Summary
هذا البروتوكول هو لاسترداد وإعداد الخلايا الهدف نادرة من خليط مع الخلايا الخلفية غير المستهدفة لتحديد الخصائص الوراثية الجزيئية على مستوى خلية واحدة. نوعية الحمض النووي يساوي عدم تعامل الخلايا المفردة، ويسمح للتطبيق خلية واحدة (كلا الفرز على أساس وتستهدف تحليل).
Abstract
يمكن أن تكون الخلايا الهدف نادرة معزولة من خلفية عالية من الخلايا غير المستهدفة باستخدام أجسام مضادة محددة للبروتينات السطحية للخلايا الهدف. ويستخدم أسلوب وضعت مؤخرا أسلاك طبية فونكتيوناليزيد مع الخلايا الظهارية المضادة الالتصاق جزيء (ابكام) الأجسام المضادة للعزلة في فيفو تعميم ورم الخلايا (ريادية)1. وأظهرت مجموعة مطابقة المريض بسرطان البروستاتا غير المنتشر أن تقنية العزل في فيفو أدى إلى نسبة أعلى من المرضى إيجابية ريادية، فضلا عن تهم لجنة مكافحة الإرهاب أعلى مقارنة بمعيار الذهب الحالية في التعداد لجنة مكافحة الإرهاب. كما لا يمكن استرداد خلايا من الأجهزة الطبية الحالية، سلك فونكتيوناليزيد جديد (المشار إليها كجهاز) تم تصنيعها من السماح بالتقاط ومفرزة اللاحقة من الخلايا قبل العلاج الأنزيمي. خلايا مسموح بإرفاق الجهاز وتصور في مجهر وفصل استخدام العلاج الأنزيمي. هي سيتوسينتريفوجيد على الشرائح المغلفة بغشاء الخلايا المستردة وتحصد على حدة عن طريق الليزر ميكروديسيكشن أو ميكرومانيبوليشن. ثم تخضع عينات الخلايا المفردة للتضخيم الجينوم كله خلية واحدة مما يتيح تحليل المتلقين للمعلومات متعددة بما في ذلك النهج الفرز ومحددة الهدف. إجراءات العزل والانتعاش غلة عالية الجودة الحمض النووي من الخلايا المفردة، ولا يخل بالتضخيم الجينوم كله اللاحقة (WGA). تضخيم الحمض النووي خلية واحدة يمكن أن تحال إلى الفحص و/أو تستهدف تحليل مثل التهجين الجينوم المقارن صفيف (الصفيف-CGH) أو التسلسل. يسمح هذا الجهاز السابقين فيفو العزلة من عينات خلية نادرة اصطناعية (أي 500 الخلايا المستهدفة التي ارتفعت إلى 5 مل دم المحيطي). بينما معدلات المفرزة من الخلايا مقبولة (50-90 ٪)، يمتد معدل الاسترداد من خلايا منفصلة على شرائح واسعة تعتمد على خط الخلية المستخدمة (< 10--> 50 ٪) ويحتاج بعض مزيدا من الاهتمام. لا يتم مسح هذا الجهاز للاستخدام في المرضى.
Introduction
في الآونة الأخيرة، سيلكوليكتور DC01، سلك طبية فونكتيوناليزيد مع الأجسام المضادة-ابكام لعزل ريادية من الدم المحيطي لمرضى السرطان، أضيفت إلى الطيف منهجية لمكافحة الإرهاب التعداد1،2،3 . في دراسة جارية حاليا في سرطان البروستاتا غير المنتشر، هذا السلك فونكتيوناليزيد التقارير تقريبا ضعف عدد المرضى أن لجنة مكافحة الإرهاب-إيجابية وتحسب أعلى لجنة مكافحة الإرهاب في المرضى مصابات بلجنة مكافحة الإرهاب بالمقارنة مع سيلسيرتش، معيار الذهب في لجنة مكافحة الإرهاب التعداد3 . بسبب هذا الأداء المشجع، عزل الخلايا من أسلاك طبية فونكتيوناليزيد لتحليل خلية واحدة سيكون من المستصوب، ولكن لا العلاج الأنزيمي مع الخلية المفرزة الحلول (مثل التربسين) لا ميكروديسيكشن ليزر يسمح استرداد خلايا سليمة (البيانات لا تظهر).
للسماح لمفرزة الخلايا الملتقطة، جيل جديد من الأسلاك فونكتيوناليزيد مجهز بوليمر محددة. هذا البوليمر الذي يربط الأجسام المضادة الالتقاط بالأسلاك، عرضه لمعاملة المخزن مؤقت الإفراج عن السماح لمفرزة من خلايا سليمة (DC03 سيلكوليكتور المشار إليها كجهاز). يسمح هذا الجهاز فونكتيوناليزيد الجديدة، عزل الخلايا الهدف من تركيزات مختلفة من سرطان الخلية خط الخلايا ارتفعت إلى ألبومين المصل البقري (BSA)/الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) والدم المحيطي، على التوالي.
لتسهيل الكشف عن الخلايا المرئية على الجهاز وبعد الانتعاش، هي المسمى الخلايا السرطانية المستهدفة مع إستر سوكسينيميديل "كاربوكسيفلوريسسين" (CFSE) ووصمة الحمض النووي قبل العلاج يتعافى (أي. الشحن وفصل). للعلاج من آثار على نوعية الحمض النووي للخلايا المفردة قيمت سابقا بعد وغ عن طريق مراقبة الجودة بكر4،5،6،CGH الصفيف7 واستهدفت التسلسل7 تبين أي فرق مقارنة ميكرومانيبولاتيد الخلايا غير المعالجة من تعليق خلية7. وميزة هذا الأسلوب يكمن في الجمع بين الخلية الهدف نادرة قبل تخصيب اليورانيوم والانتعاش للخلايا لخلية واحدة تحليل المتلقين للمعلومات (الشكل 1). عموما يتم استخدام جهاز جمع المسمى CE في فيفو الحالي لتعداد ريادية بدلاً من خلية واحدة التوصيف الجزيئي2،8. ومع ذلك، تحليل أكثر شمولاً للتحقيق في عدم التجانس بين ريادية طويلة للتحليل على مستوى الخلية الفردية (أي استهداف التسلسل على مستوى خلية واحدة). الأساليب المستندة إلى خلية أخرى تقوم على عزل إيمونوماجنيتيك ريادية ابكام الإيجابية والتعامل مع خلية واحدة استناداً إلى ديليكتروفوريسيس للتحليل الوراثي الجزيئي اللاحقة9،10. التوصيف الجزيئي ريادية شرط هام لتنفيذها مفيدة في إعداد سريرية، وهو نفس القدر من الأهمية في مجال البحوث الأساسية لتتالي المنتشر. في موازاة ريادية، أصبح يتناقل الورم الحمض النووي (كتدنا) ذات أهمية كبيرة كما أنها تتيح تحليل الحمض النووي من عبء الورم مع الحد الأدنى من العزل التقني إجراءات11،12. الخلية على أساس النهج التي قد تخدم كمساهمة تكميلية كما أنه يسمح للحمض النووي الريبي13،14 والبروتين15 تحليل التعبير وأيضا لمكافحة الإرهاب المستمدة خلية الثقافات أو تكثيفها16، 17-على الرغم من العقبات مثل استرداد خلية منخفض والتخليص للاستعمال في المرضى الذين لا تزال بحاجة للتغلب عليها، يأخذ الأسلوب المصيد والإصدار القادم خطوة هامة نحو تحديد خصائص الخلايا الهدف نادرة.
Protocol
جميع إجراءات أقرتها "لجنة الأخلاقيات" التابعة "جامعة غراتس الطبية" (25-240 ت 12/13). تم أخذ عينات الدم المحيطي للنتوءات تجارب من الأشخاص الأصحاء.
