Summary
Describimos aquí un ensayo fluorométrico sin células bioquímico para la determinación de la peroxidación lipídica HDL. Este ensayo rápido y reproducible puede ser utilizado para determinar la función del HDL en estudios a gran escala y puede contribuir a nuestra comprensión de la función del HDL en enfermedad humana.
Abstract
Los niveles de colesterol (HDL-C) bajo lipoproteína de alta densidad son uno de los más poderosos predictores independientes negativos de enfermedad aterosclerótica cardiovascular (ECV). La estructura y la función del HDL en lugar de C-HDL pueden predecir con mayor precisión la ateroesclerosis. Varios HDL proteína y lípidos composición que deterioran la función del HDL cambios en Estados inflamatorios tales como la ateroesclerosis. Función de HDL suele determinarse por célula basado en ensayos tales como ensayo de eflujo de colesterol pero estos ensayos tienen falta de desventajas numerosas de estandarización. Ensayos libres de células pueden dar medidas más sólidas de la función del HDL en comparación con ensayos de célula. Oxidación de HDL deteriora la función del HDL. HDL tiene un papel importante en el transporte de peróxido de lípido y alta cantidad de peróxidos de lípidos está relacionado con la función de HDL anormal. Deben considerarse las interacciones lípido-sonda cuando ensayos de interpretación de los resultados de fluorescencia no enzimáticos para la medición del estado oxidativo de lípidos. Esto nos motivó a desarrollar un método enzimático sin células bioquímico para evaluar HDL peróxido contenido en lípidos (HDLox) que contribuye a la disfunción del HDL. Este método se basa en la enzima peroxidasa de rábano (HRP) y el fluorocromo rojo Amplex que puede cuantificar (sin colesterol oxidasa) el contenido de peróxido de lípido por mg de HDL-C. Aquí un protocolo es describedfor determinación de la peroxidación de lípidos HDL usando el reactivo de fluorocromo. Variabilidad del ensayo puede reducirse por la estricta normalización de condiciones experimentales. HDLox los valores más altos están asociados con la función de antioxidante de HDL reducida. La lectura de este ensayo se asocia con lecturas de ensayos basadas en celdas validados, medidas sustitutas de enfermedades cardiovasculares, inflamación sistémica, disfunción inmune y fenotipos de riesgo cardiovascular y metabólico. Este enfoque técnico es un método robusto para evaluar la función de HDL en las enfermedades humanas donde systemic inflamación, estrés oxidativo y lípidos oxidados tienen un papel clave (como la ateroesclerosis).
Introduction
La enfermedad aterosclerótica cardiovascular (ECV) es la principal causa de muerte en todo el mundo1,2. Estudios epidemiológicos han mostrado que niveles bajos de colesterol de lipoproteína de alta densidad (HDL) son generalmente inversamente asociados con el riesgo para el desarrollo de ateroesclerosis1,2. Aunque varios estudios apoyan un papel ateroprotectores para HDL1,2, el mecanismo por el cual HDL atenúa la iniciación y progresión de la aterosclerosis es complejo 3,4. Así, se ha sugerido que la compleja estructura y función de HDL más que absoluta pueden predecir más exactamente ateroesclerosis 5,6,7,8. Varios HDL proteína y lípidos composición que deterioran la función del HDL cambios en Estados inflamatorios tales como la ateroesclerosis. Estos i) reduce su potencial del eflujo de colesterol 9, ii) disminuir el antiinflamatorio y aumento de proteínas proinflamatorias asociadas a HDL 6,7, iii) disminución de niveles del factor antioxidante y actividad y esferoides capacidad de inhibir la oxidación de la lipoproteína de baja densidad (LDLox)10 y iv) aumentar el lípido hidroperóxido contenido y redox actividad (HDLox)9,11. Sólidas pruebas que evalúan las funciones de pleotropic de HDL (como el eflujo de colesterol, función antioxidante) pueden complementar la determinación de HDL-C-HDL en la clínica.
Función del HDL es evaluada generalmente por métodos basados en la célula como el eflujo de colesterol ensayo de8,13,12,14. Estos métodos tienen limitaciones importantes, incluyendo una heterogeneidad significativa en cuanto a tipos de células utilizadas, tipo de lectura registrado, falta de estandarización y los efectos de confusión de triglicéridos 7,15. Estos inconvenientes plantean dificultades para los estudios clínicos grandes16. Ensayos libres de células pueden dar medidas más sólidas de la función del HDL en comparación con ensayos de célula. El eflujo de colesterol es una de las funciones más importantes de HDL pero sólo puede ser determinado por ensayos de célula. Otros enfoques para determinar la función de HDL como proteómica17,18,19,20,21,22,23, ensayos de quimiotaxis celular monocito de HDL función 17,22,25 y 24 no se han estandarizado y no puede usarse en estudios a gran escala en seres humanos.
