Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

התמיינות של תאי גזע עובריים בעכבר לתוך Interneuron קורטיקלית מבשרי

Published: December 3, 2017 doi: 10.3791/56358
Automatic Translation
1,2, 1
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת interneuron קורטיקלית אבות ו מבשרי פוסט-mitotic interneuron של תאי גזע עובריים בעכבר בשיטה שונה embryoid גוף-כדי-טפט. אלה אבות/מבשרי יכולים להיות בשימוש במבחנה או fluorescently מיון מושתלים לתוך קליפת neonatal ללמוד קביעת גורל, או שימוש ביישומים טיפולית.

Abstract

GABAergic interneurons בקליפת המוח הם אוכלוסיה הטרוגנית של תאים לשחק תפקידים חיוניים המסדיר את הפלט של נוירונים כפירמידה סינאפסות, כמו גם סינכרון התוצרים של נוירון כפירמידה הרכבים. הגירעונות בתפקוד interneuron היו מעורבים במגוון מנוטלי הפרעות, כולל סכיזופרניה, אוטיזם, אפילפסיה. ההטיה של interneurons קורטיקלית מתאי גזע עובריים לא רק מאפשר לחקר ההתפתחות והתפקוד שלהם, אך מספק תובנה המנגנונים המולקולריים שבבסיס בפתוגנזה של הפרעות הקשורות interneuron קורטיקלית. Interneurons יש גם יכולת יוצאת דופן כדי לשרוד, להעביר, ולשלב מארח המעגלים קורטיקלית שלאחר ההשתלה, שהופך אותם מועמדים אידיאליים לשימוש בטיפולים מבוססי תאים. כאן, אנו מציגים מדרגיים, יעיל ביותר, ששונה embryoid גוף-כדי-טפט שיטה ההטיה של ביטוי Nkx2.1 אבות interneuron, הצאצאים שלהם מן בתאי גזע עובריים בעכבר (mESCs). באמצעות קו mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP כתב כפול, Nkx2.1 אבות או צאצאיהן שלאחר mitotic לבטא Lhx6 יכול להיות מבודדים באמצעות תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) ולא משתמשים לאחר מכן במספר יישומים במורד הזרם. כמו כן אנו מספקים שיטות כדי להעשיר parvalbumin (PV) או somatostatin (SST) interneuron קבוצות, אשר עשוי להיות שימושי חוקרת היבטים של נחישות הגורל או לשימוש ביישומים טיפולית ירוויחו interneuron מועשר קבוצת משנה השתלות.

Introduction

הן בעכברים ובבני אדם, בערך מחצית כל קורטיקלית מעכבות interneurons (CIns) מקורם בתוך מבנה subcortical ארעית הידועה בשם קדושתו ganglionic המדיאלי (MGE), שבו המוצא לאגס neuroepithelial CIns אחרים עצביים ו גליה קבוצות מבטאים את הפקטור שעתוק Nkx2.11,2. CIn חבורות או תתי סוגים מוגדרים על-ידי מצטלבים מורפולוגי, עצבית, אלקטרופיזיולוגיות וקישוריות מאפיינים3,4. CIns MGE, נגזר ניתן לקבץ קבוצות בעיקר שאינם חופפים בהתבסס על הבעת רגשותיהם PV או SST, הביטוי של אשר בקורלציה עם מסוים אלקטרופיזיולוגיות וקישוריות נטיות5. תפקוד לקוי של interneurons, במיוחד אלה בקבוצת המשנה PV, היה מעורב במספר מנוטלי הפרעות ומחלות6,7. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לייצר תאי גזע-derived אבות mitotic ו מבשרי נודדות מועשר לגורל PV או SST CIn ללמוד ביולוגיה interneuron קורטיקלית, לשימוש בטיפולים מבוססי תאים.

פיתחנו שיטה מדרגי, יעילה במיוחד עבור ההטיה של ביטוי Nkx2.1 אבות interneuron, הצאצאים שלהם מן mESCs. באמצעות Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP של הכתב כפול mESC קו8, Nkx2.1 אבות או צאצאיהן שלאחר mitotic לבטא Lhx6 יכול להיות מבודדים באמצעות FACS משתמשים לאחר מכן במספר יישומים במורד הזרם. על-ידי מניפולציה מספר איתות המסלולים, משך הזמן של תרבות, ומצב של נוירוג'נסיס, אפשר להשיג מיליוני interneuron fluorescently שכותרתו מבשרי מתאים שורה של יישומים במורד הזרם.

למרות מספר שיטות אחרות קיימות ליצירת MGE כמו אבות מ mESCs9,10,11,12,13,14, השיטה שלנו, אשר נשענת על חגיגת אנטגוניסט מבצע של-939, יעיל במיוחד-יצירת שיתוף לבטא אבות telencephalic Foxg1/Nkx2.1. בנוסף, היכולת לבחור interneuron אבות או פוסט mitotic לבטא Lhx6 הצאצאים שלהם באמצעות מערכת כפולה הכתב שלנו, משפר באופן משמעותי את היכולת ליצור אבות ברורים, הצאצאים שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: קו mESC כתב כפול שמתואר פרוטוקול זה הינו זמין לפי בקשה (sande@mail.med.upenn.edu).

1. הכנה מדיה

הערה: חמים כל המדיה עד 37 ° C לפני השימוש בתרבית תאים.

  1. העכבר מתחלקים פיברובלסט (MEF) מדיה (עבור הכנת 500 מ)
    1. להוסיף 50 מ ל סרום שור עוברית (FBS) 449 מיליליטר של Dulbecco בינוני (DMEM ששינה רשנה), ואת מסנן דרך יחידת מסנן 500 מ"ל 0.22 נקבובית מיקרומטר.
    2. להוסיף 1 מ"ל הסוכן מיקרוביאלית (50 מ"ג/מ"ל) לאחר סינון. לאחסן התקשורת ב 4 ° C עד חודש או aliquot, בחנות ≤-20 ° C.
  2. N2 מדיה (עבור הכנת 500 מ)
    1. הוסף 5 מ ל L-אלנין-L-גלוטמין (100 x) ו- 500 µL מרקפטואתנול (55 מ מ) מ 489.5 ל DMEM: תערובת מזין F-12 (DMEM/F-12), מסנן דרך יחידת מסנן 500 מ"ל 0.22 נקבובית מיקרומטר.
    2. להוסיף 1 מ"ל הסוכן מיקרוביאלית (50 מ"ג/מ"ל) ו- 5 מ"ל N2 תוספת-B לאחר סינון. חנות התקשורת ב 4 ° C בחושך עד כחודש.
  3. מדיום הגידול ללא סרום (אופנוע) (עבור הכנת 500 מ)
    1. להוסיף 75 מ ל תוספת ללא סרום בינוניים, 5 מ לגלוטמין (100 x), 5 מ ל מם חומצות אמינו שאינן הכרחיות (MEM-NEAA) (100 x), 500 µL מרקפטואתנול (55 מ מ) ל- 413.5 mL הלא-גלוטמין המכילה DMEM, לסנן דרך יחידת מסנן 500 מ"ל 0.22 נקבובית מיקרומטר.
    2. להוסיף 1 מ"ל הסוכן מיקרוביאלית (50 מ"ג/מ"ל) לאחר סינון. חנות התקשורת ב 4 ° C עד כחודש.
  4. מדיה בתאי גזע עובריים בעכבר (עבור הכנת 500 מ)
    1. להוסיף 75 מ ל תא גזע כיתה FBS, 5 מ ל MEM-NEAA (100 x), 5 מ לגלוטמין (100 x), 500 µL מרקפטואתנול (55 מ מ) ל- 413.5 mL הלא-גלוטמין המכילה DMEM, לסנן דרך יחידת מסנן 500 מ"ל 0.22 נקבובית מיקרומטר.
    2. להוסיף 1 מ"ל הסוכן מיקרוביאלית (50 מ"ג/מ"ל) לאחר סינון. לאחסן התקשורת ב 4 ° C בחושך עד חודש או aliquot, בחנות ≤-20 ° C.