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا HT-29 (خط خلية سرطان القولون البشري) من برنامج تلفزيوني أو من مخاليط مصطنعة من الخلايا HT-29 والدم المحيطي. نفس التجربة أجريت مع اثنين من خطوط خلية إضافية (LNCaP و VCaP، البيانات التجريبية في نتائج الممثل) ويمكن نظرياً أن يؤديها مع كافة الخلايا معربا عن ابكام.
1-إعداد الخلايا الهدف
- خلية ثقافة ووضع العلامات للخلايا
ملاحظة: في هذا البروتوكول، تستزرع خلايا في قوارير الثقافة 75 cm ². الرجاء ضبط كميات الكواشف وبناء على ذلك إذا استخدمت أجهزة الثقافة خلية أخرى (مثلاً 25 cm ² ثقافة الأطباق، لوحات 6-حسنا، إلخ.). هي درجة حرارة جميع السوائل المستخدمة مسبقاً إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. إذا لم يشر إلى خلاف ذلك، يتم تنفيذ كافة الخطوات البروتوكول في درجة حرارة الغرفة (RT).- ثقافة الخلايا HT-29 في 5a "تعديل المتوسطة" في مكوي وتستكمل مع مم 2 لتر-الجلوتامين وعيار 20 ملم حبيس، 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين/ستربتوميسين 1% عند 37 درجة مئوية في جو2 CO 5%.
- عندما تكون الخلايا روافد 90%، إزالة المتوسطة وشطف الخلايا مع 10 مل من 1 x برنامج تلفزيوني.
- حصاد الخلايا، إضافة 2 مل الحل مفرزة الخلية (الجدول للمواد والمواد الكاشفة) إلى الخلايا واحتضان الخلايا لمدة 5 دقائق تقريبا عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يحتوي على الحل مفرزة proteolytic والأنزيمات كولاجينوليتيك في 1 × برنامج تلفزيوني، وحمض الإيثيلين 0.5 مم (يدتا)، وأحمر الفينول 3 مغ/لتر. خفض الاحترار قبل وقت الحل مفرزة الخلية إلى الحد أدنى كما سيكون هذا غير نشط بعد 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. وتغطي طبقة خلية كاملة للحصول على مفرزة الخلية أمثل. - تحقق من مفرزة الخلايا باستخدام مجهر مقلوب.
- نقل الخلايا كل فصل إلى أنبوب 50 مل المعبأة مع 10 مل من خلية الثقافة المتوسطة (نفس المستخدم في الخطوة 1.1.1.) وريسوسبيند الخلايا التي بيبيتينج.
- وضع تعليق خلية الباقية في خلاط اسطوانة أفقية في الرايت والمضي قدما إلى الخطوة التوسيم.
- يعيش وسمها خلية من الخلايا المستهدفة
- قبل استعد تمييع ميليلتر 1 5 مم كفسي (المتوفرة في ثنائي ميثيل سلفوكسيد، [دمس]) في 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية للحصول على الحل الوسم كفسي ميكرومتر 5 جاهزة للاستخدام.
ملاحظة: لتحقيق أفضل النتائج المصبوغة، استخدم الحلول الطازجة. - إعداد جاهزة لاستخدام الحمض النووي المصبوغة حلاً (الجدول للمواد والكاشفات) في برنامج تلفزيوني 1 x وتخزينها في 2-6 درجة مئوية محمية من الضوء.
ملاحظة: لتحقيق أفضل النتائج المصبوغة، استخدم الحلول الطازجة. - الحصول على خلايا من خلاط الاسطوانة الأفقية (الخطوة 1.1.6.) وبيليه إزالة الخلايا في 300 x ز للحد الأدنى 10 المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 10 مل من 1 x برنامج تلفزيوني.
- شطف الخلايا مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني 1 x وريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر جاهزة للاستخدام كفسي الوسم الحل.
- احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وجمع الخلايا بعد الطرد المركزي في 300 x غ لمدة 3 دقائق.
- ريسوسبيند الخلايا المسمى في 1 مل من الخلية قبل حرارة الثقافة المتوسطة والسماح للخلايا للتجدد في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- حصاد الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 3 دقائق وريسوسبيند الكريات الخلية في 1 مل من الحمض النووي جاهزة للاستخدام تلطيخ محلول عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- بيليه الخلايا وإزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 4 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. تقييم كثافة الخلية باستخدام هيموسيتوميتير والتحقق من الأسفار وسمها باستخدام مجهر الأسفار مجهزة 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) و fluorescein isothiocyanate المرشحات (فيتك) (الشكل 2 ألف و 2 هاء).
- الطرد المركزي الخلايا في 300 x ز لمدة 3 دقائق وريسوسبيند بيليه الخلية وفقا لكثافة الخلايا اللازمة لتجربة كل منهما كمعيّن في القسم التالي ومكان على الجليد.
- قبل استعد تمييع ميليلتر 1 5 مم كفسي (المتوفرة في ثنائي ميثيل سلفوكسيد، [دمس]) في 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية للحصول على الحل الوسم كفسي ميكرومتر 5 جاهزة للاستخدام.
2-فرض رسوم الأسلاك
ملاحظة: يمكن أن خلايا معزولة من سبيكينجس الدم خلية/الطرفية بمقياس المليلتر أو عن طريق توفير انخفاض عدد الخلايا في نطاق ميكروليتير الهدف. بينما تسمح النهج السابق لمحاكاة حالة نادرة الخلية في الدم المحيطي، هذه الأخيرة قد تكون الطريقة المفضلة لإرفاق بعض الخلايا أغراض البروتوكول/الاختبار الأمثل.
- شحن السلك باستخدام كمية كبيرة من تعليق خلية
- إعداد جيش صرب البوسنة 2% عرقلة الحل بتذويب 0.8 غرام من جيش صرب البوسنة في 40 مل من س 1 برنامج تلفزيوني (خلية ثقافة الاستخدام). حل جيش صرب البوسنة من خلال فورتيكسينج الأولية وحضانة اللاحقة في RT في خلاط اسطوانة أفقية لمدة 10-20 دقيقة.
- شطف فارغة يدتا أنابيب/صوديوم الهيبارين أنابيب مع 2 مل من جيش صرب البوسنة 2% لإزالة بقايا التخثر وتجاهل الحل. كتلة سطح الأنبوبة بالحضانة في الرايت مع 5 مل من جيش صرب البوسنة 2% في خلاط اسطوانة أفقية 15 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة، وتجاهل الحل.
- تمييع الخلايا المسمى (قسم 1.2.) إلى كثافة كل 100000 خلايا/مل واستخدم 5 مل لشحن السلك.
- إضافة 5 مل تعليق خلية المسمى (الخلايا 500 000 في المجموع) إلى الأنبوبة. تجنب فقاعات عند إضافة تعليق خلية.
- إزالة الأسلاك من حجرة التخزين، فضلا عن غطاء المطاط عقد الأسلاك وشطفه في برنامج تلفزيوني 1 x (الشكل 3).
- تخترق غطاء أنبوب المطاط من أنبوب يدتا (الخطوة 2.1.4.) بمساعدة إبرة حقنه (20 غ) وإدراج السلك مثل ذلك الجزء الوظيفي مغمورة تماما في تعليق خلية عندما يتم وضع الغطاء مرة أخرى على الأنبوبة والأنبوبة في خلاط الاسطوانة مائلة.
ملاحظة: ينبغي أن تغطي الجزء الوظيفي ثلاثية حلزونية من الأسلاك بتعليق خلية في جميع أنحاء تقاضي. - تدوير الأنابيب في خلاط اسطوانة مائلة لفة في الدقيقة 5 مدة 30 دقيقة للسماح للخلايا لإرفاق إلى الأسلاك.
