Summary
Este protocolo descreve uma técnica para observação de tempo real verde fluorescência proteína (GFP) com a tag 4 de transportador de glicose (GLUT4) proteína tráfico após estimulação da insulina e caracterização da função biológica de CCR5 na insulina – GLUT4 sinalização via com microscopia de deconvolução.
Abstract
Diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) é uma crise de saúde global, que se caracteriza pela insulina sinalização imparidade e inflamação crônica em tecidos periféricos. O hipotálamo no sistema nervoso central (SNC) é o centro de controle de energia e insulina resposta regulamento do sinal. Inflamação crônica nos tecidos periféricos e os desequilíbrios de certos quimiocinas (como CCL5, TNFa e IL-6) contribuem para a obesidade e diabetes. No entanto, o mecanismo (s) funcional conectando quimiocinas e regulamento de sinal hipotalâmico de insulina ainda permanecem obscuros.
In vitro de neurônio primário cultura modelos são modelos simples e convenientes que podem ser usados para investigar o Regulamento de sinal de insulina nos neurônios do hipotálamo. Neste estudo, introduzimos exogeneous GLUT4 proteína conjugada com GFP (GFP-GLUT4) em neurônios hipotálamo primários para rastrear GLUT4 translocação de membrana após estímulo de insulina. Lapso de tempo imagens de tráfico de proteína GFP-GLUT4 foram gravadas por microscopia de deconvolução, que permitia aos usuários gerar imagens de alta resolução e alta velocidade, sem danificar os neurônios significativamente durante a realização do experimento. A contribuição de CCR5 na translocação de GLUT4 insulin regulada foi observada em neurônios deficientes CCR5 hipotalâmicas, que foram isolados e cultivados de ratos do KO CCR5. Nossos resultados demonstraram que a eficiência de translocação do GLUT4 membrana foi reduzida no CCR5 deficiente hipotalâmicas neurônios após a estimulação da insulina.
Introduction
Diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) é uma crise de saúde global. T2DM caracteriza-se por sinalização de imparidade e inflamação crônica em tecidos periféricos de insulina. O hipotálamo é o centro de controle que regula a homeostase de energia, apetite e ritmos circadianos do corpo. Mais importante, o hipotálamo também Medeia a resposta do sinal de insulina para regular o metabolismo sistêmico1,2,3,4,5. Interfere com a insulina hipotalâmica sinalização via poderia induzir insulina resistência6,7. O hipotálamo coordena o status de energia celular e secreção de hormônios, como insulina e adipocinas (por exemplo, leptina) dos tecidos periféricos, para regular o metabolismo da glicose sistêmica, capacidade de resposta de insulina e ingestão de alimentos. Ligação da insulina ao receptor de insulina ativa a insulina receptor substrato (IRS) as proteínas, em seguida, ativar a jusante moléculas sinalizadoras de insulina, tais como PI3K (fosfatidilinositol 3-quinase) e AKT (proteína quinase B (PKB/AKT)), para induzir GLUT4 translocação da membrana. Neurônios não são o principal alvo para a absorção de glicose em resposta à insulina; no entanto, foram identificados níveis significativos de expressão do GLUT4 na região hipotalâmico Núcleo arqueado (ARC). Portanto, o Regulamento de GLUT4 nos neurônios do hipotálamo pode desempenhar um papel importante na sinalização do eixo cérebro-periférico de insulina.
