Summary
Denne protokollen er å komme seg og forberede sjeldne målcellene fra en blanding med ikke-mål bakgrunn celler for molekylær genetisk karakterisering på encellede nivå. DNA kvalitet er ikke behandlet enkeltceller og tillater encellede program (begge screening basert og målrettet analyse).
Abstract
Sjeldne målcellene kan isoleres fra en høy bakgrunn av ikke-målet celler ved hjelp av antistoffer spesifikke for overflate proteiner av målcellene. En nylig utviklet metoden bruker en medisinsk wire functionalized med anti-epitelial celle vedheft molekyl (EpCAM) antistoffer i vivo isolering av sirkulerende tumor celler (CTCs)1. En pasient-matchet kohort i ikke-metastatisk prostatakreft viste at i vivo isolasjon teknikken resulterte i en høyere prosentandel av pasienter positiv for CTCs samt høyere CTC teller i forhold til gjeldende gullstandarden i CTC opplisting. Som cellene kan gjenopprettes fra gjeldende medisinsk utstyr, ble en ny functionalized wire (referert til som enhet) produsert slik at fangst og påfølgende avdeling av celler av enzymatisk behandling. Cellene kan feste til enheten, visualisert på et mikroskop og frittliggende bruke enzymatisk behandling. Gjenopprettede celler er cytocentrifuged på membran-belagt lysbilder og høstet individuelt ved hjelp av laser microdissection eller micromanipulation. Encellede prøver er så utsatt for encellede hele genomet forsterkning tillater flere nedstrøms analyse inkludert sortering og mål-spesifikke tilnærminger. Prosedyren for isolasjon og gjenoppretting gir høy kvalitet DNA fra enkeltceller og svekke ikke påfølgende hele genomet forsterkning (WGA). En enkeltcelle forsterket DNA kan videresendes til screening og/eller målrettet analyse som matrise sammenlignende genomet hybridisering (matrise-CGH) eller sekvenser. Enheten kan ex vivo isolasjon fra kunstig sjeldne celle prøver (i.e. 500 målcellene piggete i 5 mL av perifert blod). Mens avdeling celler er akseptabel (50-90%), utvinningsgrad på frittstående celler på lysbilder spenner over en rekke som er avhengige av cellen linjen brukes (< 10 - > 50%) og trenger litt mer oppmerksomhet. Denne enheten er ikke fjernet for bruk i pasienter.
Introduction
Nylig ble CellCollector DC01, en medisinsk wire functionalized med anti-EpCAM antistoffer for å isolere CTCs fra perifert blod av pasienter, lagt til metodisk spekteret av CTC opplisting1,2,3 . I en pågående studie i ikke-metastatisk prostatakreft, denne functionalized wire rapporter nesten dobbelt så mange pasienter skal CTC-positive og høyere CTC teller i CTC-positive pasienter i forhold til CellSearch, gullstandarden i CTC opplisting3 . På grunn av denne oppmuntrende ytelse, isolering av celler fra en functionalized medisinske wire for én celle analyse ville være ønskelig, men verken enzymatisk behandling med cellen avdeling løsninger (f.eks trypsin) eller laser microdissection tillater utvinning av intakt celler (data ikke vist).
Hvis brøkdel av fanget celler, var en ny generasjon functionalized ledninger utstyrt med en bestemt polymer. Dette polymer, som forbinder fange antistoffer til ledningen, er utsatt for utgivelsen buffer behandling slik at avdeling av intakt celler (CellCollector DC03 referert til som enhet). Nye functionalized enheten lar isolering av målcellene fra ulike konsentrasjoner av cellen linje kreftceller piggete i bovin serum albumin (BSA) / fosfat bufret saltvann (PBS) og perifert blod, henholdsvis.
For å lette visuell gjenkjenning av celler på enheten og etter utvinning, målet kreftceller er merket med carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) og en DNA flekk før utvinne behandling (dvs. lading og frakobling). Behandlings effekter på DNA kvaliteten på enkeltceller ble tidligere vurdert etter WGA ved hjelp av en kvalitetskontroll PCR4,5, matrise-CGH6,7 og målrettet sekvensering7 viser ingen forskjell sammenlignet med ikke-behandlet celler micromanipulated celle suspensjoner7. Fordelen med denne metoden ligger i kombinasjonen av sjeldne målcellen pre berikelse og utvinning av celler i én celle nedstrøms analyse (figur 1). Gjeldende CE-merket i vivo samlingen enheten brukes vanligvis for opplisting av CTCs i stedet for én celle molekylær karakterisering2,8. Men mer omfattende analyse å undersøke heterogenitet blant CTCs etter analyse på enkeltcelle nivå (i.e. målrettet sekvensering på encellede nivå). Andre cellebasert metoder er basert på immunomagnetic isolasjon av EpCAM-positive CTCs og encellede håndtering basert på dielectrophoresis for påfølgende molekylær genetisk analyse9,10. Molekylær karakterisering av CTCs er en viktig forutsetning for gjennomføring deres nyttig i en klinisk setting og er like viktig i grunnleggende forskning av metastatisk kaskade. Parallelt med CTCs, har sirkulerende svulst DNA (ctDNA) blitt av stor betydning da DNA-analyse av tumor byrden med minimal teknisk isolasjon prosedyrer11,12. Cellen basert tilnærminger kan tjene som et supplerende bidrag som gjør det mulig for RNA13,14 og protein15 uttrykk analyse og også for CTC avledet celle kulturer eller xenografts16, 17. selv om hindringer som lav celle utvinning og klarering for bruk i pasienter fremdeles må overvinnes, Fang og slipp metoden tar et viktig neste skritt mot karakteristikk av sjeldne målcellene.
Protocol
Alle prosedyrer er godkjent av den etiske komiteen av medisinske universitet av Graz (25-240 ex 12/13). Perifert blod for skyter eksperimenter samplede fra friske individer.
