Summary
We beschrijven een facile, snelle en relatief goedkope methode voor het genereren van gen-verstoord Streptococcus mutans stammen; Deze techniek kan worden aangepast voor de generatie van gen-verstoord stammen van verschillende diersoorten.
Abstract
Typische methodes voor de opheldering van de functie van een bepaald gen omvatten vergelijkende fenotypische analyses van de wild-type stam en een stam die het gen van belang heeft is verstoord. Een gen-verstoring DNA constructie met een geschikt antibioticaresistentie marker-gen is nuttig voor de generatie van gen-verstoord stammen van bacteriën. Conventionele bouwwijze, waarvoor gene klonen stappen, betrekken echter ingewikkeld en tijdrovend protocollen. Hier, wordt een relatief facile, snelle en kosteneffectieve methode voor gerichte gene verstoring in Streptococcus mutans beschreven. De methode maakt gebruik van een 2-step fusion polymerase-kettingreactie (PCR) om de verstoring van de constructie en electroporation voor genetische transformatie te genereren. Deze methode vereist geen een enzymatische reactie, dan PCR, en bovendien biedt meer flexibiliteit in termen van het ontwerp van de verstoring van de constructie. Werkgelegenheid van electroporation vergemakkelijkt het opstellen van bevoegde cellen en verbetert de efficiency van de transformatie. De huidige methode kan worden aangepast voor de generatie van gen-verstoord stammen van verschillende diersoorten.
Introduction
Gene functie analyse betekent meestal dat een fenotypische vergelijking tussen een wild-type stam en een stam die een bepaald gen van belang heeft is verstoord. Deze verstoring van de gen techniek is gebruikt voor gene functie analyses in een breed scala van taxa, van bacteriën tot zoogdieren. De constructie van een gen-verstoring is noodzakelijk voor de generatie van de gen-verstoord stam; Deze constructie deoxyribonucleic acid (DNA) bestaat uit de antibioticaresistentie marker gene gesmolten aan de upstream- en downstream flankerende gebieden van het target-gen, en is opgenomen in het genoom via homologe recombinatie. De stam van gen-verstoord kan worden geïsoleerd met behulp van selectieve media met het antibioticum. De conventionele methode gebruikt voor de bouw van de gen-verstoord stam vereist complexe stappen, zoals de versterking van het target-gen door de polymerase-kettingreactie (PCR), Afbinding van het gen in een geschikte plasmide, spijsvertering met beperking enzymen en regeling te voegen van het antibioticum-resistentie marker-gen. Dit proces is tijdrovend, het nemen van enkele dagen tot enkele weken, afhankelijk van het succes van elke stap. Het ontwerp van verstoring constructies is bovendien afhankelijk van de restrictie-enzym-sites van de target-gen. U kunt deze problemen oplossen, zijn PCR-gebaseerde DNA splicing methoden1,2 voor het ontwerp van gen-verstoord mutanten van Dictyostelium discoideum3 en Synechocystis sp. PCC68034 gemeld. In de huidige studie, een methode ontwikkeld voor het genereren van een gen-verstoord streptokokken stam in een relatief snelle, facile en goedkope manier, gebruik makend van een gemodificeerde PCR-gebaseerde methode (aangewezen 2-step fusion PCR) voor de bouw van de verstoring Construct en electroporation voor genetische transformatie.
De fusie van de 2-step die PCR genomic DNA, de resistentie tegen antibiotica marker gene als een PCR-sjabloon en vier paar op de juiste wijze vereist ontworpen oligonucleotide inleidingen. In de eerste stap (1st PCR), een 1-kb upstream begeleidende regio van het target-gen, een stroomafwaartse begeleidende regio 1-kb van het doel worden-gen, en het antibioticum-resistentie marker-gen versterkt door PCR. De 5' regio's zowel de omgekeerde primer en de voorwaartse primer, voor versterking van de upstream en downstream bevatten flankerende gebieden, respectievelijk 15 honken complementair aan de uiteinden van het marker-gen. De 5' regio's zowel voorwaartse als terugwaartse inleidingen voor marker gene amplificatie omvatten ook 15 honken complementair aan het ondereinde van de upstream begeleidende regio van het target-gen en de bovenkant van de stroomafwaartse begeleidende regio van het target-gen, respectievelijk. Dus bevatten de drie versterkte fragmenten overlappende 30-basenpaar regio's op de site van de fusie. In de tweede stap (2nd PCR), wordt PCR uitgevoerd met genestelde PCR inleidingen met behulp van de drie fragmenten versterkt door de 1st PCR als sjablonen. De complementaire regio's van de sjablonen zijn bovendien aan elkaar gekoppeld via de 2nd PCR. Tot slot, de constructie voor homologe recombinatie is geïntroduceerd in de stam van de wild-type door electroporation. Verstoring van de succesvolle gen kan worden geverifieerd door PCR met behulp van specifieke primers. Hoewel de structuur van de verstoring wordt versterkt met behulp van HiFi-polymerase van DNA, zijn extra enzymatische reacties, zoals DNA afbinding of spijsvertering van DNA, niet nodig voor het genereren van de constructie. Daarnaast kan een verwijderde of geconserveerde regio op het genoom flexibel worden gekozen volgens primer ontwerp.