- شطف السلك مع مل 5 1 x برنامج تلفزيوني وتخزينها في الظلام في 2-6 درجة مئوية في أنبوب 15 مل يحتوي على برنامج تلفزيوني x 1 حتى الفحص البصري.
ملاحظة: يجب أن تكون مغمورة الجزء الوظيفي من الأسلاك دائماً في برنامج تلفزيوني تجنب إلحاق الضرر بالخلايا.
- عزل الخلايا الهدف من الخلائط الاصطناعية مع الدم المحيطي (الشحن الأسلوب البديل: 2.1. شحن السلك باستخدام كمية كبيرة من تعليق خلية)
- تمييع الخلايا المسمى (قسم 1.2.) للحصول على تعليق خلية بخلية عالية الكثافة (> 1 000 000 خلايا/مل)، ومن ثم الحفاظ على حجم تعليق الخلية إضافة إلى الدم المحيطي منخفضة.
- إضافة خلايا 500 و 500000 إلى 5 مل دم المحيطي ومزجها بعكس الأنبوب.
- إزالة الأسلاك من حجرة التخزين وإزالة الغطاء المطاطي عقد الأسلاك وشطفه في برنامج تلفزيوني 1 x.
- تخترق غطاء أنبوب جديد مع الجزء غير وظيفية للجهاز باستخدام إبرة حقنه (20 غ) أن الجزء الوظيفية هي مغمورة تماما في الدم ارتفعت عندما يتم وضع الغطاء مرة أخرى على الأنبوبة والأنبوبة في خلاط الاسطوانة مائلة.
ملاحظة: ينبغي أن تغطي الجزء الوظيفي ثلاثية حلزونية من الأسلاك بتعليق خلية في جميع أنحاء تقاضي. - احتضان الأنبوب في خلاط الاسطوانة مائلة 5 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في الرايت
- شطف السلك 3 مرات في برنامج تلفزيوني 1 x وتخزينها في الظلام في أنبوب 15 مل يحتوي على برنامج تلفزيوني x 1 حتى الفحص البصري.
ملاحظة: يجب أن تكون مغمورة الجزء الوظيفي من الأسلاك دائماً تجنب إلحاق الضرر بالخلايا.
- شحن السلك من تعليق خلية صغيرة الحجم (الشحن الأسلوب البديل: 2.1. شحن السلك باستخدام كمية كبيرة من تعليق خلية)
- ريسوسبيند الخلايا المسمى في خلايا/مل 1 000 000 في برنامج تلفزيوني x 1.
- إصلاح زجاج 150 مم المتاح ماصة باستور أفقياً على رف.
- إزالة الأسلاك من حجيرة تخزين ولكن الحفاظ على الغطاء المطاطي الأصفر عقد الأسلاك.
- وضع الأسلاك في ماصة مثل أن يقع الجزء فونكتيوناليزيد في طرف ماصة باستور عدم لمس الزجاج.
ملاحظة: لا ينبغي أن العصا غيض الأسلاك من طرف ماصة باستور. تجنب توصيل نهاية الجزء الخلفي من طرف ماصة باستور مع غطاء المطاط عقد الأسلاك. إذا تعلق ضيق، لا يمكن تحميل تعليق خلية في تلميح ماصة من الجانب الآخر. - تحميل 15 ميليلتر من تعليق خلية في غيض ماصة باستور تغطي الجزء فونكتيوناليزيد من الأسلاك.
- احتضان أسلاك 10 دقيقة يدوياً ربع النهائي بدوره طرف ماصة تجميع الأسلاك/باستور كل دقيقة.
- إزالة الأسلاك من طرف ماصة باستور وشطفه في 5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني وتخزينها في الظلام في 2-6 درجة مئوية في أنبوب 15 مل يحتوي على برنامج تلفزيوني x 1 حتى الفحص البصري.
ملاحظة: دائماً يجب أن تكون مغمورة الجزء الوظيفي في برنامج تلفزيوني 1 x تجنب إلحاق الضرر بالخلايا.
3-عد الخلايا بالأسلاك
ملاحظة: دائماً الجزء الوظيفي من الأسلاك المغمورة في برنامج تلفزيوني x 1 تجنب إلحاق الضرر بالخلايا.
- استخدام قلم الشحوم إلى رسم منطقة مستطيل على شريحة زجاجية وإضافة 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x.
- ثني الجزء غير وظيفية للأسلاك ووضعه على الشريحة الزجاجية بالجزء الوظيفي هي مغمورة في برنامج تلفزيوني 1 x.
ملاحظة: يصلح منطقة المستطيل وحجم برنامج تلفزيوني x 1 تغطي كامل الجزء الوظيفي من الأسلاك. استخدام شريط لاصق الوجهين لتحميل الجزء غير وظيفية من الأسلاك على الشريحة. - افحص بصريا كلا الجانبين من الأسلاك لتعداد الخلايا الملتقطة (الشكل 2 و 2 واو).
ملاحظة: يتم تحديد وجود خلايا استخدام مجهر الأسفار مزودة بمرشحات ل DAPI وفيتك. يمكن تفتيشها كلا الجانبين من الأسلاك وعدد الخلايا أما المقررة (لإعداد الخلايا عالية) أو عدها (فقط ممكناً إذا انخفاض عدد الخلايا موصولة السلك). يمكن تخطي هذه الخطوة إذا كان تعداد الخلايا غير الضرورية. - بعد المسح، ضع السلك مرة أخرى إلى 15 مل الأنبوب الذي يحتوي على برنامج تلفزيوني 1 x (انظر الحاشية 2.3.6. والفرع 3.)، تخزين فإنه السلك في الظلام.
ملاحظة: معظم الجزء غير وظيفية سلك يمكن أن يكون قطع (بما في ذلك الانحناء) وإزالة مخزن تخفيف.
4-مفرزة والانتعاش من الخلايا المستهدفة
ملاحظة: تجري المفرزة من الخلايا ضمن ح 4 بعد عزلة.
- حل 4 مغ المكون الإصدار المخزن المؤقت (الجدول للمواد والمواد الكاشفة) الواحد مل من 1 x PBS وتصفية الحل من خلال مرشح عقيمة 0.2 ميكرون للحصول على المخزن المؤقت جاهزة للاستخدام.
ملاحظة: يتكون بوليمر الأسلاك من المائية التي يتم فونكتيوناليزيد مع الأجسام المضادة لمكافحة ابكام السماح ملزم بتقديم ابكام الخلايا الهدف. المخزن المؤقت الإصدار الذي يحتوي على إنزيم proteolytic الكربون-أكسجين قادر على ناهضة المائية. انشقاق proteolytic يؤدي تدهور البوليمر، ومن ثم، مفرزة من الخلايا الملتقطة. - الحارة قبل الإفراج عن المخزن المؤقت في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إضافة 1.6 مل من الإصدار المخزن المؤقت لملء أنبوب رد فعل 1.5 مل.
ملاحظة: أنابيب مصممة لحجم رد فعل 1.5 مل تسمح التطبيق 1.6 مل هو أمر ضروري لغمر الجزء الوظيفي من الأسلاك. - احتضان الجزء الوظيفي من الأسلاك في المخزن المؤقت للإفراج على 37 درجة مئوية (حوض ماء) 20 دقيقة استخدام غطاء المطاط التي يتم شحنها مع السلك بدلاً من غطاء أنبوب لإصلاح الأسلاك في أنبوب 1.5 مل لتجنب التلوث أثناء حضانة في حوض ماء.
- نقل الجمعية الأسلاك/أنبوب لشاكر في الرايت و 500 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: قد شاكر مدار من 1.5 مم. - وضع الأسلاك/أنبوب التجميع في أجهزة الطرد مركزي، وأنها تدور في 300 x ز لمدة 10 دقائق.
