Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at beskrive en enkel, hurtig og effektiv prion amplifikationsteknologi, real-time skælven-induceret (RT-QuIC) konverteringsmetode.
Abstract
RT-QuIC teknikken er en følsomme i vitro celle-fri prion forstærkning assay hovedsagelig baseret på de seedede misfoldning og sammenlægning af rekombinant prion protein (PrP) substrat ved hjælp af prioner frø som en skabelon for konverteringen. RT-QuIC er en roman høj overførselshastighed teknik, der er analog til real-time Polymerasekædereaktionen (PCR). Påvisning af amyloid fibril vækst er baseret på farvestoffet Thioflavin T, der fluorescerer ved specifik interaktion med ᵦ-ark rige proteiner. Således kan amyloid dannelse påvises i realtid. Vi forsøgte at udvikle en pålidelig non-invasiv screeningstest for at påvise kroniske wasting disease (CWD) prioner i fecal ekstrakt. Her har vi specielt tilpasset RT-QuIC teknikken for at afsløre PrPSc såning aktivitet i afføring fra CWD inficeret hjortedyr. I første omgang var seeding aktiviteten af fækal ekstrakterne vi forberedt forholdsvis lav i RT-QuIC, muligvis på grund af potentielle assay hæmmere i fecal materiale. For at forbedre seeding aktivitet af afføring ekstrakter og fjerne potentielle assay hæmmere, homogeniseret vi fækal prøverne i en buffer, som indeholder vaske-og rengøringsmidler og proteasehæmmere. Vi har også forelagt prøverne med forskellige metoder at koncentrere PrPSc på grundlag af protein nedbør ved hjælp af natrium phosphorwolfram syre, og centrifugalkraften. Endelig, afføring ekstrakter blev testet af optimeret RT-QuIC som omfattede substrat udskiftning i protokollen at forbedre følsomheden af påvisning. Dermed, vi etableret en protokol for følsomme påvisning af CWD prion såning aktivitet i afføring af prækliniske og kliniske hjortedyr af RT-QuIC, som kan være et praktisk værktøj for non-invasiv CWD diagnose.
Introduction
Prionsygdomme eller transmissible spongiforme encephalopatier (TSE) er neurodegenerative sygdomme herunder Creutzfeldt - Jakob sygdom (CJD) hos mennesker, bovin spongiform encephalopati (BSE) hos kvæg, scrapie hos får og geder og kronisk spilde sygdom (CWD) i hjortedyr 1,2. TSE er kendetegnet ved karakteristiske spongiforme udseende og tab af neuroner i hjernen. Ifølge "protein kun" hypotese, er prioner hovedsageligt komponeret af PrPSc ("Sc" for scrapie) 3, en fejlfoldede isoform af den vært-kodet cellulære prion, PrPC. PrPSc resultater fra omdannelse af PrPC til en kropsbygning, beriget med ᵦ-ark 4,5,6 , som kan fungere som en frø til at binde og konvertere andre PrPC molekyler. De nyligt genererede PrPSc molekyler er indarbejdet i en voksende polymer 7,8 der bryder i mindre oligomerer, hvilket resulterer i højere antal smitsomme kerner. PrPSc er tilbøjelige til akkumulering og er delvist resistente over for proteaser 9,10.
CWD påvirker vilde og opdrættede elg (Cervus canadensis), mule deer (Odocoileus hemionus), hvide - tailed hjorte (WTD; Odocoileus virginianus), moose (Alces alces), og rensdyr (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. Det betragtes som den mest smitsomme prioner sygdom med horisontal overførsel begunstiget af cervid interaktioner og miljømæssige persistens af smitteevne 14,15. I modsætning til andre prionsygdomme, hvor PrPSc ophobning og smitteevne er begrænset til hjernen, i CWD findes disse også i perifere væv og legemsvæsker f.eks. spyt, urin og afføring 16,17, 18.
Immunhistokemi betragtes som guldstandarden for CWD diagnose at opdage PrPSc distribution og spongiform læsioner 19,20. ELISA og i mere sjældne tilfælde, vestlige skamplet bruges også til CWD diagnostik. Således er aktuelle prion sygdom diagnose hovedsagelig baseret på påvisning af prioner i post mortem væv. Ante mortem diagnose for CWD er tilgængelig ved at tage mandler eller recto-anal slimhinde-associerede lymfoide væv (RAMALT) biopsier; men denne procedure er invasiv og kræver erobringen af dyrene. Således ville brug af let tilgængelige enheder, såsom urin og afføring, være en praktisk måde for CWD prion påvisning. Men disse ekskrementer fra havnen relativt lave koncentrationer af prioner under detektionsgraensen for nuværende diagnostiske metoder. Er derfor behov for en mere følsom og høj overførselshastighed diagnostisk værktøj. In vitro konvertering systemer, såsom protein misfoldning cykliske forstærkning assay (PMCA) 21, amyloid såning assay, og real-time skælven-induceret konvertering (RT-QuIC) assay 22,23, 24 er meget effektive værktøjer til at udnytte PrPSc selvstændig formeringsmateriale evne til at efterligne i vitro prion konvertering proces og dermed forstærke tilstedeværelsen af små mængder af PrPSc til påviselige mængder 25 ,26. Metoden RT-QuIC imidlertid udnytter det faktum, at konvertering produktet beriget med β-plade sekundærstruktur specifikt kan binde thioflavin T (Th-T). Derfor vokser rekombinant PrP (rPrP) ved seedede konvertering ind i amyloid fibriller, som binder Th-T og dermed kan blive opdaget i realtid ved at måle fluorescens af Th-T udtrykt som relativ fluorescens enheder (RFU) over tid. Når overvåges, kan RFU bruges til at evaluere relative seeding aktiviteter og kvantitative parametre såsom den mellemliggende fase. Den mellemliggende fase repræsenterer klokkeslæt (h) kræves for at nå den tærskel, under hvilken rPrP konvertering på det tidlige stadium af reaktionen er under detektionsgrænsen for Th-T fluorescens. Slutningen af fasen synlige lag samtidig til dannelsen af en tilstrækkelig amyloid kernen (Nukleering/brudforlængelse), opstår, når Th-T fluorescens overstiger tærskelværdien og bliver positiv. Vækst af amyloid fibriller kan påvises i realtid og indledende PrPSc eller seeding aktivitet indeholdt i prøven forstærkes af segmentering, der genererer flere frø. Disse frø fremkalde igen en hurtig eksponentiel fase af amyloid fiber vækst.