In het huidige werk, werd verwijdering van de gehele codering regio van het gtfC -gen, dat glucosyltransferase in Streptococcus mutans codeert, uitgevoerd om aan te tonen van de snelle, gemakkelijke gene verstoring methode in een streptokokken soorten. Bovendien, een gtfB-verstoord stam was gegenereerd op dezelfde manier. De glucosyltransferases die zijn gecodeerd door zowel de gtfC als de gtfB bijdragen tot verwekkende tandheelkundige biofilm ontwikkeling5,6. De biofilm-vormende capaciteiten van het wild-type stam (S. mutans WT), gtfC-verstoord stam (S. mutans ΔgtfC), en gtfB-verstoord stam (S. mutans ΔgtfB) werden geëvalueerd voor vergelijkende fenotypische analyses. Dit protocol de toepassing van een methode in twee stappen voor de verstoring van het gen voor een extra vissoort wordt uitgebreid en kan worden gewijzigd voor studies van de genfunctie in een breder scala van taxa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. primer Design
- bereiden inleidingen voor 2-step fusion PCR en verificatie van de verstoring van de gene.
Opmerking: Tabel 1 toont de sequenties van de primer gebruikt in dit protocol. Figuur 1 toont een schematische afbeelding van de 2-step fusion PCR methode gebruikt voor het genereren van S. mutans Δ gtfC.- Ontwerp inleidingen voor de vervanging van de doel-regio in het genoom met de spectinomycine-resistentie gen (spc r) 7. Dit protocol wordt de hele codering regio van het gtfC-gen vervangen door spc r.
- Omvatten 15 honken ter aanvulling van de bovenste en onderste uiteinden van spc r op de 5 ' regio's van reverse-up en down-forward primers, respectievelijk. Evenzo bevatten 15 honken complementair aan de onderkant van de upstream flankerende gebieden van gtfC en de bovenkant van de stroomafwaartse flankerende gebieden van gtfC op de 5 ' regio's van spc r-voorwaarts en spc r -omgekeerde inleidingen, respectievelijk ( figuur 1A).
Opmerking: Sequenties van up-reverse, down-forward, spc r - forward en spc r - omgekeerde inleidingen worden automatisch bepaald afhankelijk van de plaats van opneming van de verstoring construct. - De up-forward en down-omgekeerde inleidingen omvat ontwerpen > 1-kb stroomopwaarts en stroomafwaarts flankerende gebieden van de gtfC-gen, respectievelijk. Instellen van de smelttemperatuur (T m) van up-naar voren en omlaag-omgekeerde inleidingen overeenkomstig de smelttemperatuur van up-reverse en down-forward primers, respectievelijk ( figuur 1A).
Opmerking: Verwijzen naar de volgende formule om te bepalen van T m: T m (° C) = 2 (* nb + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, waar * N vertegenwoordigt het aantal primer nucleotiden met de opgegeven identiteit (A, T, C en G). - Ontwerpen genestelde inleidingen (N_up-forward en reverse-N_up) voor de 2 nd PCR ( figuur 1B).
Opmerking: Hoewel het paar ultraperifere primer (up-naar voren en omlaag-reverse) kan worden gebruikt als inleidingen voor de 2 nd PCR, genestelde inleidingen (N_up-forward en N_up-reverse) werden ontworpen in dit protocol. Genestelde inleidingen zijn vaak vereist voor de 2 nd PCR, zoals beschreven in de Vertegenwoordiger resultaten. - Design primers specifiek voor spc r. De inleidingen voor PCR van de kolonie aan het scherm voor verstoring van de gtfC worden gebruikt. Verstoring van de
- design inleidingen voor de verificatie van gtfC.