- إزالة الأسلاك من الأنبوب وأغلق الغطاء والطرد المركزي الأنبوب مرة أخرى في 300 x ز لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: يمكن تخزين السلك في برنامج تلفزيوني 1 x في 2-6 درجة مئوية في الظلام لخلية العد لتقييم كفاءة مفرزة/التحقق من الخلايا المتبقية في السلك. - لتقليل حجم تعليق خلية، إزالة جميع ولكن 100 ميليلتر (ميكرومانيبوليشن) أو بدلاً من ذلك 300 ميليلتر (سيتوسينتريفوجيشن وميكروديسيكشن الليزر اللاحقة) من المادة طافية وتشرع فورا في أخذ العينات من خلية واحدة.
5-خلية واحدة أخذ العينات
- ميكرومانيبوليشن
ملاحظة: ستضاف إلى 2 ميليلتر من مزيج الرئيسي تحلل الخلية السماح وغ الخلايا المفردة. إعداد مزيج الرئيسي وفقا لعدد الخلايا لمعالجتها، وحساب كميات إضافية للخسارة بسبب بيبيتينج ومكان خلية تفسخ الرئيسي المزيج على الجليد.- إعداد خلية تفسخ الرئيسي مزيج (مكونات أدوات WGA، الجدول للمواد والمواد الكاشفة) وفقا للبروتوكول أوجزها et alCzyż18. بإيجاز، مزيج ميليلتر 2.0 رد فعل المخزن المؤقت، 1.3 ميليلتر من أوكتيلفينوكسيبوليثوكسييثانول (10% محلول)، 1.3 ميليلتر من 4--(1,1,3,3-تيتراميثيلبوتيل) البولي فينيل غليكول (10% محلول) و 2.6 ميليلتر لحل بروتيناز ك ميليلتر 12.8 خالية من رناسي/الدناز المياه للحصول على مزيج الرئيسي للعينات العشر (الحجم الإجمالي 20 ميليلتر).
ملاحظة: لمزيد من العينات، بزيادة وحدات التخزين تبعاً لذلك. تكوين مزيج الرئيسي تحلل الخلية يختلف عن تلك المستخدمة في إجراء بديل استخدام الليزر عينات ميكروديسيكشن (انظر 5.2.). - استخدام قلم الشحوم إلى رسم منطقة إجراء تعليق خلية في المكان. ضبط مساحة وحجم إذا كانت الخلية كثافة عالية جداً (أي. علامة مساحة أكبر على الشريحة الزجاجية، وتحميل 1 × برنامج تلفزيوني وقاسمه تعليق الخلية).
- "الماصة؛" تعليق الخلية الملطخة بأكملها (التي تم الحصول عليها في الخطوة 4، 8.) على شريحة الزجاج.
- نقل الشريحة الزجاجية مجهر مجهزة ميكرومانيبولاتور. السماح للخلايا تسوية لمدة 5 دقائق (الشكل 2D و ح 2).
- تعد 0.2 مل PCR أنابيب محملة ميليلتر 2.0 سيد تحلل الخلية مزيج (راجع الخطوة 5.1.1.) وتخزينها على الجليد.
- جمع الخلايا المفردة في 1 ميليلتر من PBS 1 x باستخدام ميكرومانيبولاتور ونقل الخلايا في أنبوب يحتوي على مزيج الرئيسي تحلل الخلية.
ملاحظة: لنقل الخلايا ميكرومانيبولاتيد في المخزن المؤقت لتحلل الخلية مكان شعري مباشرة في 2 ميليلتر من تحلل الحل وإخراج حتى يمكن رؤية فقاعات. - باختصار تدور أسفل العينة في عام 2000 x ز 3 s استخدام سطح مكتب [ميكروفوج] لجمع جميع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب. وضع العينات في الثلج.
- انتقل مباشرة إلى وغ خلية واحدة (انظر القسم 6. و Czyż et al. 19).
- إعداد خلية تفسخ الرئيسي مزيج (مكونات أدوات WGA، الجدول للمواد والمواد الكاشفة) وفقا للبروتوكول أوجزها et alCzyż18. بإيجاز، مزيج ميليلتر 2.0 رد فعل المخزن المؤقت، 1.3 ميليلتر من أوكتيلفينوكسيبوليثوكسييثانول (10% محلول)، 1.3 ميليلتر من 4--(1,1,3,3-تيتراميثيلبوتيل) البولي فينيل غليكول (10% محلول) و 2.6 ميليلتر لحل بروتيناز ك ميليلتر 12.8 خالية من رناسي/الدناز المياه للحصول على مزيج الرئيسي للعينات العشر (الحجم الإجمالي 20 ميليلتر).
- ليزر ميكروديسيكشن (أسلوب أخذ العينات خلية واحدة بديلة: 5.1. ميكرومانيبوليشن)
ملاحظة: تكوين المزيج الرئيسية المستخدمة في هذا القسم يختلف عن تلك المستخدمة في القسم 5.1 ميكرومانيبوليشن. وسوف تضاف إلى 4.5 ميليلتر من تحلل الخلية الرئيسية ميكس (مكونات أدوات WGA، الجدول للمواد والمواد الكاشفة) الخلايا المفردة وغ.- إعداد مزيج تحلل الخلية الرئيسية وفقا Czyż et al. 19 عن طريق خلط ميليلتر 5.0 رد فعل المخزن المؤقت، 1.3 ميليلتر من أوكتيلفينوكسيبوليثوكسييثانول (10% محلول)، 1.3 ميليلتر من 4--(1,1,3,3-تيتراميثيلبوتيل) البولي فينيل غليكول (10 ٪ حل) والتركيب. وميليلتر 2.6 من حل بروتيناز ك و 34.8 ميليلتر من رناسي/ المياه خالية من الدناز للحصول على مزيج رئيسي للعينات العشر (الحجم الإجمالي 45 ميليلتر). وضع مزيج الرئيسي على الجليد.
ملاحظة: لمزيد من العينات، بزيادة وحدات التخزين تبعاً لذلك. - الشرائح المغلفة بغشاء الأشعة فوق البنفسجية-علاج يناسب الليزر ميكروديسيكشن. ولذلك، وضع الشرائح في الحمض النووي عبر رابط الجهاز وكشف بالأشعة فوق البنفسجية أعلى لحوالي 10 دقيقة.
- قم بتجميع الشرائح المغلفة بغشاء سيتوسينتريفوجي وسيتوسبين بتعليق الخلية بأكملها في 300 x غ لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: عند استخدام نظام في السائل، حيث تكون الخلايا سيتوسينتريفوجيد على الشريحة في الحل، إزالة المادة طافية بعد سيتوسينتريفوجيشن وتطبيق جاف-تدور في الساعة العاشر ز لمدة 1 دقيقة. - الشروع مباشرة بالليزر ميكروديسيكشن أو السماح سيتوسبينس أيردري بين عشية وضحاها، وتجميد العينات في-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
- "الماصة؛" ميليلتر 4.5 من خلية تفسخ مزيج الرئيسي إلى الحد الأقصى من أنبوب بكر 0.2 مل وحصاد الخلايا المفردة عن طريق الليزر ميكروديسيكشن.
- استرداد أنبوب بكر من المجهر ميكروديسيكشن الليزر وإغلاق الأنبوب. جمع جميع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب القصير-سبين ووضع العينة على الجليد.
- المضي قدما في وغ خلية واحدة أو تخزين العينات المعزولة في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد قبل إجراء مزيد من المعالجة.
- إعداد مزيج تحلل الخلية الرئيسية وفقا Czyż et al. 19 عن طريق خلط ميليلتر 5.0 رد فعل المخزن المؤقت، 1.3 ميليلتر من أوكتيلفينوكسيبوليثوكسييثانول (10% محلول)، 1.3 ميليلتر من 4--(1,1,3,3-تيتراميثيلبوتيل) البولي فينيل غليكول (10 ٪ حل) والتركيب. وميليلتر 2.6 من حل بروتيناز ك و 34.8 ميليلتر من رناسي/ المياه خالية من الدناز للحصول على مزيج رئيسي للعينات العشر (الحجم الإجمالي 45 ميليلتر). وضع مزيج الرئيسي على الجليد.
