigen, dass sie getrennt haben, und dann anhalten Sie der Proteolyse durch Hinzufügen von neuen Medien.
- Übertragen die Zellsuspension in ein 15 mL konische Röhrchen für Zentrifugation bei 1.000 x g. überstand vorsichtig entfernen ohne zu stören das Pellet und hängen Sie die Zellen in frischen EMEM 10 % FBS 1 % Antibiotika. Zählen der Zellen und Samen ca. 1 x 106 Zellen in T75 Kultur Kolben für den weiteren Ausbau mit frischen EMEM 1 % FBS 1 % Antibiotika.
2. primäre Treibgasen Kultur und 3D Konstrukte Montage
- 3D zusammenzubauen explants Konstrukte aus zuvor gewachsen in EMEM 10 % FBS 1 % Antibiotikum/Antimycotic, Passage und Graf Treibgasen.
- Samen ca. 1 x 106 Zellen/Well des primären Treibgasen auf Polycarbonat-Membran-Einsätze mit 0,4 µm-Poren von 3D Konstruktionen, zusammen mit 1,5 mL frische EMEM 10 % FBS 1 % Antibiotikum/Antimycotic an die Spitze des Konstrukts. Fügen Sie eine weitere 1,5 mL des gleichen Mediums am unteren Rand jedes Konstrukt.
- Nach 24 Stunden der Zelle Aussaat, Kultur der Zellen mit EMEM 10 % FBS 1 % Antibiotikum/Antimycotic mit 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic Säure (Vitamin C) durch Hinzufügen von 1,5 mL auf der Oberseite und 1,5 mL auf der Unterseite jedes Konstrukt stimuliert.
- Pflegen Sie die Kulturen im Brutschrank bei 37 ° C, 5 % CO2 für 3 Wochen und liefern Sie frische Medien täglich während des gesamten Studiums. Keine weiteren Durchgang ist erforderlich.
(3) Zell-Differenzierung und Ko-Kulturen
- Nach 3 Wochen hinzufügen 8 x 103 Zellen/gut von den SH-SY5Y menschlichen Neuroblastoma Zellen auf der Oberseite der vorher montierten 3D konstruiert mit 1,5 mL von der EMEM mit 10 % FBS, 1 % Antibiotikum/Antimycotic und 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic Säure (Vitamin C).
- Lassen Sie die SH-SY5Y Neuroblastom-Zellen auf die Hornhaut Stromazellen Zellen für mindestens 24 Stunden vor dem Beginn der Zelldifferenzierung wachsen.
- SH-SY5Y-Zell-Differenzierung durch die Stimulierung der Zellen mit EMEM mit 1 % FBS und 1,5 mL von 10 µM zu initiieren Retinsäure auf das Konstrukt. 1,5 mL EMEM 10 % FBS 1 % Antibiotikum/Antimycotic 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic Säure (Vitamin C) an der Unterseite des Konstrukts hinzugeben. Beachten Sie, dass die Retinsäure Schritt im Dunkeln durchgeführt werden sollte.
- Weiterhin die Zellen in dieser Differenzierung Medien Kultur für 5 Tage.
- Wenn die Zellen die Differenzierung Phase erreicht haben, wechseln Sie die Zellen in 1,5 mL serumfreien Medium mit 2 nM von Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF) und 1 % Antibiotikum/Antimycotic hinzugefügt, EMEM, indem man an die Spitze des Konstrukts. 1,5 mL EMEM 10 % FBS 1 % Antibiotikum/Antimycotic 0,5 mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic Säure (Vitamin C) an der Unterseite des Konstrukts hinzugeben. Beachten Sie, dass der BDNF-Schritt im Dunkeln durchgeführt werden sollte.
- Kulturzellen Sie für 2 weitere Tage vor der Verarbeitung für weitere Analysen wie in Tabelle 1angegeben.
