Métodos para o pH intracelular Imaging da linhagem de células-tronco do folículo em tecido ovariano de Drosophila

Summary

Nós fornecemos um protocolo para o pH intracelular de uma linhagem de células-tronco epiteliais em tecido ovariano de Drosophila vivo de imagem. Descrevemos a métodos para gerar moscas transgênicas expressando um biosensor pH, mCherry::pHluorin, imagem o biosensor utilizando imagens de fluorescência quantitativa, gerar curvas padrão e converter valores de intensidade de fluorescência para valores de pH.

Abstract

Mudanças no pH intracelular (pHi) desempenham um papel importante na regulação de muitas funções celulares, incluindo o metabolismo, proliferação e diferenciação. Normalmente, pHi dinâmica é determinada em culturas de células, que são passíveis de medição e manipular experimentalmente pHi. No entanto, o recente desenvolvimento de novas ferramentas e metodologias tornou possível estudar a dinâmica de pHi no tecido intacto, ao vivo. Para a investigação de Drosophila , um desenvolvimento importante foi a geração de uma linha de transgénica carregando um biossensor pHi, mCherry::pHluorin. Aqui, descrevemos um protocolo que usamos rotineiramente para imagem ao vivo Drosophila ovarioles para medir pHi na linhagem de células-tronco (FSC) folículo epiteliais em linhas transgénicas tipo selvagem de mCherry::pHluorin; no entanto, os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptados para outros tecidos, incluindo os discos de asa e o epitélio do olho. Descrevemos técnicas para expressar mCherry::pHluorin na linhagem FSC, mantendo o tecido ovariano durante a imagem latente, ao vivo e aquisição e analisando imagens para obter valores de pHi.

Introduction

Estudos recentes revelaram um papel para alterações em pHi durante celular diferenciação e displasia na vivo^1,2. Estes estudos encontraram que pHi é notavelmente consistente nas células do mesmo tipo na mesma fase de diferenciação, mas que muda como células de transição de uma fase para outra. Em alguns casos, bloquear as mudanças na pHi parcialmente interrompe a diferenciação, sugerindo que a mudança na pHi não é apenas uma consequência de alterações no destino da célula, mas em vez disso, ajuda a promover a mudança no destino da célula, talvez através de efeitos no pH sensíveis à regulamentação proteínas ou reações químicas necessárias para diferenciação. Futuros estudos têm o potencial para revelar mais a introspecção as muitos papéis diferentes do pHi dinâmica na vivo. No entanto, um dos desafios de estudar pHi durante a diferenciação na vivo é a obtenção de medições precisas de pHi. Ao contrário de outras características de diferenciação, tais como alterações na morfologia celular e expressão gênica, pHi é uma propriedade química lábil da célula que não é preservada em células que foram fixadas e permeabilizadas com métodos padrão. Além disso, pHi pode não ser estável em células que estão estressadas ou morrendo como resultado de manipulação experimental. Assim, é importante manter as células viva e mais saudável possível quando se mede o pHi. Vários corantes vitais estão disponíveis que funcionam bem para medir o pHi de células em cultura³, mas em muitos casos eles não são adequados na vivo estuda porque eles não penetram o tecido profundamente ou uniformemente o suficiente para fornecer medições precisas .

Para contornar o problema da penetração de corantes pobre, nós e os outros usaram uma sonda geneticamente codificada, mCherry::pHluorin^4,5,6,7, que pode ser expressa especificamente na célula tipos de interesse e imagem em tecido vivo. pHluorin é uma variante do GFP com uma mais elevada pKa (~ 7.0 vs ~ 4.0) que dobra mais facilmente em um pH mais elevado; Então, a intensidade de fluorescência total emitida por uma população de moléculas de pHluorin na célula aumenta com o aumento de pHi⁸. Importante, a fluorescência é linear dentro da normalidade citosólica dos valores de pHi. Em contraste, a fluorescência de mCherry (pKa ~ 4.5) é insensível a mudanças de pH dentro do intervalo citosólica. Estes dois repórteres estão covalentemente ligados juntos como uma única proteína quimérico, codificada por um frame de leitura aberto único, para que eles sempre estão presentes em quantidades iguais. Portanto, a relação de pHluorin para mCherry intensidade de fluorescência fornece uma medida da pHi que é normalizado para a concentração de sonda em cada célula. Os rácios podem ser então convertidos a estimativas de valores de pHi usando uma curva padrão que é gerada, obtendo o pHluorin mCherry rácios de tecidos que tenham sido incubados para valores de pH conhecido.