Merk: Denne protokollen beskriver isolasjon HT-29 celler (human kolon kreft cellen linje) fra PBS eller kunstig blandinger av HT-29 celler og perifert blod. Samme eksperiment ble utført med to ekstra cellelinjer (LNCaP og VCaP, eksperimentelle data i representant resultater), og kan teoretisk utføres med alle celler uttrykke EpCAM.
1. utarbeidelse av målcellene
- Cellekultur og merking av celler
Merk: I denne protokollen kultivert celler i 75 cm ² kultur flasker. Juster mengden reagenser tilsvarende hvis andre celle kultur enheter brukes (f.eks 25 cm ² kultur retter, 6-og plater, etc.). Alle væsker brukes varmet pre 37 ° c i et vannbad. Hvis ikke angitt ellers, utføres alle protokollen trinnene ved romtemperatur (RT).- Kultur HT-29 celler i McCoys 5a endret Medium med 2 mM L-glutamin, 20 mM Hepes, 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin på 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære.
- Når cellene er 90% confluent, fjerner mediet og skyll cellene med 10 mL 1 x PBS.
- For å høste celler, legge 2 mL av cellen avdeling løsningen (tabell av materialer og reagenser) til cellene og ruge celler for ca 5 min på 37 ° C.
Merk: Avdeling løsningen inneholder proteolytiske og collagenolytic enzymer i 1 x PBS, 0,5 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) og 3 mg/L fenol rødt. Redusere pre oppvarming tiden av cellen avdeling løsningen til et minimum som dette blir inaktive etter 1 h på 37 ° C. Dekk hele cellen laget for å få optimal celle avdeling. - Sjekk brøkdel av celler med en invertert mikroskop.
- Overføre alle frittstående cellene til en 50 mL tube forhåndsutfylt med 10 mL av celle kultur medium (samme som brukes i trinnet 1.1.1.) og resuspend celler av pipettering.
- Plasser gjenværende celle suspensjon på en vannrett Rull mikser på RT og videre til merking trinn.
- Live celle merking av målcellene
- Fortynne 1 µL av 5 mM CFSE (inkludert i dimethyl sulfoxide, DMSO) i 1 mL 1 x PBS pre varme på 37 ° C å få 5 µM klar-å-bruke CFSE merking løsningen.
Merk: Bruk nylagde løsninger For optimal flekker resultat. - Forberede en klar-å-bruke DNA flekker løsning (tabell av materialer og reagenser) i 1 x PBS og lagre den på 2-6 ° C beskyttet mot lyset.
Merk: Bruk nylagde løsninger For optimal flekker resultat. - Få celler fra vannrett Rull blandebatteri (trinn 1.1.6.) og pellets cellene på 300 x g for 10 min. fjerne nedbryting og resuspend cellene i 10 mL 1 x PBS.
- Skyll cellene igjen med 1 x PBS og resuspend celle pellet i 500 µL klar-å-bruke CFSE merking løsning.
- Inkuber cellene på 37 ° C i 15 min og samle cellene etter sentrifugering 300 x g i 3 minutter.
- Resuspend merket cellene i 1 mL av forvarmes celle kultur medium, og at cellene å regenerere ved 37 ° C i 30 min.
- Høste celler med sentrifugering på 300 x g for 3 min og resuspend celle pellets i 1 mL av klar-å-bruke DNA flekker løsning på 37 ° C i 10 min.
- Pellets cellene, fjerne nedbryting og resuspend cellene i 4 mL 1 x PBS. Vurdere celle tettheten ved hjelp av en hemocytometer og sjekk for fluorescens merking bruker fluorescens mikroskop utstyrt med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og fluorescein isothiocyanate (FITC) filtre (figur 2A og 2E).
- Sentrifuge cellene på 300 x g for 3 min og resuspend celle pellet ifølge celle tettheter nødvendig for respektive eksperimentet som gis i neste avsnitt og sted på is.
- Fortynne 1 µL av 5 mM CFSE (inkludert i dimethyl sulfoxide, DMSO) i 1 mL 1 x PBS pre varme på 37 ° C å få 5 µM klar-å-bruke CFSE merking løsningen.
2. ladingen ledningen
Merk: Celler kan være isolert fra målet cellen/perifere blod spikings i milliliter skala eller gir lavt antall celler i mikroliter skala. Mens tidligere tilnærmingen gir mimicking sjeldne-cellen betingelse i perifert blod, kan sistnevnte være den foretrukne måten å feste cellene for protokollen optimalisering/testing.
- Lading ledningen med store mengder celle suspensjoner
- Forberede en 2% BSA blokkerer løsning ved å løse opp 0,8 g av BSA i 40 mL 1 x PBS (celle kultur bruk). Oppløse BSA ved første vortexing og påfølgende inkubasjon på RT på en vannrett Rull mikser i 10-20 minutter.
- Skyll tom EDTA rør/natrium heparin rør med 2 mL 2% BSA fjerne antikoagulerende rester og forkaste løsningen. Blokkere tube overflaten av inkubasjon på RT med 5 mL til 2% BSA på en vannrett Rull mikser på 15 rpm i 30 min og kast løsningen.
- Fortynne merkede celler (paragraf 1.2.) til en tetthet av 100 000 celler/mL og bruke 5 mL til å lade ledningen.
- Legge til 5 mL av merket celle suspensjon (500 000 celler totalt) til røret. Unngå bobler når cellen suspensjon.
- Fjerne ledningen fra oppbevaringsrom samt gummi cap holder ledningen og skyll den i 1 x PBS (Figur 3).
- Trenge gummi rør hetten av EDTA tube (trinn 2.1.4.) ved hjelp av en sprøyte nål (20G) og sett ledningen slik at den funksjonelle delen er helt oppslukt i cellen suspensjon når hetten er tilbake på røret og røret plassert på skrå roller blandebatteri.
Merk: Den triple-spiralformede funksjonell del av bardunen bør dekkes med cellen suspensjon i ladestasjonen. - Rotere rør på en skrå roller mikser på 5 rpm i 30 minutter til at cellene å knytte til ledningen.
- Skyll ledningen med 5 mL 1 x PBS og lagre den i mørket på 2-6 ° C i en 15 mL tube som inneholder 1 x PBS til visuell undersøkelse.