Fordi dette assay er købedygtig opdager så lavt som 1 fg PrPSc 24, den højfølsomme kvalificerer denne teknik til at opnå ante mortem eller non-invasiv diagnose ved påvisning af PrPSc i forskellige perifere væv, ekskrementer eller andre former for modellen husly lave niveauer af smitteevne. RT-QuIC absolut giver fordele i forhold til andre assays reproducerbarhed, praktiske, hurtighed (mindre end 50 h) og lave omkostninger i forhold til bioassays. Den undgår de tekniske kompleksitet som sonikering bruges i PMCA; også, det er udført i en tape-forseglet mikrotiterplade, der minimerer risikoen for aerosol kontaminering af hver brønd. Formatet multi godt muliggør analysen af op til 96 prøver i det samme eksperiment. For at imødegå de tilbagevendende problem af falske positiver og spontan omdannelse af rPrP i in vitro- konvertering assays er gennemførelsen af en tærskel (cut-off) i RT-QuIC meget nyttig. Faktisk, baseret på resultaterne af den negative kontrol (gennemsnitlig RFU negative prøver + 5 SD 27), en baseline er sat op som forskelsbehandling mellem positive og negative prøver kan gøres. Brugen af fire flergangsbestemmelser for hver prøve kan således bidrage til at definere en prøve som positiv, når mindst 50% af replikater viser et positivt signal, krydser dvs cut-off 28. Homologi mellem frø og substrat er ikke påkrævet i RT-QuIC, som f.eks. i en tidligere undersøgelse, hamster rPrP fandtes at være mere følsomme substrat i forhold til den homologe substrat i menneskelige PrPvCJD seedede og får scrapie seedede reaktioner 29. hamster-får kimære rPrP foreslog også for at være et mere velegnet substrat end menneskelige rPrP at opdage menneskelige variant Creutzfeldt-Jakobs sygdom prioner 30. Således er brug af rPrP substrater fra forskellige arter meget almindelige i dette assay. Denne analyse har været anvendt med succes til flere prionsygdomme, såsom sporadisk CJD 31,32,33, genEtic prion sygdomme 34, BSE 35,36,37, scrapie 23,36og CWD 38,39,40,41, 42. Undersøgelser, behandles cerebrospinalvæske, blod, spyt og urin som frø i RT-QuIC lykkedes alle at opdage PrPSc 38,39,40,41, 42. fremme opdagelse evne i prøver såsom blodplasma, der kan indeholde hæmmere af amyloid dannelse, Orrú mfl. (2011) udviklet en strategi for at fjerne potentielle hæmmere af amyloid dannelsen af kæmning PrPSc immunoprecipitation (IP) trin og RT-QuIC, opkaldt "forbedret QuIC" assay (eQuIC). Derudover var et substrat udskiftning trin ansat efter ~ 24 h af reaktionstid for at forbedre følsomheden. I sidste ende, som lavt som 1 ag af PrPSc var påvises ved eQuIC 30.
For at rense afføring ekstrakter og fjerne mulige assay hæmmere i afføring, blev fækal prøver i prækliniske og kliniske faser fra elg ved eksperimentel oral infektion homogeniseret i buffer der indeholder vaske-og rengøringsmidler og proteasehæmmere. Afføring ekstrakter indkom yderligere til forskellige metoder til at koncentrere PrPSc i prøverne udnytte protein nedbør via natrium phosphorwolfram syre (NaPTA) nedbør. Metoden NaPTA nedbør, første gang beskrevet af Safar et al. 43, der bruges til at koncentrere PrPSc i analyseprøverne. Inkubation af NaPTA med prøveresultater i præferentielle udfældning af PrPSc snarere end PrPC. Den molekylære mekanisme er imidlertid stadig uklart. Dette trin også hjulpet indeholdende og forhindre spontan omdannelse af rPrP, som er observeret i nogle tilfælde. Endelig, afføring ekstrakter blev testet af optimeret RT-QuIC ved hjælp af musen rPrP (aa 23-231) som substrat og herunder substrat udskiftning i protokollen at forbedre følsomheden af påvisning.
Resultaterne her vise, at denne forbedrede metode kan registrere meget lave koncentrationer af CWD prioner og øger følsomheden af påvisning og specificitet i fecal prøver i forhold til en protokol uden NaPTA nedbør og substrat udskiftning. Denne metode potentielt kan anvendes til andre væv og legemsvæsker og kan være til stor nytte for CWD overvågning i vilde og fangenskab hjortedyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. RT-QuIC ved hjælp af fækal materiale
- udarbejdelse af cervid afføring udtrækker
- gøre fækal homogenatet ved at tilføje 1 g fecal materiale til 10 mL af afføring uddrag buffer (20 mM natriumfosfat, pH 7.1, 130 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 1 mM PMSF og 1 x komplet proteasehæmmere, EDTA-fri) at give en endelig koncentration på 10% (w/v). Homogenisering bufferen kan forberedt inden udnyttelsen og opbevares ved -20 ° C.
- Homogenize fækal pellets (1 g) og buffer (10 mL) i rør (f.eks. gentleMACS M rør) ved hjælp af en dissociator med en forudindstillet program fra producenten til proteiner i 1 minut ved stuetemperatur. Gentag dette trin to til tre gange indtil de fækal prøver er helt homogeniseret i bufferen.
