Summary
시 토 크롬 P450s에 의해 발암 성 니트로의 α-hydroxylation는 돌연변이 일으키는 원인이 되는 DNA 손상 중간체 생산 허용된 신진 대사 통로. 그러나, 새 데이터 나타냅니다 nitrosamides 산화 추가 발생할 수 있습니다. 우리는 일반 설명 nitrosamides을 탐지 하기 위한 방법 체 외에서 시 토 크롬 P450 촉매의 물질 대사 니트로에서 생산.
Abstract
N-니트로 시 토 크롬 P450 산화 전시 활동을 요구 하는 환경 발암 물질의 기초가 튼튼한 그룹. 대사 활성화의 허용된 메커니즘 저절로 DNA alkylating 에이전트를 분해 하는 α-hydroxynitrosamines의 대형을 포함 한다. DNA 손상의 결과 돌연변이 축적 궁극적으로 암으로 이어질 수 있습니다. 새로운 증거는 α-hydroxynitrosamines 수 수 추가 산화 nitrosamides에 processively 시 토 크롬 P450s에 의해 나타냅니다. Nitrosamides α-hydroxynitrosamines 보다 일반적으로 더 안정 하 고 또한 DNA를 알 수 있습니다, 때문에 nitrosamides 발암에 역할을 재생할 수 있습니다. 이 보고서에서 우리는 니트로의 생체 외에서 시 토 크롬 P450 촉매 물질 대사에서 nitrosamide 생산을 평가 하기 위한 일반 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 관련 nitrosamides 및 생체 외에서 시 토 크롬 P450 물질 대사 분석 결과 검색에 대 한 액체 착 색 인쇄기-nanospray 이온화 높은 해상도 탠덤 질량 분석을 사용 하 여 합성 하는 일반적인 접근 방식을 활용 합니다. 이 방법은 n ′-예제 연구에서 nitrosonornicotine의 작은 대사 산물으로 n ′-nitrosonorcotinine를 감지. 메서드는 높은 감도 및 선택적으로 인해 정확한 대량 검출. 다양 한 nitrosamine-시 토 크롬 P450 시스템에이 방법의 응용이이 변환의 일반 성을 결정 하는 데 도움이 됩니다. 시 토 크롬 P450s 다형성을 활동에서 변화 하기 때문에 개별 암 위험 평가에 도움이 수 nitrosamide 대형의 더 나은 이해.
Introduction
N-니트로 사 민 다이어트, 담배 제품 및 일반 환경;에 있는 발암 물질의 큰 클래스는 1인체에서를 endogenously 형성 수 있습니다 또한. 이상의 300 N-nitroso 화합물 테스트 및 > 90%에서 발암 성 평가 했다 동물 모델2,3. 그들의 성에 전시, 먼저이 화합물 시 토 크롬 P450s1,,23에 의해 작동 한다. 연구는 시 토 크롬 P450s 쉽게 산화 α-hydroxynitrosamines (그림 1)는 ~ 5의 반감기와 반응성이 매우 높은 화합물에 니트로 자발적으로 alkyldiazohydroxides를 분해 하기 전에 s. 후자는 H2O N2의 손실 후에 DNA을 알 수 있습니다. 결과 DNA adducts unrepaired, 암 개발1이어질 중요 onco-또는 종양 억제기 유전자는 돌연변이 일으킬 수 있습니다. 이러한 이유로, 많은 노력 변화 통로의 완전 한 이해를 얻으려고 소비 되어, DNA adducts, 그리고 발암 성 니트로의 시 토 크롬 P450 산화의 다운스트림 대사 산물. 이 지식에 개별 암 위험 평가4잠재적인 응용 프로그램 합니다.
그림 1: 일반 및 니트로의 제안 된 대사.