Aqui, descrevemos os métodos para usar o mCherry::pHluorin para medir o pHi da linhagem epitelial de FSC no ovário drosófila . Este tecido bem caracterizado tem sido usado para modelar diversos aspectos da biologia epitelial, tais como células-tronco auto-renovação e diferenciação^9,10,11, migração celular coletiva¹² , o desenvolvimento e a manutenção da célula polaridade^13,14. O epitélio do folículo é produzido por dois FSCs que residem na borda anterior do tecido em uma estrutura chamada de^15,o germarium¹⁶. Estas células se dividem regularmente durante a vida adulta para auto renovar e produzir descendência, chamadas células prefollicle (PFC), que podem re-introduzir o nicho e se tornar um FSC ou se diferenciar em um dos três tipos de células do folículo diferentes: as células polares, células do caule, ou células do folículo do corpo principal. Mostramos anteriormente que no tecido de sua, o pHi aumenta progressivamente durante os primeiros estágios de diferenciação, de um pHi de aproximadamente 6,8 na FSCs para 7.0 no PFC, para 7,3 em células de folículo². Bloquear este aumento por RNAi nocaute de um trocador de sódio/próton ubiquitously expressa, DNhe2, severamente prejudica a diferenciação de pFC, Considerando que aumentando pHi superexpressão de DNhe2 provoca uma leve diferenciação em excesso fenótipo. Estes resultados demonstram que pHi estàvel é mantida na linhagem precoce do FSC e experimentalmente que pode ser aumentado ou diminuído na vivo. Os métodos descritos aqui podem ser usados para medir pHi em sua tecido ou várias formas de tecidos mutantes, incluindo knockdown RNAi ou superexpressão usando um Gal4 de interesse e clones mitóticas.

Protocol

Nota: para medir pHi na linhagem FSC, podemos calcular a relação das intensidades de fluorescência da pHluorin para mCherry em células de folículo em condições fisiológicas, pFCs e FSCs e converter os rácios em valores de pHi com padrão as curvas de calibração para cada célula tipo ⁷. Primeiras, viver experiências de imagem são realizadas para medir intensidades de fluorescência de pHluorin e mCherry em germaria dissecado em um buffer que contém NaHCO ₃, que imita condições fisiológicas ^{1 , 7}. curvas padrão, próxima são geradas por medir intensidades de fluorescência pHluorin e mCherry em um at ⁺-livre, K ⁺ tampão contendo o ionóforo nigericin ajustado para dois valores de pH diferentes, 6,5 e 7,5. Na presença de nigericin, pHi se equilibra o pH da reserva através da membrana de plasma, causando pHi coincidir com o pH extracelular. Por último, as curvas padrão são usadas para converter pHluorin para mCherry rácios para valores estimados pHi.

1. pré-julgamento: preparação antes de medição pHi In Vivo

Nota: para medir pHi na vivo, o transgene mCherry::pHluorin deve ser expressos no tipo de célula de interesse. Abaixo estão algumas maneiras comuns para gerar pHluorin transgénico voa na linhagem do FSC. A geração de clones mCherry::pHluorin é particularmente útil para identificar FSCs, que estão localizados na extremidade anterior de um clone do FSC. Tecido mCherry::pHluorin específicos expressão é útil para medir pHi em todo o tecido inteiro e também é mais conveniente quando se combina com a expressão de um RNAi ou transgene.

1. Geração de transgênico pHluorin voa
   1. mCherry::pHluorin-rotulados FSC clones
      1. tornar mCherry::pHluorin FSC clones, cruzar UAS-mCherry::pHluorin ¹ para um ato-Gal4 flipout ações ou outro o estoque com um Gal4 inducible Flp/FRT.
      2. Para fazer heatshock clones inducible, heatshock adultos F1s para 2 dias pós eclosão em frascos vazios para 1 h em um banho de água de 37 ° C, quatro vezes aproximadamente cada 12 h.
      3. Para garantir o crescimento normal e taxas máximas de oogénese durante este período, manter moscas fornecendo molhado de fermento fresco (aproximadamente partes iguais secar padeiro ' s fermento e água) diariamente pelo menos 6 dias após a indução de clone.
   2. Expressão de mCherry::pHluorin específicas de tecido
   3. Cruz UAS-mCherry::pHluorin ¹ de um folículo celular driver específico, y ¹ w *; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington ID: 7023).
   4. 3 dias depois que moscas começam eclosing, coletar e colocá-los em frascos contendo fermento molhado, pelo menos 24 h antes da dissecação.
2. Fazendo soluções
   Nota: é importante preparar os buffers de seguintes no dia do experimento, porque as concentrações de pH e soluto no buffer podem mudar ao longo do tempo.
   1. Buffers de bicarbonato, nigericin e dissecação de preparar. Adicione os componentes na ordem listada para evitar formação de precipitados (consulte a tabela 1, tabela 2 e tabela 3).