- Seal rør med parafilm og placere dem på en vuggende platform eller rotary shaker for en 1 h inkubation ved stuetemperatur.
- Centrifugeres rør på 18.000 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Indsamle de supernatanter, som indeholder protein ekstrakter og alikvot dem til 1,5 mL rør. Delprøver kan opbevares ved-80 ° C for yderligere programmer.
- Koncentration af PrP Sc i afføring ekstrakter
Bemærk: for at koncentrere CWD prioner i afføring ekstrakt prøver, dermed forbedre følsomheden af påvisning af RT-QuIC, en protein nedbør trin er tilføjet i protokollen.- NaPTA nedbør metode
- tilføje 250 µL af 10% (w/v) af N-lauryl sarcosinate (sarkosyl) til 1 mL af fækal protein extract for at give en endelig koncentration på sarkosyl på 2% (v/v).
- Forsegle de rør, der indeholder proever med parafilm og inkuberes ved 37 ° C i 30 min. under konstant rysten på 1400 rpm i en thermomixer.
- Justere blandingen af fækal protein ekstrakt og sarkosyl med en stamopløsning, som indeholder 10% (w/v) af natrium phosphorwolfram syre og 170 mM af magnesiumchlorid, pH 7,4 at opnå en endelig koncentration på 0,3% (w/v) natrium phosphorwolfram syre i stikprøverne.
- Ruger prøver ved 37 ° C i 2 timer med konstant ryster på 400 rpm.
- Centrifugeres prøver på 14 ° C i 30 min. ved 15,800 x g. fjerne analysere omhyggeligt.
- Vaske pellets af resuspending dem i vaskebuffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% Triton-X 100, 10 mM EDTA, 0,5% natrium deoxycholate (w/v), og 0,1% sarkosyl (w/v)).
- Centrifugeres prøver på 14 ° C i 15 min. ved 15,800 x g. fjerne analysere omhyggeligt.
- Resuspend pellets i 100 µL (1/10 af den oprindelige mængde af fækal protein extract) RT-QuIC fortynding buffer.
Bemærk: RT-QuIC fortynding buffer (20 mM natriumfosfat, pH 6,9, 130 mM NaCl, 0,1% SDS (w/v) og 1 X N2 tillæg) er udarbejdet forud for udnyttelsen. En samlet maengde paa 10 mL er filtreret gennem en 0,2 µm acrodisc sprøjte filter ved hjælp af en sprøjte og derefter opbevares ved-20 ° C indtil brug. - Gemme NaPTA behandlet prøver ved-20 ° C indtil udnytte dem i RT-QuIC assay.
- RT-QuIC assay
- forberede en frisk 10 mM Th-T stamopløsning (0.032 g af Th-T i 10 mL af dobbelt destilleret H 2 O).
- Lave en fortynding på 1:10 af Th-T stamopløsning i dobbelt destilleret H 2 O for at gøre en endelig koncentration på Th-T 1 mm filter det gennem en 0,2 µm acrodisc sprøjte filtrere ved hjælp af en sprøjte.
- Tø mus rekombinant PrP (rPrP, aa 23-231) substrat (10 µg/mL pr. RT-QuIC reaktion) opbevares ved-80 ° C på ice.
- Belastning 500 µL af rPrP substrat ad gangen i 100 kDa størrelse udstødelse filter microtubes og centrifugeres ved 14.000 x g i 5 min. ved stuetemperatur (et rør/filteret kan anvendes op til to gange).
- Overføre det eluted substrat ind i en sterile 1,5 mL rør og holde det ved 4 ° C indtil brug.
- Tø RT-QuIC fortynding buffer opbevares ved -20 ° C.
- Gøre fortyndinger af frø (fækal protein extract) i RT-QuIC fortynding buffer:
Ufortyndet prøve: bruger fækal protein ekstrakt ufortyndet
fortyndes 2 x 10 -1
fortyndes 2 x 10 -2
fortyndes 2 x 10 -3 - forberede RT-QuIC reaktionsblandingen stamopløsninger:
phosphat bufferet saltvand ( PBS): 5 X
NaCl: 2 M lager opløsning af NaCl forberedt i dobbelt destilleret H 2 O.
EDTA: 100 mM stamopløsning af EDTA forberedt i dobbelt destilleret H 2 O. - Forud for udnyttelse af alle løsninger (trin 1.3.8), filtreres en 0,2 µm acrodisc sprøjte filter ved hjælp af en sprøjte hver løsning separat og holde dem sterile ved stuetemperatur.
- Udarbejde en samlede volumen af RT-QuIC reaktionsblandingen afhængig af antallet af prøver (98 µL volumen af reaktion pr. sample og fire replikater pr. sample) skal anvendes plus 10% af denne mængde for at sørge for at have nok blanding til alle reaktioner.
- Brug en 15 mL tube at forberede RT-QuIC reaktionsmiljøet (20 mM natriumfosfat, pH 6,9, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 µM Th-Thomsen, 10 µg/mL rPrP substrat og dobbelt destilleret vand til at justere rPrP endelige koncentration i reaktionen) ved hjælp af stock sol utions.
- Blandes alle løsningerne, der godt ved pipettering op og ned ved hjælp af en pipette med et filter tip. Undgå så vidt muligt brug af vortex.
- Hæld blandingen i en 50 mL engangs pipettering reservoir.
- Brug en multikanalpipette til at indlæse 98 µL af RT-QuIC reaktionsblandingen i hvert hul i en 96-brønd optisk bundplade.
- Tilføje til hver RT-QuIC reaktion 2 µL af ufortyndet eller 10-fold seriefremstillede fortyndet fækal protein ekstrakt. Test hver prøve i fire replikater.
Bemærk: I hvert forsøg, serielle fortyndinger af fækal prøver (lige fra ufortyndet til 2 x 10 -3) fra CWD-negative og verificerede CWD-positive dyr bruges som negativ og positiv kontrol, hhv. - Forsegle pladen med en forsegling tape før inkubere i en Pladelæser på 42 ° C i 25 h med gentagne cyklusser af 1 min dobbelt orbital ryster (700 rpm) og 1 min hvile hele inkubation.