2. culturing mESCs

  1. צלחת mitotically MEF מזין תאים פעילים בתקשורת MEF על גבי לוחות תרביות רקמה שטופלו ב- 3-4 x4 10 תאים/ס מ2. אפשר לפחות 12 שעות להם להתיישב בה חממה תרבות של התא ב 37 ° C עם ≥ 95% לחות יחסית ו-5% CO2 לפני ציפוי של mESCs. אם לא משתמשים מיד, להחליף את המדיה MEF כל 3 ימים. להיפטר MEFs אם לא נעשה שימוש תוך 7 ימים של ציפוי.
  2. להוסיף mESCs (צפיפות נע בין 1-4 x4 10 תאים/cm2) MEF צלחות בתקשורת mESC המכיל העכבר לוקמיה מעכבות פקטור (mLIF) (1,000 U/mL). דגירה התאים ב 37 ° C עם ≥ 95% לחות יחסית ו-5% CO2.
  3. המעבר mESCs באמצעות טריפסין-EDTA (0.05% טריפסין) (1:5-1:10) לאחר המנה הופך ~ 70-80% confluent או אם המושבות מתחילים לגעת. זו בדרך כלל מתרחשת כל יומיים, אך עשויה להימשך עד 4 או 5 ימים בהתאם צפיפות ציפוי הראשונית.
  4. לשמור את mESCs בשכבה מזין MEF במדיום mESC כדי לשמור pluripotency.
  5. לפני שמתחילים בידול, המעבר את התאים לפחות פעם אחת על גבי ג'לטין מצופה לוחות ללא MEFs כדי לדלל החוצה MEFs.
    1. להכין ג'לטין מצופה לוחות על-ידי הוספת 0.1% הג'לטין בתוך buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) עם Ca2 +/Mg2 + לצלחת תרבות רקמות טיפול, עוזב ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 1 ח' צלחת 1.5-2 x 106 תאים/10 ס מ צלחת (2.7-3.6 x 104 תאים/cm2) ולאפשר את התאים להרחיב 2 ימים לפני תחילת בידול.

3. הבחנה mESCs כלפי אבות Telencephalic כמו MGE

  1. בידול יום (DD) 0 = "לצוף תאים"
    1. לאחר mESCs גדלו ג'לטין מצופה לוחות עבור 2 ימים, תשאף התקשורת ולשטוף את התאים פעם אחת עם PBS ללא Ca2 +/Mg2 +. הוסף מספיק טריפסין-EDTA (0.05% טריפסין) כדי לכסות את המשטח של הצלחת (בדרך כלל 4 מ"ל טריפסין-EDTA בשביל מנה אחת של תרביות רקמה 10 ס מ), ומניחים את התאים בחזרה לתוך החממה ב 37 ° C עם ≥95% לחות יחסית ו-5% CO2 במשך 4 דקות.
    2. לאחר 4 דקות, להרוות את טריפסין-EDTA שימוש באמצעי האחסון פי 2 עם mESC מדיה. להעביר את התאים שפופרת צנטריפוגה בגודל מתאים, centrifuge את התאים ב 200 x g למשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, להסיר את הצינור, תשאף התקשורת מבלי להפריע בגדר. Resuspend בגדר ב 1 מ"ל KSR:N2 מדיה (1:1) המכיל את המדכא BMP-כעבור שנה--193189 (250 ננומטר) והמעכב ונ ט 939-מבצע של (10 מיקרומטר).
    3. למדוד ריכוז התא באמצעות hemocytometer או מונה תא אוטומטית. התחל גדל התאים embryoid גופות (EBs) על-ידי הוספת תאים למ"ל 75,000 KSR:N2 המדיה (1:1) המכילה-כעבור שנה--193189 (250 ננומטר) ו מבצע של-939 (10 מיקרומטר) במנות תרביות רקמה שאינם מחסידי. דגירה התאים ב 37 ° C עם ≥ 95% לחות יחסית ו-5% CO2.
  2. על DD1, להכין עבור תא "נוחתים" על ידי ציפוי כלים תרביות רקמה מטופלים עם פולי-L-ליזין (10 µg/mL ב- PBS עם Ca2 +/Mg2 +) בן לילה (O/N) ב 37 ° C עם לחות יחסית של 95% ≥ או לפחות שעה.
  3. על DD2, וארוקן את פולי-L-ליזין, מעיל הצלחות עם laminin (10 µg/mL ב- PBS עם Ca2 +/Mg2 +) O/N ב 37 ° C עם ≥ 95% לחות יחסית.
    הערה: בזמן O/N הוא אופטימלי, קטנה כמו 2 h עשוי להספיק. אם לא נעשה שימוש צלחות יום למחרת, תשאף laminin להחליף עם PBS מבלי Ca2 +/Mg2 +, לאחסן ב 4 ° C עד 2 שבועות.
  4. DD3 ("אדמה תאים")
    1. לפני תחילת EB דיסוציאציה, וארוקן את laminin ולאפשר את הצלחות יבש לחלוטין בשכונה תרביות רקמה. אל תשתמש צלחות המופיעות מבריק או רטוב בעליל. להעביר את EBs עם מדיה לתוך צינור 15 מ"ל צנטריפוגה למשך 3-4 דקות בגיל 15 x g או עד EBs יש מגורען.
  5. האחות התקשורת ולהוסיף 3 מ"ל של פתרון ניתוק התא המכיל DNase (2 U/mL) דגירה ב 37 ° C עם לחות יחסית של 95% ≥ ו 5% CO2 ב 15 דקות קפיצי בעדינות את הצינור כל 3 דקות כדי לסייע EB דיסוציאציה.
  6. ברגע EBs כבר אינם גלויים או 15 דקות שחלפו, להוסיף KSR:N2 6 מ ל (1:1) המכיל DNase (1 U/mL), צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 200 x g.
  7. צלחת תאי KSR:N2 (1:1) המכיל-כעבור שנה--193189 (250 ננומטר), מבצע של-939 (10 מיקרומטר), ואת החומר המדכא רוק Y-27632 (10 מיקרומטר) ב- 4.5-5 x4 10 תאים/ס מ2.

