Summary
このプロトコルは、回復し、単一細胞レベルの分子遺伝学的解析の非対象の背景セルの混合物から珍しいターゲット セルを準備することです。DNA の品質は非処理の単一細胞であるし、により、単一セルに適用 (両方のスクリーニング ベースし、解析を対象とした)。
Abstract
まれな標的細胞は標的細胞の表面蛋白質の特異抗体を用いた非標的細胞の高いバック グラウンドから分離することができます。最近開発された方法は、医療用ワイヤー線の循環腫瘍細胞 (CTCs)1の絶縁に生体内で抗上皮細胞接着分子 (EpCAM) 抗体修飾を使用します。非転移性前立腺癌患者照合のコホートは、生体内で分離技術は、Ctc として CTC 列挙体の現在のゴールド スタンダードと比較して高い CTC 数陽性患者の割合が高いの結果を示した。セルは、現在の医療機器から復旧できない、(デバイスと呼ばれる) 新しい機能性ワイヤーはキャプチャと後続の剥離細胞の酵素処理でに製造されました。細胞は顕微鏡で視覚化、酵素処理を使用して、デバイスに接続できるとしています。回復した細胞膜コーティング スライド cytocentrifuged、レーザ切断またはマイクロマニピュレーションによる個別に収穫します。単一セルのサンプル スクリーニングとターゲット固有のアプローチを含む複数のダウン ストリーム解析を許可する単一細胞ゲノム増幅を受けます。隔離および復元の手順は単一セルから高品質 DNA を生成し、以降の全ゲノムの拡大 (WGA) を損なうことはありませんできます。単一セルの増幅された DNA のスクリーニングに転送することができますおよび/または配列比較ゲノム交配 (アレイ CGH) やシーケンスなどの分析を対象としました。デバイスには、珍しい人工細胞サンプル (すなわち500 標的細胞が末梢血 5 mL にスパイク) から分離前のヴィヴォことができます。広い範囲の細胞ラインの使用に依存して細胞の剥離料金は許容範囲 (50-90%) である一方スライド上に剥離細胞の回収率にまたがる (< 10 - > 50%) といくつかのさらなる注意が必要があります。患者の使用のため、このデバイスは消去されません。
Introduction
最近、CellCollector DC01、修飾と癌患者の末梢血から Ctc を隔離するため抗 EpCAM 抗体医療用ワイヤー線は CTC 列挙1,2,3 の整然としたスペクトルに追加されました.非転移性前立腺癌で現在進行中の研究、この官能ワイヤー レポートは CTC 陽性 2 回ほぼ多くの患者および CellSearch、CTC 列挙型3 のゴールド スタンダードと比較して CTC 陽性で高い CTC カウント.この奨励のパフォーマンスによる単一細胞解析用機能性医療線からセルの隔離が望ましいが細胞剥離ソリューション (例えばトリプシン) で酵素処理もレーザ切断可能そのままなセル (データは示されていない) の回復。
キャプチャされた細胞の剥離をできるように、官能のワイヤの新世代は特定のポリマーが装備されていた。キャプチャー抗体をワイヤーにリンク、このポリマーは (CellCollector DC03 のデバイスとする呼ばれる) そのままなセルの取り外しを許可するリリース バッファー処理に影響を受けやすい。新しい機能性デバイスにより、癌細胞にウシ血清アルブミン (BSA) スパイクの濃度から標的細胞の分離/リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と末梢血、それぞれ。
デバイスに回復後、細胞の視覚的検出を容易に標的がん細胞が付けられて carboxyfluorescein サクシニミジルエステル (CFSE) と回復の治療前に DNA 染色 (すなわち。 充電およびデタッチ)。単一細胞の DNA の品質に、治療の効果、品質コントロール PCR4、5、アレイ CGH6,7によって WGA 後以前に評価したし、ターゲット シーケンス7差が認められなかったに比べて非処理細胞 micromanipulated 細胞懸濁液7から。この方法の利点は、まれなターゲット細胞前濃縮の組み合わせと単一細胞下流解析 (図 1) のための細胞の回復であります。現在体内に CE ラベル コレクション デバイスは、単一細胞分子生物学2,8ではなく、Ctc の列挙に一般的に使用されます。ただし、Ctc の不均一性を調査するためのより包括的な解析 (すなわち対象と単一細胞レベルのシーケンス) 個々 のセル レベル分析の長い。他のセル ベースの方法は、免疫 EpCAM 正 CTCs 及びその後の分子遺伝学的解析9,10の誘電泳動に基づく単一細胞処理の分離に基づいています。Ctc の分子特性は臨床の現場で役に立つ実装にとって重要な要件と転移連鎖の基礎的研究にも同様に重要。Ctc に並行して、循環腫瘍 DNA (葉緑体) なっている非常に重要なことで最小限の技術分離手順11,12と腫瘍の重荷の DNA 解析。セルベース アプローチ RNA13,14タンパク質15式分析の相補的な貢献として役立つかもしれないこと、また CTC 派生セル文化または異種16,17. 低細胞の回復と患者の使用のためのクリアランスなどの障害物は、まだ克服しなければならない必要ですが、キャッチとリリース メソッドはまれなターゲット セルの特性評価に向けた重要な次のステップです。
Protocol
すべてのプロシージャは、グラーツ医科大学 (12/13 ex 25-240) の倫理委員会によって承認されています。実験をスパイクの末梢血は、健康な人からサンプリングされました。
注: このプロトコルには、HT 29 細胞 (ひと大腸癌細胞株) PBS や HT 29 細胞と末梢血の人工混合物からの分離について説明します。同じ実験を 2 追加のセル行 (LNCaP と VCaP 代表結果に実験データ) と行い EpCAM を表現するすべてのセルで理論的に実行できます。
1. ターゲット細胞の調製
- 細胞培養と細胞のラベリング
注: このプロトコルでセルを 75 cm ² 培養フラスコで培養しています。他の細胞培養装置を使用している場合、試薬の量を適宜調整してください(例: 25 cm ² 培養皿、6 ウェル プレート)。すべての液体は使用が 37 の ° C の水浴中で加温します。明示されていない、常温 (RT) プロトコルのすべての手順が実行されます。- 1% ペニシリン/ストレプトマイシン 5% CO2の大気中の 37 ° C で 10% 牛胎児血清 (FBS)、20 mM Hepes 2 mM L グルタミンを添加したマッコイの 5 a 変更培地で培養 HT 29 細胞。
- 細胞が 90% の合流と、メディアを取り出して、10 ml の 1x PBS のセルをすすいでください。
- 細胞を収穫するには、セルに (テーブルの材料および試薬) 細胞剥離溶液 2 mL を追加し、37 ° C で約 5 分の細胞をインキュベート