Merk: Den funksjonelle delen av ledningen må alltid være neddykket i PBS å unngå skade cellene.
- Isolere målcellene fra kunstig blandinger med perifert blod (alternativ lading metoden: 2.1. Lading ledningen med store mengder celle suspensjoner)
- Fortynne merkede celler (paragraf 1.2.) for å få celle suspensjoner med høyt tetthet (> 1 000 000 celler/mL), og dermed holde volumet av cellen suspensjon lagt til perifert blod lav.
- Legge til 500 til 500 000 celler i 5 mL av perifert blod og bland dem ved å snu røret.
- Fjerne ledningen fra oppbevaringsrom, Fjern gummi cap holder ledningen og skyll den i 1 x PBS.
- Trenge en ny tube cap med ikke-fungerende del av enheten med en sprøyte nål (20G) slik at den funksjonelle delen er helt oppslukt piggete blod når hetten er tilbake på røret og røret plassert på skrå roller blandebatteri.
Merk: Den triple-spiralformede funksjonell del av bardunen bør dekkes med cellen suspensjon i ladestasjonen. - Inkuber røret på skrå roller mikseren på 5 rpm i 30 min på RT.
- Skyll ledningen 3 ganger i 1 x PBS og lagre den i mørket i en 15 mL tube som inneholder 1 x PBS til visuell undersøkelse.
Merk: Den funksjonelle delen av ledningen må alltid være neddykket for å unngå skade cellene.
- Lading ledningen fra lavt volum celle suspensjoner (alternativ lading metoden: 2.1. Lading ledningen med store mengder celle suspensjoner)
- Resuspend de merkede cellene på 1 000 000 celler/mL i 1 x PBS.
- Fikse et 150 mm disponibel glass Pasteur pipette vannrett i en reol.
- Fjerne ledningen fra oppbevaringsrom men holde den gule gummi cap holder ledningen.
- Sett ledningen i pipette slik at den functionalized delen ligger i spissen av Pasteur pipette ikke berører glasset.
Merk: Spissen av ledningen bør ikke holde ut av Pasteur pipette spissen. Unngå koble den bakre enden Pasteur pipette tips med gummi cap holder ledningen. Hvis knyttet tett, kan ikke celle suspensjoner lastes fra den andre siden i pipette spissen. - Legg 15 µL av cellen suspensjon i spissen av Pasteur pipette dekker den functionalized delen av ledningen.
- Inkuber ledningen for 10 min. manuelt kvart montert wire/Pasteur pipette spissen hvert minutt.
- Fjerne ledningen fra Pasteur pipette spissen, skyll den i 5 mL 1 x PBS og lagre den i mørket på 2-6 ° C i en 15 mL tube som inneholder 1 x PBS til visuell undersøkelse.
Merk: Den funksjonelle delen må alltid være neddykket i 1 x PBS å unngå skade cellene.
3. telle celler på ledningen
Merk: Hold alltid den funksjonelle delen av ledningen neddykket i 1 x PBS å unngå skade cellene.
- Bruk en fett til å tegne en firkant-området på et glass lysbilde og legge 500 µL av 1 x PBS.
- Bend delen fungerer ikke i ledningen og plassere den på av objektglass slik at den funksjonelle delen ligger i 1 x PBS.
Merk: Passe området rektanglet og volum av 1 x PBS til dekker den funksjonelle delen av ledningen. Bruke en double-faced teip montere delen fungerer ikke i ledningen på lysbildet. - Visuelt inspisere begge å nummerere fanget cellene (figur 2B og 2F).
Merk: Tilstedeværelsen av celler bestemmes ved hjelp av fluorescens mikroskop utstyrt med filtre for DAPI og FITC. Begge sider av ledningen kan inspiseres og antall celler vurdert (for høyt tall) eller telt (bare mulig hvis lavt antall celler er knyttet til wire). Denne steg kan hoppet hvis opplisting av celler ikke er nødvendig. - Etter skanning plassere wire tilbake i 15 mL røret som inneholder 1 x PBS (se Note av 2.3.6. og avsnitt 3.), lagre den ledningen i mørket.
Merk: De fleste av de ikke-fungerende del av bardunen kan bli kuttet (inkludert svingen) og fjernet lettelser lagring.
4. løsgjøring og utvinning av målcellene
Merk: Avdeling av cellene skal gjøres innen 4 timer etter isolasjon.
- Oppløse 4 mg av komponenten utgivelsen buffer (tabell av materialer og reagenser) per mL 1 x PBS og filtrere løsningen gjennom et 0,2 µm sterilt filter for å få klar-å-bruke bufferen.
Merk: Polymer av ledningen består av en hydrogel som er functionalized med anti-EpCAM antistoffer tillater binding til EpCAM-presentere målcellene. Bufferen som utgivelsen inneholder et karbon-oksygen proteolytisk enzym stand til å spalte i hydrogel. Proteolytisk cleavage resulterer i nedbrytning av polymer, og dermed avdeling av fanget celler. - Forvarm utgivelsen bufferen ved 37 ° C i 5 minutter.
- Legge til 1,6 mL utgivelsen buffer til å fylle en 1,5 mL reaksjon rør.
Merk: Rør designet for 1,5 mL reaksjon volumer kan bruk av 1.6 mL som er nødvendig for submerging den funksjonelle delen av ledningen. - Inkuber den funksjonelle delen av ledningen i utgivelsen bufferen på 37 ° C (vannbad) 20 min. bruke gummi cap leveres med wire i stedet for rør cap for å fikse ledningen i 1,5 mL tube å unngå forurensning under inkubasjonen i vannbad.
- Overføre wire/rør montering til en shaker RT og 500 rpm i 15 min.
Merk: Shaker har en bane av 1,5 mm. - Plasser wire/rør montering i en sentrifuge og spinn på 300 x g i 10 min.
- Fjerne ledningen fra tuben, lukker lokket og sentrifuge røret igjen på 300 x g i 10 min.