4. SST מעשירה בפרוטוקול: "DD12 GFP גבוהה סוניק הקיפוד (ששש)" (המשך מ שלב 3.7)

  1. על DD5, לשנות את המדיה עם KSR:N2 (1:1) המכילה FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), ו- SSH (50 ng/mL).
  2. להתכונן תרביות רקמה לוחות ציפוי מחדש ביום 8 (שלב 4.4) באמצעות ההוראות המפורטות בשלבים 3.2-3.3.
  3. DD7, לשנות המדיה עם KSR:N2 (1:1) המכילה FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), וששש (50 ng/mL).
  4. על DD8, לוחית רישוי מחדש את התאים.
    הערה: במהלך השלב זה לא הכרחי, ציפוי מחדש את התאים יכול להפחית את סוגי תאים מוקדמת הבדיל, לא רצויות. ציפוי מחדש גם שובר את הביצים של תאים להקשות ניתוחים immunohistochemical במורד הזרם, מגדיל את היעילות של FACS בנקודות זמן מאוחר יותר.
    1. צלחת מחדש תאים, לנתק את התאים מהצלחת עם טריפסין-EDTA (0.05% טריפסין) עבור 5 דקות ב 37 ° C עם ≥95% לחות יחסית ו-5% CO2. להרוות את טריפסין-EDTA שימוש באמצעי האחסון פי 2 עם KSR:N2, צנטריפוגה ב g 200 x עבור 5 דק. לסנן את התאים דרך צינור מסנן 40 µm להסיר גושים כלשהם. צלחת מחדש את התאים-תאים/ס מ 250,0002 ב N2/אופנוע (1:1) המכילים FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), ו- Y-27632 (10 מיקרומטר) עם שטויות (50 ng/mL).
      הערה: אם במקום זאת, ההחלטה שלא מחדש צלחת התאים על DD8, לשנות את המדיה עם KSR:N2 המכיל ששש (50 ng/mL) כל הימים 2 DD7 ועד DD12 והמשך להוסיף IGF-1 (20 ng/mL) ו- FGF-2 (10 ng/mL) עד DD9.
  5. על DD10, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 המכיל ששש (50 ng/mL).
  6. ב- DD12, כדי להשיג התאים מועשרים עבור סוגי SST, להשתמש FACS לבודד Lhx6::GFP-רק מבטאת תאים.
    1. כדי לנתק את התאים, השתמש הלא-טריפסין המכילה תאים-דיסוציאציה ריאגנט במקום טריפסין-EDTA. רחץ תאים פעם אחת עם PBS ללא Ca2 +/Mg2 +. להוסיף מראש ומחוממת הלא-טריפסין המכילה תאים-דיסוציאציה ריאגנט המכיל DNase (2 U/mL) לתאים. למקם אותם בחממה ב 37 ° C עם ≥95% לחות יחסית ו-5% CO2 למשך 10-30 דקות, או עד התאים יש מנותק. טפח בעדינות את הצלחות כל 5 דקות כדי לסייע של הדיסוציאציה.
      הערה: על DD11-12 תרבויות, רק 10-15 דקות ייתכן שיהיה צורך. על תרבויות DD15-16, 30 דקות או יותר ייתכן שתידרש דיסוציאציה מלאה.
    2. לאחר התאים לקחתם לגמרי רלוונטי, להמשיך FACS בידוד באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים או להשתמש בתאים אחרים ניתוחים במורד הזרם.

5. PV מעשירה בפרוטוקול: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (המשך מ שלב 3.7)

  1. על DD5, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 (1:1) המכיל FGF-2 (10 ng/mL) ו- IGF-1 (20 ng/mL).
  2. להתכונן תרביות רקמה לוחות ציפוי מחדש על DD8 (שלב 4.4) באמצעות ההוראות המפורטות צעדים 3.2-3.3.
  3. על DD7, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 (1:1) המכיל FGF-2 (10 ng/mL) ו- IGF-1 (20 ng/mL).
  4. על DD8, מחדש צלחת התאים כפי שמתואר בשלב 4.4 למעט החריגים הבאים: כאשר ציפוי מחדש את התאים, להחליף ששש אגוניסט smoothened (סאג; 30 ננומטר) ולהוסיף מעכב PKC טיפוסיות (aPKCi; 2 מיקרומטר). יחדיו, התקשורת מחדש משוריין הוא עכשיו N2/אופנוע (1:1) המכילה FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 מיקרומטר), מפנקים (30 ננומטר), ו- aPKCi (2 מיקרומטר).
  5. על DD10, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 המכילים aPKCi (2 מיקרומטר).
  6. DD11
    הערה: בשלב זה, Nkx2.1::mCherry+ התאים מועשרים להפוך PV CIns.
    1. ניתוק התאים מהצלחת עבור FACS באמצעות פרוטוקול זהה המתוארים שלב 4.6. אם ההחלטה כדי לאסוף תאים Nkx2.1::mCherry+-יום לאחר מכן בידול, להתעלם שלב זה.
  7. על DD12, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 המכילים aPKCi (2 מיקרומטר). על DD14, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 המכילים aPKCi (2 מיקרומטר). על DD16, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 המכילים aPKCi (2 מיקרומטר). על DD17, לאסוף את התאים Nkx2.1::mCherry+ באמצעות פרוטוקול זהה המתוארים שלב 4.6.

6. PV מעשירה בפרוטוקול: "DD17 mCherry נמוך ששש" (המשך מ שלב 3.7)

  1. על DD5, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 (1:1) המכיל FGF-2 (10 ng/mL) ו- IGF-1 (20 ng/mL). על DD7, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 (1:1) המכיל FGF-2 (10 ng/mL) ו- IGF-1 (20 ng/mL).
  2. על DD9, לשנות את התקשורת עם KSR:N2 (1:1). מנקודה זו ואילך, ללא גורמי צמיחה נוספים נחוצים.
    1. להמשיך לשנות את המדיה כל יומיים עד קציר התאים על DD17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

את הפרוטוקול המתואר במאמר זה הוא גרסה מותאמת של16,15,שלנו פרוטוקולים שפורסמה17 ואת הותאם לשימוש עם קו כפול-כתב mESC שלנו Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. על ידי הוספת החומר המדכא ונ ט 939-מבצע של DD0-5, בשילוב עם ציפוי מחדש ב- DD8, אנו להשיג חזקים אינדוקציה Nkx2.1, שבו למעלה מ- 50% של כל הגרעינים דאפי + בתרבות הם Nkx2.1 מביעה גם (איור 1 א', ב'). אימונוהיסטוכימיה עבור mCherry ו- GFP כתבים הצגת ביטוי ברור בתוך מחוזות Nkx2.1-חיוביות immunoreactivity (איור 1 א'). FACS של תאים חיים באמצעות הכתבת מקורי מראה כי ארבע אוכלוסיות של תאי ניתן לבודד בבירור: תאים כפול שלילי GFP/mCherry (1), (2) mCherry בלבד לבטא תאים, התאים מבטאים (3) GFP בלבד ותאים (4) GFP/mCherry ביטוי כפול ( איור 1C). באמצעות הקו הזה, חלק קטן של אבות מתחיל להפוך לעיתונאי mCherry סביב DD8-9. רמות mCherry שיא בין DD12-13, ואז בהתמדה כמו אבות יציאה מחזור התא ולייצר פוסט-mitotic Lhx6::GFP + interneuron מבשרי (איור 1D). בהתאמה, הכתב Lhx6::GFP מדליק בין DD9-10 הפסגות סביב DD13-14 (איור 1D). למרות המספר הכולל של תאים Lhx6::GFP ממשיך לגדול בתרבות, האחוז. לא נכון, כנראה עקב ההתפשטות של שושלות אחרות. פעם אחת Lhx6::GFP + מבטא כתב, זה נשאר לזיהוי ללא הגבלת זמן מאז Lhx6 מתבטאת stably interneurons קורטיקלית נגזר MGE בוגר18,19. למרות Nkx2.1 ו- Lhx6 ביטוי במידה רבה שאינם חופפים בתוך מאתר הקדמי, יש אוכלוסיה ארעית של Nkx2.1::mCherry ו- Lhx6::GFP משותפת להביע תאים בתרבות. זאת לפחות בחלקו בשל perdurance של הכתב mCherry מעבר פרק הזמן הרגיל של ביטוי Nkx2.1, כמו רוב התאים התווית על-ידי כפול שאינם מבטאים רמות לגילוי של חלבון Nkx2.1 (טייסון, אנדרסון, לא פורסם). התאים ממשיכים להביע Lhx6 כתב והן דובדבן/Nkx2.1 חלבון ייתכן striatal interneurons20. עם זאת, על סמך מחקרי הדמיה חיה שלנו, יש חלון של 18 h שבו מבשרי סינכרונית, לאחרונה פוסט mitotic לבטא Nkx2.1::mCherry ו- Lhx6::GFP ניתן לבודד (Tischfield אנדרסון, לא פורסם, ואבדוק. Tischfield et al. 17)-על ידי איסוף Nkx2.1::mCherry ותאים Lhx6::GFP כפול חיובי בשלב כלשהו במהלך הפרוטוקול, לכן ניתן לקבל אוכלוסייה של תאים יש בעיקר יצאו מחזור התא בתוך כ 18 h אחד את השני. זאת בניגוד Nkx2.1::mCherry ו- Lhx6::GFP-רק מבטאת תאים, אשר מייצגים סוגים שונים של אבות ו מבשרי, בהתאמה, של birthdates בדרגות שונות.