注: 剥離ソリューションに含まれるプロテアーゼや PBS、0.5 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、および 3 mg/L フェノールレッド x 1 コラーゲン分解酵素。37 ° C で 1 時間後アクティブなこのことが細胞剥離液の前に地球温暖化の時間を最小限に抑える最適な細胞の剥離を取得する全体の細胞の層をカバーしてください。 - 倒立顕微鏡を用いた細胞の剥離を確認します。
- (で使用した同じステップ 1.1.1。) 細胞培養培地 10 mL が充填された 50 mL のチューブにすべて剥離細胞を転送し、ピペッティングにより細胞を再懸濁します。
- RT で水平ローラー ミキサーの残りの細胞懸濁液を置き、ラベリングの手順に進みます。
- 細胞は、標的細胞のラベリングをライブします。
- 5 mm CFSE (ジメチルスルホキシド、DMSO 中付属) 1 mL の 1x PBS で 1 μ L 希釈は 5 μ M に使える CFSE ラベル ソリューションを取得する 37 ° C で加温。
注: 最適な染色結果を得るのため、作りたてのソリューションを使用します。 - 準備準備ができて使用する DNA 染色ソリューション (テーブルの材料および試薬) 1x PBS で、光から保護 2-6 ° C で保存します。
注: 最適な染色結果を得るのため、作りたてのソリューションを使用します。 - 300 x gで 10 分間のセルを削除する水平ローラー ミキサー (ステップ 1.1.6。) からの細胞とペレット上清を取得し、10 mL の 1x PBS で細胞を再懸濁します。
- 1x PBS で再びセルを洗浄し、500 μ L に使える CFSE ラベリング ソリューションで細胞ペレットを再懸濁します。
- 37 ° C 15 分で細胞をインキュベートし、3 分間 300 × gで遠心分離後セルを収集します。
- 30 分の 37 ° C で再生成する細胞ができ、予め温めておいた細胞培養液の 1 mL の細胞を再懸濁します。
- 3 分間 300 × gで遠心分離によって細胞を収穫し、染色液を 37 ° C, 10 分で準備ができて使用する DNA の 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
- 細胞のペレット、上澄みを除去し、4 mL の 1x PBS で細胞を再懸濁します。診断細胞密度を評価し、装備蛍光ラベリング蛍光顕微鏡を用いた 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) とかに (FITC) フィルター (図 2 a と 2 e) をチェックします。
- 300 x g 3 分で細胞を遠心し、次のセクションと氷の場所で与えられたそれぞれの実験に必要な細胞の密度によると細胞ペレットを再懸濁します。
- 5 mm CFSE (ジメチルスルホキシド、DMSO 中付属) 1 mL の 1x PBS で 1 μ L 希釈は 5 μ M に使える CFSE ラベル ソリューションを取得する 37 ° C で加温。
2. ワイヤーの充電
注: セルはターゲット セル/末梢血液 spikings ミリリットル スケールまたは低 1 マイクロリットル スケールで細胞数を提供することによってから分離できます。一方前者のアプローチは、末梢血で珍しいセルの条件を模倣するためことができます、後者がありますプロトコル最適化/テストの目的のための少数のセルを接続する方法。
- 大量の細胞懸濁液を使用してワイヤを充電
- 40 mL の 1x PBS (携帯文化使用) に BSA の 0.8 g を溶解することにより解決を妨げる 2 %bsa を準備します。初期ボルテックスし、10 〜 20 分の水平ローラー ミキサーに RT でその後インキュベーション BSA を溶解します。
- リンス空 EDTA 管/ナトリウム ヘパリン チューブ 2 mL 2 %bsa を抗凝固剤の残基を削除し、ソリューションを破棄します。15 rpm で 30 分間の水平ローラー ミキサーに 2 %bsa の 5 mL 常温培養で管表面をブロック、溶液を廃棄します。
- ラベル付きセル (セクション 1.2) 100 000 細胞/ml の密度を希釈し、5 mL を使用して、ワイヤを充電します。
- チューブに標識細胞懸濁液 (合計 500 000 セル) 5 mL を追加します。細胞懸濁液を追加するときは、泡を避けるため。
- 収納スペースだけでなく、ワイヤーを保持しているゴム製のキャップから線を削除、1 × PBS (図 3) でそれをすすいでください。
- 注射針 (20 G) の助けを借りて、EDTA 管 (ステップ 2.1.4。) のゴム管キャップを貫通し、キャップ チューブとチューブの背面に配置する場合傾斜ローラー ミキサー一部の機能は細胞懸濁液に完全に浸漬するようワイヤーを挿入します。
注: ワイヤの三重らせん機能部分は充電中で細胞を懸濁液でカバーされなければなりません。 - セルが線をアタッチするように 30 分間 5 rpm で傾斜ローラー ミキサーにチューブを回転させます。
- 5 mL の 1x PBS でワイヤーを洗い、目視検査まで 15 mL 管内 1x PBS で 2-6 ° C で暗闇の中で保存します。
注: 線の一部の機能は、細胞を傷つけることを避けるために PBS で常に水没する必要があります。
- 末梢血と人工の混合物から標的細胞を分離する (代替充電方法: 2.1。大量の細胞懸濁液を使用してワイヤを充電)
- 細胞密度の高い細胞懸濁液を取得するラベル付きセル (セクション 1.2) を希釈 (> 1 000 000 細胞/ml)、それにより細胞懸濁液、末梢血に追加のボリュームを低く保ちます。
- 末梢血 5 mL に乃至 500 セルを追加し、チューブの反転によってそれらをミックスします。
- 収納スペースから線を削除、ワイヤーを保持しているゴム製のキャップを削除および 1x PBS で洗浄します。
- 機能部分はキャップは管と管の背面に置かれたとき傾斜ローラー ミキサー スパイクの血に没頭するように注射器の針 (20 G) を使用して、デバイスの非機能的な部分で新しいチューブ キャップを貫通します。
注: ワイヤの三重らせん機能部分は充電中で細胞を懸濁液でカバーされなければなりません。 - 室温 30 分間 5 rpm で傾斜ローラー ミキサーにチューブを孵化させなさい
- 1x PBS でワイヤーを 3 回洗浄、目視検査まで 1x PBS を含む 15 mL チューブに暗闇の中で保存できます。
注: 線の一部の機能は、細胞を傷つけることを避けるために常に水没する必要があります。
- 少量の細胞懸濁液からワイヤーを充電 (充電方法の代替: 2.1。大量の細胞懸濁液を使用してワイヤを充電)
- 1 000 000 細胞/mL の 1x PBS で細胞を再懸濁します。
- ラックに 150 ミリメートル使い捨てガラス パスツール ピペットを水平に修正します。