Merk: Kabelen kan lagres i 1 x PBS på 2-6 ° C i mørket celle teller å vurdere avdeling effektivitet/sjekk for cellene på ledningen. - For å redusere volumet av cellen suspensjon, fjerne nesten 100 µL (micromanipulation) eller alternativt 300 µL (cytocentrifugation og påfølgende laser microdissection) nedbryting av og gå rett encellede prøvetaking.
5. encellede prøvetaking
- Micromanipulation
Merk: Enkeltceller legges til 2 µL av cellen lysis master mix slik at WGA. Klargjør master blandingen av antall celler å bli behandlet, beregne ekstra volumer for tap på grunn av pipettering og sted celle lysis master mikse på isen.- Forberede celle lysis master mix (komponenter av WGA kit, tabell av materialer og reagenser) i henhold til protokollen skissert av Czyż et al18. Kort, bland 2.0 µL reaksjon buffer, 1,3 µL av octylphenoxypolyethoxyethanol (10% løsning), 1,3 µL av 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) fenyl-polyetylenglykol (10% løsning) 2.6 µL av en proteinasen K løsning og 12,8 µL RNase/DNase-gratis vann for å få en Master blanding for 10 prøver (totalt volum 20 µL).
Merk: For mer prøver, øke volumene tilsvarende. Sammensetningen av cellen lysis master mix er forskjellig fra den som brukes i den alternative prosedyren bruker laser microdissection prøver (se 5.2.). - Bruk en fett til å tegne et område holder celle suspensjon på plass. Justere areal og volum hvis cellen tetthet er for høy (dvs. merke et større område på av objektglass, laste 1 x PBS og en aliquot av cellen suspensjon).
- Pipetter hele farget cellen suspensjon (innhentet i trinn 4.8.) på av objektglass.
- Overføring av objektglass til et mikroskop utstyrt med en micromanipulator. La cellene nøy deg 5 min (figur 2D og 2 H).
- Forberede 0,2 mL PCR rør med 2.0 µL av cellen lysis blande (se trinn 5.1.1.) og lagre det på isen.
- Samle enkeltceller i 1 µL av 1 x PBS bruker micromanipulator og overføre cellene i et rør som inneholder cellen lysis master mix.
Merk: For å overføre micromanipulated cellene til cellen lyseringsbuffer plasser av kapillær direkte inn i 2 µL lysis løsning og kaste ut før bobler kan sees. - Kort Nedspinning prøven på 2000 x g for 3 s med en desktop microfuge for å samle all væsken nederst på røret. Sett prøvene på is.
- Direkte fortsette å encellede WGA (se avsnitt 6. og Czyż et al. 19).
- Forberede celle lysis master mix (komponenter av WGA kit, tabell av materialer og reagenser) i henhold til protokollen skissert av Czyż et al18. Kort, bland 2.0 µL reaksjon buffer, 1,3 µL av octylphenoxypolyethoxyethanol (10% løsning), 1,3 µL av 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) fenyl-polyetylenglykol (10% løsning) 2.6 µL av en proteinasen K løsning og 12,8 µL RNase/DNase-gratis vann for å få en Master blanding for 10 prøver (totalt volum 20 µL).
- Laser microdissection (alternativ encellede sampling metoden til: 5.1. Micromanipulation)
Merk: Sammensetningen av master mix brukes i denne delen er forskjellig fra den som brukes i pkt. 5.1 for micromanipulation. Enkeltceller legges til 4,5 µL av cellen lysis master mix (komponenter av WGA kit, tabell av materialer og reagenser) for WGA.- Klargjør celle lysis master blandingen ifølge Czyż et al. 19 ved å blande 5.0 µL reaksjon buffer, 1,3 µL av octylphenoxypolyethoxyethanol (10% løsning), 1,3 µL av 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) fenyl-polyetylenglykol (10% løsning), ansv.senter, 2,6 µL av en proteinasen K løsning og 34.8 µL av RNase / DNase-gratis vann for å få en master blanding for 10 prøver (totalt volum 45 µL). Plass mix master på is.
Merk: For mer prøver, øke volumene tilsvarende. - UV-treat membran-belagt lysbilder egnet for laser microdissection. Derfor sett lysbildene i en DNA cross koblingsfunksjonalitet enhet og utsette for høyeste UV i ca 10 min.
- Samle membran-belagt lysbildet i en cytocentrifuge og cytospin hele cellen suspensjon på 300 x g i 5 min.
Merk: Når du bruker et i-væske system, hvor cellene er cytocentrifuged inn i lysbildet på løsning, fjerne nedbryting etter cytocentrifugation og bruke en tørr-spinn 1140 x g for 1 min. - Gå direkte til laser microdissection eller la cytospins air-dry overnatting og fryse samples ved 20 ° C for langtidslagring.
- Pipetter 4,5 µL av cellen lysis master mix i hetten av et 0,2 mL PCR rør og høste enkeltceller ved hjelp av laser microdissection.
- Hente PCR røret fra laser microdissection mikroskopet og Lukk røret. Samle alle flytende nederst på røret ved kort-spinn og plasser prøven på isen.
- Fortsette med encellede WGA eller lagre isolert prøvene ved-80 ° C i opptil 1 måned før videre behandling.
- Klargjør celle lysis master blandingen ifølge Czyż et al. 19 ved å blande 5.0 µL reaksjon buffer, 1,3 µL av octylphenoxypolyethoxyethanol (10% løsning), 1,3 µL av 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) fenyl-polyetylenglykol (10% løsning), ansv.senter, 2,6 µL av en proteinasen K løsning og 34.8 µL av RNase / DNase-gratis vann for å få en master blanding for 10 prøver (totalt volum 45 µL). Plass mix master på is.