קו כפול-כתב mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP יכול לשמש כדי להעשיר עבור SST-נגזר interneurons. באופן כללי, הוספת ששש התרבויות ואיסוף GFP + מעשיר תאים בנקודות זמן קודמות ב הבידול (למשל, DD12) עבור סוגי SST. מבוסס על תצפיות שלנו, אנו לא ראינו הבדל משמעותי ביחס SST:PV בהתאם אם ששש מתווסף DD5 או DD8 (נתונים לא מוצג). על-ידי הוספת שטויות (50 ng/mL) DD8-12, אז משתילים התאים מבטאים GFP בלבד, נקבל בממוצע 7:1 יחס של15,SST:PV CIns (איור 2 א)17. ראו פרטים נוספים על השפעת ששש וזמן בתרבות על גורל interneuron באמצעות קו כפול-כתב mESC שלנו, טייסון. et al. 15

להעשיר עבור PV-נגזר CIns, ששש צריך להיות מושמט מהתקשורת תרבות. ראוי לציין, בקנה אחד עם הדרישה של איתות לשמור על Nkx2.1 ביטוי אבות mitotic21, ששש ששש איתות קיימת בתרבויות אלו ללא ששש אקסוגני שנוספו מאז ששש איתות cyclopamine אנטגוניסט מבטלת הביטוי Nkx2.115. אולם, אם התאים נמצאים מצופה מחדש על DD8, זה שטויות אנדוגני הוא שהוסרו, כגון זה סאג (30 ננומטר) להוסיף את התקשורת DD8-10 כדי לשמור על הביטוי Nkx2.1 ואת הייצור של CIns. שלנו מחקר קודם הראה כי לא ששש מן התנאים תרבות, מיון עבור תאים Nkx2.1::mCherry+ על DD17, יחס ~2.6:1 של תאים PV:SST יכול להיות מושגת (איור 2B)15. בניגוד SST יחוברו, אשר הם מועשרים בשלבים מוקדמים יותר, ובפני ששש אקסוגני, מוגבר, משך בתרבות ומעשירה חוסר ששש אקסוגני PV יחוברו15. במחקר עדכני יותר, מצאנו את aPKCi חלה על פרוטוקול "MGE" שלנו באופן משמעותי מגבירה את השבר של אבות Nkx2.1::mCherry כי אקספרס cyclin D217, סמן של תאים ביניים קדמון22. זו וריאציה פרוטוקול מבוסס על שלנו ממצא CIns לבטא PV מקורן בעיקר ביניים אבות, ואילו SST אבות מקורן בעיקר אבות רדיאלי על פני השטח חדרית23. מצאנו כי כאשר מיון מושתלים לתוך קליפת העכבר neonatal, אבות אלה מאוד מוטים לייצור PV-תת. על ידי הוספת aPKCi מ DD8-11 ומיון ואז Nkx2.1::mCherry תאים, הצלחנו להשיג יחס 5.8:1 של PV:SST יחוברו (איור 2C)17. נוסף להעשרת עבור סוגי PV, אנחנו שללו גם תאים Nkx2.1::mCherry גדל בנוכחות aPCKi מ- DD8-17. עם זאת, אנחנו לא השיגו עלייה היחס PV:SST מעבר מה הצלחנו להשיג ב- DD11, למרות עלייה שולית באחוזים של PV יחוברו שנוצר (איור דו-ממדי). תרשימי זרימה עבור כל אחד פרוטוקולים אלה כלולים באיור3. Immunostaining של העכבר מוח 30 הימים שלאחר ההשתלה עם אנטי-PV, אנטי-SST אנטי-GFP (כדי לשפר הזיהוי של Lhx6::GFP + תאים) נוגדנים מראה התאים Lhx6::GFP + נספח תכוניות מורפולוגיות בוגרת עם דפוסי ביטוי PV ל- SST דומה ויוו המקבילים (איור 4 , איור 5).

כדי לסייע בקביעת הבחנה CIn מופיע מוצלחת, הכנו סדרה של תמונות בכל שלב של פרוטוקול להפגין השתנות נורמלי (איור 6, איור 7, איור 8). נשלב גם איור הממחיש כיצד בידול כושל מופיע DD4 (איור 9). באופן כללי, differentiations לא מוצלח תניב רמות נמוכות (פחות מ 10%) של הביטוי Nkx2.1 ואחוזים האינדוקציה Nkx2.1::mCherry ו- Lhx6::GFP של-1% או פחות.