(1) 니트로 P450s α-hydroxynitrosamines (2) 자발적으로 alkyldiazohydroxides (3)을 분해 하는에 산화 됩니다. 이러한 화합물 형태로 DNA adducts DNA에 바인딩할 수 있습니다. 그것을 가정 했다 그 2 는 nitrosamides 4P450s에 의해 더 산화 된다. 이러한 형태로 소설 DNA adducts 또는 3 알려진된 DNA adducts 형태로 분해 DNA에 직접 바인딩할 수 있습니다. R1 과 R2 알 킬 그룹을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Α-hydroxynitrosamine 가설을 단단하게 광범위 한 데이터에 의해 지원 됩니다, 하지만 몇 가지 불일치;는 주요 것은 α-hydroxynitrosamines5,6의 짧은 반감기 이다. 이러한 화합물 바인딩과 그물 막에 생산 고 나중 핵 DNA를 알 알려져 있다. 몇 초 그들의 일생을 감안할 때, 그것은 어떻게 이러한 중간체 살아남을 필요한 여행 하지만 cytosol 수수께끼 이다. 하나의 가설은 이다 α-hydroxynitrosamines의 부분 산화 processively는 nitrosamides7,8, 비교9에서 매우 안정적입니다. 이것은 아마도 시 토 크롬 P450 활성 사이트에서 α-hydroxynitrosamines의 보존을 통해 발생 합니다. 산화의이 유형에 대 한 전례가 니코틴10, 알콜11, 그리고 간단한 alkylnitrosamines12,13보아 왔다. 또한, nitrosamides는 직접 연기 발암 물질2,3. 9그들의 반응 따라, 이러한 화합물 생산 DNA adducts 함께 새로운 α-hydroxynitrosamines에서 인 동일 하, 미개척된 DNA adducts (그림 1) 추정 된다. 따라서,이 가설 뿐만 아니라 설명 한다 cytosol, 통해 전송 하지만 또한 DNA의 형성 제품 손상.
이 문서에는 생체 외에서 시 토 크롬 P450 중재 변환 니트로의 nitrosamides 평가 하기 위한 일반 프로토콜을 설명 합니다. N ′-nitrosonorcotinine (NNC) 시 토 크롬 P450 2A6에 의해 n ′-nitrosonornicotine (NNN)의 이전에 보고 된 변환 예제14로 전시 됩니다. 다양 한 기질-효소 시스템에이 프로토콜의 응용 프로그램 전반적인 nitrosamine 대사 nitrosamides의 중요성을 결정 하는 데 도움이 됩니다.
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Protocol
1. 자료 및 일반 절차
- 종합 NNN 앞 15에서 설명한. Norcotinine, P450 2A6 Baculosomes, NADPH 재생 시스템, 0.5 x 반응 버퍼, 및 다른 모든 화학 시 약 급료에 상용 소스 로부터 용 매 또는.
- 500 MHz 분석기에 기록 NMR 스펙트럼. 보고서 화학 당 부품으로 교대 백만 (ppm). 잔류 용 매 피크를 사용 하 여 내부 참조 1 H NMR (7.26 ppm CDCl 3)와 13 C NMR (77.2 ppm CDCl 3).
참고: 피크 분할은 다음과 같은 약어를 사용 하 고 있다: s 내의 d = 더블 릿, dd = = 남자, dt의 남자 용 상의 삼중 항, dq의 더블 릿 = 사중주, ddd의 더블 릿 = = 남자, 그리고 m의 남자 용 상의의 더블 릿 multiplet =. - LTQ Orbitrap Velos와 m/z로 보고서 데이터에 선택 된 화합물에 대 한 고 분해능 질량 분석 (HRMS) 수행.
- 사용 polygram 미리 254 nm 형광 표시기 얇은 층 크로마토그래피 (TLC)와 실리 카 젤 TLC 판 (40 m m x 80 m m, 두께 0.2 m m) 코팅. UV 램프 조사 하 여 TLC 번호판을 시각화.
- 1.5 cm x 15 cm 유리 열을 사용 하 여 Å, 70-150 메쉬 실리 카 젤 60에 플래시 크로마토그래피를 수행.
2. Nitrosamide 긍정적인 통제의 준비 (N ′-nitrosonorcotinine, NNC)
- 건조, 하룻밤 오븐에서 (16 h, ~ 140 ° C), 25 mL, 둥근 바닥 플라스 크 자기 볶음 bar가 포함 된. 아침에 차가운 흐름의 N 2 N 2 흐름을 유지 하는 석유 bubbler를 사용 하는 동안 플라스 크 속도 초당 1 개 거품.