- Definer fluorescens målingen indstillinger:
Excitation: 450 nm
Emission: 480 nm
bunden læse, antallet af blinker: 20
Manuel gevinst: 1000 (afhænger oven på apparat)
Integration tid: 20 µs - fjerne pladen fra Pladelæser i slutningen af 25 h.
- Spin ned plade på 3.000 x g i 3 min. at undgå risikoen for kontaminering mellem brøndene.
- Fjern forseglingen fra pladen.
- Udarbejde en ny 96-brønd pladen ved at tilføje 90 µL af RT-QuIC reaktionsblandingen indeholdende frisk substrat og frisk fluorescens dye Th-T som beskrevet i punkt 1.3.1 til 1.3.6.
- Overføre 10 µL fra hvert hul i den første plade til de nypræparerede 96 godt plade.
- Forsegle den nye plade og fortsætte RT-QuIC assayet for yderligere 50 h følge trinene beskrevet taktfast 1.3.13. Denne ekstra trin af 50 h vil gøre den samlede reaktionstid af 75 h.
Bemærk: Alle procedurer af RT-QuIC assay er gjort under biosikkerhed kabinet. - Indsamler data.
- Læse og dokument Th-T fluorescens signalet i hver brønd hver 15 min.
- Indsamler data af samlede cyklusser ved hjælp af dataanalyse software og overførsel til et regneark med gennemsnittet af forsøgsbetingelse reaktioner.
- Plot gennemsnit af data. X-aksen svarer til reaktionstid af RT-QuIC (h) og y-aksen svarer til relative fluorescens enheder (RFU). Hver kurve svarer til en fortynding på et kendt udsnit.
- i hvert forsøg, afgrænse en grænse ved beregning af de højeste gennemsnitlige værdier for den negative kontrol plus 5 standardafvigelser som beskrevet i aktuelle offentliggjort litteratur 41.
BEMÆRK: Alle replikater, som krydsede den fastlagte tærskel betragtes som positive. Hvis mindst to ud af fire replikater krydser tærsklen, prøven er derefter betragtes som positive.
2. Oprensning af rekombinante prionprotein (rPrP)
- vækst af bakterielle lager og udtryk for rPrP
Bemærk: Escherichia coli (E. coli) stamme Rosetta (DE3) transformeret med vektor pET-24 kodning af musen PrP (restprodukter fra 23-231) blev brugt til at forberede rPrP.- Tø glycerol bestand af Rosetta (DE3) transformeret med pEt-24 mPrP(23-231) på ice.
- Stribe LB (Luria Bertani) plader med en endelig koncentration på kanamycin på 50 µg/mL, og der inkuberes natten over i et 37 ° C inkubator. Sørg for, at pladerne er op og ned at undgå fugt kondens i solid medier indeholdende bakterier. Forbered to plader at sørge for at have vækst i mindst én af de to plader.
- Forberede 1 L af LB og autoklave at gøre det sterile.
- Tillæg 1 L af sterile LB medier med 1 mL af kanamycin (50 mg/mL) og 1 mL af chloramphenicol (34 mg/mL).
- Vælge en koloni af hver plade ved hjælp af en engangs podning loop til podes 3 mL af LB medium indeholdende kanamycin og chloramphenicol.
- Sted mini-kulturer i en inkubator ved 37 ° C med konstant ryster på 225 rpm i 5-6 h.
- Tilføje mini-kulturer til resten af den oprindelige 1 l LB medier sammen med Express Autoinduction System 1 til induktion af protein udtryk.
- Sted kultur i 2 L målekolbe, eller større, i en inkubator ved 37 ° C med konstant ryster på 200 rpm for 20-24 h.
- Opdelt 1 L kultur i 4 x 250 mL centrifugeglas.
- Spin ned rørene indeholdende kultur på 3.750 x g i 20 min. ved stuetemperatur.
- Supernatanten og indsamle de bakterielle pellets i 50 mL centrifugeglas, så fryse dem ved-80 ° C indtil videre forarbejdning. De resulterende pellets har vejes 3 til 4 g for en god protein udbytte.
- Forberedelse af inklusion krop
- Tø frosne pellet (3 til 4 g) ved 37 ° C i få minutter.
- Fryse pellet endnu en gang for 10 min. ved-80 ° C og tø op igen. Gentag dette trin for nedfrysning og optøning to gange mere.
- Resuspenderes bakteriel i 1 X lysis reagens (f.eks. BugBuster Master Mix) af pipettering grundigt. Brug 5 mL af reagenset efter 1 g af bakteriel pellet. Sørg for at helt homogeniseres mix.
- Inkuberes homogenatet på en rocker i 20 min. ved stuetemperatur.
- Centrifugeres homogenatet på 16.000 x g i 20 min. ved stuetemperatur.
- Kassér analysere af omhyggeligt hælde det ned
- Homogeniseres pellets i den samme mængde 1 X lysis reagens som anvendt i det forrige trin.
- Inkuberes homogenatet for 15 min på en rocker stuetemperatur.
- Tilsættes en tilstrækkelig mængde af 1:10 (0,1 x) lysis reagens til at få en total homogenatet volumen på 40 mL. Mix af inversion at sørge for at homogenisere godt.
- Centrifugeres homogenatet på 7,900 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Supernatanten ved omhyggeligt hælde det.
- Resuspenderes i 40 mL 0,1 x lysis reagens.
- Centrifugeres homogenatet på 16.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Supernatanten omhyggeligt ved at hælde det og gemme pellet indeholdende optagelse organer ved-20 ° C indtil videreforarbejdning.
- Protein oprensning
- tø optagelse organer ved stuetemperatur.
- Opløses de optøede optagelse organer i 14 mL 8 M guanidin-HCL (38 g guanidin hydrochlorid i 0,1 M NaPO 4 pH 8.0 og fyld suspension med H 2 O til 50 mL; ikke justere pH på endelige løsning) til solubilize proteiner.