6-محول-رابط على أساس الجينوم كله التضخيم 18،19
ملاحظة: تأكد من إعداد جميع يمزج الرئيسية اللازمة (مكونات أدوات WGA، الجدول للمواد والمواد الكاشفة) والمخزنة على الجليد جاهزة للاستخدام. يمزج رئيسية تشمل مزيج هضم الحمض النووي 1 ميكرومانيبولاتيد العينات (انظر 5.1.) (التي تحتوي على ميليلتر 2.0 من المخزن المؤقت لرد الفعل، ميليلتر 2.0 منشأة المثنى العامةأنا إنزيم التقييد وميليلتر 16.0 المياه خالية من رناسي/الدناز) أو هضم الحمض النووي مزيج 2 لليزر ميكروديسيكشن (انظر 5.2). عينات (التي تحتوي على 2.5 ميليلتر من منشأة المثنى العامةأنا إنزيم التقييد وميليلتر 2.5 من المياه خالية من رناسي/الدناز)، قبل انلينغ ميكس الرئيسية (التي تحتوي على 5.0 ميليلتر من رد فعل المخزن المؤقت وميليلتر 5.0 لكل من محولات بكر بريانيلينج 15.0 ميليلتر من الماء خالية من رناسي/الدناز)، وربط ميكس الرئيسية (التي تحتوي على ميليلتر 30.0 ملدنة قبل بكر محولات والحل الادينوسين ثلاثي الفوسفات ميليلتر 10.0 10.0 ميليلتر T4 ليجاسى الحل) وسيد بكر الابتدائي مزيج (ميليلتر 30.0 تحتوي على عازل بكر، ميليلتر 20.0 ملم 10 ديوكسينوكليوتيدي ميكس الحل، 10.0 ميليلتر من بوليميراز ميكس و 340.0 ميليلتر من الماء خالية من رناسي/الدناز). لإعداد عينات 10 منح كافة وحدات التخزين. ضبط وفقا لعدد العينات.
- لتحلل الخلية، وضع العينات ميكروديسيكشن ميكرومانيبولاتيد/الليزر في cycler حرارية وتشغيل تحلل الخلايا المفردة التي تفرخ الخلية عند 42 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: استخدم cycler حرارية مع غطاء دافئ. يمكن أن يتم تحلل الخلية س/ن على ح 10 إلى 15. وفي هذه الحالة، حذف الخطوة الحضانة عند 65 درجة مئوية. - تشغيل مسبقاً انلينغ محولات PCR. ولذلك احتضان مزيج الرئيسي قبل انلينغ في cycler حرارية عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة تليها زيادة دورات 49، 1 دقيقة، مع انخفاض درجة الحرارة تدريجيا من 1 درجة مئوية/دورة. بعد 50 دورة (عند 15 درجة مئوية)، احتضان ميكس الرئيسي في 15 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لتوليد محولات غير المتناظر مناسبة لربط (راجع الخطوة 6.6.) مع الحمض النووي من خلية واحدة تعرض منشأة المثنى العامةأنا خلاصة القيد. - بعد تحلل الخلية، تدور أسفل عينات ليسيد في عام 2000 x ز 3 s لجمع جميع السائل في الجزء السفلي ووضعه على الجليد.
- إلى تفتيت الحمض النووي، إضافة 2 ميليلتر من مزيج هضم الحمض النووي 1 لكل عينة تفكيك ميكرومانيبولاتيد أو 0.5 ميليلتر من هضم الحمض النووي مزيج 2 إلى عينة ميكروديسيكشن الليزر وتشغيل خلاصة القيد. استخدام cycler حرارية مع غطاء دافئ في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تليها خطوة المنظمة إنزيم التقييد عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: يجوز تمديد الهضم عند 37 درجة مئوية إلى ح 3. وهذه هي الخطوة البروتوكول فقط اختلاف بين العينات التي تم الحصول عليها من ميكرومانيبوليشن والعينات التي تم الحصول عليها من ميكروديسيكشن ليزر. - تدور أسفل العينات لجمع جميع السائل في الجزء السفلي ووضعه على الجليد.
- ليجاتينج تقييد هضم الحمض النووي ومحولات ملدنة مسبقاً، أضف ميليلتر 5.0 الرئيسي ربط مزيج لكل عينة الحمض النووي هضمها واضطر أنه في cycler حرارية عند 15 درجة مئوية ح 1.
ملاحظة: هذه الخطوة يمكن تمديدها إلى 12 ح أو أداء س/أ. - تدور أسفل العينات لجمع جميع السائل في الجزء السفلي ووضعه على الجليد.
- وغ إضافة 40.0 ميليلتر من الابتدائي بكر مزيج الرئيسي لكل من هذه المنتجات ربط وتشغيل وغ في cycler حرارية مع غطاء دافئ كالتالي: أولاً، واحتضان هذه العينات في 68 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. الدورة الثانية، عن 15 مرة في 94 درجة مئوية 40 s، 57 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 68 درجة مئوية 1 دقيقة 30 ثانية + 1 s/دورة. ثم قم بإضافة 9 دورات في 94 درجة مئوية عن 40 ثانية، 57 ° C + 1 درجة مئوية دورة 30/s، 68 درجة مئوية 1 دقيقة 45 ثانية + 1 s/دورة. بعد ذلك، دورة ل 23 مرة في 94 درجة مئوية مقابل 40 ق، 65 درجة مئوية لمدة 30 ق، 68 درجة مئوية 1 دقيقة 53 ثانية + 1 s/دورة. وأخيراً، أداء ملحق نهائي في 68 درجة مئوية ل 3 دقيقة 40 ثانية والبرد العينات إلى 4 درجات مئوية.
- تدور أسفل العينات لجمع جميع السائل في الجزء السفلي، والتحقق من جودة الحمض النووي أو تخزين العينات في-20 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
7-مراقبة جودة المنتجات وغ
ملاحظة: التحقق من جودة المنتجات وغ استناداً إلى نطاق اللطاخة الحمض النووي والعدد من منتجات التضخيم بعد تشغيل مراقبة الجودة-بكر 4plex 5. تشغيل مختبرين وغ وكل منها مراقبة الجودة-PCR عينات 1.0% [اغروس] هلام للتقييم.
- إعداد 100 ميكرومتر حلول الأسهم من جميع أجهزة الإشعال المستخدمة لمراقبة الجودة 4plex بكر (الجدول 1). إضافة 8 ميليلتر من كل التمهيدي إلى ميليلتر 136.0 بكر الصف المياه لتوليد 200 ميليلتر من تجمع التمهيدي. دوامة الحل 3 ق، أنها تدور إلى أسفل في عام 2000 x ز 3 ميليلتر 20 s وقاسمه للتخزين في-20 درجة مئوية.
- استخدام مجموعات بكر القياسية لإعداد سيد بكر متعدد مزيج ميليلتر 6.0 تحتوي على مكونات x PCR 2 (باستثناء كبسولة تفجير)، 4.5 ميليلتر من الماء بكر-الصف و 0.5 ميليلتر تجمع التمهيدي.
- إضافة ميليلتر 1.0 من المنتجات وغ وأنها تدور إلى أسفل وبكر التشغيل في 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة تليها دورات 35 من تمسخ في 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، التمهيدي الصلب في 56 درجة مئوية 1 دقيقة وتمديد التمهيدي في 72 درجة مئوية ل 1 دقيقة 30 ثانية وهي خطوة تمديد النهائي في 72 درجة مئوية للحد الأدنى 7 البرد إلى 4 درجات مئوية وأنها تدور إلى أسفل ووضع العينات على الجليد لجل التحليل في نفس اليوم أو في-20 درجة مئوية لتحليلها في وقت لاحق.