Opmerking: De PCR-producten versterkt met behulp van deze inleidingen straddle de grens tussen gtfC of spc r en stroomopwaarts of stroomafwaarts flankerende gebieden van gtfC. De primer sets ' gtfC up-forward en gtfC up-omgekeerde ' en ' gtfC down-forward en gtfC down-omgekeerde ' zijn specifiek voor gtfC, en ' gtfC up-forward en spc r 2 -omgekeerde ' en ' spc r 2-forward en gtfC down-omgekeerde ' zijn specifiek voor spc r.
2. Genomic DNA-extractie uit S. mutans
- Streak voorraad S. mutan s UA159 op een hersenen hart infusie (BHI) agarplaat. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.
- Halen een één kolonie met een gesteriliseerde tandenstoker en het enten in 5 mL BHI Bouillon. Incubeer de S. mutan s cultuur 's nachts bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.
- Centrifuge de cultuur van de bacteriële cel voor de 15 min op 2.000 × g. resuspendeer de pellet cel in 5 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Centrifuge voor 15 min op 2.000 × g. resuspendeer de pellet cel in 200 µL van PBS.
- Extract van genomic DNA uit de suspensie met behulp van een kraal-gewonnen-base genomic DNA extractie kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Overdracht de schorsing naar een 2.0-mL Monster buis bevattende glazen bolletjes (meegeleverd in de kit). Voeg 750 µL van lysis van de oplossing (meegeleverd in de kit) om de celsuspensie.
- Cap strak en symmetrisch plaatsen van de buizen in de houder van de buis van de kraal-kloppend verstoring apparatuur. Proces bij de maximumsnelheid voor 5 min. Centrifuge de kraal-geslagen monsters voor 1 min op 10.000 × g. overbrengen in het supernatant het filter van de spin (meegeleverd in de kit) in een 2.0-mL collectie buis en centrifuge voor 1 min bij 7.000 × g .
- Toevoegen 1.200 µL van DNA-bindende buffer (meegeleverd in de kit) aan het filtraat. 800 µL van het mengsel aan de kolom van de spin (meegeleverd in de kit) overbrengen met een 2.0-mL collectie buis en centrifuge voor 1 min op 10.000 × g.
- Negeren de doorstroom, voeg 200 µL van vooraf wassen buffer (meegeleverd in de kit) naar de spin-kolom de kolom matrix, wassen en Centrifugeer gedurende 1 minuut op 10.000 × g. negeren de doorstroming, 500 µL van was buffer (meegeleverd in de kit) toevoegen aan de spin kolom de kolom matrix wassen en centrifugeren voor 1 min op 10.000 × g.
- Plaats van de spin-kolom in een nieuwe 1.5-mL microcentrifuge buis en 100 µL van elutie buffer (meegeleverd in de kit) toevoegen aan de kolom matrix.
- Centrifuge voor 30 s bij 10.000 × g aan de genomic DNA Elueer. Schatten van de DNA-concentratie en zuiverheid door het meten van de absorptie bij 260 nm en 280 nmusing een spectrofotometer en bevestigen dat de A 260 /A 280 verhouding groter is dan 1.8.
3. PCR versterking
- uitvoeren de 1 st PCR met behulp van de S. mutan s WT genoom en het synthetische spc r-gen als PCR sjablonen (Zie tabel 1). Versterken van de upstream begeleidende regio van het gtfC gen, de stroomafwaartse begeleidende regio of het gtfC-gen, het gen van de spc r met behulp van de drie reeksen inleidingen ( figuur 1A), beschreven als per Tabel 2 en tabel 3.
Opmerking: PCR inleidingen, reagentia en versterking cycli zijn samengevat in tabel 1, tabel 2 en tabel 3, respectievelijk. - Fractionate elke PCR-product op een 1% agarose gel en accijnzen van de overeenkomstige bands met behulp van een gel band cutter.
- Zuiveren van elke versterkte product van het DNA van de gels met behulp van een spin kolom- en silica gel membraan gebaseerde extractie kit.
- Overdracht de gel segmenten een schone microcentrifuge buis en meng met 500 µL van bindende buffer (meegeleverd in de kit). Incubeer het mengsel bij 55 ° C gedurende 15 minuten totdat de gel-segmenten zijn volledig is opgelost.