- 収納部からワイヤーを削除が、ワイヤーを保持している黄色のゴム製のキャップをしてください。
- 官能部分がガラスに触れないように Pasteur のピペットの先端に位置していますようにピペットでワイヤを配置します。
注: ワイヤーの先端はパスツール ピペット チップから守らなければなりません。ワイヤーを保持しているゴム製のキャップをパスツール ピペット チップの後部を接続しないでください。しっかり接続されている、細胞懸濁液はピペット チップに反対側から読み込むことができません。 - ワイヤの機能性の一部を覆うパスツール ピペットの先端に細胞懸濁液の 15 μ L をロードします。
- 10 分手動で 90 度回転用のワイヤーは毎分組み立てワイヤー/パスツール ピペット チップ インキュベートします。
- パスツール ピペット先端から線を削除、5 mL の 1x PBS で洗浄、目視検査まで 15 mL 管内 1x PBS で 2-6 ° C で暗闇の中で保存します。
メモ: 一部の機能は、細胞を傷つけることを避けるために 1 × PBS で常に水没する必要があります。
3. ワイヤ上のセルを数える
注: 常に、細胞を傷つけることを避けるために 1x PBS で冠水した線の機能の一部です。
- ガラス スライドに四角形の領域を描画し、1 × PBS を 500 μ l 添加グリース ペンを使用します。
- ワイヤーの非機能的な部分を曲げるし、1 × PBS に没頭して、一部の機能、スライド ガラスの上に置きます。
注: フィット 1x PBS ワイヤの一部の機能を完全にカバーするための四角形の面積および体積。スライドにワイヤーの非機能の一部をマウントするのにには、両面粘着テープを使用します。 - キャプチャした細胞 (図 2 b と 2 階) を列挙するワイヤーの両側を目視で確認します。
注: 細胞の存在は、DAPI の FITC フィルターを搭載した蛍光顕微鏡を使用して決定されます。ワイヤーの両側を検査し、細胞数が (高い細胞数) を評価またはカウント (細胞の低い数字は、ワイヤに接続されている場合のみ可能)。セルの列挙が必要ない場合、この手順をスキップできます。 - スキャンした後、1 × PBS を含む 15 の mL の管にワイヤを配置 (2.3.6 の注を参照してください。 セクション 3。)、暗闇の中でワイヤーを格納。
注: ワイヤーの非機能的な部分のほとんどは (曲げを含む) をカットすることができます、緩和ストレージを削除します。
4. 剥離と標的細胞の回復
注: 細胞の剥離は 4 h 以内分離後行うものとします。
- 1x PBS の mL あたりリリース バッファー コンポーネント (テーブルの材料および試薬) 4 mg を溶解し、0.2 μ m の滅菌フィルターをすぐに使用できるバッファーを取得するを介してソリューションをフィルターします。
注: ワイヤーのポリマーは、EpCAM 提示ターゲット細胞へのバインドを許可するアンチ EpCAM 抗体修飾とは、ゲルで構成されます。リリースのバッファーには、ヒドロゲルを割断できる炭素-酸素タンパク分解酵素が含まれています。蛋白質分解開裂は、ポリマーの劣化と、したがって、キャプチャされた細胞の剥離の結果します。 - 前 5 分の 37 ° C でリリース バッファーを温めます。
- 1.6 mL の 1.5 mL の反応管に合わせてリリース バッファーを追加します。
注: チューブ 1.5 mL 反応ボリューム用に設計された 1.6 ml 水没ワイヤの一部の機能に必要なアプリケーションができます。 - 20 分は、風呂の水で培養時の汚染を避けるために 1.5 mL チューブにワイヤーを固定するチューブ キャップの代わりにワイヤーを付属のゴムキャップを使用は、37 ° c (水浴) リリース バッファー ワイヤの一部の機能を孵化させなさい。
- ワイヤー ・ チューブ アセンブリを RT と 500 rpm で 15 分間のシェーカーに転送します。
注: シェーカーは、1.5 mm の軌道です。 - 遠心分離機のワイヤー/チューブ アセンブリを置き、300 × g 10 分間でスピンします。
- チューブから線を削除、キャップを閉めて、300 × g 10 分間でもう一度チューブを遠心分離します。
注: ワイヤーは 2 〜 6 ° C で 1 × PBS で剥離効率/チェック ワイヤで残りのセルを評価するセルをカウントするため暗闇の中で格納できます。 - 細胞懸濁液の量を減らすためには、100 μ (マイクロ)、または上澄みの代わりに 300 μ L (cytocentrifugation およびその後のレーザー顕微解剖) を削除し、すぐに単一セルのサンプリングに進みます。
5. 単一セル サンプリング
- マイクロマニピュレーション
注: セル換散マスター ミックスできる WGA の 2 μ L に単一セルが加わります。処理は、ピペッティングおよび場所のセル換散のマスターの組合せ氷の上による損失のための余分なボリュームを計算するセルの数によるとマスター ミックスを準備します。- Czyżら18で概説されたプロトコルに従ってセル換散マスター ミックス (WGA キット、材料テーブルおよび試薬のコンポーネント) を準備します。簡単に言えば、2.0 μ L の反応バッファー、octylphenoxypolyethoxyethanol (10% 溶液) の 1.3 μ L、4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) の 1.3 μ L をミックス フェニル - ポリエチレング リコール (10% 溶液)、プロテイナーゼ K 溶液の 2.6 μ L と 12.8 μ L を取得する水の RNase/DNase 自由、10 個のサンプル (容量 20 μ L) のためのマスターの組合せ。
注: より多くのサンプルのために、ボリュームをそれに応じて増やします。セル換散のマスター ミックスの組成 (5.2 を参照)。 レーザー顕微解剖サンプルを活用した代替の手順で使用されるものとは異なります。 - グリース ペンを使用して、場所に細胞懸濁液を保持領域を描きます。細胞密度が高すぎる場合、領域およびボリュームを調整 (すなわち。 スライド ガラスに大きな領域をマークすると、1 × PBS そして細胞懸濁液の因数を読み込む)。
- ピペットのスライド ガラスの上に全体のステンド グラス セル中断 (4.8 のステップで取得)。
- マイクロマニピュレーターを搭載した顕微鏡スライド ガラスに転送します。セル 5 分 (図 2 D 、2 H) のために解決しなさい
- 0.2 mL PCR チューブのセル換散マスター 2.0 μ L を搭載 (5.1.1 の手順を参照してください)。 をミックスし、氷の上保存を準備します。
- 1 μ L のマニピュレーターを使用して 1 × PBS で単一細胞を収集し、セル換散のマスターの組合せを含んでいる管にセルを転送します。