HDL cuenta con importantes antioxidantes ateroprotectores efecto5,6,7,8. Se ha determinado la función antioxidante de las HDL en presencia de LDL en el anterior celular gratis análisis fluorométrico 26. Estos métodos fluorométrico bioquímicos de la función de antioxidante de HDL fueron desarrollados originalmente por Mohamad Navab y Alan Fogelman y sus colegas26. Aunque muchos estudios en humanos han utilizado estos métodos para determinar HDL función 17,18,19,20,21,22,23 ,24, lípidos (HDL)-lípidos (LDL) y las interacciones lípido-fluorocromo pueden limitar la reproducibilidad de estos ensayos bioquímicos no enzimáticos gratis celular de HDL función27,28.
El interés reciente se ha centrado en las consecuencias funcionales de la oxidación de HDL que es el resultado de la oxidación de lípidos y proteínas dentro de HDL 27,29,30. Estudios anteriores han demostrado que oxidación de HDL deteriora la función de HDL 27,29,30. HDL tiene un papel importante en el transporte de peróxido de lípido y alta cantidad de peróxidos de lípidos está relacionado con la función de HDL anormal. Así contenido en peróxido lipídico HDL puede ser utilizado para determinar HDL función 9,17,20,31 y dado las limitaciones conocidas de anteriores ensayos de HDL función7, 15,27,32, hemos desarrollado un método fluorométrico alternativo que cuantifica HDL lípido contenido en peróxido (HDLox) 32. Este método se basa en la enzima peroxidasa de rábano (HRP) y el fluorocromo rojo Amplex que puede cuantificar (sin colesterol oxidasa) el contenido de peróxido de lípido por mg de HDL-C 32. El principio bioquímico de la prueba se muestra en la figura 1. Hemos demostrado que este enfoque basado en la fluorescencia no tiene las limitaciones del previo análisis del función de HDL de27,28. Este ensayo ha sido seguir perfeccionando y estandarizados en nuestro laboratorio, por lo que puede ser utilizado confiablemente en estudios humanos de gran escala incluso con plasma criopreservados 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. la lectura de este ensayo se asocia con lecturas de ensayos basadas en celdas validados, medidas sustitutas de enfermedades cardiovasculares, inflamación sistémica, disfunción inmune y fenotipos de riesgo cardiovascular y metabólico 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. aquí, se describe este método, sencillo y robusto para medir contenido en peróxido lipídico HDL (HDLox). Este ensayo puede utilizarse como una herramienta para responder a preguntas importantes de investigación sobre el papel de la función del HDL en enfermedad humana donde systemic inflamación, estrés oxidativo y lípidos oxidados tienen un papel clave (como la ateroesclerosis)32.
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Protocol
todos los experimentos con muestras biológicas humanas fueron realizados con la aprobación ética de la Universidad de California en Los Ángeles, Los Ángeles y el Comité de ética humana de Alfred Hospital, Melbourne.
Nota: hay muchas variaciones de la función de fluorocromo HDL ensayo (véase discusión) 32. A continuación describimos el protocolo que da los resultados más consistentes y reproducibles. Un resumen del ensayo se muestra en la figura 2.
1. procesamiento de la muestra
- uso del suero fresco, no hemolizadas (puede ser recogida en tubos de separador de suero) o citrato plasma obtenido después de 12-14 horas de ayuno. Si utiliza muestras criopreservadas, incluyen el control apropiado como se describe en el presente Protocolo.
2. Día 0-preparación para el ensayo de
- Prepare trabajo diseño de experimento con los controles adecuados, muestras y replica. Ejecute cada muestra por lo menos en triplicado. Un diseño bien representante 96 se muestra en la figura 3.
- Calcular todos los volúmenes de reactivos que se utilizarán para el ensayo basado en el número de muestras y repeticiones de.
Nota: Incluye un volumen adicional de 10% en cada bolsa de trabajo para asegurarse de que hay suficiente volumen para cada reactivo del experimento específico. - Etiqueta los tubos para todos los diferentes pasos del ensayo p. ej. para la separación de HDL, la medición de HDL-C (opcional) y el fluorochromeassay.
3. Día 1-preparación de controles
- preparación de estudio específicos combinado control
- crear una muestra de control de suero o plasma combinado de estudio todas las muestras. Si ejecuta 20 muestras en cada placa por triplicado, se combinan 10 μl de cada muestra en un control de 200 μL agrupados. Dar una alícuota separada de este control agrupado al laboratorio clínico para determinar el valor de HDL-C de este control.