- Plaats van de kolom van de spin (meegeleverd in de kit) in een buis van de collectie (meegeleverd in de kit), het monster op de spin kolom te laden en Centrifugeer gedurende 30 s bij 11.000 × g. Gooi de doorstroming, voeg de 600 µL van Wash Buffer (meegeleverd in de kit) naar de kolom Spin te wassen de silica-membraan, en Centrifugeer gedurende 30 s bij 11.000 × g.
- De doorstroming en Centrifugeer gedurende 2 min op 11.000 × g te drogen het kiezelzuur membraan negeren.
- Plaats van de spin-kolom in een nieuwe 1.5-mL microcentrifuge buis, voeg 50 µL elutie Buffer (meegeleverd in de kit), en uit te broeden bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten Centrifugeer gedurende 2 min op 11.000
- × g tot elueer de versterkte DNA. Schatten van de DNA-concentratie en zuiverheid door het meten van de absorptie bij 260 nm en 280 nmusing een spectrofotometer en bevestigen dat de A 260 /A 280 verhouding groter is dan 1.8.
- Uitvoeren de 2 nd PCR van 2-step fusie PCR met behulp van de drie ongeveer mengsel fragmenten als PCR sjablonen, volgens tabel 2 < /stRong > en tabel 3.
Opmerking: Deze fragmenten werden versterkt en verbinding aan de randen met behulp van de genestelde inleidingen ' N_up-forward en N_down-omgekeerde ' of de ultraperifere inleidingen ' up-forward en down-omgekeerde ' ( figuur 1B). PCR de inleidingen, reagentia en versterking cycli zijn samengevat in tabel 1, tabel 2 en tabel 3, respectievelijk. - Laden van een tiende van het PCR-reactiemengsel (5 µL) op een 0,8% agarose gel en vergelijk de grootte van de versterkte band met de grootte van de verwachte band te bevestigen van de generatie van de juiste amplicon ( Figuur 1 c).
- Concentreren het resterende laatste PCR-product door ethanol neerslag zonder zuivering.
- Toevoegen 55 µL van ultra pure water om de resterende PCR mengsel aan te passen van het totale volume aan 100 µL.Add een volume eentiende van 3 M Natriumacetaat (10 µL), pH 5.2, gevolgd door 2,5 volumes van 100% ethanol (250 µL). Meng en bevriezen voor 30 min op -80 ° C.
- Centrifuge gedurende 20 minuten bij 15.000 × g bij 4 ° C, om de pellet op de onderkant van de buis controleren en verwijder het supernatant. Wassen van de pellet met 1 mL 70% ethanol, centrifuge voor 5 min bij 15.000 × g bij 4 ° C, en verwijder het supernatant. De pellet gedurende ongeveer 30 minuten drogen en los met 10 µL van ultra pure water.
4. Bekwame cel voorbereiding en Celtransformatie
- Streak voorraad S. mutan s UA159 op een BHI agarplaat. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.
- Halen een één kolonie met een gesteriliseerde tandenstoker en het enten in 5 mL BHI Bouillon. Incubeer de S. mutan s cultuur 's nachts bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.
- Overbrengen van 2 mL van de S. mutan s cultuur aan 50 mL BHI Bouillon en incubeer gedurende 6-8 uur bij 37 ° C tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) van 0,2-0,4 onder anaërobe omstandigheden.
- Centrifugeren van de cellen gedurende 15 minuten staan bij 2.000 × g bij 4 ° C, verwijder het supernatant en wassen van de cellen tweemaal met 40 mL ijskoud water gevolgd door 40 mL 10% glycerol.
Opmerking: Resterende stoffen invloed op latere electroporation. - Gecombineerd het supernatant zorgvuldig met een pipet van Pasteur, als de hechting van de cel pellet in 10% glycerol gereduceerd. Resuspendeer de cellen in 1 mL vers 10% glycerol, breng 50 µL van de schorsing in elke 1.5-mL microcentrifuge buis en opslaan bij-80 ° C tot vlak voor gebruik.
- Mix de 50 µL hoeveelheid ijskoude bevoegde cellen met 5 µL van de verstoring construct hierboven beschreven in punt 3. Voeg het mengsel aan electroporation cuvettes (met een 0,2 cm afstand tussen de elektroden). Dienst van de Staphylococcus aureus-modus (1.8 kV 600 Ω, 10 µF, 1 puls) van het apparaat electroporation naar electroporate.