注: セル換散バッファーに micromanipulated セルを転送するためには、溶解溶液 2 μ L キャピラリーを直接に、泡を見ることができるまでを取り出します。 - 2000 x g 3 のサンプルを簡単にスピン s デスクトップおよび microfuge を使用して管の下部にすべての液体を収集します。氷の上にサンプルを配置します。
- 単一セルの WGA に直接進む (セクション 6 を参照してくださいと Czyżら。19)。
- Czyżら18で概説されたプロトコルに従ってセル換散マスター ミックス (WGA キット、材料テーブルおよび試薬のコンポーネント) を準備します。簡単に言えば、2.0 μ L の反応バッファー、octylphenoxypolyethoxyethanol (10% 溶液) の 1.3 μ L、4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) の 1.3 μ L をミックス フェニル - ポリエチレング リコール (10% 溶液)、プロテイナーゼ K 溶液の 2.6 μ L と 12.8 μ L を取得する水の RNase/DNase 自由、10 個のサンプル (容量 20 μ L) のためのマスターの組合せ。
- レーザーマイクロダイ セクション (代替の単一細胞採取方法として: 5.1。マイクロマニピュレーション)
注: このセクションで使用されるマスター ミックスの組成マイクロマニピュレーション用セクション 5.1 で使用されるものとは異なります。単一のセルは、WGA のセル換散のマスターの組合せ (WGA キット、材料テーブルおよび試薬のコンポーネント) の 4.5 μ L に追加が。- Czyżらによるとセル換散のマスター ミックスを調製します。1.3 μ 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)、octylphenoxypolyethoxyethanol (10% 溶液) の 1.3 μ L 反応バッファーの 5.0 μ L を混合することによって19フェニル - ポリエチレング リコール (10% 溶液)、それぞれ、プロテイナーゼ K 溶液の 2.6 μ L、RNase の 34.8 μ L/10 個のサンプル (総容積 45 μ L) のマスター ミックスを取得する DNase 自由な水。氷の上のマスターの組合せの場所。
注: より多くのサンプルのために、ボリュームをそれに応じて増やします。 - UV 治療膜コーティング スライドは、レーザ切断に適しています。したがって、リンカー デバイス クロス DNA にスライドを配置し、約 10 分のための最高の紫外線に公開します。
- 収集と cytospin 300 x gで 5 分で全体の細胞懸濁液の膜コーティング スライドを組み立てます。
注: セルがソリューションでは、スライド上に cytocentrifuged 液中システムを使用して、cytocentrifugation 後、上清を除去、1140 × gで 1 分でドライ スピンを適用されます。 - レーザーマイクロダイ セクションまたは一晩風乾、凍結、長期的な保存のための-20 ° C で cytospins に直接進みます。
- 0.2 mL PCR チューブのキャップにセル換散のマスター ミックスの 4.5 μ L をピペット、レーザ切断による単一細胞を収穫します。
- レーザー顕微解剖顕微鏡から PCR チューブを取得し、チューブを閉じます。ショート スピン チューブの下部にすべての液体を収集し、氷の上、サンプルを配置します。
- 単一セルの WGA を続行またはさらに処理する前に 1 ヶ月-80 ° C で分離のサンプルを格納します。
- Czyżらによるとセル換散のマスター ミックスを調製します。1.3 μ 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)、octylphenoxypolyethoxyethanol (10% 溶液) の 1.3 μ L 反応バッファーの 5.0 μ L を混合することによって19フェニル - ポリエチレング リコール (10% 溶液)、それぞれ、プロテイナーゼ K 溶液の 2.6 μ L、RNase の 34.8 μ L/10 個のサンプル (総容積 45 μ L) のマスター ミックスを取得する DNase 自由な水。氷の上のマスターの組合せの場所。
6. アダプター リンカーによる全ゲノム増幅18,19
注: すべての必要なマスター ミックス (WGA キット、材料テーブルおよび試薬のコンポーネント) が調製し、氷を使用する準備ができてに格納されていることを確認します。マスターのミックスは、micromanipulated の DNA 消化ミックス 1 (5.1 を参照). サンプル (2.0 μ L 反応バッファーのMseの 2.0 μ L を含む私制限の酵素そして RNase/DNase 自由水の 16.0 μ L) または DNA 消化ミックス レーザー顕微解剖用 2 (5.2 を参照)。サンプル ( Mseの 2.5 μ L を含む私制限の酵素そして RNase/DNase 自由水の 2.5 μ L)、熱処理済みマスター ミックス (反作用バッファーの 5.0 μ L、preannealing PCR アダプターのそれぞれの 5.0 μ L と RNase/DNase 自由水の 15.0 μ L 含む)、結紮術マスター ミックス (仮焼成を PCR アダプター、10.0 μ L のアデノシン三リン酸のソリューション、および 10.0 μ L T4 リガーゼ ソリューションの 30.0 μ L を含む) と主な PCR マスター ミックス (PCR バッファー、20.0 μ 10 mM deoxynucleotide ミックス ソリューション、ポリメラーゼの 10.0 μ L の含む 30.0 μ Lミックスと RNase/DNase 自由水の 340.0 μ L)。すべてのボリュームは、10 個のサンプルを準備するため与えられています。それに応じて調整するサンプルの数。
- セル換散のためサーマルサイクラーに micromanipulated/レーザー顕微解剖サンプルを配置し、65 ° C で 30 分間、80 ° C, 10 分の 45 分間の 42 ° C で細胞を培養して単一セル換散を実行します。
注: は、温水のふた付きサーマルサイクラーを使用します。セル換散は 10 に 15 h の O/N を行うことができます。その場合、65 ° c. で孵化手順を省略します。 - 事前アニーリング PCR アダプターの実行します。したがって、さらに 49 サイクル、1 分ごとに、続く 1 分の 65 ° C で熱 cycler で焼鈍前のマスターの組合せをインキュベート徐々 に 1 ° c 温度の低下とともに/サイクルします。(15 ° C) で 50 サイクル後さらに使用するまで 15 の ° c のマスターの組合せを孵化させなさい。