2. Julgamento: Medição pHi na linhagem FSC

Nota: A dissecação, montagem e ao vivo de imagens as etapas para o tampão de bicarbonato e as condições de reserva de nigericin dois talvez precise ser executada duas vezes: uma vez para determinar o microscópio configurações e uma segunda vez para coletar dados experimentais. Consulte a seção 2.2 abaixo para obter mais informações.

1. , Dissecção e montagem
   Nota: para materiais necessários para executar este passo, consulte a Figura 1 e Tabela de materiais. Para câmaras 3D montagem de impressos, arquivos de impressora 3D são fornecidos como arquivo suplementar 1 e 2 de arquivo suplementar.
   1. Dissecação:
      1. câmaras de montagem Prepare aplicando uma fina camada de graxa de vácuo para o lado mais liso da 3D impresso câmara de montagem. Coloque esse lado sobre uma lamela de 22 x 40 mM para selar a lamela para a câmara de montagem.
   2. Dissecar os ovários da fêmeas adultas moscas no buffer de dissecação 500 µ l (tampão bicarbonato ou nigericin, tabela 3)
      1. anestesiar moscas de 3-4 usando gás de CO ₂ e transferência voa sobre uma placa mosca perfundida com CO ₂ gás.
      2. Pegar uma mosca anestesiada com pinça e coloque na mídia dissecação.
      3. Beliscar o tórax de uma mosca com uma pinça, enquanto puxando a ponta de seu abdômen até que seus ovários estão expostos.
      4. Depois de descolar os ovários de outros órgãos, arreliar distante o ovarioles usando 22 ^1/2 agulhas de seringa. Cuidadosamente separada do músculo da bainha dos ovários e ovarioles individuais separadas do cluster de ovarioles. Uma técnica eficiente para isolar a bainha do músculo é usar uma agulha de seringa para segurar o cluster de ovarioles no lugar em sua extremidade anterior e curso para baixo ao longo do comprimento do único ovarioles.
      5. Incubar os ovários dissecados na mídia de dissecação por exatamente 10 min antes de prosseguir para a etapa de montagem, para que haja tempo suficiente para o pHi de células totalmente equilibrar o pH dos meios de comunicação dissecação nigericin.
         Nota: Certifique-se que a bainha do músculo é removida o ovarioles. A bainha do músculo pode atenuar o sinal de fluorescência, o que torna difícil identificar células individuais usando Concanavilin-A e pode causar ovarioles mover-se espontaneamente durante a geração de imagens ao vivo.
   3. De montagem
      1. colocar uma pequena gota de mídia de dissecação no sentido da lamela de vidro no interior da câmara de montagem.
      2. Transferência separada ovarioles usando fórceps.
      3. Separar câmaras de ovo de fase posteriores do germaria associado com câmaras de ovo de fase anteriores e tentar garantir que o germaria dissecado são colocados no centro da gota mídia dissecação.
      4. Adicionar duas pequenas gotas de esmalte para lados opostos de uma lamela de 12mm redonda e deixe secar por cerca de 10 s.
      5. Lugar a rodada lamela sobre a entrega de mídia de dissecação contendo separados germaria tal que daquele lado com esmaltes virado para baixo e entra em contato com a mídia de dissecação. Pressione as partes da borda com os esmaltes para achatar e fixar o germaria em posição. Nós recomendamos usar esmaltes mais velho porque ele mancha menos sobre a superfície da lamela como está sendo segura no lugar.
      6. Encha a câmara de montagem com meios adicionais de dissecação. Buffer de condição específica que não contenha Concanavalina-A tintura pode ser usado para encher a câmara de.
         Nota: O tempo total gasto dissecando e montagem não deve exceder 15 min. Isto é importante para minimizar os efeitos do dano tecidual e morte da pilha.
2. Imagens ao vivo:
   Nota: nesta etapa, primeiro recolher imagens da condição de bicarbonato e as duas condições de nigericin para determinar as configurações de microscópio apropriado; ajustar as configurações de microscópio, se necessário, e coletar imagens para os dados experimentais. Usar um microscópio confocal capaz de imagem em 3 canais: GFP (emissão de excitação 475/509), mCherry (emissão de excitação/610 575) e far-red (633 emissão de excitação/647).
   Nota: Definir configurações de microscópio: as intensidades pixel das imagens coletadas irão ser quantificadas para determinar as estimativas de pHi, por isso é importante que os valores de intensidade do sinal em cada conjunto de imagem é muito baixa nem saturados. A gama de intensidades que podem ser capturados em uma imagem é definida pela profundidade de bits da imagem. Em muitos casos, imagens de 8 bits são geradas por padrão, mas recomendamos adquirir os dados como imagens de 16 bits, que têm um alcance dinâmico mais amplo. É importante assegurar que a interferência entre canais fluorescentes é minimizada, então as configurações devem ser ajustadas para que o espectro de emissão coletados de cada fluoróforo não se sobreponha. Para testar essas configurações, pegue uma imagem de amostra utilizando o espectro de excitação para as boas práticas agrícolas e recolher no espectro de emissão para mCherry e vice versa. Se as configurações foram ajustadas corretamente, não deve haver nenhum sinal em ambos os casos. Defina as configurações de microscópio (i.e., configurações de tensão em uma varredura a laser confocal, tamanho poder e pinhole de laser) para que as intensidades de pixel do sinal em todos os conjuntos de três imagens estão dentro da faixa dinâmica do arquivo de imagem. Para todas as nossas experiências, foi utilizado um laser de luz branco microscópio confocal com um objectivo de 40x para adquirir imagens de 16 bits em formato de × 1.024 1.024, enquanto nós aperfeiçoamos o ganho de tensão para cada experimento, conforme necessário. Por exemplo, em um experimento, podemos definir o ganho de tensão de GFP, mCherry e far-red como 37,8% 72,9% e 260%, respectivamente.
   1. Imagem ovarioles no buffer de dissecação nigericin a pH 6,5 e ajustar as configurações, tais que as intensidades pixel das imagens pHluorin e mCherry são baixas, mas não abaixo os limites de detecção da câmera.
   2. Imagem um outro conjunto de ovarioles no buffer de dissecação nigericin a pH 7,5 e ajustar as configurações de tal forma que as intensidades de pixel das imagens pHluorin e mCherry são altas, mas não saturados.
   Ovários de imagem
   3. na dissecação de bicarbonato buffer e certifique-se de que as intensidades de pixel das imagens pHluorin e mCherry não estão saturadas com as configurações escolhidas. Se os pixels são saturados, ajuste as configurações conforme necessário.
      Nota: Microscópio parâmetros de configuração podem diferir com base na configuração do microscópio exata sendo usada e deve ser otimizado para cada experimento. Depois de microscópio configurações foram definidas, não alterá-los para o restante do experimento. As configurações devem coadunar-se através de controle e condições experimentais. Em nossos experimentos iniciais pHi, geramos 2 e 3 curvas de calibração de ponto nigericin e não encontrada nenhuma diferença significativa entre pHi calculado usando qualquer método. No entanto, em geral, a adição de mais pontos na curva de calibração seria esperada para melhorar a precisão. Portanto, é recomendável gerar curvas com diferentes números de pontos para determinar quantas são necessárias para um determinado conjunto de condições experimentais.
3. Coleta de dados:
   1. faz dissecação, montagem e a imagem das amostras nas condições tampão bicarbonato e nigericin. Depois de dissecção e montagem, o tempo máximo de um conjunto de amostras de imagens não devem exceder 45 min para garantir que as medições de intensidade de fluorescência são feitas em tecido vivo, saudável.
   2. Para cada condição, adquirir imagens pelo menos 5 germaria.