Muitos estudos têm sugerido que a inflamação crônica e quimiocinas inflamatórias no hipotálamo também desempenham um papel importante no desenvolvimento do diabetes e obesidade, e inibição da inflamação hipotalâmica pode reverter a resistência à insulina induzida pela dieta 8 , 9 , 10. Além disso, chemokine-CCL5 (ligante 5, também conhecido como RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted de C-C motif) e seus níveis de receptor CCR5 também se correlacionam com o desenvolvimento do T2DM11,12. Os papéis de CCL5 e CCR5 no metabolismo de função e glicose insulina permanecem obscuros. Um estudo relatou que a deficiência CCR5 protegidos ratos da inflamação induzida pela obesidade, recrutamento de macrófagos e insulina resistência11; em contrapartida, outro estudo relatou que CCR5 deficiência prejudica a tolerância à glicose sistêmica, bem como dos adipócitos e muscular insulina sinalização12. CCL5 é encontrado para aumentar a absorção de glicose nas células-T e a reduzir a ingestão de alimentos através de sua ação sobre o hipotálamo13,14, no entanto, tanto o mecanismo de ação e os receptores envolvidos ainda estão para ser identificado.
É difícil estudar os mecanismos celulares subjacentes o efeito da inflamação do tecido periférico na insulina funcionamento nos neurônios do hipotálamo. Isto é devido ao celulares normas de gabarito de circuito de heterogeneidade e neurônio. Por esta razão, um modelo de cultura in vitro célula fornece um modelo limpo para investigar os efeitos do chemokine sobre regulamento do sinal de insulina hipotalâmico. Embora existam que muitas estabelecidas linhas de célula neuronal hipotalâmica imortalizado para uso de pesquisa, estas linhas de célula expressaram marcadores diferentes e portanto, representam diferentes tipos de neurônios do hipotálamo15. Apesar de culturas primárias hipotalâmicas podem ser difícil de manter, eles podem fornecer a resposta mais realista dos neurônios hipotalâmicas mediante estímulo de insulina e também podem evitar o potencial de efeitos desconhecidos, que entram em jogo durante a manutenção de células a longo prazo em meio de cultura com fatores de crescimento artificiais.
Neste documento, podemos utilizar neurônios hipotálamo primários de C57BL/6 sua (WT) do rato e do rato CCR5 nocaute (CCR5- / -) e transfect os dois tipos de células com GFP-GLUT4 Construa. Para investigar a contribuição da CCR5 para tráfico de membrana de GLUT4 de insulina mediada, GFP-GLUT4 transfectadas neurônios foram tratados com insulina ou CCL5 recombinante. Podemos então caracterizar o movimento de GFP-GLUT4 na membrana plasmática em neurônios hipotálamo primários com microscopia de deconvolução.
Protocol
Todos os protocolos e métodos utilizados em assuntos animais tenham sido aprovados pelo cuidado de Animal institucional e comissões de utilização (IACUC) da Universidade de medicina de Taipei (números de protocolo: LAC-2013-0278; LAC-2015-0397)
1. cultura do neurônio primário
- Preparação antes de cultura
- Revesti os pratos de cultura com poli-D-lisina (tabela 1) um dia antes de cultura. Por um prato de 6-poço, adicione 1,5 mL poli-D-lisina (0,05 mg/mL) em cada poço. Para viver-tratamento de imagens, cultura de células em uma lamela de 12 x 12 mm em uma placa padrão de revestido 6.
- Remover/reciclar o poli-D-lisina e lavar a louça duas vezes com 2ml ddH2O.
- Preparar os instrumentos cirúrgicos: um par de microdissecando tesoura e pinça com ponta curva padrão pinça com ponta reta. Esterilizar os instrumentos cirúrgicos e mantê-los em etanol a 75% durante a cirurgia.
- Encher os pratos de petri de 10 cm com 20 mL de meio de lavagem (tabela 1) e mantenha-se em gelo.
- Encher um tubo de ensaio de 15 mL com 15 mL de meio de lavagem e mantenha o tubo no gelo.
- Isolamento de tecido cerebral de regiões diferentes do cérebro
- Sacrificar os ratos fêmeas grávidas de 16-19 dias velho com protocolos padrão eutanásia colocando ratos em uma gaiola sem ventilação e então inebriante com CO2. E15.5 ~ E16.5 embriões são recomendados para a cultura neuronal hipotalâmica e E16.5 ~ E17.5 são mais adequados para a cultura neuronal cortical e hippocampal.
- Esterilize a plataforma, microscópio de dissecação e ferramentas de cirurgia com 75% de etanol para evitar contaminação.
- Corte ao redor da área do cordão umbilical (área vermelha escura, linha de traço figura 1A, 1B ) para isolar os filhotes facilmente sem danificá-los (Figura 1, 1D).
- Remover a parte principal de cada filhote com uma tesoura (Figura 1E, F) e, em seguida, fixe a parte de cabeça no lugar, usando a pinça reta ponta fina para a região do olho (Figura 1). Uso que outro de ponta fina curva pinça para remover a pele exterior e o crânio dos dois lados e descascá-los da câmara anterior à direção dorsal (Figura 1 H, preto seta aponta para a direção). O cérebro deve ser isolado, sem nenhum dano (Figura 1I).
Nota: É essencial para manter a integridade do cérebro para garantir a precisão quando isolando diferentes regiões do cérebro. - Manter o cérebro isolado num recipiente limpo com o meio de lavagem gelada para as etapas seguintes.
- O cérebro da aleta e continue pelo lado ventral. O hipotálamo é uma estrutura redonda no meio do cérebro (Figura 1J, seta aponta para a região hipotalâmica). Isole o tecido hipotalâmico com pinça curva ponta fina. Remover as meninges (que tem uma cor vermelho-amarelado) cuidadosamente.
Cuidado: Remoção completa das meninges é um passo fundamental para evitar a contaminação dos fibroblastos. - Segure o lóbulo olfativo com o fórceps afiada e retire as finas meninges que envolvem o cérebro inteiro com a pinça curva (Figura 1, K, L).
- O hipocampo é uma forma de banana, como que é encaixada na parte inferior do córtex. Virar para o lado de baixo do córtex e separar o córtex do hipocampo, puxando-a para o lado com a pinça curva (Figura 1 MN e O). Não se esqueça de remover todos os restantes meninges que envolvem o tecido cerebral.
- Quando todas as regiões do cérebro têm sido isoladas, corte estes tecidos em tubos de 15 mL contendo meio de lavagem gelada com a ajuda da pinça (etapa 1.1.5).
Nota: Os tecidos do cérebro podem ser mantidos no meio de lavagem gelada para 2-3 h.
- Cultura, chapeamento e digestão do tecido
- Lave os tecidos por inversão do tubo de 15 mL contendo tecido 2 - 3 vezes e em seguida, manter o tubo reto para permitir que os tecidos para se estabelecer (1-3 min).
- Remover o médio superior usando o pipeta Pasteur de vidro ligado a um sistema de vácuo. Para lavar o tecido, adicionar 15 mL de meio de lavagem frio gelo e inverter o tubo 2 - 3 vezes. Repita as etapas de lavagem 3 vezes antes da próxima etapa.
Atenção: Seja cauteloso dos tecidos na parte inferior ao remover o médio superior usando um sistema de vácuo. - Após a lavagem final, remova o meio de lavagem com a ajuda de uma pipeta de 1 mL.
- Incube tecidos com tampão de digestão papaína-tripsina (tabela 1) em um banho de água de 37 ° C por 7-14 min.. agitar os tubos de cada 2 min para garantir todos os tecidos são devidamente exposto para o buffer de digestão.
Nota: Tempo de incubação e o volume de tampão de digestão podem ser ajustados baseado no tamanho tecido. Para tecido hipotalâmico coletado de 6 a 8 filhotes, recomenda-se 300 µ l papaína-tripsina digestão buffer e 7 min tempo de incubação. Mais tecido exigirá mais tampão de digestão. - Neutralize a atividade da enzima está adicionando 1 volume de soro fetal bovino. Agite o tubo de ensaio 3 - 5 vezes à temperatura ambiente.
- Mantenha o tubo nas prateleiras e esperar 1-2 min permitir que os tecidos assentar; Remova o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL.
- Adicione 6 mL chapeamento médio (tabela 1) no tubo de ensaio e pipetar o altos e baixos de tecido 50 vezes com uma pipeta de 5 mL suavemente (para uma placa de 6, 1,5 mL de meio de chapeamento por alvéolo é recomendada). A maioria das células vou apartar em únicas pilhas após repetidas pipetagem.
Nota: Tente evitar a formação de bolhas durante a realização desta etapa. A maioria dos laboratórios usam pipetas de vidro inflamado pasto para dissociar o tecido. Uma pipeta de 5 mL com uma ponta estreita pode ser uma boa alternativa para esta etapa. - Mantenha um tubo na prateleira e esperar 1-2 min permitir que os tecidos robustos, não-dissociados de assentar. A fase superior contendo dissociada de células para um tubo novo e diluir com chapeamento médio (5 x médio de chapeamento de volume por volume de 1x de células dissociadas. Por exemplo, adicione 5 mL de chapeamento médio para 1 células mL dissociada).
- Calcular a densidade de células usando um hemocytometer e propagar o número necessário de células na placa de cultura revestidas com poli-D-lisina como na etapa 1.1.1. Recomenda-se 2-4 x 105 células por poço para um prato de mm 6 prato bem/35 foram recomendados para neurônio, estudos de imagem. Seria necessário uma maior densidade para análise e coleta de proteína.
Nota: Não adicione muito médio de chapeamento, 1-1,5 mL de meio de chapeamento em um prato bem 6 é suficiente para fixação. Uma quantidade excessiva de médio vai prolongar o tempo necessário para a fixação adequada de célula. - Esperar 2-3 h e verificar os neurônios semeados sob o microscópio. Os neurônios começará crescer neurite quando eles atribuem corretamente.
- Remover o meio de chapeamento e adicionar 2 mL aquecido de meio de lavagem (37 ° C) para o prato de tirar o meio de chapeamento. Repita duas vezes.
- Adicione 2 mL de meio de cultura completo (tabela 1) em cada poço no prato 6-poços.
- Metade do meio de mudar a cada 3-4 dias. Prepare o suporte completo na hora cada vez. Neurônios cultivados de regiões do cérebro do rato diferentes terão diferente morfologia e características (Figura 2).
2. transfection do ADN do plasmídeo em neurônio primário com sistema lipossoma
Atenção: Para transfeccao de neurônio, um kit de purificação de DNA de plasmídeo livre de endotoxinas (Tabela de materiais) é recomendado para a preparação de DNA. Precipitação de etanol adicional pode remover o solvente em excesso e aumenta a concentração de DNA.
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Baseado em lipossomas transfeccao de DNA nos neurônios primários.
Nota: O tempo de transfeccao depende o estado de maturação exigido em experimentos. Os neurônios do hipotálamo foram transfectados na DIV 7-10 (DIV, dias em vitro).- DNA: Preparação de mistura lipossoma: diluir GFP-GLUT4 Plasmideo DNA16 (2 µ g) numa microcentrifuga tubo contendo 300 µ l soro baixo meio de cultura. Prepare outra microcentrifuga tubo com 2 lipossoma µ l 300 µ l soro baixo meio de cultura e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
- Combinar o conteúdo de ambos os tubos e incube por 20-30 min à temperatura ambiente.
- Retire o prato de cultura, o meio de cultura de neurônio. Adicione a mistura de DNA-lipossoma 600 µ l em cada poço e incubar a 37 ° C, durante 4-6 h.
- Após 4-6 h, retire a mistura do DNA-lipossoma e adicionar 2 mL de meio de cultura.
- Observam-se sinais fluorescentes, tais como GFP sozinho e proteína GLUT4 conjugados com tag GFP (Figura 3 e Figura 4), após 18-72 h.
3. gravação de imagem ao vivo
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Preparar células para vivem de imagem
- Cultura WT e CCR5- / - neurônio hipotalâmico celulas que expressam proteínas fluorescência verde rotulada transportador de glicose 4 (GFP-GLUT4) sobre o #1.5 (ou 0,17 mm de espessura) lamela de vidro que tem sido revestida com poli-D-lisina na etapa 1.1.1 no 6-poço placa.
- Retire as lamelas com neurônios usando fórceps cuidadosamente e coloque-o sobre as lâminas de vidro com cautela.
- Remova o excesso de médio/líquido com toalhitas delicada tarefa. Dobre as limpezas duas vezes e com cuidado, coloque-os em cima da lamela. Pressione suavemente para baixo as toalhitas sem mover a lamela.
Atenção: Não pressione a lamela contra a lâmina de vidro com força. A finalidade desta etapa é garantir que o lamela não mover/deriva durante a aquisição de imagem causada pela força de empuxo. - Coloca lamelas e desliza no palco deconvolução microscópio, com o revestimento de lamela no chão e protegido adequadamente. Esta etapa é para garantir que a posição do slide permanece constante, então os usuários podem acompanhar o mesmo conjunto de células alvo mais tarde.
- Observar o WT e CCR5- / - neurônio hipotalâmico células com um x 60 / 1,42 at óleo lente objetiva de imersão.
- Tratar as amostras de célula selecionada com CCL5 (10 ng/mL) ou insulina (10 U/mL) para um min. adicionar 1,5 µ l de insulina diluída na borda da lamela.
- Visualizar e gravar as amostras de célula selecionada imediatamente. Programa do software de gravação de vídeo para gravar por 30 min.
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Deconvolução microscopia e análise
Nota: Esta parte do protocolo requer o uso de um microscópio de deconvolução e software especializado para análise.- Ligue a alimentação do sistema de geração de imagens, permitir que a fase de microscópio inicializar corretamente e em seguida, ligue a fonte de luz LED.
- Adicione o óleo de imersão (índice de refração 1.520 para amostras vivas a 37 ° C) em uma 60 x 1,42 NA objectiva. Coloque o slide de amostra no microscópio com a lamela virada para a lente objetiva e fixe o slide corretamente.
- Use iluminação brilhante-campo ou fluorescência para identificar células-alvo. Ajuste o foco até nas células-alvo podem ser claramente observadas. Não mova a lente objetiva fora da área de lamela para evitar arranhões desnecessários.
- Identificar verde proteínas fluorescência conjugado 4 de transportador de glicose (GLUT4-GFP) pelo sinal GFP. Identifica as células de destino desejado para aquisição de imagens. Posição do alvo selecionado célula pode ser memorizada para referência futura (Figura 4).
- Configuração de parâmetros experimentais adequados (incluindo o número de pixel, comprimento de onda de excitação, percentagem de transmissão, tempo de exposição, espessura de pilha, intervalo de tempo e tempo total de imagem) em cada célula de destino. Para este experimento, o número de pixels de imagem foi fixado em 512 x 512 (ela pode ser definida em 1.024 x 1.024 para maior resolução) para sinais GFP. O tempo de exposição foi definido entre 0,025 a 0,05 s para cada x lateral menor de 5 min., y e z ajustes pode ser controlado pelo software recomendado ( tabelademateriais ).
- Defina o parâmetro de exposição para aproximadamente 2.000 a 3.000 contagens para alcançar a intensidade máxima de pixel. Para minimizar a fluorescência fotobranqueamento, reduza a percentagem de transmissão de luz de excitação tanto quanto possível, enquanto manter exposição tempo inferior a 1 s. Repita estes passos para cada canal (s) adicional de fluorescência e cada área individual de interesse.
- Defina o limite superior e inferior da pilha-Z em cada célula de destino. Isto pode ser conseguido movendo o estágio de microscópio até a parte superior e inferior da célula de destino são ambos ligeiramente fora de foco. Os usuários podem ajustar a resolução do eixo z, definindo o número de imagens entre o limite superior e inferior (que pode ser feito definindo a distância entre cada imagem).
- Pilhas de imagens foram deconvolved e posteriormente analisadas com a ajuda do respectivo software – velocidade da PerkinElmer neste caso.
Representative Results
Os hipotálamo neurônios cultivados de ratos mais foram identificados por imunocoloração com proteína específica hipotalâmico - pro-opiomelanocortin (POMC) anticorpo e marcador neuronal - microtubule-associada da proteína 2 (MAP2) (Figura 2A). Confirmamos que os neurônios hipotálamo culturas primários expressaram proteína hipotalâmica POMC. A expressão do receptor CCR5 e CCL5 nos neurônios do hipotálamo foram identificadas com anticorpos específicos e co rotulado com anticorpo POMC (Figura 2A, 2B).
Após 3 dias de cultivo, os neurônios foram transfectados com DNA de GFP (Figura 3) ou GFP conjugados GLUT4 (Figura 4). Expressão de GFP geralmente pode ser encontrado toda parte que a célula sem um padrão específico (Figura 3), mas o GLUT4-GFP irá expressar como uma estrutura punctate no citosol (Figura 4). O kit de transfeccao utilizado neste estudo não é o método mais eficiente para transfeccao de neurônio; no entanto, é um método menos rigoroso para melhor sobrevivência da pilha após a transfeccao, que contribui para melhor viver-pilha de imagem/gravação mais tarde. As imagens dos neurônios expressando GFP-GLUT4 foram tiradas antes filmes de lapso de tempo (Figura 4A-B, vídeo complementar 1, 2) após estímulo de insulina ou estimulação CCL5 (Figura 4, vídeo complementar 3). Os sinais de GFP e GFP-GLUT4 são claras e fortes nos neurônios.
Hipotalâmicas neurônios com transfeccao de GLUT4-GFP mais foram tratados com insulina (40 U) para caracterizar tráfico de GFP-GLUT4. Reprehensive vídeos do movimento de GLUT4-GFP após estímulo de insulina em ambos WT e CCR5- / - hipotalâmicas neurônios são mostrados como Video 1 e Video 2, respectivamente.
Figura 1: isolamento de tecidos de diferentes regiões do cérebro do rato na fase embrionária (dia 16,5). (A-D) As etapas envolvidas na separação dos filhotes da placenta. (E, F) A dissecação de uma cabeça de cachorro do corpo. (G-eu) As etapas envolvidas no isolamento do cérebro inteiro do crânio. Os pontos de seta preta no sentido de ser puxado ao remover o crânio usando fórceps. (J) o isolamento do hipotálamo. Os pontos de seta preta à região hipotalâmica entre fórceps. (K-L) Isolamento do córtex do cérebro do rato. O asterisco preto indica a região cortical do cérebro do rato e a seta branca aponta para a separação do córtex do cérebro inteiro. (M-O) A separação da porção hippocampal do córtex. A seta branca superior marca o tecido hippocampal e a seta inferior branca marca o tecido cortical. Barras de escala = 1 cm (A-F), 200 µm (G-O). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: caracterização do marcador neuronal hipotalâmica - POMC e a expressão co de CCL5 e CCR5. (A) principal culto hipotalâmicas neurônios foram rotulados com marcador neuronal hipotalâmica - POMC (vermelho), a expressão co do CCR5 (verde) e o neurônio marcador MAP2 (cinza). (B) o CCL5 (verde) expressão em neurônios hipotálamo POMC (vermelho), positivos (adaptado a partir dos dados suplementares da referência17). Aqui, o DAPI rotulado o núcleo com cor azul. Barras de escala = 50 µm em (A) e (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: expressão de proteína GFP em neurônios primários de rato. GFP Plasmídeo transfected em neurônios cultivados preliminares após cultura de 4 dias (DIV4) com lipossomas e expressa por mais de 3 dias (DIV7). (A-B) GFP é expressa em neurite e soma. (C-D) Neurônios com transfeccao simulado; DAPI rotulado o núcleo em (B, D). Barras de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: os instantâneos de GFP-GLUT4 nos neurônios do hipotálamo. (A, C) Proteína GFP-GLUT4 expressos em neurônios hipotálamo sua (WT) e (B) CCR5- / - neurônios hipotalâmicas. Os neurônios foram estimulados com insulina (A, B) ou CCL5 (C). As setas apontam para a GFP-GLUT4 punctate na neurite antes (-) e depois (+) insulina ou estimulação CCL5 e asteriscos apontam para a superfície GLUT4-GFP antes (-) e depois (+) CCL5 estimulação em (C). (Figura adaptada de referência17). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 5 x tampão Borade | Companhia | Número de catálogo | Volume de |
| Ácido bórico | Sigma-Aldrich | B6768 | 1,55 g |
| Bórax | Sigma-Aldrich | 71997 | g 2,375 |
| ddH2O | 100 mL | ||
| Filtrado, manter a 4 ° C | |||
| 20 x estoque de poli-D-lisina | Companhia | Número de catálogo | Volume de |
| Poli-D-lisina | Sigma-Aldrich | P6407 | 100 mg |
| ddH2O | 100 mL | ||
| Filtrado, manter a-20 ° C | |||
| 1 x poli-D-lisina | Volume de | ||
| 20 x poli-D-lisina | 5 mL | ||
| 5 x tampão Borade | 20 mL | ||
| ddH2O | 75 mL | ||
| Total | 100 mL | ||
| Manter a 4 ° C | |||
| Médio de lavagem | Companhia | Número de catálogo | Volume de |
| DMEM-alta glicose | Gibco | 12800-017 | 495 mL |
| Antibiótico-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 5 mL |
| Total | 500 mL | ||
| Manter a 4° C | |||
| Tampão de digestão de papaína-tripsina: | Companhia | Número de catálogo | Concentração de volume/Final |
| Papaína (10 mg/mL) | Sigma-Aldrich | P4762 | 200 µ l (2 mg/mL) |
| Trypsin-EDTA (0,25%) | Gibco | 25200-072 | 200 Μ L (0.05%) |
| Médio de lavagem | 600 Μ l | ||
| Total | 1.000 Μ l | ||
| Manter a-20 ° C | |||
| Chapeamento do meio: | Companhia | Número de catálogo | Volume de |
| Neurobasal médio | Gibco | 21103-049 | 176 mL |
| Soro fetal bovino | Gibco | 10437-028 | 20 mL |
| L-glutamato (200 mM) | Gibco | 25030 | 2 mL |
| Antibiótico-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 2 mL |
| Total | 200 mL | ||
| Manter a 4 ° C | |||
| Meio de cultura completo | Companhia | Número de catálogo | Volume de |
| Neurobasal médio | Gibco | 21103-049 | 95 mL |
| Suplemento de N2 (100 x) | Gibco | 17502-048 | 1 mL |
| B27 suplemento (50x) | Gibco | 17504-04 | 2 mL |
| L-glutamato (200 mM) | Gibco | 25030 | 1 mL |
| Antibiótico-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 1 mL |
| Total | 100 mL | ||
| Preparados na hora |
Tabela 1: Digestão buffer e mídia composição usada neste estudo.
Suplementar vídeo 1: Insulina estimulada GFP-GLUT4 movimento nos neurônios hipotálamo WT. Clique aqui para baixar este arquivo.
Suplementar vídeo 2: Insulina estimulada GFP-GLUT4 movimento no CCR5- / - neurônios hipotálamo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo complementar 3: CCL5 estimulou o movimento de GFP-GLUT4 nos neurônios hipotálamo WT (Vídeo adaptado da referência17). Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
A capacidade de monitorar as células vivas, após estimulação CCL5 ou insulina, é criticamente importante para estudar o efeito rápido de CCL5 ou insulina na circulação de GLUT4. Na verdade, ela nos permite visualizar a diferença significativa entre WT e CCR5- / - hipotalâmicas neurônios após estímulo de insulina. Efetuamos a rotulagem superfície da proteína endógena de GLUT4 no WT e CCR5- / - hipotalâmicas neurônios em pontos diferentes de tempo após a estimulação de insulina17. A rotulagem das proteínas de superfície celular requer alta especificidade anticorpo com baixo fundo. Além disso, quantificação de superfície fluorescência também pode ser difícil e demorado. Assim, gravação de lapso de tempo permite-na certeza de que o efeito de CCL5, ou a insulina é uma verdadeira mudança fisiológica com base em condições experimentais, ao invés de uma variação estatística. Juntamente com superfície rotulagem de GLUT4 endógena, nós fornecemos fortes evidências e experimentos para demonstrar como CCL5 e CCR5 participarem na translocação de GLUT4 e sinalização de insulina.
Estudos de biologia molecular e biologia celular moderna, muitas experiências requerem a utilização de microscopia de fluorescência. Esta tecnologia permite aos cientistas Visualizar a relação espacial entre proteínas e/ou organelas celulares, além de direção de movimento e velocidade, efeitos estimulatórios, alterações morfológicas e tráfico de proteína. No entanto, esta tecnologia ainda tem sua limitação: quando fluorophores são excitadas, os sinais emitidos a partir da proteína do alvo (ou área) podem ser oprimidos por fluorescência de fundo. Como resultado, imagens de fluorescência podem aparecer borradas com sinais esperados, enterrados profundamente em sinais de fundo. Este fenômeno é especialmente evidente para a observação das proteínas de membrana-limite.
Total interna reflexão fluorescência microscopia (TIRFM) foi desenvolvido para superar esta dificuldade. Ele permite que os cientistas Visualizar a excitação do selecionado fluorophores ligados a superfície sem afetar o fundo fluorophores. Permite que os cientistas caracterizar seletivamente recursos e eventos em uma região de superfície muito fina como uma membrana plasmática. Microscopia de deconvolução é uma imagem computacionalmente intensiva transformação técnica que se torna possível com a ajuda dos avanços tecnológicos nos últimos anos. Tem sido frequentemente utilizada para melhorar a resolução da imagem digital de fluorescência. Como mencionado anteriormente, quando fluorophores estão sendo animados por qualquer tipo de iluminação (como laser ou LED), todos os fluorophores emitirá sinais luminosos independentemente se eles estão em foco ou não, então a imagem aparecerá sempre borrada. Esta indefinição é causada por um fenômeno chamado "Função ponto de espalhar" (PSF), como a luz vinda de uma pequena fonte fluorescente (ponto brilhante) vai espalhar ainda mais e tornar-se fora de foco (Desfoque). Em princípio, este evento irá produzir um sinal fluorescente em forma de ampulheta, como, e uma imagem de fluorescência pode ser composta por numerosos tais sinais luminosos. O processo de deconvolução pode reatribuir todos os sinais de fluorescência para sua forma original de mancha brilhante e eliminar a maioria da luz para melhorar o contraste da imagem fora de foco.
Nos últimos anos, algoritmos de deconvolução geraram imagens com uma resolução comparável àquele de um microscópio confocal. Além disso, em comparação com TIRFM, que impede que o Borrão fora de foco sendo detectada por uma região limitada da excitação, microscopia de campo amplo permite que a luz de todos os sinais para ser detectado e reatribui-los a voltar para sua origem através do processo de deconvolução. Portanto, na prática, microscopia de deconvolução tornou-se não só um método mais eficiente de aquisição de imagem, mas também um método mais econômico quando comparado com microscopia TIRF.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos os subsídios fornecidos pelo Ministério da ciência e tecnologia, Taiwan - sobretaxa MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3), saúde e bem-estar dos produtos do tabaco - MOHW106-TDU-B-212-144001-S-Y C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
| SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
| VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
| Insulin | Actrapid, Denmark | ||
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
| GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
| Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
| CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
| 12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
| micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
| curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
| 5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |
References
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