6. kort-linker basert hele genomet forsterkning 18,19
Merk: Kontroller at alle nødvendige master mikser (komponenter av WGA kit, tabell av materialer og reagenser) er forberedt og lagret på is klar til bruk. Master mikser inkluderer DNA fordøyelsen mix 1 for micromanipulated (se 5.1.) prøver (som inneholder 2.0 µL reaksjon bufferen, 2.0 µL av Msejeg begrensning enzym og 16,0 µL av RNase/DNase-fritt vann) eller DNA fordøyelsen bland 2 for laser microdissection (se 5.2.) eksempler (som inneholder 2,5 µL av Msejeg begrensning enzym og 2,5 µL av RNase/DNase-fritt vann), pre annealing master mix (inneholder 5.0 µL reaksjon bufferen, 5.0 µL av preannealing PCR kortene og 15,0 µL av RNase/DNase-fritt vann), hemorroider Master mix (inneholder 30.0 µL av pre glødet PCR-kort, 10,0 µL adenosin trifosfat løsning og 10,0 µL T4 ligase løsning) og primære PCR master mix (som inneholder 30.0 µL PCR bufferen, 20.0 µL av 10 mM deoxynucleotide blanding løsning, 10,0 µL av et utvalg blanding og 340.0 µL av RNase/DNase-fritt vann). Alle volumer er gitt for å forberede 10 prøver. Justere tilsvarende antall eksempler.
- For cellen lysis, plassere micromanipulated/laser microdissection prøvene i en termisk cycler og encellede lysis av rugende cellen i 42 ° C i 45 min, 65 ° C for 30 min og 80 ° C i 10 min.
Merk: Bruk en termisk cycler med oppvarmet lokk. Cellen lysis kan gjøres O/N 10 til 15 h. I så fall Utelat inkubasjon trinnet på 65 ° C. - Kjør pre annealing av PCR kortene. Derfor ruge pre annealing master mix i en termisk cycler ved 65 ° C i 1 min etterfulgt av ytterligere 49 sykluser, 1 min hver, med gradvis redusere temperaturen med 1 ° C/syklus. Etter 50 sykluser (på 15 ° C), ruge master mix på 15 ° C til fremme bruk.
Merk: Dette trinnet er nødvendig å generere asymmetrisk adaptere egnet for hemorroider (se trinn 6.6.) med én celle DNA utsatt for Msejeg begrensning digest. - Etter celle lysis, Nedspinning lysed prøvene 2000 x g for 3 s å samle all væsken nederst og plassere den på is.
- For å fragmentere DNA, legge 2 µL av DNA fordøyelsen mix 1 hver lysed micromanipulated utvalg eller 0,5 µL av DNA fordøyelsen bland 2 laser microdissection utvalg og kjøre begrensning digest. Bruk en termisk cycler med oppvarmet lokk på 37 ° C for 5 min etterfulgt av en begrensning enzym inaktivering trinn ved 65 ° C i 5 minutter.
Merk: Fordøyelsen ved 37 ° C kan utvides til 3t. Dette er den eneste protokoll skrittet skiller mellom prøver innhentet fra micromanipulation og prøver innhentet fra laser microdissection. - Nedspinning prøvene å samle all væsken nederst og plassere den på is.
- For ligating begrensning fordøyd DNA og pre glødet kort, legge 5.0 µL av hemorroider master bland til hver fordøyd DNA-prøve og ligate det i en termisk cycler ved 15 ° C i 1 time.
Merk: Dette trinnet kan utvides til 12 h eller utført O/N. - Nedspinning prøvene å samle all væsken nederst og plassere den på is.
- For WGA legge 40,0 µL av primære PCR master mix hver ligatur produktene og kjøre WGA i en termisk cycler med oppvarmet lokk som følger: første, ruge prøvene på 68 ° C i 3 minutter. Andre syklus 15 ganger på 94 ° C i 40 s, 57 ° C for 30 s og 68 ° C i 1 min 30 s 1 s/syklus. Deretter legger 9 sykluser på 94 ° C i 40 s, 57 ° C + 1 ° C/syklus for 30 s, 68 ° C i 1 min 45 s 1 s/syklus. Etter syklus 23 ganger på 94 ° C i 40 s, 65 ° C for 30 s, 68 ° C i 1 min 53 s 1 s/syklus. Til slutt, utføre en endelig utvidelse på 68 ° C for 3 min 40 s og chill prøvene til 4 ° C.
- Nedspinning prøvene å samle all væsken nederst og sjekke DNA kvaliteten eller lagre prøver på 20 ° C eller-80 ° C for langtidslagring.
7. kvalitetskontroll av WGA produkter
Merk: Kontrolle kvaliteten på WGA produkter basert på DNA smear og antall forsterkning produkter etter kjører en 4plex QC PCR 5. Kjøre WGA dele og respektive QC PCR eksempler på en 1,0% agarose gel for evaluering.
- Forberede 100 µM lager løsninger av alle primere brukt for 4plex kvalitetskontroll PCR (tabell 1). Legge til 8 µL av hver primer 136.0 µL PCR-grade vann å generere 200 µL av primer. Vortex løsningen for 3 s, Nedspinning 2000 x g for 3 s og aliquot 20 µL for lagring på 20 ° C.
- Bruk standard PCR prosjektpakker å forberede en multiplex PCR-master bland inneholder 6.0 µL av 2 x PCR komponenter (unntatt primere), 4,5 µL PCR-grade vann og 0,5 µL av primer.
- Legge til 1.0 µL av WGA produktene, spinne den ned og kjøre PCR ved 94 ° C i 2 min etterfulgt av 35 sykluser av rødsprit 94 ° c for 1 min, primer annealing på 56 ° C for 1 min og primer forlengelsen ved 72 ° C i 1 min 30 s og et endelig utvidelse skritt ved 72 ° C i 7 min. Chill det 4 ° c, spinne den ned og plassere prøvene på is for gel analyse samme dag eller på 20 ° C for senere analyse.
Merk: Skremmende i den termiske cycler kan utføres ved 12 ° C å øke levetiden av Peltier elementer. - Analysere WGA produkter (hentes fra 6.8.) og respektive 4plex QC PCR produkter på en agarose gel5.