참고: 냉각 후, 아무 주의 N 2 플라스 크를 유지 하는 필요. - 연기 후드, norcotinine (31.8 mg, 0.196 mmol), 아세트산 무수 물 (5 mL), 및 초 산 (1 mL)을 추가 냉각된 플라스 크. 지속적으로 물이 얼음 욕조와 0 ° C에 냉각 하는 동안이 혼합물을 저 어.
주의: 아세트산 무수 물과 아세트산은 부식성. - 추가 나노 2 (33.3 mg, 0.483 mmol) 한 부분을 지속적으로 2.5 h. TLC에 의해 모니터 반응 진행에 대 한 혼합물을 저 어 (100 %EtOAc, R f = 0.19, 단계 1.4 참조).
참고:이 시간이 지남에 혼합 될 것입니다 점점 노란색 가끔 버블링. - (18 mL) 얼음 처럼 차가운 H 2 O로 혼합물을 붓는 의해 반응을 끄다. 바로 채널 2 Cl 2 100 mL separatory 깔때기에 18 mL와 용액을 추출 합니다. 추출 물의 레이어 채널 2 Cl 2 (각 9 mL)와 적어도 2 추가 시간.
- 풀링된 생명체 2 분 필터 MgSO 4 이상 ~ 100 mg을 건조 하 고 원유, 노랑, 석유를 회전 증발에 의해 솔루션을 집중. 증발 잔류 초 산을 제거 하는 동안 30 ° C에 물 목욕 열.
참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 화합물 채널 2 Cl 2와 2-8 ° c.에 어둠 속에 저장 하는 솔루션에 용 해 하는 경우 - 칼럼 크로마토그래피에 의해 원유 화합물 정화 (단계 1.5 참조) 실리 카 젤을 사용 하 여 고정 위상 및 100%로 EtOAc eluent 16.
주의: NNC와 관련된 nitrosamides 처리 주의 그들은 인간의 발암 물질로 간주 됩니다. - CDCl 3 순수 화합물을 녹이 고 NMR을 사용 하 여 (단계 1.2 참조) 구조를 확인 하 고이 솔루션 17의 몰 확인 하. 2-8 ° C까지 필요에 어둠 속에서이 솔루션을 저장.
참고:이 솔루션 (3.5 단계)의 체 외에 분석 결과에 긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다. NMR 스펙트럼 및 화학 교대 지원 정보에서 사용할 수 있습니다. - 순수한 NNC 솔루션으로는 정확한 확인 질량 부모 고 1.3 및 4.3 단계에서 설명 하는 매개 변수에서 고해상도 질량 분 서 계 (HRMS)에 직접 주입 하 여 제품 이온 대중의 결정.
참고: 제품 질량 체 외에 대사 분석 결과 (4.3 단계)에서 화합물 검출을 위해 사용 됩니다.
3. 예제 nitrosamine P450 생체 외에서 부 화
- -80 ° C 냉동 고에서 P450 2A6 Baculosomes, 생생한 NADPH 재생 시스템, 그리고 10 mM NADP + 재고 솔루션을 제거 하 고 얼음에 녹여 그들. 일단 해 동, 희석 Baculosomes 및 NADPH 재생 시스템 1: 10과 1:50, 0.5 X 반응 버퍼 단일 1 mL 튜브에 각각. 마찬가지로, 추가 반응 버퍼 X + 재고 솔루션 0.5 97 μ를 NADP의 3 μ.
참고: NADP +은 빛에 민감한입니다. 이 솔루션의 컨테이너 알루미늄 호 일에 감싸서 보호 유지. 효소 솔루션은 민감한 freeze-thaw 주기; 이 2 개 이상의 주기를 제한 합니다. Aliquots 미래 실험을 위한 필요에 따라 준비. - 각 보육에 대 한 추가 50 μ 효소 솔루션 (5 pmol P450 포함) 1 mL의 튜브 반응 버퍼와 4 μ M NNN 솔루션의 포함 40 μ. 미리 물을 욕조를 사용 하 여 37 ° C에서 2 분에 대 한이 새로운 혼합물을 품 어 고 희석된 NADP + 솔루션의 10 μ를 추가 합니다. 37에 1-30 분에 대 한 전체 시스템을 품 어 ° c.