Nota: Utilice este control agrupado para estandarizar el análisis y dar cuenta de todo posible conocido (por ejemplo, tipo de suero matriz versus plasma, congelación y descongelación, congelación) y factores de confusión desconocidos que pueden afectar la variabilidad experimental 27 , 28.
- crear una muestra de control de suero o plasma combinado de estudio todas las muestras. Si ejecuta 20 muestras en cada placa por triplicado, se combinan 10 μl de cada muestra en un control de 200 μL agrupados. Dar una alícuota separada de este control agrupado al laboratorio clínico para determinar el valor de HDL-C de este control.
- Preparación específicas del laboratorio de control de calidad (QCs)
- preparar un amplio stock de HDL en cada laboratorio (por ejemplo HDL aislado de 5 mL de plasma de donantes sanos 10) y criopreservar varias alícuotas de este acciones para minimizar los ciclos de congelación-descongelación.
- Uso por lo menos 10 diferentes replica de esta población para determinar el valor promedio de HDLox. Valores de un rango aceptable de medición HDLox para cada muestra de control de calidad incluido en cada ensayo está dentro < 15% del coeficiente de variación de este valor medio.
- Dar una alícuota separada de este control agrupado al laboratorio clínico para determinar el valor de HDL-C de este control (por ejemplo, 40 mg/dL).
Nota: Un enfoque detallado cómo utilizar sangre de bancos de sangre para crear estos controles ha sido previamente descrito 27 , 28 , 32. Utilice QCs adicionales según sea necesario (por ejemplo, uno de un donante sano sabido que tienen función de HDL normal y uno de un donante conocido en gran parte anormal función de HDL.
- Optimización de señal de fondo y valores en blanco (opcionales)
- para reducir al mínimo el fondo, añadir la cantidad apropiada de catalasa (1-4 U/mL) en el medio de incubación para eliminar rápidamente la forma H 2 O 2 debido a la oxidación espontánea del aire de los amortiguadores.
Nota: Puesto que los valores de los pocillos del blanco (no HDL) se se restan de los valores de las muestras de HDL y los resultados están siendo registrados en relación con un control combinado (que se incluye en el mismo plato bien 96), hemos encontrado que este paso no prácticamente no afectar t los resultados. Por lo tanto, optimización de la señal de fondo con la catalasa puede ser omitido, si es necesario.
- para reducir al mínimo el fondo, añadir la cantidad apropiada de catalasa (1-4 U/mL) en el medio de incubación para eliminar rápidamente la forma H 2 O 2 debido a la oxidación espontánea del aire de los amortiguadores.
4. Día 1-separación de HDL colesterol mediante precipitación de HDL
Nota: utilice un reactivo precipitante de colesterol HDL estandarizado disponible comercialmente para aislar apoB agotado suero según el fabricante ' s instrucciones. Estos reactivos son ampliamente utilizados en los ensayos colorimétricos para determinar los niveles de colesterol HDL.
- Fresca (o descongelar) muestra de plasma o suero.
- Mezclar volúmenes iguales (por ejemplo 80 μL) del plasma y el reactivo de precipitación de colesterol de HDL (20% p/v polietilenglicol en Tampón glicina a pH 10.0 (25 ° C)).
- Mezcla bien mediante pipeteo arriba y abajo.
- Centrifugar a 1000-2000 x g durante 10 minutos
- Aspirar el sobrenadante (fracción HDL).
- Idealmente utilizar de inmediato el HDL aislado para la fluorochromeassay de la peroxidación lipídica de HDL. Sin embargo, si varias muestras son en el mismo día y otros pasos tales como medición de la concentración de HDL-colesterol también se hacen, luego almacenar el HDL aislado a 4 ° C y utilizarlo al día siguiente para la función de fluorochromeHDL ensayo.
5. Día 1-determinación de HDL-C en HDL aislado
Nota: esto es opcional si el valor de HDL-C del laboratorio clínico se utiliza para normalizar la HDLox por la cantidad de HDL-C.
- Cuantificar el colesterol HDL del plasma, utilizando colorimétrico estándar ensayos de 27. Añadir 50 μl de reactivo de colesterol en cada pozo y determinar la concentración de colesterol utilizando un lector de placas colorimétrico y un colesterol estándar en cada juego.
6. Día 2-preparación de reactivos
- soluciones preparar HRP y colesterol de HRP 5 U/mL de la solución (rango 1-10 U/mL).
- Preparar 20 mM fluorocromo (p. ej., Amplex rojo) soluciones: descongelar un vial de reactivo de fluorocromo y DMSO a temperatura ambiente. Antes del uso, disolver reactivo fluorocromo (1 mg) en 200 μL de DMSO. Solución stock congelado en ≤-20 ° C, protegido de la luz.