注: この手順は非対称アダプター結紮に適して生成に必要な (ステップ 6.6 を参照してください). 単一細胞の DNA とを受けるMse私制限のダイジェスト。 - 3 2000 x gで分離サンプル スピンダウン セル換散後 s を下部にすべての液体を収集し、氷の上に置きます。
- DNA を断片化するには、各分離 micromanipulated サンプルに 2 μ L の DNA 消化ミックス 1 を追加または 0.5 μ L の DNA 消化レーザー顕微解剖サンプル 2 をミックスし、制限のダイジェストを実行します。37 ° C で加熱されたふた付け 5 分間続き、65 ° c 5 分制限の酵素不活性化ステップのサーマルサイクラーを使用します。
注: 37 ° C で消化が 3 h に延長されます。これはマイクロマニピュレーションから得られたサンプルとレーザー顕微解剖から得られた試料の異なるプロトコル手順のみです。 - スピン ・ ダウン下部のすべての液体を収集し、氷の上のサンプル。
- 結紮術マスターの 5.0 μ L を追加制限消化 DNA および仮焼成をアダプターを縛ることの各消化の DNA サンプルを混合し、1 h 15 ° C で熱 cycler で縛る。
注: この手順 12 h に拡張することができますまたは O/n. を実行 - スピン ・ ダウン下部のすべての液体を収集し、氷の上のサンプル。
- WGA の結紮製品のそれぞれに主な PCR マスター ミックスの 40.0 μ L を追加次: 最初として温水ふた付きサーマルサイクラーで WGA を実行、68 ° C、3 分でサンプルをインキュベートします。40 94 ° C で 15 回のサイクルの第二に、s、57 ° C、30 秒、1 分 30 の +1 秒/サイクルの 68 の ° C。40 94 ° C で 9 サイクルを追加 s、57 + 1 ° C 30 サイクル/秒、1 分 45 の +1 秒/サイクル 68 ° C。その後、23 回 40 94 ° C でのサイクル s、65 ° C、30 s、68 ° C、1 分 53 の +1 秒/サイクル。最後に、3 分 40 秒の 68 ° C で最終的な拡張を実行し、4 ° C にサンプルを冷やす
- 下部のすべての液体を収集および DNA の品質をチェックまたは-20 ° C または長期保存用-80 ° C でサンプルを格納するサンプルをスピンダウンします。
7. WGA 製品の品質の管理
注: 4 plex QC PCR 5を実行した後 DNA スミアと増幅製品数の範囲に基づいて WGA 製品の品質を確認してください。評価の 1.0% の agarose のゲルに WGA 因数とそれぞれ QC PCR サンプルを実行します。
- 4 plex 品質コントロール PCR (表 1) に使用されるすべてのプライマーの 100 μ M 溶液を準備します。136.0 μ L の PCR 用プライマー プール 200 μ L を生成する水にすべてのプライマーの 8 μ L を追加します。渦 3 ソリューション s、3 s と因数 20 μ-20 ° C で保存用の 2000 x gでスピンダウン
- マルチプレックス PCR マスターを準備する使用標準 PCR キット含む 6.0 μ (プライマー) を除く 2 x PCR コンポーネント、PCR グレード水 4.5 μ およびプライマー プールの 0.5 μ L を混ぜます。
- WGA 物 1.0 μ L を追加、それをスピンダウン、94 ° C、2 分で実行 PCR 後変性 94 ° C で 1 分、プライマーアニー リングの 56 ° C、1 分と 1 分 30 秒 72 ° C でプライマー拡張で最終的な拡張ステップの 35 サイクル4 ° C にそれを冷やす 72 ° c で 7 分間、それをスピンダウンし、同日のゲルの分析や後の分析のための-20 ° C で氷の上サンプルを配置します。
注: 熱 cycler の低温は、熱電変換素子の寿命を増加する 12 の ° C で実行できます。 - (6.8 から取得) WGA 製品および agarose ゲル5にそれぞれ 4 plex QC PCR の製品を分析します。
Representative Results
CFSE と核酸染色後の細胞は、DAPI の FITC フィルター搭載蛍光顕微鏡を用いた評価できます。細胞の細胞質を示す (図 2 aと2 e) 異種のセル間強度と CFSE と制服ラベルに対し核を DAPI チャネルで明るい対比染色と提示します。似た形や強度を染色がワイヤ (図 2 bと2 f) に接続されているセルからの期待と同様ワイヤーを切り離す、スライド (図 2 Dと2 H) の回復します。
高細胞密度 (例えば> 1 000 000 細胞/ml) ワイヤーを充電時細胞とワイヤの全体をカバーになります。しかし、細胞の密度を低く、インキュベーション中に回転速度の変化と別の細胞ラインの使用の分離効率に影響を与える個別にテストする必要があります。ときワイヤー培養 5 ml 100 000 で HT 29 セルのセル/セクション 2.1 で説明として mL。、254 ± 103 セルの平均値 (n = 5) ワイヤで捕えられました。同じ平均 440 ± 319 細胞 LNCaP 細胞を用いた実験 (n = 5) ワイヤあたりが得られました。
75 ± 18 セル、25 ± 9 セル、および 47 ± 57 細胞の捕獲で起因した提示 (プロトコル セクション 2.2) によるとワイヤーに末梢血 5 mL のバック グラウンドで 500、5 000、50 000 の HT 29 細胞 (n = 3、それぞれ)、それぞれ。ワイヤーはセクション 2.3 でプロトコルに従って細胞懸濁液 (1 000 000 細胞/mL) の 15 μ L と満たされるかどうか。、1 000 (HT 29) まで細胞をワイヤーに添付可能性があります。
HT 29 セルで 81% であった剥離効率を細胞 (54.9% 93.2%、および n の範囲 = 5) 81% (63.51%-92.87%、n の範囲 = 6) と 91% (84.7%-95.3%、n の範囲 = 6) VCaP と LNCaP 細胞それぞれ。同様に、剥離細胞の回復は違い細胞: 戸建 HT 29 セルの 28% の平均が cytocentrifugation によって回復されました。LNCaP の回収率は 10% よりも低い、VCaP セルの平均回収率 55% であった。
単一細胞の約 75% が収量高品質 WGA WGA を受ける: これは 1) 0.1 から > 1 kb (図 4、上部パネル)、2) 3 まで WGA 製品の汚れまたは 4 plex 品質の 4 バンド コントロール PCR (図 4下のパネル).WGA 製品の 1) アレイ CGH 後再増幅 WGA 7単一セル配列 CGH プロファイル6,7と 2) ターゲットを絞った NGS の品質基準を満たすプロファイルを使用できます。