Representative Results
Cellene etter CFSE og nukleinsyre flekker kan evalueres ved hjelp av en immunofluorescence mikroskop utstyrt med filtre for DAPI og FITC. Kjerner presenterer en lyse counterstain i DAPI kanalen mens cytoplasma cellene Vis uniform merking med CFSE med heterogene mellom cellen intensitet (figur 2A og 2E). Lignende form og flekker intensiteter er forventet fra celler knyttet til ledningen (figur 2B og 2F) samt løsrevet fra ledningen og gjenopprettet på et lysbilde (figur 2D og 2 H).
Høyt tettheter (f.eks > 1 000 000 celler/mL) kan føre til total dekning av ledningen med celler når lading ledningene. Imidlertid lavere celle tettheter, endringer i rotasjonshastighet under inkubasjonen, og bruk av ulike cellelinjer påvirker isolasjon effektiviteten og må testes separat. Når ledningene ble inkubert med 5 mL HT-29 cellene på 100 000 celler / mL som beskrevet i Seksjon 2.1., et gjennomsnitt på 254 ± 103 celler (n = 5) ble tatt på ledninger. Med samme eksperimentere med LNCaP celler, et gjennomsnitt på 440 ± 319 celler (n = 5) per wire ble innhentet.
Presentere 500, 5 000 og 50 000 HT-29 celler i en bakgrunn av 5 mL av perifert blod ledninger (i henhold til protokollen delen 2.2.) resulterte i erobringen av 75 ± 18 celler, 25 ± 9 celler og 47 ± 57 celler (n = 3, hver), henholdsvis. Hvis kabelen belastes med 15 µL av cellen suspensjon (1 000 000 celler/mL) i henhold til protokollen i avsnitt 2.3., opp til 1000 innbyggere (HT-29) celler fester seg til en ledning.
Celle avdeling effektivitet varierte fra 81% i HT-29 celler (rekkevidde 54.9 – 93.2%, og n = 5) 81% (varierer 63.51 – 92.87%, n = 6) og 91% (varierer 84.7 – 95.3%, n = 6) i LNCaP og VCaP celler, henholdsvis. Tilsvarende utvinning av frittstående celler skiller mellom linjer: et gjennomsnitt på 28% av frittstående HT-29 celler gjenvunnet ved cytocentrifugation. Mens utvinningsgrad for LNCaP var lavere enn 10%, var mener utvinningsgrad for VCaP cellene 55%.
Ca 75% av enkeltceller utsatt for avkastning på WGA kvalitetsprodukter WGA: Dette er 1) smøre WGA produkter spenner fra 0,1 til > 1 kb (4 figur, toppanelet) og 2) tre eller fire band i 4plex kvaliteten kontroll PCR (Figur 4, nedre panelet) . WGA produkter benyttes for 1) matrise-CGH profilering møte kvalitetskriterier for enkeltceller matrise-CGH profiler 6,7 og 2) målrettet NGS etter re forsterkning WGA 7.
Figur 1: arbeidsflyt for isolering og gjenoppretting målcellene for én celle analyse. (A) celler er kultivert til 90% confluency, og (B) høstet for å få en enkeltcelle suspensjon. Etter farging med CFSE og kan flekken, (C) functionalized ledningen er ruges i nærvær av cellene i et volum på 5 mL bruker reaksjon rør eller et lavt volum bruker et Pasteur pipette tips. Sistnevnte gir anvendelse av cellen suspensjon volumer så lite som 15 µL. (D) celler må kobles innen 4 timer etter lading. Derfor plasseres wire i en 1,5 mL reaksjon rør fylt med utgivelsen buffer. Etter 15 min incubation rocker og 10 min sentrifugering, wire fjernes, og cellen suspensjon er centrifuged for å pellets cellene. (E) gjenopprettet celler enten overført til et glass lysbilde for én celle micromanipulation (øverst) eller cytocentrifuged på en membran-belagt lysbilde og sendt for å laser microdissection (nederst). (F) til slutt høstet enkeltceller er forsterket med hele genomet forsterkning (WGA). WGA-produkter er kompatible med array-CGH og målrettet NGS nedstrøms analyse. EpCAM epitope: grønn sirkel celleoverflaten. Functionalized ledning: enhet, grå trippel-spiralformede ledninger. Polymer: lilla linjer. Anti-EpCAM antistoffer: oransje. Slipp buffer aktivitet: rød pil. Fett merke å holde celle suspensjon på plass: mørk blå ellipse. Gjenopprettet celle suspensjon: lys blå. Kapillær for micromanipulation: svart linje. Forstørrelse: gjenopprettede celle høstet av micromanipulation, cytospin på membran-dekket Skyv inneholder gjenopprettede celler (grå fylt ellipse). Forstørrelse: gjenopprettede cellen blir laser microdissected (grå sirkulær linje: membranen fra membranen lysbilde som ryggraden for laser microdissection), objektiv med laserstrålen (blå linje nærmer membran lysbildet nedenfor). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: visualisere merkede celler. (A, E) Celler før lading: celler er merket med CFSE og counterstained med en DNA intercalating fargestoff viser et utvalg av CFSE (grønn) signal intensitet. (B,F) Merkede celler på ledningen. (C,G) Wire etter celle-avdeling. (D,H) Celler løsrevet fra wire og av cytocentrifugation på et lysbilde. CFSE: FITC kanal (grønn). DNA flekk: DAPI kanal (blå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Wire og lagringen avlukke. (A) deler av ledningen. (B) detaljer av functionalized. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: kvalitetskontroll av WGA produkter innhentet fra enkelt micromanipulated celler. Topp panel: WGA produkter fra enkeltceller vanligvis resulterer i DNA celleprøver mellom 0,2 kb > 1.0 kb med en topp intensitet rundt 0,5 kb. Prøver nummer 1, 7 og 13 (angitt med stjernene) Vis suboptimal eller ingen DNA smøres utover. Nedre panelet: WGA produktene er av tilstrekkelig kvalitet hvis 4plex PCR gir tre eller fire av fire PCR-produkter (på 100, 200, 300 og 400 bp). Prøver 1, 7, 10 og 13 vise færre enn tre bånd og ekskluderes fra videre analyse. Lane M inneholder en 100 bp stige og stjernene indikerer prøvene av utilstrekkelig WGA produktkvalitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Primer sekvens | MERK |