3. Pós-julgamento: Análise de imagem

1. intensidades de fluorescência medida em células de folículo, PFC e FSCs
   1. fundo subtração:
      1. Open in natura imagens em FIJI com cada canal em uma janela separada ( a Figura 4).
      2. Usar a ferramenta retângulo para desenhar uma região de interesse (ROI) na janela do canal pHluorin em uma parte da imagem sem sinal.
      3. Opcional passo: definir o limite inferior do limiar para que os pixels com valores de intensidade abaixo de fundo são excluídas e definir o limite superior do limiar máximo. Quando o limite é definido desta forma, as áreas da imagem sem sinal em sua maioria são azuis e o sinal é claramente visível ( Figura 4A).
      4. Medir a intensidade de fluorescência média no ROI. Se o limite foi definido na etapa 3, certifique-se de verificar o " limite de limiar " caixa na caixa de diálogo Definir medições.
      5. Subtrair a intensidade de fundo medido de cada canal e fatia da imagem usando a função Subtract, encontrada no processo de → menu matemática.
      6. 3.1.1.2-6 passos de repetição para a janela de canal mCherry exceto que, na etapa 3.1.1.2, em vez de desenhar um novo retângulo com a ferramenta retângulo, use a função de seleção de restauração, encontrado no editar → menu de seleção, adicionar um retângulo com o mesmo dimensões e posição na imagem.
   2. FSCs identificar, pFCs e células de folículo:
      1. identificar a FSCs, pFCs e células do folículo por morfologia e localização usando o Concanavalina-A coloração para encontrar os limites da célula ( Figura 2).
      2. FSCs são finas células triangulares localizadas na borda do germarium na fronteira região 2a/2b. Se o mCherry::pHluorin é expresso em um clone do FSC, FSC também pode ser identificado como a célula mais anterior do clone.
      3. PFC é células de forma irregulares na região 2b, imediatamente adjacente e a jusante da FSCs.
      4. Folículo são células quadradas ou colunares que cercam o cisto de células germinativas na região 3.
   3. Obtenção rácios de intensidade de fluorescência
      1. escolher uma ou mais fatias no qual a célula de interesse tem maior intensidade de fluorescência no canal de mCherry e certifique-se que a coloração Concanavalina-A, vi no canal de far-red, é em foc Nós dentro da fatia selecionada.
      2. Desenhar ROI em torno de cada medida a intensidade de fluorescência média de pHluorin e mCherry em todos os gomos escolhida para medições e FSC.
      3. Dividir a intensidade média de fluorescência do canal pHluorin pela intensidade média de fluorescência do canal mCherry para calcular a proporção de pHluorin para mCherry fluorescência.
2. PHi derivar valores e gerar imagens pseudocolored
   1. derivar valores de pHi
      1. em todos os casos, a curva de regressão linear deve ser gerada usando ovários de moscas com o mesmo genótipo para ambos experimental e controlar as condições. Gere uma curva de regressão linear para cada tipo de célula, usando os dados de duas condições de reserva nigericin ( Figura 3). No Excel, isso pode ser feito plotando os dados em um gráfico e adicionando uma linha de tendência linear. Como alternativa, consulte:
      2. uso a inclinação e a interseção y da curva de regressão linear calculados a partir das condições de nigericin e a equação de uma linha (y = mx + b) converter o pHluorin de mCherry relação valores calculados das amostras no bicarbonato de condição para valores de pH. Nesta equação, substituir a forma de inclinação (a intercepção de y) para b, colocar o valor em relação x e resolver para y.
   2. Gerar uma imagem pseudocolored, refletindo os valores de relação em FIJI.
      1. , Siga o procedimento acima para subtração de fundo (etapa 3.1.1 e Figura 4).
      2. Dividir o canal de pHluorin do canal mCherry usando a função de calculadora de imagem, no menu processo. Certifique-se o " criar nova janela " e " resultado de 32-bit (flutuar) " as caixas de seleção são ambos verificadas. Alterar a tabela de pesquisa (LUT), encontrado no menu imagem, térmica ou LUT de escolha. Consulte a Figura 4 para outras opções apropriadas.
      3. Na caixa de diálogo ajustar brilho e contraste (imagem → ajuste → brilho/contraste), clique o " definido " botão. Conjunto o mínimo exibido o valor como 0 e o máximo exibido valor para uma relação que melhor capta os dados, geralmente 1.0-2.0 ( Figura 5).