Figure 1
איור 1: דור של מבשרי interneuron Nkx2.1::mCherry, Lhx6::GFP. (א) מוצג כאן הם תמונות נציג של immunostaining Nkx2.1, Nkx2.1::mCherry (RFP) של Lhx6::GFP (GFP) מתרבות בידול יום 12 (DD12). שימו לב כי תמונות אלה חופפות ערוצים באותו שדה הראייה. (B) כימות של האחוז הממוצע של דאפי + גרעינים לבטא Nkx2.1 ב DD12 בתרבות (n = 3 differentiations עצמאית). (ג) נציג FACS מגרש להפגין על האוכלוסיות ארבעה תאים שונים ניתן לבודד באמצעות קו mESC שלנו כתב כפול. שימו לב כי mCherry בציר ה-x, ה-GFP נמצא על ציר ה-y. לפיכך, התיבה הימנית העליונה מייצג תאים שהם חיוביים mCherry/GFP-זוגי. (ד) מסלול הזמן האינדוקציה Nkx2.1::mCherry ו- Lhx6::GFP מ- DD6-16 באחוזים של תאים בתרבות mCherry בלבד לבטא, GFP בלבד לבטא או mCherry/GFP משותפת להביע. אחוזים אלה התקבלו מתאי גדל בנוכחות ששש במהלך פרוטוקול מעשירה SST, מייצגים ממוצעים מן 3 differentiations עצמאית. קווי שגיאה (ב') ו- (ד) מייצגים ב- SEM. סולם בר = מיקרומטר 150 (א). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: מניפולציה של תרבות תנאים מעשיר באופן שונה עבור PV-לעומת SST-נגזר mESC נגזר קורטיקליים interneurons. (א) אחוז של PV + SST +, PV- / SST-interneurons מתקבל כאשר DD12, התאים מבטאים GFP בלבד גדל בנוכחות ששש (50 ng/mL) DD5-12 מושתלים לתוך קליפת neonatal וניתח השתלת שלאחר 30 יום. (B) אחוז של PV + SST +, PV- / SST-interneurons המתקבל כאשר DD17, mCherry בלבד לבטא תאים גדל ללא משלימה ששש הם מושתלים לתוך קליפת neonatal וניתח 30 הימים שלאחר השתלת. (ג) אחוז של PV + SST +, PV- / SST-interneurons מתקבל כאשר DD11, mCherry בלבד התאים מבטאים גדל בנוכחות סאג (30 ננומטר; DD8-10), aPKCi (2 מיקרומטר; DD8-11) מושתלים לתוך קליפת neonatal וניתח השתלת שלאחר 30 יום. (D) אחוז של PV + SST +, PV- / SST-interneurons מתקבל כאשר DD17, mCherry בלבד התאים מבטאים גדל בנוכחות סאג (30 ננומטר) DD8-10, aPKCi (2 מיקרומטר) מ- DD8-17 מושתלים לתוך קליפת neonatal וניתח 30 ימים שלאחר ההשתלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תרשימי זרימה הממחישות את הפרוטוקולים שונים PV ו SST-העשרת המתוארים במחקר זה. (A) עבור כל הפרוטוקולים, השלבים שלפני תחילת הבידול כולל DD0-5 זהים. כל התאים גדלים embryoid גופות מ- DD0-3 ב- N2:KSR (1:1) בתוספת BMP-מעכב את-כעבור שנה--193189, החומר המדכא ונ ט 939-מבצע. על DD3, התאים הם "נחת" N2:KSR (1:1) המכיל-כעבור שנה--193189, 939-מבצע של החומר המדכא רוק Y-27632. להעשיר עבור SST-תת, ששש נוסף מ DD5-12. לחלופין, ששש מתווסף מ DD8-12 מאז, מניסיוננו, התוספת של שטויות של DD5 נגד DD8 ואילך לא להשפיע באופן משמעותי על היחס של תת PV:SST שנוצר. גירסאות קודמות של הפרוטוקול (ראה טייסון et al. 15) לא לשלב צעד משוריין מחדש על DD8, במקום בתוספת התקשורת עם ששש אקסוגני על DD5. פרוטוקול זה שונה מאוחר יותר לשלב צעד משוריין מחדש על DD8 יחד עם כניסתה של שטויות, אף אחד מהם לא לשנות משמעותית את היחס PV:SST. פרוטוקול זה "high-ששש", Lhx6::GFP + תאים גדל בנוכחות אקסוגני ששש הם FACS מבודדת על DD12 לשימוש ביישומי במורד הזרם. (B) עבור "נמוך-ששש" PV-הפרוטוקול, מושמטים ששש אקסוגני, כמו גם את הצעד משוריין מחדש על DD8. במקום זאת, תאים Nkx2.1::mCherry+ הם FACS מבודדת על DD17 לשימוש ביישומי במורד הזרם. (ג) עבור "+ aPKCi" פרוטוקול PV, aPKCi נוסף יחד עם סאג DD8-10 ונוספת רק aPKCi מ- DD10 ואילך. DD11 או DD17, תאים Nkx2.1::mCherry הם FACS מבודד לשימוש ביישומי במורד הזרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: immunostaining PV ל- SST בשנת Lhx6::GFP + תאים 30 הימים שלאחר השתלת לתוך קליפת neonatal. (א) תמונה מתח גבוה SST-להביע, Lhx6::GFP + 30 הימים שלאחר השתלת תא לתוך קליפת neonatal. בתוך כל אחת מהעמודות של ארבע תמונות הן תמונות ערוץ אחד של Lhx6::GFP, PV והביטוי SST עם תמונת הממוזג 3-ערוץ בתחתית. כפי שמוצג בחלונית העליונה, הזה Lhx6::GFP + הנוירון מרחיב מרמז מורפולוגיה בשלה של תהליכים מרובים. (B) מתח גבוה תמונה של שני PV-המבטאת Lhx6::GFP + תאים 30 הימים שלאחר ההשתלה. התמונה מתח גבוה (C) SST- / PV-כפול שלילית, Lhx6::GFP + תא. למרות תא זה מרחיב תהליכים מרובים בקנה אחד עם התמיינות להשלים ושילוב קורטיקלית, תא זה לא ברור לבטא PV או SST. שימו לב כי יש גרעין PV + הסמוך לתא Lhx6::GFP + אבל כי זה לא חופף. גודל ברים = 50 מיקרומטר (A-C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: בינוני ונמוך כוח תמונות של ביטוי חלבון PV SST, Lhx6::GFP 30 ימים שלאחר ההשתלה לתוך קליפת neonatal. (א) כוח בינוני תמונה של אזור של העכבר וקליפת המכיל 30 Lhx6::GFP + תאים 30 הימים שלאחר ההשתלה. תאים אלה היו מבוגרים באמצעות פרוטוקול PV (+ aPKCi מ DD8-11; FACS לבודד והשתלת Nkx2.1::mCherry+-DD11). התאים 30 לראות כאן, 16 אקספרס PV 4 אקספרס SST, 10 אקספרס PV וגם SST. (B) התמונה צריכת חשמל נמוכה של אזור של העכבר וקליפת המכיל רבים, היטב הבדיל Lhx6::GFP + תאים 30 הימים שלאחר ההשתלה. הערה של השפע Lhx6::GFP + תהליכים זורם בכל רחבי קליפת המוח. תאים פה ושם מצויים גם ההיפוקמפוס, היכן הם מופיעים כדי לשלב ועיבוד תהליכים בקנה אחד עם פנוטיפ בוגרת. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר (א); 550 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: מראה נורמלי של העכבר פיברובלסט עובריים מזין שכבה ותאי גזע מובחן. (א) מוצג כאן הן 4 X 10 X הגדלה brightfield תמונות הממחיש מראה טיפוסי שלנו מזין עובריים פיברובלסט (MEF) העכבר שכבות 24 שעות לאחר ציפוי. (B) המוצגת הנה במראה הטיפוסי של העכבר שלנו בתאי גזע עובריים (mESCs) 2 ימים לאחר ציפוי על גבי MEF מזינים. שימו לב כי המושבות יש מתחם בהיר והם אליפטית או אובאלית במראה. אם המושבות לאבד את המתחם הזה בהיר או להתחיל לשלוח תחזיות כלפי חוץ, ישנם סימנים לכך עשוי להיות המבדילים התאים. (ג) מוצג כאן הם mESCs 1 ו- 2 ימים לאחר ציפוי מחדש לתוך הג'לטין מצופה מנות על מנת לדלל את מזיני MEF לפני תחילת בידול. שימו לב כי תאי גזע להרחיב במידה ניכרת אחרי 48 שעות על ג'לטין, להתחיל לחלץ. את מראה אובאלית עם היקף בהיר. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר 4 X ו- X 10 תמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: המראה של תאי גזע עובריים בעכבר על בידול ימים 1 עד 7. (א) יום לאחר צף, הגזע ניתן לראות תאים להרכיב קטן embryoid גופים (EBs). ביום השני EBs גדלו במידה ניכרת. שים לב כי כמה EBs יש תקועים יחד ויצרו אשכולות גדולים יותר של תאים. לא נמצא כי זה פוגע הבידול. לאחר 3 ימים, EBs גדלו גדולה עוד יותר, כמה כבר לא מעבירות אור דרכם. זה נורמלי לראות שאריות תאים ברקע. (B) מוצג כאן הם תאי גזע 24 שעות לאחר הנחיתה ביום בידול 4 (DD4). הערה הצפיפות של התאים. רבים החלו להרחיב תהליכים קטנים, אשר יגדיל הבידול ממשיך. לציין כאן כי התאים הם אפילו צבעוניים עם נקודות שחורות קטנות הפזורים. אם התאים נמצאים מבריק או הומוגנית להופיע, זה סימן של בידול חריגה. (ג) מאת DD5, התאים המשיכו להתרבות וליצור רוזטות עצבית. תאים רבים הרחיבו תהליכים ארוכים, רזה. (ד) על ידי DD7, התאים צריך להיות confluent. זה נורמלי לראות דפוס "גבינה", שבו תאים גדולים, שטוחים, multinucleated (ואולי ependymal או גלייה) ליצור איים מעגלית בשכבה של אבות עצבית. לעיתים כאשר הצפיפות התא הוא גבוה מהרגיל, דפוס "גבינה שוויצרית" זה עושה לא פיתוח, כפי שמוצג בתמונה האמצעית. בהתאם הבידול, זה עלול להשפיע על אינדוקציה עצבית. 4 x ו- 10 x מציינים את רמת ההגדלה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר 4 X ו- X 10 תמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: המראה של בידול בימים 9 עד 14. (א) תאים בודדים, ניתן לאבחן יום לאחר ציפוי מחדש. שימו לב שלהם מראה הפרעה דו קוטבית, האופייני אבות עצבית. התרבות היא הומוגנית עם כמה סוגי תאים infiltrating אחרים. הצפיפות מתאימה בשלב זה. (B) מאת DD11, התאים גדלו לתוך טפט. בדומה לשלבים מוקדמים יותר הבידול, גדול תאים רב nucleated "כמו ביצה" ניתן לראות interspersed בכל רחבי. (ג) על ידי DD13 שהתאים ממשיכים להתרבות. הם עכשיו ניתן לראות ויוצרים תלים קטנים. תאים "כמו ביצה," רבים הם עדיין נוכחים בכל רחבי. מנקודה זו ואילך, התרבות יראה שינויים מעטים בלבד, למעט תלים ההולכים וגדלים. 4 X, 10Xx, 20 X מציינות את רמת ההגדלה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר 4 X 10 X תמונות ואת סולם בר = 50 מיקרומטר בתמונות X 20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9: מראה בידול כושל ביום 4. DD4 חשוב מבחינת להערכת ההצלחה של הבחנה כי המסקנה היא אחד הצעדים הקשים ביותר של הפרוטוקול: הנחיתה על DD3. מאת DD4, התאים היו 24 שעות להתאושש לאחר להיות משויך לזהויות גופות embryoid. כפי שניתן לראות כאן, רוב התאים הם מבריקה ואחידה להופיע. וביניהם ברחבי הם תאים פה ושם נראים תקינים, יש מראה כהה עם נקודות שחורות קטנות הפזורים. בנוסף, תאים שטוח גדולים (כמו ניתן לראות בחלונית השמאלית התחתונה) מעידים על בידול חריגה. בחלונית הימנית התחתונה, לפחות שלוש קבוצות קטנות של תאים (חיצים צהובים) מופיעים גופים embryoid קטן, המציין בידול פגום, דיסוציאציה EB לא שלם או הדבקות המסכן פני השטח של הלוח התרבות תאים. תמונות אלה מופיעים בניגוד לאלה המוצגים באיור 7 ב, המתארים בריאה ונורמלית לתאים DD4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אמנם שיטה זו יעילה מאוד על תכנים mESCs נגזר J1 (SCRC-1010), שאנו חווים הצלחה משתנה עם קווים mESC אחרים מבודד המשובטים. למשל, Foxg1::venus mESCs (EB3 נגזר; . דאנג'ו et al. תגובה 13) גרוע זה פרוטוקול, אינדוקציה Foxg1 על ידי DD12 הוא בדרך כלל גודל 1-2%. מסיבות שאנחנו לא מבינים לחלוטין, Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP עוד כתב כפול שיבוט (הנקרא JQ59) שהיה מבודד בו זמנית כמו הקו המתואר פרוטוקול זה (הנקרא JQ27), מייצרת פחות מ 1% לבטא Nkx2.1 תאים כאשר גדל בתנאים זהים. קו האב (J1; ATCC SCRC-1010), עם זאת, מגיב היטב פרוטוקול זה, מייצרת אחוזי תאים לבטא Nkx2.1 DD12 דומים לאלה המוצגים ב איור 1B. במידת הצורך, ניתן להתאים את ריכוזי מבצע של-939 ששש/סאג כדי למטב את התנאים בידול על בסיס שורה אחר שורה. עם זאת, הניסיון שלנו באמצעות פרוטוקול זה כדי להתמיין קווים mESC אחרים MGE כמו אבות מוגבל.