| 5 '-gtt cca ata tga ttc cac cc-3 | 100 bp frem primer |
| 5 '-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3 | 100 bp omvendt primer |
| 5 '-agg tgg agc kneble gct agc-3 | 200 bp frem primer |
| 5 '-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3 | 200 bp omvendt primer |
| 5 '-agg tga gac att ctt gct gg-3 | 300 bp frem primer |
| 5 '-tcc handle aac cag tca gcg tc-3 | 300 bp omvendt primer |
| 5 '-aca gtc katten gcc atc handle gc-3 | 400 bp frem primer |
| 5 '-gct tga caa agt ggt cgt vs-3 | 400 bp omvendt primer |
Tabell 1: Primer sekvenser for 4plex kvalitetskontroll PCR
Discussion
Beskrevet protokollen tar sikte på å hente celler fra en functionalized wire (referert til som enhet) for ex vivo encellede genomisk analyse. Vi testet tre EpCAM-positive linjer (HT-29, LNCaP og VCaP), men i prinsippet kan denne metoden brukes til enhver celle linje uttrykke EpCAM. EpCAM-positive målcellene kan presenteres på enheten som ren celle suspensjon (se 2.1.) eller blandet inn i et overskudd av bakgrunnen celler (f.eks. perifert blod, se 2.2.). Mens spesielt sistnevnte kan brukes til å teste isolasjon kapasiteter under sjeldne celle forhold, finjustering av antall celler knyttet til ledningen kan gjøres med det beskrevet lav-volumet tilnærming (se 2.3.). Forskjeller mellom linjer er å forvente, hastighet egnet cellen tettheter for lading ledningen, rotasjon samt inkubasjonstiden må testes empirisk ved å evaluere antall tilknyttede celler ved hjelp av en immunofluorescence mikroskop.
For genomisk nedstrøms programmer på én celle nivå WGA, kreves. WGA metoden for valg kan variere mellom laboratorier, og i prinsippet vår metode er åpen for alle metoder enn kan håndtere prøver innhentet fra micromanipulation eller laser microdissection. I denne protokollen bruker vi en metode basert på enzymatisk fragmentert DNA på grunn av en bedre ytelse i forhold til en varme-fragmentering basert WGA7. Valgfritt, enkelt celler kan bli videresendt til isotermiske WGA slik at etterfølgende DNA profilering20,21.
Beskrevet protokollen tar sikte på å gjenopprette intakt celler etter å være knyttet til en ny generasjon functionalized ledninger for genomisk encellede analyse. Den første generasjonen av functionalized ledninger, som også representerer berikelse bare CE-godkjent i vivo enheter på markedet så langt, ble brukt for opplisting CTCs i metastasized kreftpasienter. Tidligere publikasjoner og våre egne data tyder isolasjon i vivo teknikk for å være mer følsomme forhold til gjeldende gullstandarden teknologi2. Derfor kan utstyre denne i vivo isolasjon teknikken med en funksjon for gjenoppretting som realiseres i enheten kombinere høy CTC utvinning med karakterisering på encellede nivå.
Men enheten fjernes ikke for bruk i pasienter, dermed kliniske data er ikke tilgjengelig. Ex vivo programmer (dvs. isolere CTCs fra perifert blod etter utvalg) anbefales ikke som teknologien er tilpasset innstillingene i cubital forgjeves, f.eks lav diameteren på den forgjeves (øke sannsynligheten for direkte kontakt mellom CTCs og fange antistoffer) og lange tiden (30 min, slik at 2-3 L blod skjedde ledningen). Men som beskrevet i delen 2.2. målcellene kan også være isolert fra blandet prøver7.
En gjeldende begrensning av metoden er ineffektiv utvinning av unfixed celler etter løsgjøring fra ledninger. Dette kan imidlertid forbedres ved en celle fiksering trinn før avdeling behandling.
I sammendraget er denne protokollen et første skritt mot kombinert bruk av en i vivo isolasjon teknikk med celle utvinning for å karakterisere genmodifiserte enkeltceller. Ytterligere innsats må ta optimalisering av celle utvinning og klarering for dens anvendelse i pasienter1,2. Personlig medisin for behandling overvåking og terapi beslutninger er imidlertid utover opplisting av CTCs. Dermed er denne metoden et første skritt mot genomisk CTC karakterisering på enkeltcelle nivå.
Søknader mot encellede transcriptome analyse synes mulig som intakt celler er høstet. Men gjenstår det å bli vurdert om utvinne prosedyren har en innvirkning på RNA integritet (f.eks videresending gjenopprettede enkeltceller til direkte lyse etterfulgt av RT-qPCR22). Hvis karakteristikk av enkeltceller (f.eks CTCs) kan bli forskjøvet til transcriptome nivå, slik at mer detaljerte analyser. I denne forbindelse, RNA-seq bruker Smart-seq2 gir et verdifullt verktøy for RNA nedstrøms analyse av enkeltceller som preamplified cDNA (innhentet under RNA-seq biblioteket forberedelse) kan utsettes for kvantitative PCR. Dette vil tillate en kombinert mål og screening-basert analyse av enkeltceller gjenopprettede22,23.
Gjeldende functionalized ledninger er basert på anti-EpCAM antistoffer som er en mye brukt epithelial for positiv utvalg av CTCs24. Som flere CTCs kan downregulate epitel markører som cytokeratins eller EpCAM25, vil legge antistoffer som HER2/nye øke sjansen for CTC isolasjon. Flere antistoff basert berikelse strategier er utviklet og gjennomgått av Ferreira et al. i 201626. En blanding av antistoffer immobilisert på en wire kan være en fremtidig forbedring av teknologien fører til isolasjon av mange og flere undergrupper av CTCs.