- Sørg for at homogenisere godt af pipettering op og ned.
- Incubate lysate på en rocker ved stuetemperatur i 50 min.
- Forberede 18 g Ni-NTA resin perler (18 g for 3 til 4 g bakteriel pellet), skyl dem med 100 mL vand ved hjælp af vakuum og et 100 mL 0,22 µm flaske top filter.
- Sted Ni-NTA resin perler 18 g i 50 mL tube og tilføje tilstrækkeligt volumen af denatureringen buffer (100 mM natrium fosfat, 10 mM Tris, pH 8,0, 6 M guanidin hydrochlorid, pH 8) for at gøre den endelige mængden op til 50 mL.
- Reagensglasset perler i bufferen i 50 min. på en rocker ved stuetemperatur til denaturering.
- Centrifugeres inklusion krop lysate på 16.000 x g i 5 min. til at fjerne uopløselige snavs.
- Tilføje supernatanten til de afbalancerede perler og kassér pellets.
- Sætte blandingen på en rocker i 40 min ved stuetemperatur til at tillade protein binding til Ni-NTA harpiks.
Bemærk: Nikkel Chelat perler bruges til at rense PrP af dens nikkel affinitet. Regionen histidin-rige N-terminalen af PrP gengiver affinitet til nickel(II), som giver mulighed for protein til at binde til nikkel-ioner uden nogen hans tag. - Vask FPLC med vand til at rense ud både linjer (A og B).
- Køre denaturering buffer (100 mM natrium fosfat, 10 mM Tris, pH 8,0, 6 M guanidin hydrochlorid, pH 8) gennem begge linjer (A og B) til prime systemet (kolonnen er endnu ikke knyttet.)
- Indlæses harpiks kolonne. Sørg for at minimere luftbobler.
- Knytte kolonnen til FPLC og køre en lineær gradient fra 100% denatureringen buffer A og 0% af hvorved man genfolder buffer B (100 mM natriumfosfat, 10 mM Tris, pH 8,0) i første omgang til 0% denatureringen buffer og 100% hvorved man genfolder buffer ved udgangen. Denne gradvise Skift drives med en væskehastighed på 0,75 mL/min. til 240 min og er nødvendig for korrekt foldning af PrP.
Bemærk: Under den chromatografiske rensningsprocessen, denatureret PrP er først langsomt refolded på harpiks ved at anvende en lineær gradient hvorved man genfolder buffer til at erstatte den denaturering buffer. Dette trin fjerner også chaotropic guanidin-HCl. - Sørg for, at 100% hvorved man genfolder buffer fortsætter med at flyde gennem kolonnen for en yderligere 30 min på 0,75 mL/min.
- Skylles linje A med vand efterfulgt af eluering buffer (100 mM natrium fosfat, 10 mM Tris, 500 mM imidazol, pH 5,8) omgåelse kolonnen. Dette vil rense den denaturering buffer, som har erstattet nu ved eluering buffer i ordningen AKTA.
- Elute protein på 2 mL/min. ved at køre en lineær gradient til 40 min fra 100% hvorved man genfolder buffer B og 0% eluering buffer A i første omgang til 0%, hvorved man genfolder buffer og 100% eluering buffer.
Bemærk: Den høje koncentration af imidazol i eluering buffer vil konkurrere PrP ' s binding til nickel(II). Den primære protein peak bør begynde at eluere omkring 1/3 af vejen igennem forløbet.- Se kromatogram til OD 280 nm øge.
- Indsamle kun rør indeholdende protein i midten af den store højdepunkt.
Bemærk: Eluted fraktioner i 2 mL hver er indsamlet i 15 mL rør. - Fortyndes protein indeholdt i rør straks med ca 1/3 bind (1 mL) af dialyse buffer (10 mM natriumfosfat, pH 5,8).
- Umiddelbart placerer rør på ice.
- Pool eluted protein indeholdt i rørene.
- Dårlig protein i dialyse kassetter (molekylvægt cut-off 10 kDa).
- Sætte kassetter i pre kølet dialyse buffer (3.6 L) i 2 timer ved 4 ° C, så overføre kassetter til en frisk dialyse buffer (3.6 L) for natten. Gøre sikre, at dialyse buffer er under konstant omrøring.
- Filtreres protein efter dialyse gennem en 0,2 µm acrodisc sprøjte filter ved hjælp af en sprøjte.
- Måle proteinkoncentration ved hjælp af en BCA protein assay kit.
- Koncentrat eller fortyndes hvis det er nødvendigt at justere proteinkoncentration til 0,3 mg/mL.
NOTE: Bekræfte renhed af SDS-PAGE og Coomassie blå farvning. - Gøre 1 mL alikvoter af protein i microcentrifuge rør og straks opbevares ved-80 ° C indtil videre brug som beskrevet i RT-QuIC protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CWD fækal ekstrakter forberedt på 10% (w/v) var i stand til frø RT-QuIC reaktion, men følsomheden af påvisning var lav 27. Ved hjælp af en specifik buffer for fækal homogenisering var et afgørende skridt til at undgå høje baggrund fluorescens i RT-QuIC reaktioner samtidig brug af musen rPrP substrat i stedet for deer rPrP, som gjorde det muligt for at få mere specifikke resultater 27. Tilsætning af NaPTA nedbør reduceret spontan omdannelse af rPrP i RT-QuIC (figur 1) uden at hæmme forstærkning af seeding aktiviteten af reaktioner (figur 2). Selv om bedre forstærkning blev observeret ved NaPTA behandling, var resulterende fluorescens signaler CWD-positive fækal prøver stadig lav (figur 1). Derudover nået prion forstærkning af nogle prøver en konstant plateau på lav fluorescens niveauer. Dette angiver mætning af reaktioner, som kan være på grund af nedbrydning/denaturering af rPrP eller dannelsen af off-pathway aggregater, der forbruger rPrP pool 30. For yderligere at forbedre forstærkning af prioner og øge følsomheden af påvisning, blev et substrat udskiftning trin indarbejdet i protokollen. Indførelsen af substrat udskiftning af RT-QuIC protokollen (figur 2) øget følsomhed (77%; 14 ud af 18 prøver i RT-QuIC var positive) og specificitet (100%, ingen af de negative kontroller i RT-QuIC vendte positiv) påvisning (jf. Tabel 1 fra Cheng et al. 27). Endelig, alle disse trin (figur 3) førte til optimering af en pålidelig og følsom protokol for RT-QuIC påvisning af CWD prioner, ved hjælp af modellen med et lavt indhold af smitteevne.