図 1: 分離および単一細胞解析のための標的細胞を回復するためのワークフロー 。(A) 90% の confluency に培養される細胞および(B)単一細胞懸濁液を取得する収穫します。CFSE と核酸染色、 (C)官能のワイヤを染色後は 5 mL の反応管を使用してのボリューム、パスツール ピペット チップを使用して少量の細胞の存在下で培養しました。後者は、細胞懸濁液ボリュームのアプリケーション 15 μ L と低(D)セルは充電後 4 時間以内にデタッチする必要があります。したがって、ワイヤは、1.5 mL の反作用の管をリリース バッファーでいっぱいに配置されます。ロッカーで 10 分遠心 15 分後、ワイヤが削除され、セルをペレットに細胞懸濁液を遠心しました。(E)回復済みセルがどちらか単一セル マイクロマニピュレーション (上) または cytocentrifuged 膜コーティング スライドにスライド ガラスに転送され、レーザーマイクロダイ セクション (下部) に転送されます。(F)最後に、収穫の単一セルは、全ゲノムの拡大 (WGA) によって増幅されます。WGA の製品は、アレイ CGH と NGS 下流解析と互換性が。EpCAM エピトープ: 細胞表面に緑色の円。ワイヤーを官能基化: 灰色のトリプル ヘリカル ワイヤ デバイス。ポリマー: 紫のライン。アンチ EpCAM 抗体: オレンジ。解放バッファー活動: 赤い矢印。代わりに細胞懸濁液を保持するグリース マーカー: 暗い青色の楕円。細胞懸濁液を回復: 水色します。マイクロマニピュレーション用キャピラリー: 黒のライン。倍率: マイクロマニピュレーションにより収穫された回復されたセル、膜で覆われた上 cytospin 回復を含んでいるセル (灰色塗りつぶし楕円) をスライドさせます。倍率: 回復されたセルがされている microdissected のレーザー (灰色の円の線: レーザ切断のためのバックボーンとして膜スライドから膜)、レーザー (膜スライドを下から近づいて青線) を用いた客観的。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ラベル付きセルの視覚化します。(A ・ E)充電する前にセル: セルを付けられて CFSE して染料 CFSE 範囲 (緑) の信号強度を示す間をインターカ レート DNA と counterstained。(B、F)ワイヤーでキャプチャされた細胞。(C、G)細胞の剥離処理後に配線します。(D,H)セル ワイヤから切断し、スライドに cytocentrifugation によって回復します。CFSE: FITC チャンネル (グリーン)。DNA 染色: DAPI チャネル (青)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ワイヤーおよびストレージコン パートメント。(A)電線のコンパートメント。(B)機能部分のディテール。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: WGA 製品の品質管理は、単一の micromanipulated 細胞から得られた。上部パネル: 単一細胞から得られた WGA 製品通常 DNA の結果塗抹 0.5 kb のまわりでピーク強度と > 1.0 kb 0.2 kb に至る。サンプル数 1、7、13 (アスタリスクで示される) 最適ではない表示または DNA を塗りません。底板: WGA 製品が十分な品質の 3 つまたは 4 つの PCR の製品の 4 4 plex PCR が得られます (100、200、300、400 で bp)。1、7、10、および 13 のサンプルより少ない 3 つのバンドを表示、さらに分析から除外されます。レーン M 100 bp ラダーを含み、アスタリスクが不十分な WGA 製品品質のサンプルを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| プライマー シーケンス | メモ |
| 5 ' gtt cca ata tga ttc cac cc-3 ' | 100 bp 前方プライマー |
| 5 '-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3 ' | 100 bp 逆プライマー |
| 5 ' agg tgg agc ギャグ gct agc-3 ' | 200 bp 前方プライマー |
| 5 ' ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3 ' | 200 bp 逆プライマー |
| 5 ' agg tga gac att ctt gct gg-3 ' | 300 bp 前方プライマー |
| 5 ' tcc 法 aac cag tca gcg tc-3 ' | 300 bp 逆プライマー |
| 5 '-aca gtc 猫 gcc atc 法 gc-3 ' | 400 bp 前方プライマー |
| 5 ' gct tga caa agt ggt cgt tg-3 ' | 400 bp 逆プライマー |
4 plex 品質コントロール PCR のプライマー シーケンスを表 1:
Discussion
記述されていたプロトコルは前のヴィヴォ単一細胞のゲノム解析の機能性ワイヤ (デバイスと呼ばれる) からのセルの取得を目指しています。3 EpCAM 陽性細胞 (HT 29、LNCaP, と VCaP) をテストしました、EpCAM を表現する任意のセルの行には、原則としてこの方法を適用できます。EpCAM 肯定的な標的細胞を純粋な細胞懸濁液としてデバイスに表示できる (2.1 を参照してください). または背景セルの黒字に混合 (e.g。 末梢血, 2.2 を参照してください。)。特に後者を使用する珍しいセル条件下で分離能力を試験するのに対し、ワイヤーに接続されているセルの数の微調整を行うことが記載されている低ボリュームを使用してアプローチ (2.3 を参照してください).。細胞ライン間の相違が予想されるとおり、ワイヤー、回転を充電するための適切なセル密度速度同様インキュベーション時間は蛍光顕微鏡を使用して接続されているセルの数を評価することによって実験的にテストする必要があります。
WGA の単一細胞レベルでゲノム下位アプリケーションが必要です。WGA の選択の方法は、ラボによって異なるかもしれませんが、原則として、本手法はマイクロマニピュレーションやレーザー顕微解剖から得られたサンプルを処理できるよりもすべてのメソッドにオープン。このプロトコルでは熱の断片化による WGA7と比較してパフォーマンスを向上させるための酵素によって断片化された DNA に基づくメソッドを使います。省略可能な単一セルは、20,21以降 DNA を許可する等温 WGA に転送できます。