Det er obligatorisk for alle foranstaltningene innvolvere wire håndtering for å holde den funksjonelle delen av ledningen neddykket i løsning for å opprettholde sin funksjonalitet. Vi anbefaler for å plassere ledningen i 1 x PBS under evaluering (mikroskop; f.eks. trinn 3.1. -3.3.) og lagring. For å unngå upassende flekker, anbefaler vi nymalt forberedt flekker løsning i trinn 1.2.1. og 1.2.2. Svakt farget celler hemmer celle teller på ledningen og kan føre til undervurdering av tilknyttede cellene.
Er det nødvendig å unngå koble Pasteur pipette med gummi cap når setter inn ledningen i Pasteur pipette for påfølgende lasting av cellen suspensjon (trinn 2.3.4.). Gummi cap brukes til å holde wire på plass slik at den funksjonelle delen ligger inni tuppen av Pasteur pipette. Hvis hetten er tilknyttet for fast på baksiden av Pasteur pipette, er lasting av cellen suspensjon ikke mulig. I dette tilfellet lette hetten slik at luften som er fortrengt av lastet celle suspensjon kan la pipette.
Bøye ledningen er avgjørende for retningen under cellen teller i trinn 3.2. og 3.3. Montere ledninger med teip slik at ikke-fungerende slutten av ledningen kommer å ligge på en side. Etter skanning av hele lengden av funksjonelle rulles ledningen 180° så den andre halvdelen av funksjonelle ledningen kan skannes. Dette trinnet er viktig for initial eksperimenter å vurdere antall celler på ledningen. Når antall celler for en bestemt celle linje og prosedyre evalueres, fremgangsmåten kan gjentas uten celle teller (f.eks. bare sjekke for tilstedeværelsen av celler eller utelate dette trinnet). Forsiktig pipettering er avgjørende for å unngå tap av cellen når redusere volumet av nedbryting i trinn 4.8. Sikre pipettering gjøres jevnt uten å forårsake turbulens å pellet.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert av østerrikske Science Fund (FWF), prosjekt-ingen. I 1220-B19 (til PS) som en del av ERANET prosjektet i translasjonsforskning Cancer Research (TRANSCAN) "Circulating tumorceller som biomarkør for Minimal gjenværende sykdom i prostatakreft (CTC-SCAN)". Doktorgradsstipendiat S.C. ble opplært i rammen av PhD-programmet molekylær medisin i medisinske universitet i Graz. Forfatterne erkjenner takknemlig Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz og Johanna Schiller for deres ekspert teknisk assistanse. Forfatterne takker Georg Peinhaupt for grafisk design støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gilupi Release Buffer | Gilupi | GIL083 | Used to detach cells from the wire |
| McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 16600-082 | Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | PAA | S11-001 | Supplement for McCoy's 5A Medium |
| Foetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Biowest | L0018-100 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Phosphate Buffered Saline (1x PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-015 | |
| Accutase | Biowest | L0950-100 | Cell detachment solution (cell culture) |
| Water bath | GFL | Type 1003 | Used for prewarming solutions |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Used to incubate cells (cell culture) | |
| 50 mL reaction tubes | VWR | 525-0403 | |
| Roller mixer | Stuart Scientific | SRT6D | Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34554 | Used to label living cells (cytoplasmic label) |
| Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Scientific | Used to stain DNA (nucleic counterstain) |
| Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Megafuge 40R | Used for pelleting cells |
| Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) | Carl Zeiss Microimaging | Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter) | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Used for coating glass/plastic surfaces |
| MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | Used for vortexing |
| Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes | BD | 366450 (or 366480) | Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells |
| Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R) |
| Syringe needles (G20) | VWR | 613-0554 | Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it |
| Neubauer chamber | Roth | T729.1 | Used to count cells |
| Pasteur pipettes 150 mm | Volac | D810 | Used for the low-volume application of cells to the C&R |
| Grease pen | Dako | S2002 | Used on glass slides to hold cell suspension in place |
| Steril syringe filter (0.2 µm) | Corning | 431219 | For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer |
| Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | Used for agitation during cell detachment |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 30,125,150 | |
| Ampli1 WGA Kit | Silicon Biosystems | To be ordered via Silicon Biosystems | |
| Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Use micromanipulation at hand | |
| Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Used for micromanipulating cells |
| 0.2 mL PCR tubes | Biozym | 710920 | |
| Cytocentrifuge and equippment | Hettich | Universal 32 | Use cytocentrifuge at hand |
| Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | Every thermo cycler with heated lid can be used |
| Microcentrifuge | Roth | CX73.1 | Use desk-top centrifuge at hand |
| MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Membrane-coated glass slides used for laser microdissection |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | Use DNA cross linker at hand |
| Standard PCR reagents | |||
| 6x DNA Loading | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Use gel loading dye at hand |
| DNA ladder | BioLabs | N0551G | Use 100 bp ladder at hand |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Gel electorphoresis station | Bio-Rad | Use electrophoresis system at hand | |
| Gel Red Nucleic Acid Stain | Biotium | 41003 | Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels |
References
- Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
- Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).
- Kuske, A., et al. Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients. Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).
- van Beers, E. H., et al. A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples. Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).
- El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA. Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).
- Möhlendick, B., et al. A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH. PLoS ONE. 8 (6), e67031 (2013).
- Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci Rep-UK. 7, 43424 (2017).
- Zhang, H., et al. Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck. Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).
- Carter, L., et al. Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer. Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).
- Luca, F. D., et al. Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer. Oncotarget. , (2016).
- Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection. Cell. 168 (4), 571-574 (2017).
- Page, K., et al. Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer. Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).
- Kalinich, M., et al. An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma. P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).
- Gorges, T. M., et al. Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells. Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).
- Sinkala, E., et al. Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting. Nat Commun. 8, 14622 (2017).
- Morrow, C. J., et al. Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study. Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).
- Williamson, S. C., et al. Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer. Nat Commun. 7, 13322 (2016).
- Czyż, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM. Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).
- Czyż, Z. T., Klein, C. A. Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells. Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).
- Kroneis, T., et al. Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR. J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).
- Kroneis, T., et al. Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification. Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).
- Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification. Sci Rep-UK. 7, 45219 (2017).
- Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. Potential and Challenges of Liquid Biopsies. Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).
- Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. Circulating tumor cell technologies. Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).