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Representative Results
Abbildung 1 ist ein Schritt für Schritt repräsentatives Bild von 3D in-vitro- Arbeitsmodell. Im ersten Schritt werden Zellen aus menschlichen Hornhaut isoliert. Dann sind sie auf einer Polycarbonat-Membran angebaut und mit Vitamin C zu eine Self sekretierte 3D Matrix montieren stimuliert. Dieses 3D Konstrukt System induziert die Synthese von einem vielschichtigen zellulären in Vivo-wie Stromazellen Matrix. Danach sind Neuroblastom-Zellen auf die stromale Zellen, gefolgt von neuronalen Zelldifferenzierung initiiert ausgesät. Dies führt zu der Kokultur Stromazellen Hornhautzellen und differenzierte Nervenzellen im 3D in-vitro- Modell. Abbildung 2 ist die hohe Vergrößerung Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Bild der 3D selbstgebaute Konstruktion (Abbildung 2A) zeigt die Polycarbonat-Membran und Stromazellen Hornhautzellen ausgesät obenauf, sezernierenden eine selbstgebaute matrix gefolgt von (Abb. 2 b) differenzierte neuronale Zellen ausgesät an der Spitze zeigt eine stromale neuronale Zelle Anordnung. Die Pfeile im Bild zeigen die neuronalen Zellen. Angesichts der direkten Übersprechen zwischen die Hornhaut Stroma und neuronalen Zellen, glauben wir, dass die Hauptakteure, die die Regulierung der Hornhaut Mängel betreffen im Stroma Layer vorhanden. Daher stellt dieses Modell einen menschlichen neuronalen in-vitro- Modell differenzierenden SH-SY5Y Neuroblastom Zellen in eine nachhaltige neuronale Morphologie durch die Kombination mit unserem vorher festgelegten 3D-Modell der extrazellulären Matrix (ECM) Kultivierung mit verschiedenen ausschlaggebenden Faktoren. So vermuten wir, dass dieses Modell zukünftige Studien der morphologischen und molekularen Unterschiede zwischen gesunden und Kranken ECM ermöglichen wird. Wir glauben, dass dieses neuartige 3D in-vitro- Modell hilft, wesentliche Aspekte der Hornhaut Stroma-Nerv Interaktionen Hornhaut Pathologie zugeordnet zu sezieren und ebnen den Weg für die Entwicklung neuer Therapeutika.
Abbildung 1: anschauliche Darstellung 3D in Vitro Kokultur Modell in gewissem Sinne schrittweise. Dieses Bild zeigt die Zelle Isolierung von der menschlichen Hornhaut und Stromazellen Zellen ausgesät auf einer Polycarbonat-Membran, befindet sich in der 3D Konstruktion, in EMEM kultiviert und stimuliert mit Vitamin c. Darüber hinaus sind differenzierte Nervenzellen gezeigt, um auf die stromale Zellen ausgesät werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Hohe Vergrößerung TEM Bild 3D in-Vitro -System. (A) Stromazellen Zellen Anordnung auf der Oberseite der Polycarbonat-Membran. (B) gesetzte differenzierte Nervenzellen auf die stromale Zellen. Skalieren von Balken = 500 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Techniken für die Analyse | Mögliche Auswirkungen |
| Quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion | Kollagen-Marker zu untersuchen (Col I, Col III und V Col), fibrotische Marker Alpha-Glattmuskel Aktin (α-SMA) und wichtige Mediatoren in DM einschließlich Insulin Wachstumsfaktor-1 (IGF-1) und es ist Rezeptor (IGF1-R) |
| Transmissions-Elektronenmikroskopie | Strukturelle Veränderungen sind wie Kollagen-Fibrillen und Zelle-ECM-Interaktionen untersucht. |
| Immunfluoreszenz | Verwendung der spezifischen Antikörper konjugiert chemisch zu fluoreszierenden Farbstoff, zelluläre Antigene zu untersuchen |
Tabelle 1: Analyse-Techniken.