לגבי קו mESC כתב כפול שלנו Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, לא כל Nkx2.1 + התאים מבטאים את mCherry. למרות כמעט כל mCherry + התאים מבטאים חלבון Nkx2.1, כתב ביטוי ומהפיתוח מאחורי ביטוי חלבון Nkx2.1, במיוחד בשלבים המוקדמים של הבידול (DD7-9). השבר של Nkx2.1 + תאים המבטאים mCherry בהתמדה גדל לאורך כל הקורס של הבידול. ברמות שיא (~ DD12-14) mCherry מתבטאת כ- 30% של כל Nkx2.1 לבטא אבות17. בנוסף, נעשה שימוש מלאכותי אותו חיידקי כרומוזום משמש לביטוי mCherry נסיעה לנהוג Cre recombinase בתחומים Nkx2.1-ביטוי של העכברים הטרנסגניים24. בעכברים הללו, Cre-ביטוי היה חלש בתוך התאים לבטא Nkx2.1 של האזור הגבי ביותר של MGE ונראה הגורל-מיפוי עם העכבר הזה תחת תווית לבטא SST CIns הידועים ניתן להפיק במידה רבה של אזור זה25, 26,27,28. עם זאת, למרות סתירות אלה, מיליוני GFP או תאים לבטא mCherry ניתן לבודד רק כמה שעות של FACS.

ישנם שני יתרונות עיקריים של טכניקה זו. ראשית, בשילוב עם קו כפול-כתב mESC שלנו Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, לא ניתן לקבל מספר גדול של מבשרי interneuron מועשר להפוך תת קורטיקליים interneuron PV או SST-נגזר. היתרון העיקרי השני הוא הקלות עם אילו מספרים גדולים של interneuron נגזר התאים יכולה להיות מושגת. למרות מספר טכניקות ששונה אחרים EB קיימות כדי להבדיל MGE אבות ונוירונים, פרוטוקולים אלה מסתמכים בדרך כלל על השימוש של מולקולות מעכבות-חגיגת כגון Dkk113,14,29. אנחנו גילינו כי החומר המדכא ונ ט 939-מבצע של משפר באופן משמעותי את הדור של אבות telencephalic pallidal, כפי שמעידים ביטוי Foxg1 ו- Nkx2.115.

כפי שהוזכר קודם, מספר שיטות אחרות קיימות עבור יצירת אבות MGE כמו של mESCs. ואטאנבי. et al. 14 חלוץ בתחום של בידול telencephalic מ- mESCs על ידי להיות הראשון לפתח שיטה תרבות ללא סרום ההשעיה ואחריו ציפוי מחדש על גבי משטח חסיד. הם מצאו כי ונ ט ו Nodal היריבים, Dkk1 ו- LeftyA, בהתאמה, ביעילות פגעה mESCs neuroectodermal מוקדם שושלות13. על-ידי החלת ששש תרבויות אלה, הם הבחינו כי בין 5-15% של כל התאים תרבות משותפת ביטוי Nkx2.1/Foxg1, יכולות להיחשב MGE, כמו אבות13. עם זאת, בעת הנחת היסודות למחקרים רבים לבוא, מחקר זה לא היה דרך לבודד MGE אבות או להעשיר עבור סוגי CIn מסוים.

כעבור מספר שנים. דאנג'ו et al. 13 המשמש תרבות באותה שיטה ללא סרום הבולם בשילוב עם הממשל מתוזמן של גורמי גדילה שונים, ב ששש מסוים, להשגת מפרט subregional של mESC-derived את הגחון רקמות telencephalic. באמצעות שורת כתב Foxg1::venus, הם מצאו כי הממשל ששש DD3-12 לאחר טיפול Dkk1, גרמו בין 45-68% של כל התאים בתרבות לבטא את הכתב Foxg1::venus13. בתוך האוכלוסייה Foxg1::venus + כ- 32% של תאים הביעו Nkx2.113. על-ידי החלפת ששש על סאג והוספת Fgf8, הם עוד יותר משופר השבר של אבות Nkx2.1 בתוך אוכלוסייה Foxg1::venus + כ-41%13. כאשר לבדיקה לגורל, תאים אלה יוצרו כ 17% SST, 21% PV, 18% NPY ו- 8% calretinin יחוברו13. עם זאת, בעוד מחקר זה תיאר שיטה כדי לציין CGE נגד הגורל CIn נגזר MGE, זה לא מתארים שיטה להעשיר באופן סלקטיבי עבור סוגי PV או SST.