- Schorten de cellen in 500 µL van BHI Bouillon onmiddellijk na electroporation en voeg 50 µL van de ophanging aan spectinomycine-bevattende BHI-agar platen.
Opmerking: Extra incubatie tijd nadat electroporation is niet vereist. Echter incubatie gedurende 1-2 uur na electroporation kunt efficiënter transformatie. - Broeden de plaat voor 2-6 dagen bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.
Opmerking: S. mutans Δ gtfB wordt geconstrueerd zoals hierboven beschreven. De hele codering regio van het gtfB-gen is vervangen door de erythromycine resistentie gen 8 in S. mutans Δ gtfB. Elke stam S. mutans is gekweekt in BHI Bouillon bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.
5. Verificatie van Gene verstoring en opslag
- Kies willekeurige kolonies en enten ze in het mengsel van PCR uit te voeren volgens tabel 2 en tabel 3 PCR van de kolonie. PCR de inleidingen, reagentia en versterking cycli zijn samengevat in tabel 1, tabel 2 en tabel 3, respectievelijk.
- Laden het reactiemengsel PCR op een 1% agarose gel te bevestigen de spc r-specifieke DNA band.
- Halen de positieve kolonie met een gesteriliseerde tandenstoker en subcultuur cellen in 10 mL spectinomycine-bevattende BHI bouillon voor 2 dagen bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.
- Het controleren van de generatie van S. mutans Δ gtfC.
- De celsuspensie gelijkelijk verdelen. Uittreksel genomic DNA van de cellen die hierboven beschreven (stappen 2.3. aan 2.5.5.). Uitvoeren van PCR met genomic DNA als de PCR-sjabloon, gebruikend inleidingen voor de verificatie van verstoring van de gtfC (tabel 1) volgens tabel 2 en tabel 3.
Opmerking: De PCR inleidingen, reagentia en versterking cycli zijn samengevat in tabel 1, tabel 2 en tabel 3, respectievelijk. - Laden van de PCR-mix op een 2% agarose gel en vergelijk de grootte van de versterkte band met de grootte van de verwachte band te bevestigen van de generatie van de passende amplicon .
- De resterende celsuspensie gedurende 15 minuten staan bij 2.000 × g Centrifugeer bij 4 ° C. resuspendeer de pellet cel in 5 mL PBS.
- Centrifuge voor 15 min bij 2.000 × g bij 4 ° C. resuspendeer de pellet in 1,5 mL BHI bouillon met 25% glycerol en op te slaan in-80 ° CvdR -20 ° C. de cel
- De celsuspensie gelijkelijk verdelen. Uittreksel genomic DNA van de cellen die hierboven beschreven (stappen 2.3. aan 2.5.5.). Uitvoeren van PCR met genomic DNA als de PCR-sjabloon, gebruikend inleidingen voor de verificatie van verstoring van de gtfC (tabel 1) volgens tabel 2 en tabel 3.
6. Fenotypische analyse
- Streak elke S. mutan s stam op een BHI agarplaat. Incubeer de plaat 's nachts bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.
- Halen een één kolonie met een gesteriliseerde tandenstoker en het enten in 2 mL BHI bouillon met of zonder een juiste antibioticum. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.
- 20 µL van de overnachting cultuur schorsing in BHI bouillon met 1% of 5% sacharose zonder antibiotica in een reageerbuis glas 2 mL beënten; cultuur van de cellen met de proefbuis in een geneigd positie 's nachts bij 37 ° C onder anaërobe omstandigheden.
- Vortex de glazen reageerbuizen voor 10 s en decanteren cultuur schorsingen. Wassen van de reageerbuisjes driemaal met gedestilleerd water. Voeg vervolgens 1 mL van 0,25% Coomassie briljante blauw (CBB) om de biofilms vlek op de buiswand, en vervolgens Incubeer gedurende 1 min.
- De kleurstofoplossing decanteren, de reageerbuisjes driemaal met gedestilleerd water wassen en drogen van de reageerbuisjes.