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Discussion
Mehrere Studien konzentrierten sich auf die Entwicklung von verschiedenen Tiermodellen, die helfen, ein besseres Verständnis von Erkrankungen der Hornhaut entwickeln können, sowie Behandlungen zu entdecken. Ein erheblichen Wert für den Menschen aus diesen Studien wurde jedoch nicht bestätigt. Bisher sind verschiedene in-vitro- Modelle entwickelt und weithin wegen ihrer bemerkenswerten klinischen Bedeutung untersucht. Unser vorher festgelegten 3D in-vitro- Modell ist ein neuartiges System, das maßgeblich trägt zur medizinischen Wissenschaft Fortschritte in der Vision Forschung und zeigt makellose Fähigkeit der Rekapitulation in Vivo Ereignissen in-vitro-28 , 29 , 30. Ziel dieses Protokolls ist es, die nächste Generation von diesem in Vitro Hornhaut Modell zu entwickeln, die zur zelluläre und molekulare Mechanismen der Komplikationen im Zusammenhang mit Hornhauterkrankungen wie diabetische Keratopathie, Keratokonus Untersuchung , und Fuchs. Diesem Fortschritt könnten solide Grundlagen für die Entdeckung neuer Behandlungsmethoden, die klinisch dringend notwendig sind.
Dieses Modell kann helfen bei der Identifizierung von verschiedenen strukturellen und zellulärer Veränderungen in DM und anderen Hornhauterkrankungen. Dies bietet erhebliche Auswirkungen, einschließlich der Möglichkeit für das Screening für diese Krankheiten im Anfangsstadium, potenziell mit Disease-Management zu helfen. Das Modell schlug hier ist einfach, aber es ist sehr innovativ. Einer der wichtigsten Vorteile ist, dass die stromale Hornhautzellen dürfen zu sezernieren und montieren ihre eigenen ECM statt auf einer künstlichen Umgebung ausgesät. Darüber hinaus dürfen die Nerven genauer Modell Hornhaut Stromazellen Nerv Interaktionen zu unterscheiden. Diese Methode liefert die Fähigkeit, die menschliche Hornhaut Stroma sowie Nerven-Netzwerk und die Zellen, die sich innerhalb der Stroma-Umgebung befinden. Diese kulturelle Plattform ermöglicht zukünftige Untersuchungen komplexer Zell-Zell und Zelle-Matrix Interaktionen, die die Kranken Staaten der Hornhaut zu beeinflussen. Diese 3D in-vitro- Modell-Ansatz wird erwartet, um bieten verbessert und neuartige Einblicke in Krankheitsmechanismus, insbesondere im Vergleich zu aktuellen konventionelle Kultur Systeme oder Tiermodellen.
Die beschriebenen Generation dieses Modells 3D in-vitro- ebnet den Weg für zukünftige therapeutische Behandlung und Entdeckungen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir möchten unseren aufrichtigen Dank Dr. Ben Fowler für seine technische Hilfe bei der TEM-Experimente zu verlängern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Healthy corneal tissue | NDRI | Samples from donors with no ocular trauma or systemic disease | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Sterile forceps | Fischer Scientific | 13-812-42 | Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps |
| Single edge razor blades | Personna | 270100 | |
| Sterile surgical scalpel blades No.10 | Feather Surgical Blade | 2976#10 | |
| Eagle’s Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | 10% FBS is required for media preparation |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco by Life Technologies | 15240-062 | 1% Antibiotic-Antimycotic is required for media preparation |
| 0.05% Trypsin EDTA(1X) | Gibco by Life Technologies | 25300062 | |
| Polycarbonate membrane inserts with 0.4-μm pores | Corning Costar | 3412 | |
| 2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma-Aldrich | SMB00390-14 | A concentration of 0.5 mM should be used for the study |
| Wax block | VWR | 50-949-027 | |
| SH-SY5Y Neuroblastoma cells | ATCC | SHSY5YATCC CRL-2266 | |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | SRP3014-10UG | Final concentration of 10uM needs to be used |
| BDNF | Sigma-Aldrich | R2625-100MG | Final concentration of 2nM needs to be used |
| Dimethyl Sulfoxide(DMSO) | VWR-Alfa Aesar | 67-68-5 | Ultra Pure Grade-Sterile DMSO to be used |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25) | Fisher Scientific | 12-565-351 | |
| Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75) | Fisher Scientific | 12-565-349 |
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