בשנה שלאחר מכן, Cambray. et al. 11 להשתמש בשיטה ללא סרום חד שכבתי עם ציפוי מחדש על DD5 ללמוד את השפעת activin על בידול וזהות של מבשרי עצבית telencephalic נגזר ESCs האנושי של עכבר. למרות מחקר זה לא דיווח האחוז של תאים Nkx2.1 שנוצר בפרוטוקול שלהם, הם מדווחים כי כ- 54% של תאים בתרבות הביע משותפת Nestin/Foxg1-DD2 (5 ימים של צמיחה בנסיוב מדיה פנויה ואחריו נוספים 2 ימים של תרבות לאחר ציפוי מחדש)11. כמו כן דווח כי עם התוספת של activin, ~ 55% של תאים שותף הביע nestin CouptfII, המציין כי תאים אלה ייצגו סימטרית תאים דמויי קדושתו ganglionic, אשר מייצרים את רוב לבטא calretinin interneurons קורטיקלית 11. אכן, על-ידי 8 ימים בתרבות (הכוללת 13 ימים) 39% של תאים נמצאו לבטא משותפת calretinin/ביל-טובולין, בעוד 59% של תאים נמצאו לבטא משותפת גאבא/ביל-טובולין11. מחקר זה לא לבחון את הייצור של תתי סוגים PV או SST.

שוב באמצעות שיטת EB ששונה, צ'ן. et al. 12 הפגינו זה משפר ספציפי MGE אלמנטים יכול לשמש כדי לעקוב אחר ולטהר את תאי הגזע נגזר תאים דמויי MGE12. במחקר זה, הם לעומת השפעת תנאים תרבות אחרת במהלך differentiations מכוונת של mESCs לתוך MGE כמו אבות באמצעות קו כתב Lhx6::GFP; באותו קו אשר שימש כקו האב עבור קו כפול-כתב Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP המתואר בכתב היד. הם הראו כי על-ידי הוספת Dkk1 לתרבות תנאים DD0-3, ואחריו התוספת של קשת, upwards של ~ 10% של כל התאים בתרבות הביע Lhx6::GFP12. הם גם מצאו כי באותו הפרוטוקול, חלה על הקו Foxg1::venus מתוארת על ידי. דאנג'ו et al. 12, הביא כ- 37% של כל התאים לבטא הכתב Foxg1::venus. כאשר תאים Lhx6::GFP היו המושתלים ויוו, אחוזי הממוצע הבאות של סמני סוג של CIn נצפתה: 22% PV, SST 58% ו- 16% NPY12.

לאחרונה, קבוצות אחרות השתמשו ביטוי מאולץ של השושלת, הגדרת גורמי שעתוק כדי לציין ישירות CIns. אולי ההפגנה הראשונה זה היה מאת פטרוס. et al. 10 שהיה מקדם דוקסיציקלין-inducible נוהג ביטוי Nkx2.1 ב mESCs Ainv15 ששונו להכיל כרומוזום מלאכותי חיידקי Lhx6::GFP. במחקר זה נעשה שימוש תרבות תנאים דומים לאלה המתוארים בכתב היד הנוכחי אך ללא התוספת של 939-מבצע של10. עם זאת, מסיבות הם הבינו, אחוז נמוך יותר של תאים Lhx6::GFP + נצפו בתנאים בידול אותו לעומת כאשר באמצעות קו האב J1 Lhx6::GFP תיאר את כתב היד10. למרות להשגת רמות דומות של Foxg1 ביטוי (סה כ % לא ידוע), הייתה ירידה מתונה המספר הכולל של Nkx2.1 תאים לא גדול מ- 2% של כל התאים לבטא את הכתב Lhx6::GFP10. מחקר זה מדגיש את ההבדלים הטבועים הקיימים בין קווים ESC שונים ואת האתגרים הפנים חוקרים, כאשר מנסים להחיל בידול פרוטוקולים על ESC קווים שונים מאלה ששימשו במקור לפתח את הפרוטוקולים.

באמצעות גישה אלגנטית, Au. et al. 9 הייתה ביטוי מאולץ רציפים של גורמי שעתוק ליצירת תתי סוגים ספציפיים של interneurons בקליפת המוח באמצעות הפרדיגמה בידול telencephalic הגחוני באותו שפותחה על ידי ואטאנבי. et al. 14 בזמן שהם אינם מדווחים האחוזים המדויקים של Foxg1 +, Nkx2.1 + Olig2 + מבשרי המיוצר בתרבות, הם המדינה כי כ- 50% של כל התאים בתרבות הבדיל לתוך הנוירונים GABAergic9. ב 11 ימים שלאחר בידול, EBs הפומבית, מושתלים לתוך עוברי מארח9MGE של E13.5. אחוז קטן של אלה (פחות מ 1%) היגרו את MGE לתוך קליפת לאן הם היו המזוהה על-ידי כתב Dlx5/6-eGFP שלהם, ניתח גורל9. המחברים נצפתה במגוון אחוזי PV SST, הגורל, כמו CGE בהתבסס על האסטרטגיה שלהם אינדוקציה בכפייה שבחרת9. מעניין, עם ביטוי של הגורם שעתוק Lmo3, הם הבחינו בממוצע כ 57% PV SST 21%, 15% נגזר CGE יחוברו (SST- / הגלגל! הזה + או ה-VIP-היחידה +)9. האחוז הגדול ביותר של תת SST נצפתה הושג באמצעות קו GOF Nkx2.1/Dlx2, אשר הפיקה כ-32% SST, 35% PV ו- 25% יחוברו נגזר CGE9.

בשנת 2015, Colasante. et al. 30 הראה כי הביטוי כפויה של חמשת גורמי שעתוק (Foxg1, Sox2, Ascl1, Dlx5 ו Lhx6) בתוך fibroblasts מן GAD67-GFP כתב עכברים שהוסב 15% של כל התאים, כמו GABAergic CIns. למרבה הפלא, כ- 90% של תאים אלה המשיך להביע PV, עם רק נדיר תאים המבטאים SST30. למרות ששיטה זו לא היה מוחל על mESCs, השתמשו בו עם האדם iPSCs, איפה זה היה מוערך כי כ-30% של כל התאים מאומץ זהות GABAergic30.

כפי שמוצג באיור2, קיימות מספר דרכים ליצירת אוכלוסיות מועשר של PV או SST CIns. היתרונות העיקריים של aPKCi ניצול PV-פרוטוקול על פרוטוקול DD17 הם מספר גדול יותר של תאים אחד יכול לבודד, התא הכדאיות משך של תרבות. אמנם אנחנו לא מראים נתונים עבור רמות אינדוקציה DD17 באיור1, יש בערך פי שניים mCherry + תאים-DD11 כפי שיש ב- DD17 (נתונים לא מוצג). בעת איסוף תאים עבור השתלת, אנו מוצאים מספר רב יותר של החל תאים (ראו להלן) הוא מועיל, מאז בערך 30-50% של תאים אובדים בתהליך נרכז אותם להזרקה. בנוסף, ניתן לקבל מספר גדול של תאים עם זמנים קצרים יותר FACS, אשר מגביל את כמות הזמן התאים הם על קרח, מורידה את העלות הכוללת. קרוב לוודאי כי אחוז גבוה יותר של התאים דובדבן + שבאוכלוסיה, תאים בשלבים מוקדמים של תרבות (למשל, DD11) להפגין הישרדות גדול יותר בהשוואה לתאים DD17 לאחר השתלת לתוך קליפת neonatal. כאשר מספר גדול של התאים קיימא נדרשים, לדוגמה במקרה של השתלת תא לטיפול באפילפסיה, יש אוכלוסייה גדולה יותר ההתחלה והן הכדאיות רבתי הוא יתרון גדול.