- Preparar controles positivos y negativos: uso 1 X ' tampón de reacción ' sin colesterol y 20 mM H 2 O 2 solución diluida como control positivo y negativo, respectivamente.
7. Día 2-fluorocromo ensayo
- añadir 50 μl de 1 x buffer de reacción como blanco (control negativo).
- Opcional: Añadir solución de trabajo de 20 mM de H 2 O 2 como control positivo en cada placa.
- Para minimizar la variabilidad experimental y asegurar además de los reactivos y las muestras se realiza constantemente y de manera oportuna, realiza todas las adiciones de las muestras en un separado 96 bien fondo redondo, claro, poliestireno o polipropileno placa (placa 1). Luego utilizar una pipeta multicanal para transferir volúmenes específicos 3 placas de 96 pocillos (placas de 2-4: bot polipropileno, planaTom, negro) (que tienen idéntico diseño) ( figura 2, figura 3).
- Por ejemplo, primero agregue 160 μl de HDL aislado en cada pozo/muestra de la placa 1 y luego con el uso de pipeta multicanal transfiera 50 μl de HDL-colesterol de cada muestra de pozo en las placas de 96 pozos negras. Cambiar consejos entre cada fila o columna y utilizar las puntas sin filtrar para todas las transferencias de.
- Dejar las muestras en los pozos. No se deshaga. Hay no hay pasos de lavado entre la adición de reactivos.
- Añadir 50 μl de solución de HRP 5 U/mL (0,25 U) a cada pocillo.
Nota: Uso HRP antes de la adición del reactivo de fluorocromo. - Incubar durante 30 min a 37 ° C. No deseche las muestras después de la incubación (no hay pasos de lavado entre adiciones de reactivos).
- Añadir 50 μl de fluorochromereagent para una concentración final de 300 μm. En este punto, el volumen de reacción total es 150 μL. mezcla bien y proteger de la luz.
- Evaluar la lectura fluorescente (en la oscuridad) cada minuto durante 120 min a 37 ° C con un lector de placa fluorescente (530/590 filtros de nm).
Nota: Utilice un intervalo más corto de 60 minutos con muestras frescas. Hemos encontrado esa serie 120 minutos da más datos reproducibles con el uso de muestras criopreservados. - Registrar datos utilizando software apropiado.
8. Día 3-Análisis
- unidades de fluorescencia (unidades arbitrarias) de grabar a 120 minutos después de la adición de fluorocromo reactivo para todas las muestras incluyendo los pocillos del blanco y todos los controles de.
- Calcular el valor medio de unidades de fluorescencia (basado en por lo menos triplica) (HDL ox_sample). No tome valores atípicos (> 2 SDs de valor promedio) en cuenta.
- Restar la fluorescencia de fondo utilizando la siguiente ecuación:
- normalización de la cantidad de colesterol HDL (HDL-C): normalizar el valor de peroxidación de lípidos de HDLox para cada muestra (incluyendo el control agrupado) por el HDL-C) (mg/dl). A lo largo de la sección de resultados, HDL buey se presenta como n HDLox (HDL-C) medida para reflejar el ajuste para el HDL-C. Utilice la siguiente ecuación:
- normalizar la expresión de HDLox valor de peroxidación de lípidos de cada muestra contra el valor de un control combinado. Normalizar el n valor de peroxidación de lípidos (HDL-C) HDLox para cada muestra (ajustado para HDL-C) por n valor de peroxidación de lípidos (HDL-C) HDLox del control agrupado. A lo largo de la sección de resultados, HDL buey se presenta como medida de buey de nHDL para reflejar el ajuste por variabilidad experimental y HDL-C. Utilice la siguiente ecuación:
Nota: este método es similar a otros enfoques experimentales establecidos para reducir la variabilidad experimental de mediciones tales como internacional había normalizada ratio (INR) 44 , 45. Este enfoque ha sido validado en estudios clínicos 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. - realizar control de calidad de resultados experimentales, utilizando muestras de control de calidad estándar. Cada laboratorio debe establecer sus propios controles de calidad (QCs). Idealmente no hay un control de calidad para nHDLox de una muestra con conocidas HDL disfuncional y un control de calidad para nHDLox de una muestra de donantes sanos [e.g. uso grupo de muestras de adultos jóvenes que son donantes de banco de sangre establecido y no tiene comorbilidad conocida o factores de riesgo para enfermedad cardiovascular incluyendo fumar]. El control último estandariza resultados entre diferentes laboratorios. Los valores promedio de estos QCs son establecidos basado en al menos 5 muestras (normalmente usamos 10 repeticiones para este importante paso).