ملاحظة: يمكن أن يؤديها تقشعر لها اﻷبدان في cycler الحرارية في 12 درجة مئوية لزيادة طول عمر عناصر بلتيير. - تحليل المنتجات وغ (التي تم الحصول عليها من 6.8.) والمنتجات QC-بكر 4plex كل منهما على [اغروس] هلام5.
Representative Results
الخلايا بعد كفسي وتلطيخ النووية يمكن تقييمها باستخدام مجهر الفلورة مزودة بمرشحات ل DAPI وفيتك. الأنوية الحالية مع كونتيرستين مشرق في قناة DAPI حين السيتوبلازم للخلايا تظهر العلامات الموحدة مع كفسي بكثافة بين الخلية غير متجانسة (الشكل 2 ألف و 2 هاء). المتوقع من الخلايا التي تعلق على السلك (الشكل 2 و 2 واو) الشكل وتلطيخ كثافة مماثلة، فضلا عن فصل من السلك واستردادها على شريحة (الشكل 2D وح 2).
خلية عالية الكثافة (مثل > الخلايا 1 000 000/mL) قد يؤدي إلى التغطية الكاملة للأسلاك مع الخلايا عند شحن الأسلاك. ومع ذلك، خفض كثافة الخلية، التغيرات في سرعة دوران أثناء الحضانة، واستخدام خطوط خلية مختلفة تؤثر على كفاءة العزل وينبغي أن تختبر بشكل منفصل. عندما كانت المحتضنة الأسلاك مع 5 مل خلايا HT-29 في كل 100000 خلايا/مل كما هو موضح في القسم 2.1.، يعني 254 ± 103 الخلايا (n = 5) تم القبض على الأسلاك. بنفس التجربة باستخدام خلايا LNCaP، يعني 440 ± 319 الخلايا (n = 5) حصل على كل الأسلاك.
عرض الخلايا HT-29 500، و 5 000، و 50 000 في خلفية 5 مل من الدم المحيطي للأسلاك (وفقا للبروتوكول القسم 2-2.) أسفرت عن القبض على 25 ± 9 خلايا، 75 ± 18 الخلايا والخلايا ± 57 47 (n = 3، كل)، على التوالي. إذا السلك يتوجب مع 15 ميليلتر من تعليق خلية (خلايا 1 000 000/mL) وفقا للبروتوكول في الفرع 2-3.، يصل إلى 1 000 (HT-29) قد إرفاق الخلايا بسلك.
الخلية المفرزة الكفاءة تتراوح بين 81% في الخلايا HT-29 (تتراوح 54.9 في المائة-93.2%، و n = 5) إلى 81 في المائة (تتراوح 63.51 – 92.87%، n = 6) و 91 في المائة (نطاق 84.7 في المائة-95.3%، ن = 6) LNCaP و VCaP في الخلايا، على التوالي. وبالمثل، استرداد خلايا منفصلة تختلف بين خطوط الخلايا: يعني بنسبة 28% من فصل خلايا HT-29 تم استردادها سيتوسينتريفوجيشن. وفي حين أن معدل الاسترداد LNCaP بأقل من 10%، كان معدل الاسترداد يعني للخلايا VCaP 55%.
حوالي 75% خلايا المفردة تعرض لمنتجات وغ ذات جودة عالية الغلة وغ: هذا 1) تشهير المنتجات وغ تتراوح بين 0.1 > 1 كيلوبايت (الشكل 4، اللوحة العلوية) و 2) ثلاث أو أربع فرق في نوعية 4plex التحكم بكر (الشكل 4، اللوحة السفلية) . يمكن استخدام منتجات وغ ل 1) الصفيف-CGH التنميط في الوفاء بمعايير الجودة خلية واحدة الصفيف-CGH الملامح 6،7 وخ ع 2) المستهدفة بعد إعادة تضخيم وغ 7.
رقم 1: سير العمل لعزل واستعادة الخلايا المستهدفة لتحليل الخلايا المفردة. (أ) تستزرع خلايا إلى 90% كونفلوينسي وتحصد (ب) للحصول على تعليق خلية واحدة. بعد تلطيخ مع كفسي والنووية وصمة عار، (ج) أسلاك فونكتيوناليزيد المحتضنة هو حضور الخلايا حجم 5 مل باستخدام أنابيب رد فعل أو في وحدة تخزين منخفضة باستخدام تلميح ماصة باستور. هذا الأخير يسمح لتطبيق وحدات تعليق خلية منخفضة تصل إلى 15 ميليلتر. الخلايا (د) بحاجة إلى أن تكون منفصلة ضمن ح 4 بعد الشحن. ولذلك يتم وضع الأسلاك في أنبوب رد فعل 1.5 مل مليئة بالإفراج عن المخزن المؤقت. بعد 15 دقيقة الحضانة على الروك والطرد المركزي 10 دقيقة، يتم إزالة الأسلاك وهو فصل تعليق خلية بيليه الخلايا. (ه) الخلايا مسترد هي أما نقلها إلى شريحة زجاجية لخلية واحدة ميكرومانيبوليشن (أعلى) أو سيتوسينتريفوجيد إلى شريحة المغلفة بغشاء وإحالتها لليزر ميكروديسيكشن (أسفل). (و) تتضخم الخلايا المفردة المقطوع أخيرا، عن طريق التضخيم الجينوم كله (WGA). وغ منتجات متوافقة مع CGH الصفيف وهادفة خ ع تحليل المتلقين للمعلومات. حانمه ابكام: دائرة خضراء على سطح الخلية. فونكتيوناليزيد الأسلاك: الجهاز، أسلاك حلزونية ثلاثية اللون الرمادي. البوليمر: خطوط أرجوانية. الأجسام المضادة-ابكام: اللون البرتقالي. الإصدار المخزن المؤقت للنشاط: السهم الأحمر. العلامة الشحوم إلى إجراء تعليق خلية في المكان: البيضوي الأزرق الداكن. استرداد تعليق الخلية: أزرق فاتح. الشعرية ميكرومانيبوليشن: خط أسود. التكبير: خلية المستردة حصادها من ميكرومانيبوليشن، سيتوسبين على المغطاة بغشاء الشريحة التي تحتوي على خلايا تم استردادها (رمادي ممتليء). التكبير: خلية المستردة يجري الليزر ميكروديسيكتيد (الرمادي الخط الدائري: غشاء من الشريحة الغشاء بمثابة العمود الفقري لليزر ميكروديسيكشن) وموضوعية مع شعاع الليزر (الخط الأزرق يقترب الشريحة غشاء من الأسفل). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تصور الخلايا المسمى. (ألف وهاء) الخلايا قبل الشحن: المسمى مع كفسي الخلايا وكونتيرستينيد مع الحمض النووي إينتيركالاتينج صبغة تظهر كثافة إشارة النطاق كفسي (أخضر). (ب،و) الخلايا المسمى القبض على السلك. (ج،ز) أسلاك بعد الإجراء الخلية المفرزة. (د،ح) خلايا منفصلة من الأسلاك وتعافي من قبل سيتوسينتريفوجيشن إلى شريحة. كفسي: قناة فيتك (أخضر). الحمض النووي وصمة عار: قناة DAPI (أزرق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: حجرة الأسلاك والتخزين. (أ) الأجزاء الأخرى الأسلاك. (ب) تفاصيل الجزء فونكتيوناليزيد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: مراقبة جودة المنتجات وغ التي تم الحصول عليها من خلايا مفردة ميكرومانيبولاتيد. أعلى اللوحة: وغ المنتجات التي تم الحصول عليها من خلايا مفردة عادة نتيجة في الحمض النووي مسحات تتراوح بين 0.2 كيلو بايت > 1.0 كيلو بايت بكثافة ذروة في حوالي 0.5 كيلوبايت. عدد العينات 1 و 7 و 13 (المشار إليها بعلامات نجمية) إظهار الأمثل أو الحمض النووي لا مسحات. لوحة أسفل: وغ منتجات ذات جودة كافية إذا بكر 4plex غلة ثلاثة أو أربعة من أربعة منتجات PCR (في 100، و 200، و 300، و 400 شركة بريتيش بتروليوم). إظهار أقل من ثلاثة نطاقات لعينات 1، 7 و 10 و 13 وستكون مستبعدة من مزيد من التحليل. لين م يحتوي على سلم bp 100 وتشير العلامات النجمية إلى عينات جودة المنتج وغ غير كافية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| تسلسل التمهيدي | ملاحظة |