참고: 보육 시간 5 분 간격을 사용 하 여 (예: 5, 10, 15 분, 등) 충분 한 nitrosamide 형성 시간 코스를 제공 합니다. - 원하는 보육 시간 후 3.0 N ZnSO 4의 첫 번째 추가 10 μ와 3.0 N Ba(OH)의 다음 10 μ 끄다 2. 소용돌이이 솔루션 및 백색 침전 물은 형성할 것 이다. 원심 침전 작은 4 분 8000 x g에서 샘플.
참고: 절차 해야 하지 일시 중지이 단계에서 수성 해결책에 있는 안정성을 제한 하는 구성 된 nitrosamides로 합니다. 허위 제외 어 긴 일시 중지 될 수 있습니다. - 즉시는 상쾌한 플라스틱 및 액체 크로마토그래피 긍정적인 nanoelectrospray-이온화 고해상도 탠덤 질량 분석에 의해 2 μ를 분석 (LC-NSI +-HRMS/MS, 4.1 4.3 단계).
- 긍정적인 제어 외피에 대 한 흐름의 N 2 1 mL 튜브에 합성된 NNC 솔루션의 100 fmol을 포함 하는 약 수를 증발. 이 유리병에 3.2 단계에서 전체 효소 시스템을 추가 하 고 3.3-3.4 단계에 설명 된 대로 진행.
- 부정적인 제어 외피 수행 실험 설명된 (3.2-3.4 단계)로 바꾸기는 50 μ 효소 반응 버퍼 X 0.5 솔루션 제외.
4. LC-NSI +에 의해 nitrosamide 탐지에 대 한 매개 변수 예제-HRMS/MS
- LC에 대 한 구성 요소를 사용 하는 상업, 손 포장 18 C18 UPLC 시스템 단계 4.2에서에서 다음과 같은 여러 단계로 그라데이션 적용 (5 μ m), 100 m m x 75 μ m, 15 μ m 구멍 모 세관 칼럼.
- 용 매와 용 매 b MeCN로 사용 하 여 5 mM NH 4 OAc 1 μ/분 5 %B 실행 하 여 열에 샘플을 로드 0-5 분, 그리고 다음 이후에 0.3 μ/분 유량을 둔화. 다음, 실행 그라디언트 5에서 20% 이상 4 분, 55% B 10 분 이상 램프 및 다음 5%를 다시 평형 b.
- 수행 LC NSI +-LTQ Orbitrap에 HRMS/MS. 전체 검사와 MS 2 조각화 NNC 위한 모니터. 60, 000의 해상도에서 전체 검사를 수행 하 고 5 ppm의 대량 허용에 정확한 부모 질량 (192.07670)를 추출 합니다. 격리 하 부모 이온 (2.0 amu) 및 조각 충돌 유도 된 분리 (CID) 충돌 에너지 25 eV, 15000의 해상도의 여 고 30 양의 시간을 스캔 사용 MS 2 조각화 추출 NNC (m/z의 제품 이온에 대 한 정확한 질량 192 m/z 134.04739와 162.07874) 5 ppm의 대량 허용 오차에서.
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Representative Results
백인 외의 작업을 기반으로 합니다. 19, norcotinine 되었고 NNC에 니트로 소화 깔끔하게 높은 수율 (80-92%)에서 생체 외에서 실험에 대 한 표준 생산 하. 성공적인 반응에 대 한 구조적 증거 1H NMR, 13C NMR, 아늑한, 그리고 부모 질량 [M + H] 확인 HRMS 함께 HSQC (지원 정보)를 포함 하 여 분 광 분석에서 얻은+ 의 5 ppm 이내는 이론적인 값 (그림 2)입니다. MS2 조각화 NNC의 가장 풍부한 제품 이온 질량을 결정 하기 위해 사용 되었다. 대 중에서 체 외 분석 결과의 LC-NSI+-HRMS/MS 방법에서 사용 되었다 결정된 정확한 부모 질량과 제품 이온. 2-8 ° C에서 어둠 속에 저장 하는 경우 NNC 솔루션 3 개월 이상에 대 한 안정적입니다. 이것은 매우 일반적인 반응, 그것은 어떤 2 ° 아 미드를 응용 프로그램.