- Compruebe si QCs medidos en cada ensayo tienen valores dentro del rango de valores. Asumiendo una variabilidad experimental máximo aceptable de 15%, todos los valores experimentales medidos deben caer dentro del 15% de los valores medios conocidos de control de calidad establecido. Use las ecuaciones siguientes:
Nota: Si cualquiera de control de calidad incluido muestras () normal versus HDL disfuncional) da HDLox valores fuera de rango (establecido en cada laboratorio) entonces repetir el experimento.
- Compruebe si QCs medidos en cada ensayo tienen valores dentro del rango de valores. Asumiendo una variabilidad experimental máximo aceptable de 15%, todos los valores experimentales medidos deben caer dentro del 15% de los valores medios conocidos de control de calidad establecido. Use las ecuaciones siguientes:
- Realizar control de calidad de los resultados experimentales utilizando el coeficiente de variación (CV) para cuantificar la variabilidad experimental: repetir todas las muestras con CV % > 15%. Utilice la siguiente ecuación:
Nota: es un típico intra-ensayo (dentro de la misma placa) y la variabilidad experimental Inter-ensayo (entre diferentes placas) < 15%. 2) típico CV intraensayo es entre 1-7% y un típico interassay CV es entre 3-10%.
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Representative Results
Se añaden 50 μl de cada muestra de HDL en cada pozo como en el paso 7.3. 50 μl de solución HRP 5 U/mL (0,25 U) se añaden en cada pozo como en el paso 7.5. Las muestras se incuban durante 30 min a 37 ° C como en el paso 7.6. Entonces se añaden 50 μl de reactivo de fluorocromo en cada pozo como en el paso 7.7 (concentración final de 300 μm). La lectura fluorescente (en oscuro) entonces se evalúa cada minuto durante 120 minutos a 37 ° C con un lector de placa fluorescente (530/590 filtros de nm). Datos representativos de la fluorescencia para el control en blanco, combinado, muestra con conocidas HDL disfuncional y muestra con HDL normal se muestran en la figura 4. Se muestran datos representativos y paso a paso el análisis de resultados usando las ecuaciones descritas en la sección 8 del protocolo en tabla 1. En este ejemplo, se utilizaron muestras frescas de HDL y HDLox los valores más altos se obtienen generalmente con HDL fresco. Por ejemplo, HDL conocido por ser disfuncionales basado en ensayos independientes de la función del HDL y de la persona VIH-infectada tenía aproximadamente 2 veces relativamente mayor cantidad de peróxido de lípido en comparación con los HDL de participantes sanos. La figura 5 muestra resultados representativos de un estudio con sujetos que tiene alterada la función de HDL28,32. Las personas infectadas por el VIH tenían aproximadamente un 60% más alto significa HDL-lípido contenido en peróxido (por mg de C-HDL) en comparación con las personas no infectadas. En nuestros estudios anteriores publicados con HDL criopreservado, este método fue capaz de demostrar por lo menos 10% diferencias relativas en HDLox compararon con HDL de control grupos (sin enfermedad p. ej. infección por VIH crónica)36,37, 38.
Figura 1: Determinación del contenido en peróxidos lípidos HDL por una cantidad específica de HDL-C.
En Estados de inflamación sistémica y estrés oxidativo HDL aumentó peróxidos lipídico (LOOH) (HDLox) que están asociados con la función deteriorada de la HDL. HRP cataliza la oxidación del fluorocromo no fluorescente para rojo fluorescente resorufin. Esta oxidación puede ser impulsada por peróxidos endógenos presentes en la reacción (OH-) y peróxidos lípidos HDL (LOOH-). Sin colesterol oxidasa, resorufin (con HRP) puede cuantificar el intrínseco contenido en peróxido lipídico HDL de una cantidad específica de colesterol HDL. La producción del fondo de OH - como resultado de la oxidación del aire del búfer se resta de la lectura fluorescente de cada pozo. Resorufin tiene mínimo autofluorescencia en la mayoría de las muestras. Esta cifra ha sido modificada 32. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resumen del flujo de trabajo para la fluorochromeassay de la peroxidación lipídica de HDL.
Día 0: Preparación para el análisis: A) 96 diseños bien placa de diseño, estimación de volumen de necesitan muestras (suero, plasma) y reactivos (enzima HRP, fluorocromo reactivo, buffers, reactivo PEG), etiqueta de tubos
Día 1: Preparación para el análisis y aislamiento de HDL: A) elaboración de precipitación B) HDL de controles (control de estudio específicos agrupados, controles de calidad, controles positivos y negativos) mediante reactivo PEG.