- Evalueren zowel de kleur-dichtheid en de uitbreiding van het CBB gekleurd-biofilm visueel om te bepalen van het vermogen van biofilm-vormende in een fenotypische analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 toont dat de omvang van elk product uit de 1st PCR, zoals waargenomen op de 1% agarose gel, was in goede overeenkomst met de voorspelde grootte van ongeveer 1 kb. Figuur 3 toont de analyse van de Elektroforese van het gel van de producten van de 2nd PCR. Figuur 4 toont S. mutans kolonies getransformeerd met de verstoring van de constructie, en een analyse van de Elektroforese van het gel van de kolonie PCR producten. De waarbij van alle kolonies waren van de voorspelde grootte. Figuur 5 toont de primer-bandplaatsen voor de verificatie van gtfC verstoring en gel elektroforese van de PCR-producten. PCR producten verkregen door versterking met behulp van de gtfC -specifieke primer set werden bevestigd in S. mutans WT, maar niet in degtfCvan de Δ van S. mutans , overwegende dat PCR producten verkregen met behulp van de spcr-specifieke primer set werden bevestigd in S. mutans ΔgtfC, maar niet in S. mutans pm Figuur 6 toont de sacharose afkomstige biofilm-vormende vermogen van elke S. mutans stam. Een aanhangend biofilm werd gevormd door S. mutans WT in aanwezigheid van sacharose bevat; het aanhangend biofilm-vormende vermogen van S. mutans ΔgtfB was lager dan dat van S. mutans pm S. mutans ΔgtfC tentoongesteld zeer lage aanhangend biofilm vorming in aanwezigheid van sacharose.
Cijfer 1:Strategy voor 2-step fusion PCR. Een schematische illustratie van S. mutans ΔgtfC bouw wordt weergegeven. De gen-lengtes zijn niet op schaal. (A) stroomopwaarts en stroomafwaarts flankerende gebieden van de gtfC en de spcr werden loci versterkt door PCR. De primer bandplaatsen in de sjabloon worden aangeduid met identieke patronen. (B) de tweede stap van de PCR werd uitgevoerd met behulp van de 3 fragmenten die werden versterkt in de eerste stap van de PCR met genestelde inleidingen (als sjablonen). (C) de verstoring construct is verkregen voor homologe recombinatie bij de bacteriestammen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Vertegenwoordiger gelelektroforese van producten uit de 1st PCR. Waarbij van de upstream begeleidende regio van gtfC en downstream begeleidende regio van gtfC en spcr worden weergegeven. M: moleculaire marker. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: de Elektroforese van het gel van de vertegenwoordiger van producten uit de 2nd PCR. Producten versterkt met de genestelde inleidingen en de ultraperifere inleidingen worden weergegeven. De solide pijl geeft de voorspelde grootte van de verstoring van de constructie. M: moleculaire marker.
Figuur 4: Screening voor verstoring van de gtfC door (A). PCR van de kolonie S. mutans kolonies op de spectinomycine-bevattende BHI-agarplaat; elke omcirkelde cijfer geeft aan dat de kolonie ID. (B) vertegenwoordiger gelelektroforese van kolonie PCR producten; elke omcirkelde lane-cijfer geeft aan dat de bijbehorende ID van de kolonie in figuur 4A. M: moleculaire marker, WT: Wild-type genomic DNA gebruikt als sjabloon. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Verificatie van de verstoring van de gtfC door PCR. (A) Primer-bandplaatsen; Gene lengte is niet op schaal. PCR werd uitgevoerd met behulp van S. mutans genomic DNA als een sjabloon. Primer sets: gtfC up-forward en gtfC up-reverse (specifiek voor gtfC); gtfC down-forward en gtfC down-reverse (specifiek voor gtfC); gtfC up-forward en spcr2-reverse (specifiek voor spcr); spcr2-forward en gtfC down-reverse (specifiek voor spcr). (B) vertegenwoordiger gelelektroforese van de PCR producten; elke omcirkelde lane cijfer verwijst naar de overeenkomstige primer zoals in figuur 5A. Één elektroforetische afbeelding is verdeeld als u de markering bands label. M: moleculaire marker (100-basenpaar ladder). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: fenotypische analyse op basis van biofilm ontwikkeling. Sacharose afkomstige biofilms gevormd door elke S. mutans stam werden gekleurd met briljante Coomassie blue. WT: S. mutans WT, ΔgtfB: S. mutans ΔgtfB, Δ,gtfC: S. mutans ΔgtfC. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Primer paar | Volgorde (5' naar 3') | Verwachte band maat (bp) | |