Substrat udskiftning blev indført efter den første 25 h i RT-QuIC reaktion, af efterfyldning reaktion buffer indeholdende frisk substrat og frisk fluorescens dye Th-T. Ved at indføre substrat udskiftning trin i protokollen, blev RT-QuIC reaktionstiden udvidet fra 50 h 75 h. Som vist i figur 2 med inkorporering af substrat udskiftning, blev en betydelig forbedring af prioner forstærkning observeret.
Figur 1: reduceret spontan omdannelse af mus rPrP substrat i RT-QuIC seedede med renset CWD-negativ fecal homogenatet. Fækal homogeniseret af ikke-inficerede elg (C181-006) eller muldyr hjorte blev homogeniseret i afføring ekstrakt buffer til at opnå en endelig koncentration på 10% (w/v). Til rensning, blev disse fækal homogeniseret forarbejdet og 10 - gange koncentreret med NaPTA nedbør. De urenset fækal homogeniseret (en), NaPTA-renset og koncentreret former (b) fortyndet som angivet blev brugt til seed forsøgsbetingelse RT-QuIC reaktioner med musen rPrP som substrat. Y-axes vise relative Th-T fluorescens enheder, x-axes skildrer reaktionstiden. En reduktion af spontan konverteringer blev set i NaPTA-renset fækal prøver (b). Data, der anvendes fra Cheng et al. 27. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Forbedret detektion af CWD prioner i afføring ved hjælp af substrat udskiftning. Fækal homogeniseret af individuelle elg (C051-05, C052-05) mundtligt inficeret med CWD prioner blev renset og koncentreret med NaPTA nedbør. NaPTA-behandlede prøver blev fortyndet mellem 2 x 10-1 til 2 x 10-3 bruges til seed forsøgsbetingelse RT-QuIC reaktioner med musen rPrP substrat. RT-QuIC analysen blev udført uden substrat udskiftning (en) i en regelmæssig periode på 50 h eller med inkorporering af substrat erstatning for en udvidet inkubationstid på 75 h (b). For sidstnævnte, substrat udskiftning blev indført efter den første 25 h i RT-QuIC reaktion. Halvfems procent af mængden, reaktion var fjernet og erstattet af frisklavede RT-QuIC reaktionsblandingen indeholdende rPrP substrat og Th-T. Ved at indføre substrat udskiftning trin i protokollen, blev RT-QuIC reaktionstiden udvidet fra 50 h til 75 h. Data anvendes fra Cheng et al. 27. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Flow diagram beskriver PrPSc fækal udvinding fra CWD-inficerede hjortedyr og såning aktivitet og prion forstærkning ved hjælp af RT-QuIC assay. Fækal prøver fra CWD-inficerede dyr er homogeniseret i en fækal ekstraktionsbuffer, indsendt til NaPTA nedbør metode og testet af RT-QuIC assay. Sidstnævnte blev udført ved at indføre et substrat udskiftning trin. Indarbejdelse af NaPTA og substrat udskiftning trin resulterede i en reduktion af spontan omdannelse og stærk forbedring af såning aktivitet og prion forstærkning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RT-QuIC var tidligere ansat til at opdage CWD prioner i urin og fækal ekstrakter mundtligt inficerede hvide - tailed hjorte og mule deer 38. Systemet vist i dette håndskrift er en tilpasset metode af RT-QuIC analysen. Yderligere trin blev indarbejdet i den "klassiske" RT-QuIC assay at forbedre afsløring og følsomhed af analysen for CWD prioner i fecal materiale af inficerede dyr.
Lav følsomheden af påvisning i afføring ekstrakter førte os til forbedring af RT-QuIC protokollen. For at opnå følsomme in vitro- påvisning af prioner i afføring, blev kritiske trin føjet til forberedelse af prøver for at fjerne komponenter som forstyrrende prion konvertering og/eller formering og øge følsomheden af påvisning. Indarbejde substrat udskiftning i protokollen af RT-QuIC og NaPTA/sarkosyl behandling var kritisk til påvisning af seeding aktivitet i prækliniske og kliniske CWD-inficerede elg, og for at øge påvisningsgrænserne for prion konvertering i afføring ekstrakter .
NaPTA nedbør er en almindelig teknik som regel ledsaget af sarkosyl udvinding til at isolere og koncentrere PrPSc til en påviselig niveau. NaPTA er kendt for helst udfældningen PrPSc over PrPC 43 mens sarkosyl er et rengøringsmiddel, der er kendt for at lette prion omdannelse ved lave koncentrationer i en celle gratis system 44. I tråd med dette, kan ved hjælp af en kombination af NaPTA og sarkosyl generere et højere udbytte af fibrillar aggregater i vitro som vist før 45,46,47. Denne metode er tidligere blevet indarbejdet i RT-QuIC assay til påvisning perifere CWD prioner med succes i modellen som renset spyt 39 og fuldblod 40. Vores undersøgelse giver første dokumentation for at indarbejde NaPTA/sarkosyl rensning i protokollen af fækal prøveforberedelse muliggør CWD prion påvisning af RT-QuIC. Desuden, med denne metode kunne vi reducere spontan omdannelse af rPrP substrat i CWD-negativ fecal homogeniseret i RT-QuIC assay.