Representative Results

Aqui descrevemos o processo de medição pHi no epitélio do folículo, que envolve várias etapas. Primeiro, os ovários são dissecados de moscas do genótipo apropriado usando ferramentas para dissecar e montagem (Figura 1). Os ovarioles são então fotografadas usando microscopia de fluorescência quantitativa e as imagens são analisadas para obter medições de pHi. Para cada imagem, os tipos de células de interesse são identificados conforme descrito na secção 3.1 (Figura 2). A relação entre as intensidades de fluorescência em canais de GFP e mCherry é convertida em valores de pHi usando uma curva padrão (Figura 3A), conforme descrito na seção 3.2. Usando esse método, nós encontramos que aquele pHi aumenta com diferenciação na FSC linhagem precoce, de 6,8 na FSCs, de 7.0 nas células prefollicle, para 7,3 nas células do folículo (Figura 3B). Os valores de pHi de cada tipo de célula podem ser representados graficamente, como na Figura 3B, ou como uma micrografia pseudocolored que mostra as diferenças no pHluorin de relações mCherry (Figura 4 e Figura 5). Nestas imagens, diferenças no pHluorin mCherry rácios são exibidas como diferenças na cor, tal como definido por uma LUT. É importante selecionar um LUT e valores máximos e mínimos para o intervalo de cores para produzir uma imagem que é o mais representativo dos dados. Embora, em geral, a escolha de configurações de LUT e gama não vai dar a aparência de diferenças que não estão presentes na imagem, uma escolha menos adequada de LUTs pode obscurecer as diferenças pHi presentes na Micrografia (Figura 5).