| 2-step PCR voor verstoring van de gtfC | |||
| 1STE PCR | |||
| up-forward up-reverse |
AAGATATTTTGATAAGCAATCTGGGAACATGTATC CGAACGAAAATCGA TATTTCCTCCAAAAAT AGTTA |
1,036 | |
| SPCr-vooruit SPCr-omgekeerde |
ATTTTTGGAGGAAATA TCGATTTTCGTTCG TGAAT CTTCTAAGATAAGTA CATATGCAAGGGTTT ATTGT |
1,188 | |
| Down-forward Down-reverse |
AAACCCTTGCATATG TACTTATCTTAGAAG AATAG TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC |
1,059 | |
| 2DE PCR | |||
| N_up-forward N_down-omgekeerde |
TTTTATTGAAAACGAAGAAGGTAAATGGCTGTATC GCCATACTTAGAGAAATTTCTTTGCTAAATTCTTG |
3,132 | |
| Verificatie van de verstoring van de gtfC | |||
| PCR van de kolonie voor screening | |||
| S_spcr-vooruit S_spcr-omgekeerde |
GGATCAGGAGTTGAGAGTGGACTAAAACCAAATAG | 535 | |
| Laatste verificatie | |||
| gtfC up-forward gtfC up-reverse |
TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG GGTTGGTTGAGATGTTGCTGAAGTTGCTGTACTTG |
498 | |
| gtfC down-forward gtfC down-reverse |
GCCTTAATTGGTTGGCATGTTGTTGAAGGAAGACG TTGTCCACTTTGAAGTCAACGTCTTGCAAGGCATG |
557 | |
| gtfC up-forward spcr2-reverse |
Hierboven beschreven CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC |
641 | |
| spcr2-forward gtfC down-reverse |
GTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAG Hierboven beschreven |
623 | |
| Reagens | Concentratie van stamoplossingen | Volume | Eindconcentratie |
| DNA-polymerase premix | 2 × | 25 ΜL | 1 × |
| Voorwaartse primer | 5 ΜM | 2 ΜL | 0,2 ΜM |
| Omgekeerde primer | 5 ΜM | 2 ΜL | 0,2 ΜM |
| Sjabloon DNA | Variabele | Variabele | Variabele * ** *** |
| Gedeïoniseerd water | - | maximaal 50 μl | - |
Tabel 2: PCR reagentia. * Voor 1st stap PCR; 100 ng. ** Voor 2nd PCR; elke 30-50 ng van 1st stap PCR amplicon. Voor de kolonie PCR; directe toevoeging van bacteriële cellen aan het reactiemengsel.
| Cyclus stap | Temperatuur | Tijd | Aantal cycli |
| Eerste denaturatie | 98 ° C | 2 min | 1 |
| Denaturatie Gloeien Uitbreiding |
98 ° C 55 ° C 72 ° C |
10 s 5 s Amplicon afhankelijk (1 min/1 kbp) |
35 |
| Final Extension | 72 ° C | Amplicon afhankelijk (1 min/1 kbp) |
1 |
Tabel 3: PCR versterking cycli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het huidige protocol, moeten de inleidingen voor de 1st PCR worden ontworpen om het versterken van ongeveer 1 kb stroomopwaarts en stroomafwaarts flankerende gebieden van de regio van de doelgroep in het genoom. Dergelijke lange flankeren de opeenvolgingen van zijn nodig ter verbetering van de efficiëntie van homologe recombinatie.
De sequenties van de inleidingen (up-reverse, down-forward, spcr-vooruit, en spcr-reverse) in dit protocol werden automatisch bepaald op basis van de site van opneming van de verstoring van de constructie. Elke primer bevat 15 honken complementair aan het einde van de 2nd PCR sjabloon op de 5'-regio. Een langere binding site kunt efficiëntere productie voor de verstoring construct. Opneming van ten minste 10 complementaire basen in de regio 5' van elke primer is9aanbevolen.
Genestelde inleidingen (N_up-forward en N_up-reverse) werden gebruikt voor de 2nd PCR, in plaats van de ultraperifere inleidingen (up-naar voren en omlaag-reverse). Het gebruik van de ultraperifere inleidingen voor de 2nd PCR is nuttig in sommige gevallen; succesvolle versterking voor de verstoring construct voor S. mutans ΔgtfB werd bereikt met behulp van de ultraperifere inleidingen (gegevens niet worden weergegeven). Het gebruik van de ultraperifere inleidingen voor de 2nd PCR stap leidt echter vaak onvoldoende PCR versterking, zoals afgebeeld in Figuur 3. Het gebruik van genestelde inleidingen werd gevonden voor het oplossen van dit probleem-9. Wanneer de verstoring van de constructie niet aanzienlijk zelfs met behulp van de genestelde inleidingen versterkt is, niettemin, kan herontwerp van de in de 1ste PCR gebruikt inleidingen worden verlangd.