記述されていたプロトコルは、ゲノムの単一細胞解析の機能ワイヤの新しい世代にアタッチした後はそのままなセルの回復を目指しています。これまでのところ市場で生体内で唯一の CE 承認された濃縮デバイスを表し、官能のワイヤの最初の世代は、転移がん患者で Ctc を列挙するために使用されました。以前の出版物および私達の自身のデータは、現在のゴールド スタンダード技術2と比較してより敏感であるため生体内で分離手法を提案します。したがって、単一細胞レベルでの解析と高 CTC 復旧を組み合わせることにより、デバイスで実現、この生体内で分離手法では回復機能を装備します。
しかし、患者で使用するため、デバイスは消去されません、したがって、臨床データはご利用いただけません。前のヴィヴォアプリケーション (すなわちサンプリング後の末梢血から Ctc を分離する) 技術の設定肘無駄、例えば低直径無駄 (増加の確率の存在に適応としては推奨されませんCtc とキャッチ抗体間の接触を直接) と長い保持時間 (30 分) 2-3 L 血のワイヤーを渡すことができます。しかしで説明セクション 2.2。標的細胞の混合サンプル7から分離も可能です。
メソッドの現在の制限は、電線から剥離後未固定細胞の非効率的なリカバリです。これはしかし、セル固定が剥離治療前に一歩改善可能性があります。
要約すると、このプロトコルは遺伝的単一細胞を特徴付けるための細胞回復と生体内での分離法の併用への第一歩です。一層の努力は、細胞回復、患者1,2への応用にクリアランスの最適化に対処する必要があります。しかし、治療のモニタリングと治療の決定のための個別化医療は Ctc の列挙体外です。したがって、このメソッドは、単一セルのレベルでゲノムの CTC 特性への第一歩です。
単一細胞のトランスクリプトーム解析に向けてのアプリケーションはようそのままなセルを収穫可能。ただし、それは復元の手順 RNA 整合性 (例えば転送直接溶解 Rt-qpcr22続いて回復された単一セル) の影響があるかどうか評価する残ります。成功した場合は、トランスクリプトームのレベルより詳細な解析を可能に単一細胞 (Ctcなど) の特性を移すことができます。この点、RNA シーケンス (RNA シーケンス ライブラリの準備時に得られた) preamplified cDNA を量的な PCR に受けることができます、単一細胞の RNA 下流解析の貴重なツールを提供しますスマート seq2 を使用します。これは、結合されたターゲットと回復した単細胞22,23のスクリーニングに基づく解析が許可されます。
現在の機能性線は Ctc24の肯定的な選択のために広く使用されている上皮性マーカーである抗 EpCAM 抗体に基づいています。いくつか Ctc では、レセプター サイトケラチンなど EpCAM25上皮系マーカーを可能性があります、HER2/新しいなどの抗体を追加で CTC 分離のチャンスを高めるでしょう。いくつかの抗体と濃縮戦略開発・ フェレイラらによって検討しました。201626。ワイヤに固定化した抗体の混合物より高い番号の分離と Ctc のサブタイプにつながる技術の将来の改善可能性があります。
ワイヤは、その機能を維持するために溶液中浸漬ワイヤの一部の機能を維持する処理を含むすべての手順は必須です。1x PBS で評価 (顕微鏡; 中にワイヤを配置するをお勧めします例えば。 3.1 の手順。-3.3.)そして記憶。不適切な染色を避けるために、手順 1.2.1 で染色液を準備たてを使用をお勧めします。1.2.2 と。弱陽性細胞細胞を頼りにワイヤーを妨げるし、接続されたセルの過小評価につながる可能性があります。
細胞懸濁液 (手順 2.3.4。) の後続の読み込みをパスツール ピペットでワイヤーを挿入するときにゴム製のキャップをパスツール ピペットを差し込むことは避けるべきです。ゴム製のキャップは、パスツール ピペットの先端内部機能の一部にあるので、場所にワイヤーを保持するために使用されます。キャップは、パスツール ピペットの後部にもしっかりと接続されている場合、細胞懸濁液の読み込みは不可能です。この場合、読み込まれた細胞懸濁液によって転置される空気は、ピペットを残すことができますようにキャップを緩和します。
ワイヤーを曲げは、3.2 の手順を数えるセル中にその方向に不可欠です。3.3。ワイヤーの非機能的な一端を 1 つの側面に嘘をつくような粘着テープを使用してワイヤーをマウントします。一部の機能の全体の長さをスキャンした後、ワイヤーは機能ワイヤの他の半分をスキャンすることができますので 180 ° がロールバックされます。この手順は、ワイヤ上のセルの数を評価する最初の実験のために重要です。セルをカウントせずに手順を繰り返すことができます特定の細胞およびプロシージャのための細胞の数が評価されると (e.g。 だけ細胞の存在を確認し、この手順を省略)。注意ピペッティング ステップ 4.8 の上澄みの量を減らすとき、セル損失を避けるために重要です。ペレットに乱れを発生させることがなくスムーズに行われ、ピペッティングを確認します。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究は、オーストリア科学基金 (FWF)、プロジェクト no によって賄われていた。私は ERANET プロジェクト並進癌研究 (TRANSCAN)「前立腺がん (CTC スキャン) 微小残存病変に対するバイオ マーカーとして循環腫瘍細胞」の一部として (の ps) に 1220 B19。博士後期課程サウスカロライナは、グラーツ医科大学の PhD プログラム分子医学の枠内で訓練されました。著者感謝して、専門的な技術支援のニーナ反応における触媒表面、ダニエル ・ クンマー、ガビ Wendt、クラウディア Chudak、ジュリア シュルツ、ヨハンナ ・ シラーを認めます。著者はゲオルク ・ Peinhaupt のグラフィック デザイン サポートをありがちましょう。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gilupi Release Buffer | Gilupi | GIL083 | Used to detach cells from the wire |
| McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 16600-082 | Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | PAA | S11-001 | Supplement for McCoy's 5A Medium |
| Foetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Biowest | L0018-100 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Phosphate Buffered Saline (1x PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-015 | |