| 5-فريق التقييم القطري المشترك آتا tga عقاري cac cc-3 | 100 شركة بريتيش بتروليوم التمهيدي إلى الأمام |
| 5-لجنة مكافحة الإرهاب ctg جا جات ggt جات زز-3 | 100 شركة بريتيش بتروليوم عكس التمهيدي |
| 5-agg تج agc اسكت بنا agc-3 | 200 شركة بريتيش بتروليوم التمهيدي إلى الأمام |
| 5-ttt tgc ggt gga صرفة غيغاطن ct-3 | 200 شركة بريتيش بتروليوم عكس التمهيدي |
| 5-agg tga gac توري ضريبة تحويل العملة بنا زز-3 | 300 شركة بريتيش بتروليوم التمهيدي إلى الأمام |
| 5-tcc قانون الجميح للسيارات كاج tca فريق tc-3 | 300 شركة بريتيش بتروليوم عكس التمهيدي |
| 5-هيئة مكافحة الفساد غيغاطن القط دول مجلس التعاون الخليجي اتفاق المنسوجات والملابس قانون gc-3 | 400 شركة بريتيش بتروليوم التمهيدي إلى الأمام |
| 5-بنا tga الجهاز المركزي للمحاسبات agt ggt cgt تيراغرام-3 | 400 شركة بريتيش بتروليوم عكس التمهيدي |
الجدول 1: تسلسل التمهيدي لمراقبة الجودة 4plex بكر
Discussion
ويهدف البروتوكول وصف استرداد خلايا من سلك فونكتيوناليزيد (المشار إليها كجهاز) السابقين فيفو تحليل الجينوم خلية واحدة. وقمنا باختبار ثلاثة خطوط الخلايا إيجابية ابكام (HT-29 ولنكاب و VCaP)، ولكن من حيث المبدأ، يمكن تطبيق هذا الأسلوب لأي خط الخلية الإعراب عن ابكام. الخلايا الهدف ابكام إيجابية يمكن عرضها على الجهاز كتعليق خلية النقي (انظر 2.1.) أو مختلطة في فائض خلايا الخلفية (مثلاً. المحيطية الدم، راجع 2.2.). حين لا سيما الأخير يمكن أن تستخدم لاختبار قدرات عزلة في ظروف نادرة الخلية، ضبط عدد من الخلايا التي تعلق على السلك يمكن القيام به وصفه صغيرة الحجم باستخدام النهج (انظر 2.3.). نظراً للاختلافات بين خطوط الخلية المتوقعة، سرعة كثافة الخلية المناسبة لشحن السلك، تناوب، فضلا عن وقت الحضانة تحتاج إلى اختبار تجريبي بتقييم العدد الخلايا المرفقة باستخدام مجهر الفلورة.
للجينوم التطبيقات المصب وغ على الصعيد خلية واحدة، هو المطلوب. قد تختلف طريقة وغ الاختيار بين مختبرات، ومن حيث المبدأ، لدينا أسلوب مفتوح لجميع الأساليب مما يمكن معالجة العينات التي تم الحصول عليها من ميكروديسيكشن ميكرومانيبوليشن أو الليزر. في هذا البروتوكول، نحن نستخدم أسلوب يقوم على الحمض النووي انزيماتيكالي مجزأة بسبب أداء أفضل بالمقارنة مع وغ حرارة-تجزئة على أساس7. اختياري، واحدة من الخلايا يمكن أن تحال إلى وغ متحاور السماح للحمض النووي بعد ذلك التنميط20،21.
ويهدف البروتوكول وصف استعادة الخلايا سليمة بعد تولي لجيل جديد من الأسلاك فونكتيوناليزيد لتحليل الجينوم في خلية واحدة. الجيل الأول من الأسلاك فونكتيوناليزيد، التي تمثل أيضا أجهزة التخصيب CE المعتمدة فقط في فيفو في السوق حتى الآن، استخدمت لتعداد ريادية في مرضى السرطان الجسد. المنشورات السابقة والبيانات الخاصة بنا تشير إلى أسلوب العزل في فيفو لتكون أكثر حساسية بالمقارنة إلى معيار الذهب التكنولوجيا الحالية2. وهكذا، تجهيز هذه في فيفو العزلة التقنية مع ميزة استرداد كما أدركت في الجهاز يسمح الجمع بين ارتفاع مكافحة الإرهاب الانتعاش مع توصيف على مستوى خلية واحدة.
ومع ذلك، لا يتم مسح الجهاز للاستخدام في المرضى، وبالتالي، لا تتوفر البيانات السريرية. السابقين فيفو التطبيقات (أي عزل ريادية من الدم المحيطي بعد أخذ العينات) لا ينصح كما أن التكنولوجيا تتكيف مع الإعدادات الحالية في المرفقي عبثا، مثل انخفاض القطر من دون جدوى (زيادة الاحتمال الاتصال بين ريادية والأجسام المضادة لاصطياد المباشر) ووقت الاحتفاظ الطويل (30 دقيقة، مما يتيح ل 2-3 من الدم لتمرير السلك). لكن، وكما هو مبين في القسم 2-2. أيضا يمكن أن تكون الخلايا المستهدفة معزولة من عينات مختلطة7.
حد الحالي للأسلوب هو عدم كفاءة استرداد خلايا غير المثبتة بعد مفرزة من الأسلاك. هذا، ومع ذلك، قد تحسين بخطوة تثبيت خلية قبل العلاج مفرزة.
وخلاصة القول، هذا البروتوكول خطوة أولى نحو الجمع بين استخدام أسلوب العزل في فيفو مع استعادة خلية لتميز وراثيا الخلايا المفردة. بذل المزيد من الجهود بحاجة إلى معالجة الأمثل لاسترداد الخلية والتخليص لتطبيقه في المرضى1،2. ومع ذلك، الطب شخصية لقرارات العلاج للرصد والعلاج يتجاوز تعداد ريادية. وهكذا، هذا الأسلوب خطوة أولى نحو الجينوم توصيف لجنة مكافحة الإرهاب على مستوى الخلية الواحدة.
تطبيقات نحو تحليل الترنسكربيتوم خلية واحدة يبدو ممكناً كما يتم حصاد خلايا سليمة. ومع ذلك، يبقى أن تقيم ما إذا كان الإجراء الذي يتعافى له تأثير على سلامة الحمض النووي الريبي (مثل إعادة توجيه الخلايا المفردة المستردة لتحلل مباشرة متبوعاً RT qPCR22). وإذا نجحت، يمكن أن تحول توصيف الخلايا المفردة (مثل ريادية) إلى مستوى الترنسكربيتوم، مما يتيح إجراء تحليلات أكثر تفصيلاً. وفي هذا الصدد، تسلسل الحمض النووي الريبي استخدام الذكية-seq2 يوفر أداة قيمة لتحليل الحمض النووي الريبي المتلقين للمعلومات من خلايا مفردة كما كدنا بريامبليفيد (التي تم الحصول عليها أثناء إعداد المكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي) يمكن أن تخضع ل PCR الكمي. وهذا سيسمح الهدف المشترك والتحليل القائم على فحص خلايا تم استردادها مفردة22،23.