PCR van de kolonie in staat stelt gunstige screening van de stam van gen-verstoord. Inleidingen van bekende opeenvolgingen kunnen worden toegepast voor de generatie van de gen-verstoord stam met spcr. Electroporation werd gebruikt voor de introductie van verstoring constructies in S. mutans WT, als de efficiëntie van de transformatie bereikt met behulp van electroporation over het algemeen hoger dan die door andere procedures toegelaten is. Transformatie met paard serum, of paard serum met bevoegdheid-stimuleren peptides, is algemeen aanvaard in de Streptococcus10,11,12. Hoewel een electroporation apparaat vereist is, zijn de procedures betrokken zijn, zoals bevoegde cel voorbereiding, veel eenvoudiger dan die in alternatieve methoden10,11. Electroporation verdient Daarnaast, vanuit het oogpunt van het dierenwelzijn.
Dit protocol is van toepassing op meerdere gene ontwrichting, afhankelijk van het aantal ofantibiotic-markeringen. Voor het genereren van zowel gtfC- als gtfB-verstoord S. mutans stammen, de constructie van bijvoorbeeld DNA voor gtfC-verstoring gebouwd door 2-step PCR kan worden omgezet in S. mutans ΔgtfB. Omdat gtfC en gtfB in dit geval aangrenzende zijn, S. mutans ΔgtfC en S. mutans ΔgtfB genomen moeten worden gebruikt als sjablonen voor 2-step PCR te handhaven van de homologe reeksen homologe recombinatie. In feite, dubbele gen-verstoord S. mutans stam werd eerder gebouwd door dit protocol9.
Het huidige protocol voor de verstoring van het gen in S. mutans kan worden aangepast voor de generatie van gen-verstoord stammen van verschillende diersoorten. Dit protocol is niet vereist voor de gene klonen stap betrokken bij conventionele protocollen. PCR is bovendien de enige vereiste enzymatische reactie; plasmide vectoren, Escherichia coli, ligase en restrictie-enzymen zijn daarom niet nodig. Bovendien, het huidige protocol biedt meer flexibiliteit in termen van ontwerp van constructie voor de verstoring als het ontwerp van de constructie onafhankelijk van restrictie-enzym sites van het target-gen is. Onderzoekers kunnen regio's die worden verwijderd of bewaard in het genoom te ontwerpen de omgekeerde primer voor versterking van de upstream begeleidende regio's en de voorwaartse primer voor versterking van de stroomafwaartse begeleidende regio's bepalen. Dit begeleidende regio's zijn onmiddellijk upstream en onmiddellijk stroomafwaarts van de regio van DNA gewenst voor verwijdering, respectievelijk. Die flexibiliteit kan worden gebruikt voor het verminderen van externe invloeden, zoals polar effecten, op de expressie van genen die naaste.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Japan-maatschappij voor de promotie van wetenschap [Grant nummers 16 K 15860 tot T.M. en 15 K 15777 naar N.H.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptococus mutans | Stock strain in the lab. | Wild-type strain (Strain UA159) | |
| Genomic DNA extraction kit | Zymo Research | D6005 | |
| Bead-beating disruption apparatus | Taitec | GM-01 | |
| Synthetic genes | Eurofins Genomics | Custom-ordered | Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene |
| Thermal cycler | Astec | PC-708 | |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | 35 bases in length |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
| Electroporator | Bio-rad | 1652100 | |
| Electroporation cuvette | Bio-rad | 1652086 | 0.2-cm gap |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture media |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics |
| Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotics |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Kuwayama, H., et al. PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors. Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).
- Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II. Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).
- Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis. Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis. Gene. 19 (3), 345-353 (1982).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. J Vis Exp. (69), (2012).
Tags
Genetica kwestie 128 Gene verstoring DNA construct de Kettingreactie van de polymerase primer design antibioticaresistentie marker gene Streptococcus mutans electroporation homologe recombinatie View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
