Summary
Этот протокол описывает метод для наблюдения в реальном времени зеленый флуоресценции белков (ГПУП) меткой 4 транспортера глюкозы (GLUT4) белки людьми после стимуляции инсулина и характеристика биологической роли CCR5 в инсулин GLUT4 сигнальный путь с деконволюция микроскопии.
Abstract
Сахарный диабет типа 2 (T2DM) представляет собой кризис глобального здравоохранения, который характеризуется инсулина, сигнализации обесценения и хронического воспаления в периферических тканях. Гипоталамуса в центральной нервной системе (ЦНС) является центром управления для энергетики и инсулин сигнал ответа регулирования. Хроническое воспаление в периферических тканях и диспропорций в некоторых chemokines (например, CCL5, TNFα и IL-6) способствуют диабета и ожирения. Однако функциональные механизм(ы) соединения chemokines и гипоталамо инсулин сигнал регулирование по-прежнему остаются неясными.
В vitro первичный нейрон культуры модели являются удобной и простой модели, которые могут быть использованы для изучения инсулин сигнал регулирования в нейронов гипоталамуса. В этом исследовании мы внедрили периферийной GLUT4 белка с GFP (GFP-GLUT4) в первичных нейронов гипоталамуса отслеживать GLUT4 мембраны транслокации после стимуляции инсулина. Промежуток времени изображения оборота белка GFP-GLUT4 были записаны деконволюция микроскопии, что позволило пользователям создавать высокоскоростной, с высоким разрешением изображения без повреждения нейронов значительно во время проведения эксперимента. В CCR5 несовершенным нейронов гипоталамуса, которые были изолированы и культивировали от CCR5 нокаут мышей наблюдалось вклад CCR5 в инсулин регулируется GLUT4 транслокации. Наши результаты показывают, что эффективность транслокации мембраны GLUT4 был уменьшен в CCR5 несовершенным нейронов гипоталамуса после стимуляции инсулина.
Introduction
Сахарный диабет типа 2 (T2DM) представляет собой кризис глобального здравоохранения. T2DM характеризуется инсулина, сигнализации обесценения и хронического воспаления в периферических тканях. Гипоталамус является центр управления, который регулирует энергетического гомеостаза организма, аппетит и циркадные ритмы. Самое главное гипоталамус также посредником инсулин сигнал реагировать регулировать системного метаболизма1,2,3,4,5. Нарушая гипоталамуса инсулина сигнализации, путь может индуцировать инсулин сопротивление6,7. Гипоталамус координирует клеточной энергии статус и секреции гормонов, таких как инсулин и адипокинов (например, лептин) от периферических тканей, регулируют метаболизм системных глюкозы, инсулина быстродействие и приема пищи. Инсулин связывание с рецепторами инсулина активирует рецепторов инсулина субстрата (IRS) белков, которые затем активировать инсулина течению сигнальных молекул, таких как PI3K (фосфатидилинозитол-3-киназы) и AKT (протеинкиназы B (PKB/AKT)), чтобы побудить GLUT4 транслокации мембраны. Нейроны не являются основной мишенью для поглощение глюкозы в ответ инсулина; Однако значительные уровни выражения GLUT4 были определены в регионе гипоталамуса дугообразном ядре (ARC). Таким образом регулирование GLUT4 в нейронов гипоталамуса могут играть важную роль в инсулине сигналов в мозг периферической оси.
Многие исследования показали, что хроническое воспаление и воспалительные chemokines в гипоталамусе также играют важную роль в развитии диабета и ожирения, и подавление гипоталамо воспаления может обратить вспять диета индуцированного инсулина сопротивления 8 , 9 , 10. Кроме того, хемокиновых CCL5 (C-C мотив лигандом 5, также известный как RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) и его рецептор CCR5 уровнях также коррелирует с развитием T2DM11,12. Роли CCL5 и CCR5 в функции и глюкозы метаболизм инсулина остаются неясными. Одно исследование сообщало, что CCR5 дефицит защищенных мышей от ожирения индуцированной воспаления, макрофагов вербовки и инсулин сопротивление11; в отличие от другого исследования сообщили, что CCR5 дефицит ухудшает системных глюкозе, а также Адипоцит и мышцы инсулина, сигнализации12. CCL5 найдена увеличить поглощение глюкозы в Т-клеток и уменьшить потребление пищи через свои действия на гипоталамус13,14, однако, механизм действия и рецепторов, участвующих еще должны быть определены.
Это трудно изучение клеточных механизмов, лежащих в основе эффект воспаление периферических тканей на инсулин, функционирующих в нейронов гипоталамуса. Это по соображениям сотовой неоднородность и нейрон цепь обратной связи. По этой причине в пробирке модель культуры клеток обеспечивает чистую модель для изучения последствий хемокиновых гипоталамуса инсулин сигнал регулирования. Хотя есть много установленных увековечен гипоталамуса нейрональных клеточных линий для использования в исследовательских целях, эти клеточные линии выразили различные маркеры и поэтому представляют собой различные типы нейронов гипоталамуса15. Хотя основной гипоталамуса культур может быть трудно поддерживать, они могут обеспечить наиболее реалистичный ответ нейронов гипоталамуса после стимуляции инсулина и можно также избежать возможных неизвестные эффекты, которые приходят в играть при поддержании клеток Долгосрочный в питательной среды с искусственных факторов роста.
Здесь мы используем первичной нейронов гипоталамуса C57BL/6 wildtype (WT) мыши и CCR5 нокаут (CCR5- / -) Мышь и transfect обоих типов клеток с GFP-GLUT4 конструкции. Расследовать CCR5 вклад инсулина при посредничестве GLUT4 мембраны людьми, GFP-GLUT4 transfected нейронов относились с инсулина или рекомбинантным CCL5. Мы затем характеризуют движение GFP-GLUT4 на плазматической мембране в первичной нейронов гипоталамуса с деконволюция микроскопии.
Protocol
Все протоколы и методы, используемые в животных темы были одобрены институциональный уход животных и использование комитетов (IACUC) из Тайбэйского медицинского университета (протокол чисел: Лак-2013-0278; LAC-2015-0397)
1. первичный нейрон культура
- Подготовка перед культуры
- Герб культуры блюда с поли D-Лизин (Таблица 1) за один день до культуры. Для 6-ну блюдо добавьте 1,5 мл поли D-Лизин (0,05 мг/мл) в каждой скважине. Live-образов культура клетки на 12 мм х 12 мм coverslip в стандартной пластине покрытием 6-хорошо.
- Удалить/переработке поли D-лизин и мыть посуду дважды с 2 мл ddH2O.
- Подготовить хирургические инструменты: пара микро Рассекающий ножницы, щипцы изогнутые наконечником и стандартные прямо наконечником щипцы. Стерилизовать хирургические инструменты и держать их в 75% этанола во время операции.
- Заполните Петри 10 см с 20 мл мыть среднего (Таблица 1) и держать на льду.
- Заполнить в 15 мл пробирку с 15 мл мыть среднего и держать трубку на льду.
- Изоляция ткани мозга от различных мозга
- Пожертвуйте 16-19 день старого беременных самок мышей с протоколами стандартных euthanization, поместив мышь в клетке не проветривается и затем опьяняющий с CO2. E15.5 ~ E16.5 эмбрионы рекомендуются для нейронов гипоталамуса культуры и E16.5 ~ E17.5 являются более подходящими для гиппокампа и корковых нейронов культуры.
- Стерилизуйте платформы, рассечения микроскопа и хирургии инструменты с 75% этанола, чтобы избежать загрязнения.
- Вырежьте вокруг области пуповины (темно красная площадь, Рисунок 1A, 1B прерывистая линия), изолировать детенышей легко, не повреждая их (рис. 1 c, 1 D).
- Удаление части головы каждого щенка с ножницами (Рисунок 1E, F), а затем обеспечить части головы на месте с помощью острым концом прямой щипцы для области глаз (рис. 1 g). Используйте другой штраф накренилась Изогнутый пинцет, чтобы удалить наружную кожу и черепа с двух сторон и отделите от передней спинной направлении (Рисунок 1 H, черная стрелка указывает на направление). Мозг должен быть изолирован без повреждений (рис. 1I).
Примечание: Важно сохранить целостность мозга для обеспечения точности при изоляции различных регионов мозга. - Держите изолированных мозги в чистой Петри с ледяной мыть средой для следующих шагов.
- Флип мозга и держать вентральной стороне. Гипоталамус является структурой раунда в середине мозга (Рисунок 1J, стрелка указывает в область гипоталамуса). Изолируйте гипоталамуса ткани с острым концом Изогнутый пинцет. Удаление мозговых оболочек (которые имеют желтовато красный цвет) тщательно.
Предупреждение: Полное удаление мозговых оболочек является важным шагом, чтобы избежать загрязнения фибробластов. - Держите обонятельные доли с острыми щипцами и отделите тонкие мозговые оболочки, окружающие весь мозг с Изогнутый пинцет (рис. 1 K, L).
- Гиппокамп является банан образную форму, который встроен в нижней части коры головного мозга. Панель в нижней части коры и отдельные гиппокампа от коры, потянув ее к стороне с Изогнутый пинцет (Рисунок 1 MN и O). Убедитесь в том удалить все оставшиеся мозговые оболочки, окружающие ткани мозга.
- Когда все регионы мозга были изолированы, нарезать эти ткани в 15 мл пробирки, содержащие среднего ледяной мыть с помощью щипцов (шаг 1.1.5).
Примечание: Ткани мозга может храниться в ледяной вымыть средством для 2-3 ч.
- Ткани пищеварение, обшивка и культура
- Полоскания тканей, инвертирование ткани содержащих 15 мл 2 - 3 раза, а затем держать трубку прямо разрешить в ткани, чтобы успокоиться (1-3 мин).
- Удаление верхней среды с помощью стеклянной пипетки Пастера прилагается к вакуумной системе. Мыть ткань, добавить 15 мл лед холодной мыть среднего и перевернуть трубку 2 - 3 раза. Повторите шаги мыть 3 раза перед следующим этапом.
Предупреждение: Будьте осторожны тканей на дне при удалении верхнего среднего с использованием вакуумной системой. - После окончательного вымыть удалите средство мыть с помощью пипетки 1 мл.
- Инкубируйте тканей с буфером папаин-трипсин пищеварения (Таблица 1) в ванну воды 37 ° C 7-14 мин Shake трубы, каждые 2 мин для обеспечения всех тканей надлежащим образом воздействию в буфер пищеварение.
Примечание: Время инкубации и объем буфера пищеварение может регулироваться на основании размера ткани. Для гипоталамуса ткани, собранных от 6-8 щенков рекомендуется 300 мкл папаин-трипсин пищеварение буфер и 7 min время инкубации. Больше ткани потребует более переваривания буфера. - Нейтрализовать активность фермента, добавив 1 объем плода бычьим сывороточным. Встряхните пробирку 3 - 5 раз при комнатной температуре.
- Держите трубку на стеллажи и ждать 1-2 мин позволить ткани поселиться; Удалите супернатант тщательно с Пипетка 1 мл.
- Добавьте 6 мл, обшивка среднего (Таблица 1) в пробирку и пипетки прихваченного ткани 50 раз с 5 мл пипетки мягко (для 6-ну плита, 1,5 мл обшивка среднего за хорошо рекомендуется). Большинство клеток будет отделить в отдельные клетки после неоднократных закупорить.
Примечание: Старайтесь избегать образование пузырьков при проведении этот шаг. Большинство лабораторий позволяет отделить ткани обожженные стекла пастбищ пипец. 5 мл пипетки с узким концом может быть хорошей альтернативой для этого шага. - Держите трубку на стойку и ждать 1-2 мин позволить коренастый, снимите диссоциированных тканей, чтобы успокоиться. Верхний этап содержащие отделить клетки к новой трубки и разбавляют покрытие средний (5 x объем обшивка среднего за 1 x количество диссоциированных клеток. Например добавьте 5 мл, обшивка среднего за 1 мл отделить клетки).
- Рассчитать плотность клеток с помощью Горяева и семян требуемое количество клеток в пластину культуры с поли D-лизин как шаг 1.1.1 покрытием. Мы рекомендуем для нейрон imaging исследования были рекомендованы 2-4 x 105 клеток на хорошо для блюдо 6 хорошо блюдо/35 мм. Для белка сбора и анализа потребуется более высокой плотности.
Примечание: Не добавляйте слишком много обшивка среднего, среднего покрытие 1-1,5 мл в одном блюде 6-хорошо достаточно для вложений. Чрезмерное количество средних продлит время, необходимое для надлежащего клеток вложения. - Подождите 2-3 часа и проверить в сеяный нейронов под микроскопом. Нейроны начнут расти невриты, когда они придают должным образом.
- Удалите покрытие среднего и добавить 2 мл утепленные мыть среднего (37 ° C) в блюдо, чтобы смыть средство покрытия. Повторите этот шаг два раза.
- Добавьте 2 мл, полной питательной среды (Таблица 1) в каждую лунку в 6-ну блюдо.
- Измените половина среды каждые 3-4 дня. Подготовка полного среднего свежий каждый раз. Нейроны, культивированный из разных мыши мозга регионов будет иметь различные морфологии и характеристики (рис. 2).
2. transfection плазмидной ДНК в первичный нейрон с липосомами системы
Предупреждение: Для transfection нейрон, эндотоксин бесплатно плазмида ДНК очистки комплект (Таблица материалов) рекомендуется для подготовки ДНК. Дополнительные этанола осадков можно удалить избыток растворителя и повышает концентрации ДНК.
-
На основе липосом трансфекции ДНК в первичной нейронов.
Примечание: Время трансфекции зависит от статуса созревания, необходимые в экспериментах. Нейронов гипоталамуса были transfected в DIV 7-10 (DIV, дней в vitro).- ДНК: Подготовка смеси липосом: разбавляют GFP-GLUT4 плазмида ДНК16 (2 мкг) в microcentrifuge трубки содержащих 300 мкл низкой сыворотки питательной среды. Подготовить еще microcentrifuge трубка с 2 мкл липосомы в 300 мкл низкой сыворотки питательной среды и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Объединить содержимое обеих трубок и инкубировать на 20-30 минут при комнатной температуре.
- Удалите из культуры блюдо нейрон питательной среды. Добавить 600 мкл ДНК липосомы смесь в каждой скважине и инкубировать при 37 ° C для 4-6 ч.
- После 4-6 ч удалите ДНК липосомы смесь и добавить 2 мл питательной среды.
- Флуоресцентный сигналов, таких как только GFP и GLUT4 белков, конъюгированных с тегом GFP (рис. 3 и рис. 4), может наблюдаться после 18-72 ч.
3. жить запись изображения
-
Подготовка клетки для жить изображений
- Культуры WT CCR5- / - гипоталамический нейрон клетки и выражая зеленый флуоресценции белков, помечены транспортера глюкозы 4 (GFP-GLUT4) на #1.5 (или 0,17 мм толщиной) стекла coverslip, который был предварительно покрытых с поли D-Лизин в шаге 1.1.1 в 6-хорошо пластины.
- Тщательно удалите coverslips с нейронами, с помощью щипцов и поместите ее на стекло слайды с осторожностью.
- Удалите лишнюю среднего/жидкость с деликатной задачей салфетки. Складывать салфетки дважды и осторожно поместите их на вершине coverslip. Аккуратно прижмите салфетки без перемещения coverslip.
ВНИМАНИЕ: Не нажимайте coverslip против стеклянное скольжение насильственно. Этот шаг призван обеспечить что coverslip не двигаться/дрейф во время захвата изображений, вызванные сила. - Место coverslips и слайды на деконволюция микроскопа, с облицовкой coverslip вниз и обеспеченных должным образом. Этот шаг, чтобы обеспечить, что слайд позиция остается постоянным, так что пользователи могут отслеживать тот же набор клеток-мишеней позже.
- Соблюдать WT и CCR5- / - клетки гипоталамуса нейрона с 60 x / 1.42 NA масло погружения объектива.
- Лечить образцы выбранной ячейки с CCL5 (10 нг/мл) или инсулин (10 ед/мл) для одной мин добавить 1,5 мкл разбавленного инсулина на краю coverslip.
- Визуализация и немедленно записать образцы выбранной ячейки. Программа записи видео программное обеспечение для записи на 30 мин.
-
Деконволюция микроскопии и анализа
Примечание: Эта часть протокола требует использования микроскопа деконволюция и специализированного программного обеспечения для анализа.- Включите питание системы обработки изображений, позволяют микроскопа для инициализации, а затем включите светодиодный источник света.
- Добавьте масло иммерсионное (преломления 1.520 для живых образцов при 37 ° C) на 60 x 1,42 NA объектива. Поместите образец слайда на микроскоп с coverslip, с которыми сталкиваются сторону объектива и закрепите слайд правильно.
- Используйте ярко поле или флуоресцентной подсветки для идентификации клеток-мишеней. Отрегулируйте фокус, пока клетки-мишени можно ясно наблюдать. Не перемещать объектив вне области coverslip, чтобы избежать ненужных ссадины.
- Определения зеленой флуоресцирование белками конъюгированных 4 транспортера глюкозы (GFP-GLUT4), GFP сигнала. Определение требуемой целевой ячейки для захвата изображений. Выбранный целевой ячейки позицию можно запомнить в будущем (рис. 4).
- Установка надлежащего экспериментальной параметров каждой целевой ячейки (включая число точек, длина волны возбуждения, процент передачи, время экспозиции, толщина стека, интервал времени и общее время обработки изображений). Для этого эксперимента количество пикселей изображения была установлена в 512 x 512 (он может быть установлен на 1024 x 1024 для более высокого разрешения) для GFP сигналов. Время экспозиции был установлен между 0,025 до 0,05, которую s для каждые 5 минут мелкие боковые x, y и z корректировки могут быть проконтролированы рекомендуемое программное обеспечение ( Таблицаматериалов ).
- Установите параметр воздействия примерно 2000-3000 пунктам для достижения максимальной пиксель интенсивности. Для сведения к минимуму флуоресценции Фотообесцвечивание, снизить процент возбуждения пропускания света как можно больше во время экспозиции по поддержанию время менее 1 с. Повторите эти шаги для каждого дополнительного флуоресценции каналы и каждой индивидуальной области интереса.
- Установите верхний и нижний предел Z-стека на каждой целевой ячейки. Это может быть достигнуто путем перемещения микроскопа до тех пор, пока в верхней и нижней части целевой ячейки являются оба слегка не в фокусе. Пользователи могут настроить разрешение оси z, установив количество изображений между верхний и нижний предел (что может быть сделано путем задания расстояния между каждым изображением).
- Стеки изображений были deconvolved и позже в этом случае анализируются с помощью соответствующего программного обеспечения скорости от Перкинэлмер.
Representative Results
Нейронов гипоталамуса, культивированный от мышей были далее определены иммуноокрашивания с гипоталамуса конкретных - про opiomelanocortin (POMC) антитела и нейрональных маркер - микротрубочек связанный протеин 2 (MAP2) (рис. 2A). Мы подтвердили, что основной культурный нейронов гипоталамуса выразил гипоталамуса белка POMC. Выражение рецептор CCR5 и CCL5 в нейронов гипоталамуса были определены с специфическими антителами и совместно помечены POMC антитела (рисунок 2A, 2B).
После 3 дней культивирования, нейроны были transfected с GFP ДНК (рис. 3) или GFP проспряганное GLUT4 (рис. 4). Экспрессия гена GFP обычно можно найти все, что клетки без определенного шаблона (рис. 3), но GLUT4-GFP будет выражать как пунктата как структура в цитозоле (рис. 4). Трансфекция комплект, используемые в данном исследовании не является наиболее эффективным методом для transfection нейрона; Однако это менее строгие метод для лучшего выживаемость клеток после трансфекции, которая способствует лучше жить клеточной изображений/записи позже. Изображения выражая нейронов GFP-GLUT4 были взяты до замедленной съемки фильмов (Рисунок 4A-B, дополнительные видео 1, 2) при стимуляции инсулина или CCL5 стимуляции (рис. 4 c, дополнительные видео 3). Сигналы GFP и GFP-GLUT4 являются ясными и сильным в нейроны.
Нейронов гипоталамуса с transfection GLUT4-ГФП были далее лечение инсулином (40 ед) характеризовать GFP-GLUT4 людьми. Возмутительное видео GLUT4-GFP движения после стимуляции инсулина в WT и CCR5- / - нейронов гипоталамуса показаны видео 1 и видео 2, соответственно.
Рисунок 1: изоляции тканей из разных регионов мозга мыши на эмбриональной стадии (день 16.5). (A-D) Этапы в отделение щенков от плаценты. (E, F) Рассечение головы щенка от тела. (G-я) Этапы в изоляции весь мозг от черепа. Черная стрелка указывает в направлении быть вытащил во время удаления черепа с помощью щипцов. (J) изоляции гипоталамуса. Черная стрелка указывает на гипоталамические региона между щипцами. (K-L) Изоляция коры головного мозга мыши. Черный звездочка указывает регионе коры головного мозга мыши и белая стрелка указывает к разделению корой от весь мозг. (M-O) Отделение части гиппокампа от коры. Верхняя белая стрелка знаменует гиппокампа ткани и нижняя белая стрелка знаменует кортикального слоя ткани. Масштаб баров = 1 см (A-F), 200 мкм (G-O). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: характеристика нейронов гипоталамуса маркера - POMC и Сопредседатель выражение CCL5 и CCR5. (A) основным культивировали нейронов гипоталамуса были помечены нейронов гипоталамуса маркер - POMC (красный), Сопредседатель выражение CCR5 (зеленый) и нейрон маркера MAP2 (серый). (B) CCL5 (зеленый) выражение в POMC (красный) положительных нейронов гипоталамуса (адаптировано из дополнительных данных ссылка17). Здесь DAPI помечены ядро с синим цветом. Масштаб баров = 50 мкм в (A) и (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: белка экспрессия гена GFP в мышь первичной нейронов. GFP плазмида ДНК transfected в основной культурный нейроны после 4 дней культуры (DIV4) с липосомами и выражена еще 3 дней (DIV7). (A-B) GFP выражается в невриты и сома. (C-D) Нейроны с макет трансфекции; DAPI помечены ядро в (B, D). Масштаб баров = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: снимки GFP-GLUT4 в нейронов гипоталамуса. (A, C) Белка GFP-GLUT4 в Wildtype (WT) нейронов гипоталамуса и (B) выразил CCR5- / - нейронов гипоталамуса. Нейроны были стимулируется с инсулина (A, B) или CCL5 (C). Стрелки указывают GFP-GLUT4 пунктата в неврит до (-) и после (+) инсулин или CCL5 стимуляции и звездочки указывают на поверхности GLUT4-GFP до (-) и после (+) CCL5 стимуляции (C). (Рисунок адаптировано из ссылка17). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| 5 х Borade буфера | Компания | Номер каталога | Объем |
| Борная кислота | Sigma-Aldrich | B6768 | 1.55 g |
| Буры | Sigma-Aldrich | 71997 | 2,375 g |
| ddH2O | 100 мл | ||
| Фильтруется, хранить при 4 ° C | |||
| 20 x поли-D-лизин фондовой | Компания | Номер каталога | Объем |
| Поли D-лизин | Sigma-Aldrich | P6407 | 100 мг |
| ddH2O | 100 мл | ||
| Фильтруется, держите при температуре-20 ° C | |||
| 1 x поли D-лизин | Объем | ||
| 20 x поли D-лизин | 5 мл | ||
| 5 х Borade буфера | 20 мл | ||
| ddH2O | 75 мл | ||
| Итого | 100 мл | ||
| Хранить при 4 ° C | |||
| Вымойте среднего | Компания | Номер каталога | Объем |
| Глюкоза DMEM-высокий | GIBCO | 12800-017 | 495 мл |
| Антибиотик Antimyotic | GIBCO | 15240-062 | 5 мл |
| Итого | 500 мл | ||
| Хранить при 4° C | |||
| Папаин-трипсин пищеварение буфер: | Компания | Номер каталога | Объем/окончательная концентрация |
| Папаин (10 мг/мл) | Sigma-Aldrich | P4762 | 200 мкл (2 мг/мл) |
| Трипсин ЭДТА (0,25%) | GIBCO | 25200-072 | 200 МКЛ (0,05%) |
| Вымойте среднего | 600 МКЛ | ||
| Итого | 1000 МКЛ | ||
| Хранить при температуре от-20 ° C | |||
| Обшивка среднего: | Компания | Номер каталога | Объем |
| Neurobasal средний | GIBCO | 21103-049 | 176 мл |
| Плода бычьим сывороточным | GIBCO | 10437-028 | 20 мл |
| L-глутаминовой кислоты (200 мм) | GIBCO | 25030 | 2 мл |
| Антибиотик Antimyotic | GIBCO | 15240-062 | 2 мл |
| Итого | 200 мл | ||
| Хранить при 4 ° C | |||
| Полная культуры среднего | Компания | Номер каталога | Объем |
| Neurobasal средний | GIBCO | 21103-049 | 95 мл |
| N2 дополнение (100 x) | GIBCO | 17502-048 | 1 мл |
| B27 дополнение (50 x) | GIBCO | 17504-04 | 2 мл |
| L-глутаминовой кислоты (200 мм) | GIBCO | 25030 | 1 мл |
| Антибиотик Antimyotic | GIBCO | 15240-062 | 1 мл |
| Итого | 100 мл | ||
| Свежеприготовленные |
Таблица 1: Пищеварение буфера и СМИ состав используется в данном исследовании.
Дополнительные видео 1: Инсулин стимулирует GFP-GLUT4 движение в WT нейронов гипоталамуса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные видео 2: Инсулин стимулирует GFP-GLUT4 движение в CCR5- / - нейронов гипоталамуса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные видео 3: CCL5 стимулирует GFP-GLUT4 движение в WT нейронов гипоталамуса (Видео взято из ссылка17). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Возможность контролировать живых клеток, при CCL5 или инсулин стимуляции, является критически важным для изучения быстрого эффекта CCL5 или инсулина на GLUT4 движения. В самом деле это позволяет нам визуализировать существенное различие между WT и CCR5- / - нейронов гипоталамуса после стимуляции инсулина. Мы выполнили поверхности маркировки эндогенного белка GLUT4 в WT и CCR5- / - нейронов гипоталамуса в разное время точках после инсулина стимуляции17. Маркировки белков клеток поверхности требует высокой специфичности антитела с низким фоном. Кроме того поверхности флуоресценции количественной оценки также может быть сложным и трудоемким. Таким образом покадровой записи позволяет нам быть уверены, что эффект CCL5 или инсулин является истинной физиологических изменений, основанных на экспериментальных условиях, вместо того, чтобы статистические вариации. Вместе с поверхности маркировки эндогенного GLUT4, мы предоставляем убедительные доказательства и экспериментов, чтобы продемонстрировать, как CCL5 и CCR5 участвуют в GLUT4 транслокации и инсулина сигнализации.
В современной клеточной биологии и молекулярной биологии исследования многие эксперименты требуют использования микроскопии флуоресцирования. Эта технология позволяет ученым для визуализации пространственных отношений между белков и/или клеточных органелл, помимо направления движения и скорости, стимулирующее воздействие, морфологические изменения и белка людьми. Однако, эта технология по-прежнему имеет свои ограничения: при возбуждении флуорофоров, сигналов от целевого белка (или области) может быть перегружены фон флуоресценции. В результате флуоресценции изображения можно размытым с ожидаемой сигналов, похоронены глубоко в фон сигналов. Это явление особенно очевидна для наблюдения за мембраны прыгните белков.
Общая микроскопии флуоресцирования внутреннего отражения (TIRFM) была разработана для преодоления этой трудности. Это позволяет ученым представить возбуждения отдельных привязанных к поверхности флуорофоров, не затрагивая фон флуорофоров. Это позволяет ученым выборочно охарактеризовать функции и события на очень тонкой поверхности региона например плазматической мембраны. Деконволюция микроскопии-образ интенсивных вычислений, обработки технику, что стало возможным с помощью технологических достижений за последние годы. Он часто использовались для улучшения разрешения изображения цифровой флуоресценции. Как упоминалось ранее, когда флуорофоров возбуждаются любые виды освещения (например, лазерные и светодиодные), все флуорофоров будет излучать световые сигналы независимо от если они находятся в центре внимания или нет, поэтому изображение всегда будет размытым. Это размывание вызвано явление под названием «Точка распространения функция» (ФСФ), как свет приходя от источника небольшой флуоресцентные (яркое пятно) будет распространяться дальше и стать не в фокусе (размытие). В принципе это событие будет производить Песочные часы как формы флуоресцентного сигнала, и образ флуоресценции может состоять из многочисленных такие световые сигналы. Деконволюция процесс может переназначить все сигналы флуоресценции к своей первоначальной форме яркие пятна и устранить большинство из фокус света улучшить контрастность изображения.
В последние годы деконволюция алгоритмы создают изображения с сопоставимыми резолюции что конфокального микроскопа. Кроме того по сравнению с TIRFM, который предотвращает размытие вне фокуса будучи обнаруженным ограниченной возбуждения региона,-поля микроскопии позволяет всем свет сигналы, чтобы быть обнаружены и переназначает их обратно к их источнику через процесс деконволюции. Таким образом на практике, деконволюции микроскопии стала не только более эффективный метод получения изображения, но и более эффективный метод по сравнению с TIRF микроскопии.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарны за субсидии, предоставленные Министерством науки и технологии, Тайвань - MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) и здравоохранения и социального обеспечения за дополнительную плату табачных изделий - MOHW106-TDU-B-212-144001 с S-Y.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
| SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
| VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
| Insulin | Actrapid, Denmark | ||
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
| GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
| Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
| CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
| 12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
| micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
| curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
| 5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |
References
- Levin, B. E., Sherwin, R. S. Peripheral glucose homeostasis: does brain insulin matter? J Clin Invest. 121 (9), 3392-3395 (2011).
- Kleinridders, A., Ferris, H. A., Cai, W., Kahn, C. R. Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function. Diabetes. 63 (7), 2232-2243 (2014).
- Duarte, A. I., Moreira, P. I., Oliveira, C. R. Insulin in central nervous system: more than just a peripheral hormone. J Aging Res. 2012, 384017 (2012).
- Vogt, M. C., Bruning, J. C. CNS insulin signaling in the control of energy homeostasis and glucose metabolism - from embryo to old age. Trends Endocrinol Metab. 24 (2), 76-84 (2013).
- Plum, L., Schubert, M., Bruning, J. C. The role of insulin receptor signaling in the brain. Trends Endocrinol Metab. 16 (2), 59-65 (2005).
- Lin, X., et al. Dysregulation of insulin receptor substrate 2 in beta cells and brain causes obesity and diabetes. J Clin Invest. 114 (7), 908-916 (2004).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. J Biol Chem. 279 (34), 35298-35305 (2004).
- Thaler, J. P., Guyenet, S. J., Dorfman, M. D., Wisse, B. E., Schwartz, M. W. Hypothalamic inflammation: marker or mechanism of obesity pathogenesis? Diabetes. 62 (8), 2629-2634 (2013).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61 (6), 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Exp Diabetes Res. 2012, 847246 (2012).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61 (7), 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (7), E897-E906 (2013).
- Chan, O., Burke, J. D., Gao, D. F., Fish, E. N. The chemokine CCL5 regulates glucose uptake and AMP kinase signaling in activated T cells to facilitate chemotaxis. J Biol Chem. 287 (35), 29406-29416 (2012).
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266 (5 Pt 2), R1711-R1715 (1994).
- Mayer, C. M., Fick, L. J., Gingerich, S., Belsham, D. D. Hypothalamic cell lines to investigate neuroendocrine control mechanisms. Front Neuroendocrinol. 30 (3), 405-423 (2009).
- Lizunov, V. A., et al. Insulin stimulates fusion, but not tethering, of GLUT4 vesicles in skeletal muscle of HA-GLUT4-GFP transgenic mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (8), E950-E960 (2012).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