| Accutase | Biowest | L0950-100 | Cell detachment solution (cell culture) |
| Water bath | GFL | Type 1003 | Used for prewarming solutions |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Used to incubate cells (cell culture) | |
| 50 mL reaction tubes | VWR | 525-0403 | |
| Roller mixer | Stuart Scientific | SRT6D | Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34554 | Used to label living cells (cytoplasmic label) |
| Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Scientific | Used to stain DNA (nucleic counterstain) |
| Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Megafuge 40R | Used for pelleting cells |
| Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) | Carl Zeiss Microimaging | Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter) | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Used for coating glass/plastic surfaces |
| MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | Used for vortexing |
| Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes | BD | 366450 (or 366480) | Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells |
| Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R) |
| Syringe needles (G20) | VWR | 613-0554 | Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it |
| Neubauer chamber | Roth | T729.1 | Used to count cells |
| Pasteur pipettes 150 mm | Volac | D810 | Used for the low-volume application of cells to the C&R |
| Grease pen | Dako | S2002 | Used on glass slides to hold cell suspension in place |
| Steril syringe filter (0.2 µm) | Corning | 431219 | For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer |
| Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | Used for agitation during cell detachment |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 30,125,150 | |
| Ampli1 WGA Kit | Silicon Biosystems | To be ordered via Silicon Biosystems | |
| Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Use micromanipulation at hand | |
| Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Used for micromanipulating cells |
| 0.2 mL PCR tubes | Biozym | 710920 | |
| Cytocentrifuge and equippment | Hettich | Universal 32 | Use cytocentrifuge at hand |
| Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | Every thermo cycler with heated lid can be used |
| Microcentrifuge | Roth | CX73.1 | Use desk-top centrifuge at hand |
| MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Membrane-coated glass slides used for laser microdissection |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | Use DNA cross linker at hand |
| Standard PCR reagents | |||
| 6x DNA Loading | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Use gel loading dye at hand |
| DNA ladder | BioLabs | N0551G | Use 100 bp ladder at hand |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Gel electorphoresis station | Bio-Rad | Use electrophoresis system at hand | |
| Gel Red Nucleic Acid Stain | Biotium | 41003 | Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels |
References
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