그림 2: HRMS와 HRMS NNC의2 스펙트럼.
5 ppm의 대량 허용 오차 NNC의 A) 정확한 부모 질량: 계산: [M + H]+ = 192.07675, 발견: 192.07670. 2.0 amu의 격리 폭 m/z 192의 B) MS2 조각. 두 개의 가장 풍부한 제품 이온은 134.04739 및 162.07875. 화학 res. Toxicol., 2016, 29, pp 2194-2205에서 허가로 증 쇄. 저작권 2016 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
합성된 NNC는 생체 외에서 P450 대사 분석 결과 대 한 표준으로 이용 되었다. 시 토 크롬 P450 2A6 NNN 산화20의 효과적인 촉매로 알려져 있다 때문에 사용 되었다. 마찬가지로, 그것은 α-hydroxylation21Km 에 근접 NNN 농도 2 μ M으로 설정 했다. 설명 하는 컬럼에 조건에서 합성 NNC elutes 부모 이온 제품 이온에서 잘 해결 봉우리 ~17.5 분 채널. 긍정적인 통제에 따라 NNC의 형성은 1, 5, 및 10 분 외피에 지적 했다.
그림 3: LC NSI HRMS chromatograms NNN-시 토 크롬 P450 2A6 외피에서 발생.
모든 섹션에 대 한 최고 크로마 대량 NNC에 대 한 전체 검색에서 추출 된 정확한 부모입니다. 중간과 하단 chromatograms는 두 정확한 제품 이온 대중의 NNC의 MS2 조각에서 추출. 섹션은 다음과 같습니다: NNC 표준 (A), NNC-시 토 크롬 P450 2A6 외피 포함 하는 모든 관련 효소와 cofactors 인큐베이션 타임 1 분 (B), (C), 5 분 및 10 분 (D). RT = 보존 시간; MA = 대량 지역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
NNC 수준 5 분에 최대한 고 나중 시간 포인트 감소. 상대 정량 표준 추정 최대 NNC 합성 NNC를 사용 하 여 레벨 10 nM. P450 시스템 부족 부정적인 컨트롤에서 전혀 NNC 형성 검색된 (데이터 표시 되지 않음), 따라서 나타내는 효소 변환 필요 했다. 함께,이 프로토콜 P450 2A6에 의해 NNC NNN의 변환에 대 한 직접 증거를 보여줍니다 형성의 정도 사소한에 비해 NNN의 α-hydroxylation.
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Discussion
니트로의 신진 대사를 elucidating 그들의 성에 이해 하는 중요 한 구성 요소입니다. 이기 때문에 관련 된 시 토 크롬 P450s와 다른 대사 효소 다형, 더욱이 지식을 응용 프로그램 식별할 수 있는 잠재적으로 위험이 높은 개인1,4. 새로운 데이터의 α-hydroxynitrosamines, DNA 바인딩에 관련 된 니트로의 추정된 주요 대사 산물을 더 산화, nitrosamides 하는 것은 가능 합니다; 그러나, 이것은 엄격 하 게 테스트 되지 기판의 넓은 범위에 걸쳐. 우리는 nitrosamides 체 외에 니트로의 processive 산화의 정도 결정 하기 위한 프로토콜을 설명 했습니다. 이 방법의 다양 한 응용 물질 대사의이 루트의 전반적인 중요성을 결정 하는 데 도움이 됩니다.