Día 2: Preparación para el ensayo (si no hecho en día 1) y el ensayo de fluorocromo: A) elaboración del control (control de estudio específicos agrupados, controles de calidad, controles positivos y negativos) A) además de muestras de HDL: para minimizar la variabilidad experimental y asegurar además de los reactivos y las muestras se hará constantemente y en tiempo y forma se recomienda que todas las adiciones de las muestras (p. ej. 160 μL) se realizan primero en un separado 96 bien fondo redondo, claro, poliestireno o polipropileno placa (placa 1). Una pipeta multicanal puede utilizarse para transferir volúmenes específicos (por ejemplo 50 μL) en 3 placas de 96 pocillos (placas de 2-4: polipropileno, parte inferior plana, negro placas) (que tienen idéntico diseño). B) adición de HRP: Añadir 50 μl de 5 U/mL (0,25 U) a cada pocillo con una pipeta multicanal C) incubar a 37 ° C por 30 min D) Añadir 50 μl de 300 μm/bien de fluorocromo reactivo a cada pocillo con una pipeta multicanal E) evaluar la lectura fluorescente (en oscuridad) cada minuto más de 120 minutos a 37 ° C con un lector de placa fluorescente (530/590 filtros de nm).
Día 3: Análisis de los datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diseño representativo de 96 placas de pozos que se utilizan normalmente en la función de fluorocromo HDL ensayo.
Las diferencias en tiempo de adición de las muestras de HDL en los pocillos de una placa pueden conducir a diferencias en la oxidación espontánea entre diferentes pozos. Para minimizar la variabilidad experimental, evitar la oxidación espontánea variable entre diferentes pozos y adición de reactivos y las muestras se hará constantemente y de manera oportuna, se recomienda que todas las adiciones de las muestras (p. ej. 160 μL) son primero se realiza en un separado 96 fondo bien redondo, claro, poliestireno o polipropileno placa (placa 1). Una pipeta multicanal puede utilizarse para transferir volúmenes específicos (por ejemplo 50 μL) en 3 placas de 96 pocillos (placas de 2-4: polipropileno, parte inferior plana, negro placas) (que tienen idéntico diseño). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Datos representativos del análisis de peroxidación de lípidos HDL.
La lectura fluorescente (en la oscuridad) entonces se evalúa cada minuto durante 120 minutos a 37 ° C con un lector de placa fluorescente (530/590 filtros de nm). Datos representativos (unidades arbitrarias) se muestran en blanco (no HDL; controles negativos), control positivo (H2O2), combinado control de HDL y HDL de pacientes que se sabe para tener HDL disfuncional (basado en dos independientes función de HDL eflujo de colesterol análisis y ensayo de Quimiotaxis de monocitos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: El ensayo de peróxido de lípido de la función de HDL puede detectar peróxido lipídico alto contenido por una cantidad específica de HDL-C en vivo.
HDL fue aislado y HDLox se determinó como se describe en el protocolo en 100 pacientes con infección por VIH y en 50 sujetos sanos. Las personas infectadas por el VIH tuvieron mayor HDLox (1.59±0.53) en comparación con los controles (1.01±0.31) (p < 0.001). Esta cifra ha sido modificada 32. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo aquí descrito ofrece una herramienta robusta para responder a preguntas de la investigación sobre el papel de la función de HDL en la aterosclerosis y la enfermedad humana. El ensayo cuantifica el contenido en peróxido lipídico HDL por mg de HDL-C mediante amplificación enzimática (HRP). Este enfoque evita limitaciones conocidas de anteriores ensayos de función de HDL (p. ej. ensayo de eflujo de colesterol) incluyendo una heterogeneidad significativa en cuanto a tipos de células utilizadas, tipo de lectura registrado, falta de estandarización y los efectos de confusión de los triglicéridos7,15,32. Determinación de la bioquímica en lugar de propiedades biológicas (por ejemplo, eflujo de colesterol) de HDL puede ser más reproducible. La variabilidad experimental Inter-ensayo de < 10% se compara favorablemente con el celular-ensayos de la función del HDL, donde inter variabilidad experimental es a menudo > 15% (o no). Además, este enfoque puede limitar las interacciones bioquímicas entre lípidos y puntas de prueba fluorescentes de32. Determinación de la oxidación de HDL es relevante en el contexto de las enfermedades cardiovasculares dado el papel clave de estrés oxidativo en la pared arterial en la patogenia de la aterogénesis 46. Hemos utilizado el análisis de la función del HDL de fluorocromo para detectar función deteriorada de la HDL en Estados de estrés oxidativo crónico tales como ateroesclerosis y Virus de inmunodeficiencia humana (VIH) la infección32. Usando análisis bioquímico de la función del HDL, varios estudios han confirmado la Asociación de HDLox con la obesidad y enfermedades cardiovasculares 19,21,27,34,35 ,36,47. Significativamente, en los estudios piloto en humanos demostramos asociaciones de HDLox con el validados ensayos celulares, sustitutas de las medidas de las enfermedades cardiovasculares, inflamación sistémica, disfunción inmune y asociada a riesgo cardiovascular y metabólico fenotipos de32,36. Aunque este ensayo se ha utilizado en varios estudios sobre el papel de la función del HDL en diferentes enfermedades como crónica VIH infección32,38, 32 y obesidad aterosclerosis36, queda validados en estudios a gran escala con puntos finales clínicos disponibles de ECV (p. ej. ataques al corazón).