En potentiel mekanisme er blevet foreslået til at forklare effekten af substrat udskiftning 30. I de første runder af reaktion (før tilsætning af friske substrat), er kun en lille mængde af frø føjet til RT-QuIC reaktioner. Mens kun en del af rPrP er indarbejdet i de seedede reaktioner, resten af substratet kan enten bruges ved at interagere med vægge af reaktion plade brønde til formen ikke-amyloid aggregater, eller ændres til en form, som er mindre tilbøjelige til at blive konverteret af Se DED RT-QuIC produkter snarere end de oprindelige frø. Som et resultat, iblanding af rPrP at frøene er langsom, og fibril formation kan ikke spores i den mellemliggende fase. Som de seedede RT-QuIC produkter dyrket i den mellemliggende fase er endelig aflange for at nå frem til en "Hurtig montage stage", kan prioner være forstærket hurtigt af segmentering gennem ryster eller laterale tilsætning af mindre aggregater. På dette stadium, er friske substratet føjet til reaktionen let indarbejdet i seedede produkter i stedet danner uspecifik aggregater. Indarbejdelse af substrat udskiftning trin i vores protokol var en modifikation, at øget følsomhed; Det var nyttigt at opdage prion frø i prøver med et meget lavt beløb af PrPSc fra prækliniske dyr og/eller som indeholder hæmmende stoffer.
Ved hjælp af RT-QuIC assay snarere end PMCA, som er den første i vitro protein misfoldning forstærkning assay beskrevet 21, har flere fordele. I PMCA er rørene udruget og sonicated i et vandbad, der er indeholdt i sonikator; rør placeret i periferien af sonikator Vis mindre effekten af forstærkning i forhold til rør placeret i center 48. RT-QuIC system skælven synes at være lettere at kontrollere. Brug af en 96 godt format er en reel fordel af RT-QuIC, dog mb-PMCA udviklet af Moudjo et al. 49 , 50, viste lignende fordele, men stadig mindre anvendes i PMCA.
Som substrat bruger RT-QuIC rekombinante rPrP for konvertering; derimod bruger PMCA i de fleste tilfælde normal hjerne homogenatet. Derudover i RT-QuIC er ingen sekvens homologi påkrævet mellem frø og substrat 51-53.
Tilstedeværelsen af cofaktorer er nødvendige for prion replikation i PMCA og det resulterende produkt er smitsom. I RT-QuIC assay er den forstærkede PrP ikke smitsom. In vitro- forstærkning assays er forekomsten af falsk positive reaktioner sandsynligvis på grund af spontan omdannelse af PrPC et tilbagevendende problem. Derfor, analyse og betingelser anvendes i denne undersøgelse var skræddersyet til at minimere sådanne forstyrrelser for at maksimere forskellen mellem seedede rPrP-konvertering og spontan omdannelse.
Afslutningsvis, NaPTA/sarkosyl behandling giver mulighed for fjernelse af assay hæmmere i afføring og reducerer spontan omdannelse. Interessant, behandlingen ikke hindre seeding aktivitet af precipitatedPrPSc. Derudover blev følsomheden af påvisning væsentligt forbedret når substrat udskiftning vedtog samtidig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain laboratorier) for at give uddannelses- og cervid PrP bakteriel udtryk plasmid. SG understøttes af programmet Canada forskning stol. Vi anerkender, at finansiering af denne forskning til SG fra genom Canada, Alberta Prion Research Institute og Alberta landbrug og skovbrug gennem genom Alberta, og University of Calgary til støtte for dette arbejde. Vi anerkender forskning tilskud fra Margaret Gunn Foundation for Animal forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Acrodisc seringe filters | PALL | 4652 | |
| amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit | Millipore | UCF901024 | |
| BD 10 ml seringe | VWR | CA75846-842 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Corning bottle-top vacuum filters | Sigma-Aldrich | 431118 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| gentleMACS M Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | ThermoFisher Scientific | 12780029 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| N2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 15502048 | |
| N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | ML9150 | |
| Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K | PALL | OD100C34 | |
| Nunc sealing tapes | ThermoFisher Scientific | 232702 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-000 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Calbiochem | 7910-OP | |
| sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) | Sigma-Aldrich | 496626 | |
| Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516 | |
| Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Triton-100 | Calbiochem | 9410-OP | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial buffers and solutions | |||
| BugBuster Master Mix | Nogagen | 71456-4 | |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 1018401 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) | Life Technoligies | P5493 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977015 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standards and commercial kits | |||
| Express Autoinduction System 1 | Novagen | 71300-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment setup | |||
| AKTA protein purification systems FPLC | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Beckman Avanti J-25 Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Beckman rotor JA-25.50 | Beckman Coulter | ||
| Beckman rotor JA-10 | Beckman Coulter | ||
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sofware | |||
| MARS Data Analysis | BMG Labtech | ||
| GraphPad Prism6 | GraphPad software |
References
- Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
- Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Groveman, B. R., et al. Parallel in-register intermolecular beta-sheet architectures for prion-seeded prion protein (PrP) amyloids. J Biol Chem. 289 (35), 24129-24142 (2014).
- Vazquez-Fernandez, E., et al. The Structural Architecture of an Infectious Mammalian Prion Using Electron Cryomicroscopy. PLoS Pathog. 12 (9), e1005835 (2016).
- Wille, H., et al. Structural studies of the scrapie prion protein by electron crystallography. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3563-3568 (2002).
- Caughey, B. Prion protein conversions: insight into mechanisms, TSE transmission barriers and strains. Br Med Bull. 66, 109-120 (2003).
- Soto, C., Estrada, L., Castilla, J. Amyloids, prions and the inherent infectious nature of misfolded protein aggregates. Trends Biochem Sci. 31 (3), 150-155 (2006).