메서드는 표준 관심의 nitrosamide에 대 한 준비 하 여 시작 합니다. 예를 들어 연구에서는 NNC, 담배 발암 물질 NNN, 담배 제품14,22에 발암 물질의 가설된 대사 산물입니다. 설명 했 듯이, norcotinine의 니트로 뚜렷한 측면 제품을 원활 하 게 진행 됐다. 원유 제품만 시작 아 미드와 초 산, 열 착 색 인쇄기에 의해 쉽게 제거 했다에 의해 오염 되었다. 이것은 NMR와 HRMS 구조의 확인에 의해 선행 되었다. 이 방법의 장점은 조사를 여러 nitrosamine/nitrosamide 시스템을 수 있는 거의 모든 아 미드에 대 한 적합 하다는 것입니다. 또한, 정량에 대 한 NMR의 사용 표준 솔루션17몰의 직접 측정을 제공합니다. 역 상 HPLC 등 파괴적인 기술에 의해 불활성 조건 보다는 필요한 측정에서 화합물의 저장 수 있습니다. 그런 다음 다양 한 희석 실험 디자인에 맞게 만들 수 있습니다.
긍정적인 통제와 잘 특징이 대량 조각 패턴, 매우 민감하고 선택적 LC-NSI+-HRMS/MS 메서드는 비교적 복잡 한 행렬에 nitrosamides의 검색을 수 있습니다. 같이, 메서드는 1-10 nM 또는 2-20 fmol에 열 시작 nitrosamine, 효소, 다른 공동 인자 1000-fold 초과도 불구 하 고 NNC 농도 추정. 감도 및 선택 방법의 모니터링, 어떤 표준 LC-MS 시스템 부족 높은 해상도의 사용 예정 이다. 5 ppm 대량 공차와 부모 이온 선택 원하는 분자 공식으로 화합물만 격리 됩니다 보장 합니다. 마찬가지로, 그들의 보존 기간에 따라 두 가지 가장 풍부한 제품 이온의 정확한 질량 감지 추가 분석 확인을 제공합니다. 이 때문에, 질량 분석 방법은 많은 매개 변수 격리 너비, 충돌 에너지 및 검색 시간을 포함 하 여 최적화 된 필요 합니다. LC 그라데이션 또한 다른 물질과 공동 차입 작성 이온 트랩 대상 nitrosamide 제한으로 감도 개선 하기 위해 수정할 수 있습니다.
예를 들어 연구14, NNC 형성 사소한 했다. NNC는 대량 지역에 따라, ~ 4000-fold 적은 α-hydroxyNNN21의 분해 제품 보다 풍부. 이 나타내는 NNC는 NNN의 아주 사소한 대사 산물, 다른 시스템 다 수 있습니다. 게 외. dimethylnitrosamine 및 diethylnitrosamine;의 상당한, processive 산화를 발견 그러나, nitrosamide 중간 그들의 조건12에서 감지 되지 않았습니다. 여기에 설명 된 기술에 의해 그들의 시스템을 reanalyzing nitrosamide 형성을 계시 할 수 있었다 가능 하다. 그들의 형성 수준에 α-hydroxynitrosamines에 비해 nitrosamides의 높은 안정성으로 그들은 더 쉽게 셀을 전송 한다 이러한 화합물은 생물 학적 중요성을 나타낼 수 있습니다.
이 메서드는 대부분 nitrosamine 효소 시스템에 적용 될 것입니다, 하지만 몇 가지 제한이 있습니다. 가장 중요 한 것은 메서드는 양적. 예를 들어 실험에서 형성 긍정적인 컨트롤 샘플의 대량 spectrometric 피크 지역에서 추정 되었다. 보다 정확한 측정을 위해 isotopically 이라는 nitrosamide를 활용 하 여 동위 원소 희석 방법 개발 될 수 있습니다. 또 다른 방법은 N-acetyllysine 또는 N-진, 같은 화합물으로 트래핑 전략을 구현할 것 이라고 하지만이 우리의 손에14날짜에 실패 했다.
또 다른 한계는 nitrosamides의 경향을 쉽게9; 따라서 샘플을 개별적으로 처리 해야 합니다. 이 워크플로 속도가 느려집니다 하 고 샘플 분석에 대 한 공동 작업자를 전송 하지 않도록 합니다. 마지막으로, 그 시 토 크롬 P450 2A6 그리고 많은 다른 상업적으로 사용할 수 있지만, 일부 필요 단백질 표정과 정화를 주목 한다. 예,이 분석 결과 시 토 크롬 P450 2A1314에 적용 했다 하지만 그것은 엄격한 격리 프로세스23후 사용할 수만.