La reacción de fluorocromo con peróxidos en presencia de HRP para producir resorufin altamente fluorescente es bien establecido 48,49. HRP cataliza la oxidación del fluorocromo no fluorescente para resorufin fluorescentes rojo50,51. Esta oxidación puede ser impulsada por peróxidos endógenos presentes en la reacción (OH-) y peróxidos lípidos HDL (LOOH-). Sin colesterol oxidasa, resorufin (con HRP) puede cuantificar el intrínseco contenido en peróxido lipídico HDL de una cantidad específica de colesterol HDL. La producción del fondo de OH - como resultado de la oxidación del aire del búfer se resta de la lectura fluorescente de cada pozo. Resorufin tiene mínimo autofluorescencia en la mayoría de las muestras. Adición de catalasa (1-4 U/mL) en el tampón de reacción puede atenuar rápidamente peróxidos endógenos para que el aumento en la lectura fluorescente con el tiempo es conducido por los peróxidos de lípidos HDL. El ensayo es versátil y puede evaluar el contenido de peróxido lípido en ésteres de colesterol de HDL versus libre HDL colesterol32,48,49 .
Hay muchas variaciones de la función del HDL del fluorocromo ensayo32. Brevemente, hay por lo menos 3 principales enfoques: un) añadir un volumen específico de HDL (por ejemplo 50 μL) por pozo y después normalizar el valor de peroxidación de lípidos HDL por el nivel de HDL-C según lo determinado en el laboratorio clínico; b) determinar la concentración de HDL-C en cada muestra basado en ensayos de colesterol colorimétrico estándar y agregue una cantidad específica de HDL-C (por ejemplo, 1 μg) por pozo; y c) normalizar la lectura función de HDL HDL o apoA-I proteína contenido32. También hay por lo menos 3 principales enfoques sobre cómo aislar las HDL para análisis de peroxidación de lípidos HDL: colesterol HDL a) precipitación por ejemplo con glicol de polietileno; b) captura de inmunoafinidad; y c) otros métodos de alto rendimiento no estándar para el aislamiento de HDL como µLtracentrifugation32. Además, el ensayo es versátil y puede evaluar el contenido de peróxido lípido en ésteres de colesterol de HDL versus libre HDL colesterol 32. Hay varias formas de informar que los resultados por ejemplo fluorescencia arbitraria, unidades estandarizadas de resorufin fluorescencia, normalizaron cociente a un control combinado de32. Adjunto presentamos el método más reproducible.
Si se utiliza plasma es importante preparar plasma en tubos con citrato de sodio como anticoagulante 27,28. 40 y heparina sulfato de EDTA puede interferir con las reacciones de oxidación 41,42. Sulfato de heparina puede interferir con pruebas bioquímicas de función de HDL 27,28. Aunque criopreservados de suero y plasma son subóptimos para la determinación de lípidos, la función del HDL y la peroxidación de los lípidos HDL, criopreservadas muestras pueden cuantificar diferencias relativas en la peroxidación de los lípidos HDL por mg de HDL. Es importante procesar todas las muestras dentro de un estudio específico de la misma forma exacta (por ejemplo mismo ciclos hielo-deshielo) e incluir un control combinado en cada plato para tener en cuenta factores de confusión potenciales relacionadas con diferencias en el procesamiento de las muestras entre diferentes estudios. Criopreservación a largo plazo puede comprometer los resultados de los análisis de función de HDL43 pero diferencias relativas en la peroxidación de los lípidos HDL entre muestras dentro de un estudio pueden aplicarse aún si un apropiado control combinado es utilizado 27, 28.