- Prusiner, S. B. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13363-13383 (1998).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Prusiner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
- Benestad, S. L., Mitchell, G., Simmons, M., Ytrehus, B., Vikoren, T. First case of chronic wasting disease in Europe in a Norwegian free-ranging reindeer. Vet Res. 47 (1), 88 (2016).
- Williams, E. S., Young, S. Chronic wasting disease of captive mule deer: a spongiform encephalopathy. J Wildl Dis. 16 (1), 89-98 (1980).
- Gilch, S., et al. Chronic wasting disease. Top Curr Chem. 305, 51-77 (2011).
- Johnson, C. J., Pedersen, J. A., Chappell, R. J., McKenzie, D., Aiken, J. M. Oral transmissibility of prion disease is enhanced by binding to soil particles. PLoS Pathog. 3 (7), e93 (2007).
- Pritzkow, S., et al. Grass plants bind, retain, uptake, and transport infectious prions. Cell Rep. 11 (8), 1168-1175 (2015).
- Mathiason, C. K., et al. Infectious prions in the saliva and blood of deer with chronic wasting disease. Science. 314 (5796), 133-136 (2006).
- Tamguney, G., et al. Asymptomatic deer excrete infectious prions in faeces. Nature. 461 (7263), 529-532 (2009).
- Haley, N. J., Seelig, D. M., Zabel, M. D., Telling, G. C., Hoover, E. A. Detection of CWD prions in urine and saliva of deer by transgenic mouse bioassay. PLoS One. 4 (3), e4848 (2009).
- Spraker, T. R., et al. Validation of monoclonal antibody F99/97.6.1 for immunohistochemical staining of brain and tonsil in mule deer (Odocoileus hemionus) with chronic wasting disease. J Vet Diagn Invest. 14 (1), 3-7 (2002).
- Spraker, T., et al. Comparison of histological lesions and immunohistochemical staining of proteinase-resistant prion protein in a naturally occurring spongiform encephalopathy of free-ranging mule deer (Odocoileus hemionus) with those of chronic wasting disease of captive mule deer. Vet Pathol. 39 (1), 110-119 (2002).
- Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411 (6839), 810-813 (2001).
- Atarashi, R., et al. Simplified ultrasensitive prion detection by recombinant PrP conversion with shaking. Nature Methods. 5 (3), 211-212 (2008).
- Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
- Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
- Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2), 175-178 (2011).
- Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
- Cheng, Y. C., et al. Early and Non-Invasive Detection of Chronic Wasting Disease Prions in Elk Feces by Real-Time Quaking Induced Conversion. PLoS One. 11 (11), e0166187 (2016).
- Cramm, M., et al. Stability and Reproducibility Underscore Utility of RT-QuIC for Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease. Mol Neurobiol. 53 (3), 1896-1904 (2016).
- Orrú, C., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
- Orrú, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
- Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2175-2178), (2011).
- Orrú, C. D., et al. A test for Creutzfeldt-Jakob disease using nasal brushings. N Engl J Med. 371 (19), 519-529 (2014).
- Orrú, C. D., et al. Rapid and sensitive RT-QuIC detection of human Creutzfeldt-Jakob disease using cerebrospinal fluid. MBio. 6 (1), (2015).
- Sano, K., et al. Early detection of abnormal prion protein in genetic human prion diseases now possible using real-time QUIC assay. PLoS One. 8 (1), e54915 (2013).
- Orrú, C., et al. Detection and discrimination of classical and atypical L-type bovine spongiform encephalopathy by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 53 (4), 1115-1120 (2015).
- Orrú, C. D., et al. Bank vole prion protein as an apparently universal substrate for RT-QuIC-based detection and discrimination of prion strains. PLoS Pathog. 11 (6), e1004983 (2015).
- Masujin, K., et al. Detection of Atypical H-Type Bovine Spongiform Encephalopathy and Discrimination of Bovine Prion Strains by Real-Time Quaking-Induced Conversion. J Clin Microbiol. 54 (3), 676-686 (2016).
- John, T. R., Schätzl, H. M., Gilch, S. Early detection of chronic wasting disease prions in urine of pre-symptomatic deer by real-time quaking-induced conversion assay. Prion. 7 (3), 253-258 (2013).
- Henderson, D. M., et al. Rapid antemortem detection of CWD prions in deer saliva. PLoS One. 8 (9), e74377 (2013).
- Elder, A., et al. In vitro detection of prionemia in TSE-infected cervids and hamsters. PLoS OnE. 8 (11), e80203 (2013).
- Haley, N. J., et al. Prion-seeding activity in cerebrospinal fluid of deer with chronic wasting disease. PLoS One. 8 (11), e81488 (2013).
- Haley, N., et al. Detection of chronic wasting disease in the lymph nodes of free-ranging cervids by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 52 (9), 3237-3243 (2014).
- Safar, J., et al. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat Med. 4 (10), 1157-1165 (1998).
- Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Wille, H., et al. Surface charge of polyoxometalates modulates polymerization of the scrapie prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3740-3745 (2009).
- Lee, I. S., Long, J. R., Prusiner, S. B., Safar, J. G. Selective Precipitation of Prions by Polyoxometalate Complexes. J Am Chem Soc. 127 (40), 13802-13803 (2005).
- Levine, D. J., et al. Mechanism of scrapie prion precipitation with phosphotungstate anions. ACS Chem Biol. 10 (5), 1269-1277 (2015).
- Gonzalez-Montalban, N., et al. Highly efficient protein misfolding cyclic amplification. PLoS Pathog. 7 (2), e1001277 (2011).
- Moudjou, M., et al. Glycoform-independent prion conversion by highly efficient, cell-based, protein misfolding cyclic amplification. Sci Rep. 6, 29116 (2016).
- Moudjou, M., et al. Highly infectious prions generated by a single round of microplate-based protein misfolding cyclic amplification. MBios. 5 (1), (2013).
- Orru, C. D., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
- McGuire, L. I., et al. Real time quaking-induced conversion analysis of cerebrospinal fluid in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Ann Neurol. 72 (2), 278-285 (2012).
- Orru, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