요약, 우리는 nitrosamides 시 토 크롬 P450 촉매 산화 니트로 체 외에서 발생을 탐지 하기 위한 프로토콜을 설명 했습니다. 프로토콜에는 긍정적인 제어 및 생체 외에서 시 토 크롬 P450 물질 대사 분석 결과 검색에 대 액정-NSI+-HRMS/MS를 사용 nitrosamide 표준에 대 한 일반적인 합성 포함 되어 있습니다. 예 연구에 NNC는 모든 외피까지 NNN의 사소한 대사 산물 뿐 아니라 1-10 분에서 시간에 검색 되었습니다. 다른 니트로에이 프로토콜의 응용 프로그램의 일반 및 nitrosamine 발암에 nitrosamides의 잠재적인 역할을 평가할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구 보조금에 의해 지원 되었다 아니. 캘리포니아-81301 국립 암 연구소에서. 우리 편집 지원에 대 한 칼 슨 밥, 박사 피터 Villalta 프리메이슨 암 센터의 분석 생화학 공유 리소스에서 질량 분석에 쉰 밍 박사 아담 T. Zarth 그리고 그들의 귀중 한 토론에 대 한 박사 안 나 공화국 미셸 감사 합니다. 그리고 입력. 분석 생화학 공유 리소스는 부분적으로 지원 하 여 국립 암 연구소 암 센터 지원 그랜트 CA-77598
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Norcotinine | AKoS GmbH (Steinen, Germany) | CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
| Acetic Anhydride | Sigma-Aldrich | 242845 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 431311 | |
| Barium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 433373 | |
| D-Chloroform | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| HPLC Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Chloride | Sigma-Aldrich | 34856 | |
| Sodium Nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit | Life Technologies | PV6140 | |
| Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | 221376 | |
| 0.5 mL tubes | Fisher | AB0533 | |
| 100 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z510424 | |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | CLS4980125 | |
| 125 mL Separatory Funnel | Sigma-Aldrich | Z261017 | |
| 25 mL round bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 500 MHz NMR Spectrometer | Bruker | ||
| Allegra X-22R Centrifuge | Beckman-Coulter | ||
| LC vials | ChromTech | CTC–0957–BOND | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Scientific | ||
| Magnetic Stir bar | Sigma-Aldrich | Z127035 | |
| NMR tube | Sigma-Aldrich | Z274682 | |
| P1000, P200, and P10 pipettes | Eppendorf | ||
| Rotary evaporator | Sigma-Aldrich | Z691410 | |
| RSLCnano UPLC system | Thermo Scientific | ||
| Shaking Water Bath | Fisher | FSSWB15 | |
| Stir plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420 | |
| PicoFrit Column | New Objective | PF3607515N5 | |
| Luna C18, 5 um | Phenomenex | 535913-1 |
References
- Rom, W. N., Markowitz, S. Environmental and Occupational Medicine. , 4th ed, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins. 1226-1239 (2007).
- Preussmann, R., Stewart, B. W. Chemical Carcinogens, ACS Monograph 182. Searle, C. E. 2, 2nd ed, American Chemical Society. 643-828 (1984).
- Magee, P. N., Montesano, R., Preussmann, R. Chemical Carcinogens. ACS monograph 173. Searle, C. E. , American Chemical Society. 491-625 (1976).
- Zhu, A. Z., et al. Alaska Native smokers and smokeless tobacco users with slower CYP2A6 activity have lower tobacco consumption, lower tobacco-specific nitrosamine exposure and lower tobacco-specific nitrosamine bioactivation. Carcinogenesis. 34 (1), 93-101 (2013).
- Mesić, M., Revis, C., Fishbein, J. C. Effects of structure on the reactivity of alpha-hydroxydialkynitrosamines in aqueous solutions. J. Am. Chem. Soc. 118, 7412-7413 (1996).
- Mochizuki, M., Anjo, T., Okada, M. Isolation and characterization of N-alkyl-N- (hydroxymethyl)nitrosamines from N-alkyl-N- (hydroperoxymethyl)nitrosamines by deoxygenation. Tetrahedron Lett. 21, 3693-3696 (1980).