Lo importante es que, previo análisis de la función de HDL no se estandardizan. Aquí describimos un acercamiento donde uso de los controles adecuados garantiza la estandarización de la lectura. Más específicamente, hay varios parámetros conocidos que pueden afectar la lectura de Ensayos bioquímicos de HDL funcionan como efectos de matriz (suero vs método de preparación de plasma), presencia de albúmina y otras proteínas, criopreservación, hielo-deshielo 32. HDL la función fluorocromo análisis pueden ser estandarizado con el uso de estándares disponibles en el mercado y reactivos experimental32. Sin embargo, también hayvarios factores de confusión desconocidas (o mal caracterizados) en cada estudian y entre personas diferentes que pueden afectar la determinación de HDL función de resultados. Así, en cada plato utilizamos un control de HDL combinado preparado a partir de las muestras específicas de interés dentro de un estudio determinado (que han sido procesadas idénticamente) que minimiza los artefactos y confusión32. Uso de las muestras del Banco de sangre plasma y los valores de HDL-C desde el laboratorio clínico puede estandarizar más el ensayo32.
Previamente hemos demostrado que diferentes métodos de aislamiento de HDL significativamente pueden afectar la lectura de Ensayos bioquímicos de la función de HDL 27,28,32 pero el fluorocromo puede medir confiablemente independientemente de HDLox del aislamiento HDL 32. Métodos de aislamiento de HDL son un factor limitante importante para estudios de alto rendimiento de la función del HDL. Ultracentrifugación se considera el método de referencia hoy, pero sigue siendo un método desperdiciador de tiempo de52. Electroforesis es imprecisa y no estandarizado 53. HDL precipitación métodos implican el uso de polianiones como el polietilenglicol (PEG) para precipitar lipoproteínas de baja densidad dejando el HDL en el sobrenadante 54. Aunque estos métodos muestran ciertos inconvenientes como resultados variables con sueros lipémicos e interferencias con modificaciones previo de colesterol enzimático procedimientos 55 en el procedimiento original uso estandarizados disponibles en el mercado reactivos producen un procedimiento simple, confiable y exacto56. Aunque la precipitación PEG es un método comúnmente utilizado para aislar las HDL21,57 de suero del paciente, una cuestión importante es la presencia de proteínas no-HDL como albúmina58. Inmunoafinidad aislamiento puede utilizarse para reducir al mínimo el efecto de la albúmina sobre la función de HDL 32. Aunque pueden evaluarse diferencias relativas en HDLox para un método de captura específicas, anticuerpos específicos contra el HDL pueden no completamente capturar estructuras complejas de HDL. Utilizando los controles adecuados como se describe en este protocolo, diferencias relativas en HDLox entre ejemplares de HDL (aisladas por la precipitación de PEG) pueden ser confiablemente determinadas.
Este ensayo, como todos los otros ensayos de la función del HDL, tiene limitaciones fundamentales. En vivo la oxidación de HDL en la pared arterial es bastante compleja y heterogénea y contenido en peróxido lípido puede reflejar solamente parcialmente HDLox46. Función y estructura de HDL continuamente cambios en vivo y medición de la función del HDL en un punto puede no reflejar el impacto de la disfunción de HDL en la enfermedad de órgano de extremo largo tiempo59. No se sabe si la lectura HDLox debe normalizarse por el C-HDL o HDL proteína 22. Los estudios clínicos futuros deben validar la importancia de la lectura del ensayo (HDL lípido contenido en peróxido por mg de HDL-C).
En conclusión, el análisis de la función del HDL de fluorocromo es un método fiable para la determinación del contenido en peróxido lipídico HDL por una cantidad específica de HDL (HDLox). HDLox los valores más altos están asociados con la función de antioxidante de HDL reducida. La lectura de este ensayo se asocia con el validados celular ensayos, medidas sustitutas de las enfermedades cardiovasculares, inflamación sistémica, disfunción inmune y fenotipos de riesgo cardiovascular y metabólico asociado 19, 21,27,32,34,35,36,37,38,39, 47. este método ofrece una herramienta conveniente, y sin embargo robusta para examinar el papel de la función del HDL en enfermedad humana.
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Disclosures
Este protocolo y el análisis son relevantes para la patente PCT/US2015/018147.
Acknowledgments
Los autores reconocen con gratitud el trabajo de Dr. Mohamad Navab, Alan Fogelman y Srinivasa Reddy por su papel clave en el desarrollo de iteraciones anteriores de este modelo. T.A.A. es apoyado por Beca Postdoctoral un RMIT Universidad del rector. AJ y AH son apoyados por el NHMRC proyecto grant 1108792. TK es apoyado por subvenciones de NIH NIH K08AI08272, subvención del NIH/NCATS # µL1TR000124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Experimental Reagents | |||
| HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red reagent. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| DMSO. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Horse Radish Peroxidase (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Esterase. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Resorufin fluorescense Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| 5x Reaction Buffer. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| HDL Cholesterol Automated Reagent | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200, sterile | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-387--955 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gen5 2.01 software | Biotek, Vermont, USA | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gen5 Plate reader | Biotek, Vermont, USA | NA |
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