Figura 1: Materiais para dissecção e montagem Drosophila ovarioles. (A), uma imagem apresentando: (1) esmaltes; (2) dica de gordura, proveta e pipeta vácuo usada para aplicar graxa; (3) 23-calibre seringa de agulhas; (4) pinça de Inox Dumont, tamanho 5; (5) 3D impresso câmara de montagem; (6) 22 x 40 mM as lamelas de vidro; (7) ronda as lamelas de vidro, diâmetro de 12 mm, 0.13-0.16 mm de espessura; e (8) 9-poço vidro dissecando o prato. (B) A imagem de close-up da câmara 3D montagem impressas. (C) uma imagem mostrando um par dissecado de sua ovários. (D) uma imagem mostrando ovarioles bem separados. (E), A imagem da câmara 3D com ovários dissecados montado sob uma lamela de vidro redonda. Os pontos pretos são gotas de esmalte usado para prender a lamela redonda no lugar. (F), uma imagem de ovarioles dissecado por baixo de uma rodada lamela de vidro após a montagem. A caixa-preta indica uma região da imagem com uma única ovariole dissecado. Barras de escala representam cerca de 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: identificando as células do folículo, pFCs e FSCs. Dois exemplos de germaria com UAS-mCherry::pHluorin e 10930-Gal4 manchadas com Concanavilin-A. Um ROI delineando um FSC, um soldado e uma célula de folículo é mostrado em cada imagem. As intensidades de fluorescência média nos canais de pHluorin e mCherry são usadas para calcular o pHluorin de relações mCherry. Barras de escala representam aproximadamente 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: pHi aumenta durante a diferenciação na linhagem FSC. Resultados representativos tirados de Ulmschneider et al . mostrando ² : curva (A), uma regressão linear típico usada para calcular valores de pH de pHluorin a mCherry rácios; e (B), o pHi calculado valores com intervalos de confiança de 95% para FSCs, pFCs e células do folículo. Esta figura foi adaptada depois da permissão, de Ulmschneider et al . ². , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: usando FIJI para gerar uma imagem de ratiometric pseudocolored. (A) imagens que mostram os resultados de cada etapa no processo de subtração de fundo. Começando com uma imagem não processada (painéis à esquerda), o primeiro passo é definir os limites de limiar para que os pixels com valores de intensidade abaixo de fundo são excluídos. O limite superior do limiar situa-se no máximo. FIJI será de cor os excluídos pixels azul, resultando em uma imagem com um fundo azul e um germarium claramente visível (painéis de médios). Note que este passo é opcional. A segunda etapa é desenhar um ROI em uma parte da imagem sem medida de sinal (quadrados vermelhos em painéis de médios), a intensidade média de fluorescência do ROI e subtraia o valor de toda a imagem, resultando em um plano subtraído imagem (painéis de direito). O terceiro passo é usar a função de cálculo de imagem para dividir a imagem no canal de pHluorin pela imagem no canal mCherry. O resultado será uma imagem exibida com a tabela de pesquisa de Greys e os valores de exibição de imagem definido para abranger todo o intervalo dinâmico fornecido pela profundidade de bits da imagem. A etapa final é para ajustar as configurações de exibição de imagem para uma gama mais adequada e selecione uma tabela de pesquisa. (B) mostrando o resultado de um cálculo de imagem com o mínimo de imagens de amostra exibir valor definido como 0 e o valor de exposição máximo definido como 2.5 usando quatro tabelas de pesquisa diferente. O retângulo ao lado de cada imagem mostra as cores usadas em toda a gama dinâmica para cada tabela de pesquisa. Observe que para HiLo, 16 cores e térmica, cores diferentes são usadas para pixels com um valor de intensidade de 0 ou máximo (por exemplo, azul e vermelho, respectivamente, em HiLo). Isso fornece uma referência visual fácil dos limites do intervalo dinâmico, permitindo que o espectador vê que o sinal está dentro do intervalo dinâmico. (C) captura de tela mostrando as opções selecionadas ao importar um arquivo em ImageJ usando o plug-in importação Bio-formatos. escala barras representam 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: definindo a imagem valores de exibição de imagens ratiometric pseudocolored. Os valores de exibição de imagem de mínimo e máximo devem ser definidos para que o sinal em imagens da condição de bicarbonato, bem como de ambas as condições nigericin estão dentro do intervalo dinâmico. Para ilustrar este ponto, duas imagens de cada uma das três condições são mostradas com quatro configurações de exibição de imagem diferentes (0-0,5, 0-1, 0-2,5 e 5-0) usando a tabela de pesquisa térmica. Observe que, para todas as três condições experimentais, quando as imagens são exibidas com o conjunto de valor máximo indicado para 0,5, grande parte o sinal está próximo do máximo da escala colorimétrica e quando ele estiver definido para 5.0, grande parte o sinal está próximo do mínimo na cor escala de imetric. Em ambos os casos, as diferenças no pHluorin mCherry relação entre o tecido não podem ser facilmente apreciadas para que essas configurações não são ideais. Em contraste, valores de exposição máxima de 1.0 ou 2.5 são muito mais apropriados. Com essas configurações, as diferenças nas relações entre o tecido podem ser facilmente apreciadas, e os sinais nas imagens de todas as três condições experimentais são exibidos nas cores que estão dentro do intervalo dinâmico da escala colorimétrica. Barras de escala representam aproximadamente 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Aqui, descrevemos um método para medir o pHi de células na linhagem FSC dentro sua tecido. Este protocolo foi desenvolvido e refinado nos últimos cinco anos, desde que primeiro começamos a estudar pHi em tecido ovariano de Drosophila . Durante esse tempo, o protocolo tem sido usado com sucesso por vários investigadores em nosso laboratório e em pelo menos quatro diferentes girando disco e microscópios de exploração do laser. Reprodutibilidade da nossa observação original, que aumenta de pHi como células na linhagem FSC diferenciarem as células-tronco para o pFC para o estado de células do folículo, através desses vários ensaios demonstra ambos que este fenómeno biológico é robusto e que a metodologia é confiável. No entanto, em nossa experiência, este é um procedimento desafiador ao mestre. Requer muita atenção aos detalhes em cada etapa e execução rápida, altamente proficiente da dissecação, montagem e passos de imagem. Conforme o protocolo, o processo de dissecção e montagem inclui uma incubação de 10 min, mas não deve exceder 15 min total e o procedimento de imagem deve ser concluído em 45 min. Sob condições ideais, Drosophila ovarioles podem ser mantidas em cultura para até 14 h¹⁷, mas achamos que o tecido começa a morrer muito mais rapidamente nos buffers de nigericin usados para gerar as curvas padrão. Nossas diretrizes garantir que todos os dados são coletados enquanto o tecido é ainda bem dentro da janela de tempo que parece saudável e morfologicamente normal. Isto não deixa muito tempo para cada etapa, embora, por isso é importante planejar com antecedência garantir que tudo está pronto para avançar de um passo para o próximo. Na verdade, é muito mais eficiente se duas pessoas trabalham juntas na dissecação, montagem, e imagem latente de procedimentos, com uma pessoa executando um passo enquanto a outra pessoa se prepara para a próxima etapa.