أسلاك فونكتيوناليزيد الحالية تقوم على أجسام المضادة-ابكام الذي علامة الظهارية مستخدمة على نطاق واسع للتحديد الإيجابي ريادية24. كما يمكن ريادية عدة علامات طلائي دوونريجولاتي مثل سيتوكيراتينس أو ابكام25، إضافة الأجسام المضادة مثل HER2/الجديدة ستزيد فرصة لعزل الإرهاب. جسم عدة على أساس تخصيب اليورانيوم قد وضعت استراتيجيات واستعرضها فيريرا وآخرون. في26من عام 2016. يمكن أن تكون خليط من الأجسام المضادة معطلة على سلك تحسين التكنولوجيا مما أدى إلى عزل عدد أكبر وأنواع فرعية إضافية من ريادية في مستقبل.
وملزمة لجميع الخطوات التي تنطوي على سلك التعامل مع إبقاء الجزء الوظيفي من الأسلاك المغمورة في حل من أجل الحفاظ على الوظائف. ونحن نوصي لوضع الأسلاك في برنامج تلفزيوني x 1 خلال التقييم (المجهر؛ على سبيل المثال-خطوات 3.1. -3.3.) والتخزين. تفاديا لتلطيخ غير مناسب، نوصي باستخدام طازجة أعد الحل المصبوغة في خطوات 1.2.1. و 1.2.2. خلايا ضعيفة الملون تعوق خلية العد بالأسلاك وقد يؤدي إلى التقليل الخلايا المرفقة.
من الضروري تجنب يسد ماصة باستور مع غطاء المطاط عند إدخال الأسلاك في ماصة باستور للتحميل اللاحقة من تعليق خلية (الخطوة 2.3.4.). Cap مطاط يستخدم لعقد الأسلاك في مكانها حتى أن يقع الجزء الوظيفي داخل غيض ماصة باستور. إذا تم إرفاق الغطاء أيضا بشدة على الجزء خلفي ماصة باستور، من غير الممكن تحميل تعليق خلية. في هذه الحالة، سهولة عملية النداء الموحد أن الجو الذي شرد من تعليق خلية تحميل يمكن أن تترك الماصة.
الانحناء الأسلاك أمرا حاسما لتوجهها خلال الخلية العد في خطوات 3.2. و 3-3. جبل الأسلاك باستخدام شريط لاصق مثل أن يأتي نهاية السلك غير وظيفية يكذب على جانب واحد. بعد المسح من طول الجزء الوظيفي، يتم إرجاع الأسلاك 180° حتى يمكن مسحها ضوئياً والنصف الآخر من السلك الوظيفي. تعد هذه الخطوة مهمة للتجارب الأولية لتقييم عدد الخلايا بالأسلاك. حالما يتم تقييم عدد الخلايا لخط الخلية وإجراء معين، يمكن أن يتكرر الإجراء دون احتساب الخلية (على سبيل المثال-التحقق من وجود خلايا أو إهمال هذه الخطوة فقط). بيبيتينج دقيق أمر حاسم لتجنب فقدان الخلية عند تقليص حجم المادة طافية في الخطوة 4، 8. تأكد من بيبيتينج تتم بسلاسة دون التسبب في تثربولنسس لبيليه.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذه الدراسة من النمساوية العلم الصندوق (FWF)، المشروع--لا. أنا 1220-B19 (إلى ب. س.) كجزء من مشروع ارنت في المتعدية السرطان البحوث (ترانسكان) "خلايا الأورام يتناقل كالعلامات البيولوجية للأمراض المتبقية ضئيلة في سرطان البروستات (لجنة مكافحة الإرهاب--المسح الضوئي)". وتم تدريب الدكتوراه المرشح الليبي في إطار برنامج دكتوراه الطب الجزيئي في "جامعة غراتس الطبية". المؤلفون امتنان تعترف شلوغل نينا، كومر دانيال، Wendt جابي، كوداك كلوديا، شولتز جوليا، وجوانا شيلر لمساعداتها التقنية الخبراء. يشكر المؤلفون غيورغ بينهاوبت لدعم تصميم الرسوم البيانية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gilupi Release Buffer | Gilupi | GIL083 | Used to detach cells from the wire |
| McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 16600-082 | Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | PAA | S11-001 | Supplement for McCoy's 5A Medium |
| Foetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Biowest | L0018-100 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Phosphate Buffered Saline (1x PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-015 | |
| Accutase | Biowest | L0950-100 | Cell detachment solution (cell culture) |
| Water bath | GFL | Type 1003 | Used for prewarming solutions |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Used to incubate cells (cell culture) | |
| 50 mL reaction tubes | VWR | 525-0403 | |
| Roller mixer | Stuart Scientific | SRT6D | Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34554 | Used to label living cells (cytoplasmic label) |
| Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Scientific | Used to stain DNA (nucleic counterstain) |
| Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Megafuge 40R | Used for pelleting cells |
| Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) | Carl Zeiss Microimaging | Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter) | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Used for coating glass/plastic surfaces |
| MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | Used for vortexing |
| Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes | BD | 366450 (or 366480) | Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells |
| Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R) |
| Syringe needles (G20) | VWR | 613-0554 | Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it |
| Neubauer chamber | Roth | T729.1 | Used to count cells |
| Pasteur pipettes 150 mm | Volac | D810 | Used for the low-volume application of cells to the C&R |
| Grease pen | Dako | S2002 | Used on glass slides to hold cell suspension in place |
| Steril syringe filter (0.2 µm) | Corning | 431219 | For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer |
| Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | Used for agitation during cell detachment |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 30,125,150 | |
| Ampli1 WGA Kit | Silicon Biosystems | To be ordered via Silicon Biosystems | |
| Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Use micromanipulation at hand | |
| Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Used for micromanipulating cells |
| 0.2 mL PCR tubes | Biozym | 710920 | |
| Cytocentrifuge and equippment | Hettich | Universal 32 | Use cytocentrifuge at hand |
| Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | Every thermo cycler with heated lid can be used |
| Microcentrifuge | Roth | CX73.1 | Use desk-top centrifuge at hand |
| MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Membrane-coated glass slides used for laser microdissection |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | Use DNA cross linker at hand |
| Standard PCR reagents | |||
| 6x DNA Loading | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Use gel loading dye at hand |
| DNA ladder | BioLabs | N0551G | Use 100 bp ladder at hand |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Gel electorphoresis station | Bio-Rad | Use electrophoresis system at hand | |
| Gel Red Nucleic Acid Stain | Biotium | 41003 | Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels |
References
- Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
- Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).
- Kuske, A., et al. Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients. Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).
- van Beers, E. H., et al. A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples. Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).
- El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA. Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).
- Möhlendick, B., et al. A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH. PLoS ONE. 8 (6), e67031 (2013).
- Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci Rep-UK. 7, 43424 (2017).
- Zhang, H., et al. Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck. Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).
- Carter, L., et al. Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer. Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).
- Luca, F. D., et al. Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer. Oncotarget. , (2016).
- Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection. Cell. 168 (4), 571-574 (2017).
- Page, K., et al. Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer. Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).
- Kalinich, M., et al. An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma. P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).
- Gorges, T. M., et al. Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells. Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).
- Sinkala, E., et al. Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting. Nat Commun. 8, 14622 (2017).
- Morrow, C. J., et al. Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study. Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).
- Williamson, S. C., et al. Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer. Nat Commun. 7, 13322 (2016).
- Czyż, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM. Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).
- Czyż, Z. T., Klein, C. A. Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells. Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).
- Kroneis, T., et al. Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR. J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).
- Kroneis, T., et al. Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification. Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).
- Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification. Sci Rep-UK. 7, 45219 (2017).
- Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. Potential and Challenges of Liquid Biopsies. Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).
- Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. Circulating tumor cell technologies. Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).