- Guttenplan, J. B. Effects of cytosol on mutagenesis induced by N-nitrosodimethylamine, N-nitrosomethylurea and à-acetoxy-N-nitrosodimethylamine in different strains of Salmonella:evidence for different ultimate mutagens from N-nitrosodimethylmine. Carcinogenesis. 14, 1013-1019 (1993).
- Elespuru, R. K., Saavedra, J. E., Kovatch, R. M., Lijinsky, W. Examination of a-carbonyl derivatives of nitrosodimethylamine in ethylnitrosomethyamine as putative proximate carcinogens. Carcinogenesis. 14, 1189-1193 (1993).
- Chow, Y. L. ACS Symposium Series. 101, American Chemical Society. 13-37 (1979).
- von Weymarn, L. B., Retzlaff, C., Murphy, S. E. CYP2A6- and CYP2A13-catalyzed metabolism of the nicotine delta5'(1')iminium ion. J. Pharmacol. Exp. Ther. 343 (2), 307-315 (2012).
- Bell-Parikh, L. C., Guengerich, F. P. Kinetics of cytochrome P450 2E1-catalyzed oxidation of ethanol to acetic acid via acetaldehyde. J Biol Chem. 274 (34), 23833-23840 (1999).
- Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Nagy, L. D., Guengerich, F. P. Oxidation of methyl and ethyl nitrosamines by cytochrome P450 2E1 and 2B1. Biochemistry. 51 (50), 9995-10007 (2012).
- Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Guengerich, F. P. Oxidation of N-nitrosoalkylamines by human cytochrome P450 2A6: sequential oxidation to aldehydes and carboxylic acids and analysis of reaction steps. J Biol Chem. 285 (11), 8031-8044 (2010).
- Carlson, E. S., Upadhyaya, P., Hecht, S. S. Evaluation of nitrosamide formation in the cytochrome P450-mediated metabolism of tobacco-specific nitrosamines. Chem Res Toxicol. 29 (12), 2194-2205 (2016).
- Amin, S., Desai, D., Hecht, S. S., Hoffmann, D. Synthesis of tobacco-specific N-nitrosamines and their metabolites and results of related bioassays. Crit. Rev. Toxicol. 26, 139-147 (1996).
- Clark, A. G., Wong, S. T. A rapid chromatographic technique for the detection of dye-binding. Anal Biochem. 89 (2), 317-323 (1978).
- Pauli, G. F., et al. Importance of purity evaluation and the potential of quantitative (1)H NMR as a purity assay. J Med Chem. 57 (22), 9220-9231 (2014).
- van der Heeft, E., et al. A microcapillary column switching HPLC-electrospray ionization MS system for the direct identification of peptides presented by major histocompatibility complex class I molecules. Anal Chem. 70 (18), 3742-3751 (1998).
- White, E. H. The Chemistry of the N-Alkyl-N-nitrosoamides. I. Methods of Preparation. J. Am. Chem. Soc. 77, 6008-6010 (1955).
- Patten, C., et al. Evidence for cytochrome P450 2A6 and 3A4 as major catalysts for N'-nitrosonornicotine alpha-hydroxylation by human liver microsomes. Carcinogenesis. 18, 1623-1630 (1997).
- Wong, H. L., Murphy, S. E., Hecht, S. S. Cytochrome P450 2A-catalyzed metabolic activation of structurally similar carcinogenic nitrosamines: N'-nitrosonornicotine enantiomers, N-nitrosopiperidine, and N-nitrosopyrrolidine. Chem. Res. Toxicol. 18, 61-69 (2004).
- Hecht, S. S. Biochemistry, biology, and carcinogenicity of tobacco-specific N-nitrosamines. Chem. Res. Toxicol. 11, 559-603 (1998).
- von Weymarn, L. B., Zhang, Q. Y., Ding, X., Hollenberg, P. F. Effects of 8-methoxypsoralen on cytochrome P450 2A13. Carcinogenesis. 26 (3), 621-629 (2005).