Uma vez pHi pode ser sensível para as manipulações experimentais necessárias para a imagem do tecido ex vivo, tais como temperatura e buffer de composição, esse método é melhor para identificar alterações relativas em pHi. Dado que a sonda consiste de duas proteínas fluorescentes distintas, suas propriedades de fluorescência como rendimento quântico, propriedades de tempo de vida e dobramento podem ser afetadas de forma diferente em diferentes tipos de células. Portanto, é essencial incluir amostras tratadas com as condições de reserva nigericin e usá-los para gerar uma nova curva de calibração para cada tipo de célula em cada julgamento. A fim minimizar fontes adicionais para a variabilidade, manter todas as condições consistentes durante o curso de geração de imagens é enfatizada. Amostras em nigericin condições de reserva devem ser preparadas e fotografadas no mesmo dia, como aqueles em condição de buffer o bicarbonato e a aquisição de imagem e preparação de todas as amostras devem ser mantidas tão consistentes quanto possível. Isto é importante porque as medições de pHi baseiam-se numa comparação entre a imagem de moda, diferenças tão experimentais que afetam a detecção do mCherry e pHluorin em um ou mais dos conjuntos de imagem pode diminuir a precisão das estimativas pHi. Fatores como alterações nas configurações de tensão de tubos fotomultiplicadores (se estiver usando um laser scanning confocal) ou tempos de exposição (se estiver usando um disco girando confocal) ou uma lente suja que reduz a quantidade de luz atingindo a câmera, claramente afetarão os resultados . Mas há uma infinidade de outros fatores mais sutis que podem variar de dia a dia e também poderia influenciar os resultados, como se as moscas estão bem alimentadas, a idade de moscas, e quanto tempo os lasers estão na antes da imagem latente. Preparando e todas as três condições de imagem no mesmo dia minimiza estas diferenças e, portanto, produzirá os resultados mais consistentes. Notavelmente, cada vez que nós mudamos para um novo microscópio ou componentes do microscópio foram atualizados, era necessário reotimizar as configurações no novo equipamento. Muitas vezes o que resultou em uma mudança nos valores médios das medições individuais, mas, enquanto novas curvas de calibração foram geradas com cada julgamento, as mudanças no equipamento tinham um impacto mínimo sobre as estimativas de pHi. Além disso, a comparação relevante é muitas vezes entre diferentes tipos de células que estão dentro do mesmo tecido (por exemplo, os FSCs, pFCs e folículo de células) e, portanto, são internamente controlada para variações experimentais.

Embora este protocolo centrou-se na medição pHi do tecido de sua, a metodologia é compatível com o padrão drosófila métodos para manipular a expressão de gene, como expressão de RNAi ou um transgene usando UAS/Gal4 e análise de mosaico. Desde que mCherry::pHluorin é impulsionado por um promotor UAS, sempre será co expressa com o RNAi ou transgene e MARCM¹⁸ pode ser usado para gerar clones mutantes homozigotos com mCherry::pHluorin como o marcador clonal. Pelas razões descritas acima, sua tecido deve ser analisado como um controle ao lado de cada julgamento com um genótipo mutante. Por último, os princípios gerais descritos aqui podem ser aplicados para o uso de mCherry::pHluorin para medir pHi em outros tecidos também. Com efeito, este protocolo foi adaptado de um protocolo para o uso de mCherry::pHluorin para medir pHi no Drosophila olho⁷, e nós usamos metodologia semelhante à imagem mCherry::pHluorin no cérebro larval. Em geral, as ferramentas e métodos descritos aqui fornecem novas oportunidades para investigar muitas funções diversas de pHi na vivo em tecido vivo, intacto.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly Stocks
UAS-mCherry::pHluorin[1]
y1 w*;P{GawB}10930/CyO	Bloomington Stock Center	7023
Act-Gal4 flipout stock	Bloomington Stock Center	4409
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals for Buffer preparation
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
KCl	Sigma Aldrich	P-3911
glucose	Mallinckrodt	4912
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310
MgSO4	Thermo Fisher Scientific	M63
CaCl2	Sigma Aldrich	C-5080
HCO3	Sigma Aldrich	S-5761
MgCl2	Sigma Aldrich	M-9272
NMDG+	Sigma Aldrich	M-2004
K2HPO4	Mallinckrodt	7088	Use to Make KHPO4 pH 7.4
KH2PO4	Thermo Fisher Scientific	BP362	Use to Make KHPO4 pH 7.4
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	C21421	0.25 mg/ml dilution
Nigericin	Thermo Fisher Scientific	N1495
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection and mounting tools
2 Dumont Inox forceps (Size 5)	Thermo Fisher Scientific	NC9473431
2 23-gauge syringe needles	Sigma Aldrich	Z192457
9-well glass dissecting dish	Thermo Fisher Scientific	13-748B
Vacuum Grease	Dow Corning	1018817
22 X 40 mM glass coverslips	Thermo Fisher Scientific	12545C
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness	Ted Pella, Inc.	26023
3-D mounting chamber	custom manufactured		.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other equipment
pH meter	Thermo Fisher Scientific	13-620-183A	Model: Accumet AB15
Dissection microscope	Olympus Corporation	0H11436	Model: SZ2-ST
Confocal Microscope	Leica Biosystems		SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3