כפי שהיא מתוארת באיור 2, בהתאם לפרוטוקול, כ- 25-39% של תאים Lhx6::GFP + ניתח 30 הימים שלאחר השתלת שאינם מבטאים רמות לגילוי של חלבון PV או SST עם אימונוהיסטוכימיה שגרתית. באופן כללי, אלה PV - תאי-SST אקספרס גאבא, כמו גם Sox6, סימן MGE, נגזר interneurons בקליפת המוח (ראה טייסון. et al. 15. Tischfield et al. 17)-פחות מ 1% של PV- / SST - Lhx6::GFP + תאים אקספרס סמנים של קבוצות interneuron אחרים, כגון calretinin, הגלגל! הזה או neuropeptide Y (נתונים לא מוצג). זה דומה ויוו גורל מחקרים מיפוי אשר הראו כי בין ~ 15-25% של interneurons MGE, נגזר שאינם מבטאים PV או SST23,25,31. כאשר תאים Nkx2.1::mCherry+ או Lhx6::GFP + הם מבודדים, מצופה אל חולדה מזיני קורטיקלית במבחנה, מצאנו את זה ~ 40-70% של Lhx6::GFP + תאים מנותח לאחר 28 יום בתרבות PV-/ SST-, עם רוב של אלה כתם חיובי הבעת SST. עלייה זו PV- / תאי-SST יכול להיות בגלל העדר אות maturational החיצוניים נוכח ויוו, כפי במיוחד ייתכן המקרה עבור הביטוי PV בוגרת או קלט אלקטרופיזיולוגיות שיוצרת מתאי מזין. מה הסיבה עשויה להיות, אנו מעדיפים השתלת תאים לתוך קליפת neonatal עבור בידול ניתוח מאשר במבחנה הגורל.

לניסויים השתלת רוב, אנו ממליצים צף על DD0 מינימום של שתי תרביות רקמה שאינם מחסידי ס מ-10 מנות כל 7.5 המכיל x 105 mESCs ב- 10 מ"ל של N2/אופנוע (7.5 x 104 תאים למ"ל; הנפח הכולל 20 מ ל). ביחד, שתי צלחות תניב בדרך כלל 8-12 x 106 תאים לאחר דיסוציאציה EB על DD3, של אילו 5.4 x 106 תאים יכול לשמש כדי זרע שתי צלחות תרביות רקמה. ובכן 6 מטופלים (50,000 תאים/cm2; כ 110 ס מ2 סה כ). מאת DD8, כל צלחת 6-ובכן מניב כ 5-7 x 107 תאים, אשר יכולים לשמש לאחר מכן זרע של שלושה נוספים חמישה לוחות 6-ובכן-צפיפות של תאים/ס מ 250,0002 (הדורשים סכום כולל של 4.05 x 107 תאים במקרה של 6 שלוש-. טוב צלחות או 6.75 x 107 תאים במקרה של חמישה לוחות 6-טוב). מאת DD14, כל צלחת 6-ובכן תניב בדרך כלל 1-2.5 x 106 mCherry או תאים לבטא-GFP. בהתאם לצרכים של הניסוי, לנו יש צף מינימום של 7.5 x 10 mESCs5 עבור ניתוחים אימונוהיסטוכימיה בקנה מידה קטן כדי למעלה מ- 6 x 10 mESCs6 לפרויקטים גדולים השתלת.

השלבים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול שמירה של mESCs במצב pluripotent לפני תחילת בידול והשלב הנחיתה/דיסוציאציה על DD3. אם התאים תוחזקו כראוי הנחיתה/הדיסוציאציה על DD3 נעשית בקפידה, הבידול בדרך כלל יהיה מוצלח. רק תאי גזע זה מופיעים בריא והוא צריך לשמש הבידול. אם EBs לא יוצרים בין DD0-3 או טופס מרובים, גופים קטנים, סימטרי, הבידול הוא עשוי להיות לא מוצלחת. בנוסף, במהלך EB הדיסוציאציה על DD3 של EB צריך בזהירות לפקח עד כבר לא ניתן לראות בעין כדי להימנע משהייה ממושכת ריג'נט תא-דיסוציאציה המכיל הלא-טריפסין.

התוצאות שהוצגו במאמר זה התקבלו בתנאים אופטימליים בעזרת ריאגנטים שבשליטת איכות. זה חשוב הערה מאז לנו קושי בהשגת אינדוקציה Nkx2.1 חזקים מדי, ועל -ידי סיומת, mCherry וביטוי כתב GFP. על סמך הניסיון שלנו, אנו מאמינים כי רבים-להרבה השתנות FBS חשבונות סביר על שינויים אלה. בתור שכזה, רצוי לבחון שונה הרבה FBS כדי לקבוע אשר פועלות בצורה הטובה ביותר לשמירה על mESCs. אמנם לא השתמשנו במערכת 2i/LIF (ללא סרום בינוני המכיל MEK מעכב PD03259010 ו- GSK-3α/β המדכא CHIR99021), זה אפשרי כי התנאים ללא סרום mESC אולי לייצר תוצאות עקביות יותר. אנו, לעומת זאת, בדקו השערה זו, יש אין נתונים לגבי השימוש ללא סרום mESC מדיה משפיע את הבידול של mESCs לתוך MGE כמו אבות. בנוסף, הקפד להשתמש טריים גורמי גדילה במידת האפשר על-ידי aliquoting אותם לשימוש יחיד. בהתאם למשתמש, צפיפויות תא ייתכן שתצטרך להיות מוגברת להשגת הישרדות cell נאותה, במיוחד במהלך השלב הנחיתה על DD3.

Interneurons יש יכולת יוצאת דופן כדי לשרוד, להעביר לשלב השתלת שלאחר מארח-המעגלים. ככזה, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי השתלת interneuron מבשרי לתוך מודלים העכבר אפילפטי, דגמים אחרים של מחלות נוירולוגיות, מנוטלי (ראה סאותוו'ל. et al. 32 ו טייסון ועם אנדרסון33 לסקירות של תא interneuron מבוסס טיפולים). לדוגמה, במחקר שנערך לאחרונה דונגן. et al. 34 מועשר אוכלוסיות של PV ל- SST CIns עבור השתלת למודל בעכבר של סכיזופרניה. הם מצאו כי PV ל- SST מועשר השתלות המיוצר השפעות שונות על התנהגות העכבר, אוכלוסיות PV מועשר נורמליזציה של endophenotypes סכיזופרניה זה הם למדו.

בשנים האחרונות שימש את מערכת transposon PiggyBac כדי להשיג ביטוי יציב transgenes במספר מערכות. השתמשנו המערכת בקלות ובמהירות ליצור stably לבטא miRNA דוקסיציקלין-inducible בונה ללמוד את התפקיד של גנים מסוימים במהלך הפיתוח interneuron. אנחנו גם שימוש בטכנולוגיה זו כדי ליצור כתב כפול קווים mESC express channelrhodopsin-2 (ChR2) optogenetically mESC נסיעה נגזר interneurons או DREADD טכנולוגיה קולטן כדי להפעיל או לבטל המושתלים תאים בהמוניהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנחנו מודים שו צ'ינג לפתח את Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP כתב כפול mESC קו, כמו גם ג'ניפר טייסון, אסיף Maroof ו טים פטרוס עבודתם מוקדם על עוזרת לפתח פרוטוקול זה. אנו מודים גם את ליבת cytometry זרימה CHOP לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי, MH066912 R01 NIH (SA) ו F30 MH105045-02 (DT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841 (2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956 (2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622 (2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Tags

מדעי המוח גיליון 130 המוח העכבר interneuron בידול קליפת המוח תרבית תאים תאי גזע השתלת
התמיינות של תאי גזע עובריים בעכבר לתוך Interneuron קורטיקלית מבשרי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tischfield, D. J., Anderson, S. A.… More

Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter