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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

代替体外ウイルスのカプシド構造健全性の定量方法

Published: November 16, 2017 doi: 10.3791/56444
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Food, Bioprocessing, and Nutrition Sciences, North Carolina State University, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, North Carolina State University

Summary

ウイルス遺伝子増幅を利用したルーチンの検出方法は、非感染性粒子から感染を区別する無力によって制限されます。この資料の目的は、アプタマー バインディング、動的光散乱、透過型電子顕微鏡を用いた感染症ノロウイルス粒子の識別を支援する別の方法について詳細なプロトコルを提供することです。

Abstract

ヒトのノロウイルスは、かなりの公衆衛生と世界的な経済損失を強要します。体外新興栽培の進歩はまだ適用されませんルーチン検出ウイルスのためです。電流検出と定量化技術は、核酸増幅に主に依存している差別しない非感染性のウイルス粒子の感染。この資料の目的は、さらにウイルス粒子の感染状況に関する情報を取得するために一緒に使用される技術の最近の進歩に関する特定の詳細を提示することです。1 つの技法は、カプシドにノロウイルス一本鎖 Dna アプタマーの結合を評価します。簡単に合成し、変更されているという利点がある、アプタマーとは、安価で安定しました。別の手法、動的光散乱 (DL)、ソリューションにおけるキャプシド挙動を観察することの利点があります。電子顕微鏡によるウイルスのカプシドの構造の整合性の可視化が可能です。有望なが非特異的アプタマーへのバインディングなど荷電分子サンプル マトリックスから dl、精製キャプシドの要件と感度不良電子顕微鏡検査のためのそれぞれの手法のいくつかの欠点があります。それにもかかわらず、これらの技術を組み合わせて使用する場合生成データの体について説明しますより包括的な感染性の正確な評価のために不可欠である情報を推論するためノロウイルス キャプシドの整合性不活化メソッドまたはウイルスの検出の解釈。この資料では、感染のヒトのノロウイルス粒子を識別するこれらのメソッドを使用してプロトコルを説明します。

Introduction

ヒトのノロウイルスはかなり保健負担を担当、世界的に約 6 億 8500 万病気や 212,000 人が死亡の原因と毎年1ドル2,3の十億の費用で。今日では、ノロウイルスの検出と定量化ゲノム増幅および/またはリガンド ベースのプラットフォームが含まれます。前者は、量的な情報はより敏感、偽陽性の結果4のリスクが低く、一般に好ましい。最も一般的なノロウイルスの検出と定量化ゲノム増幅技術は、逆転写酵素定量ポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR-RT) です。対象人間ノロウイルスのゲノムの小さなセグメントを増幅するので、RT qPCR だけでは感染を区別できないと非感染性粒子、無料のゲノム RNA として破損しているゲノムを含むカプシド、カプシドと致命的なゲノムの変異切り捨てはまだ Rt-qpcr によって増幅することができます。両方はまだウイルス定量 RT qPCR に依存し、まだ日常臨床・環境の可能なメソッドではありません 2 つ新しい体外栽培技術人間ノロウイルス5,6は、最近報告されているが、ヒトのノロウイルスをテストします。従って、RT qPCR 残る臨床・環境をテストするためのゴールド スタンダードです。

その他の培養方法は、ノロウイルス粒子の感染状態を適切に推定するために開発されています。これらのメソッドは、ノロウイルス キャプシドの整合性をアドレスとゲノムの評価として一般に分類できます。前者のアプローチはより普及しました。これは致命的な変異があるウイルス粒子と同様、ウイルスの粒子はそのまま残りますが、宿主受容体/co-因子をバインドする機能がないため考慮しませんしかし、一般的に使用されるメソッドはウイルスのゲノム RNA の抽出前に RNase 前処理または切り捨てたりゲノム7をわずかに破損しています。人間ノロウイルス co-receptor/共同因子、炭水化物であるにバインドする、ウイルスの能力に基づいて、キャプシドの整合性を評価できる病理組織血液型抗原 (HBGAs) として知られています。HBGAs 糖タンパク質や糖脂質 (他の複数の組織) の中の一部として宿主の腸管上皮細胞に存在し唾液のような体液の分泌があります。その表面上 HBGA 様物質を含む腸内細菌は、ヒトのノロウイルス8,9,10をバインドする示されているし、このような相互作用は、ノロウイルス感染症5を促進する可能性が。HBGA バインディングを活用の基本概念は、ウイルス粒子のみ、推定受容体/共同-factor をバインドできる細胞を感染させることができることです。複数の研究が核酸増幅の前ビーズ ベース HBGA バインディングが感染性差別11,12,13,14のための有望な方法であることを示唆しています。 15,16。HBGAs に関する主要な課題は、人間ノロウイルス遺伝子型のすべてをバインドできます単一 HBGA 型がないことです。これに対処するため HBGAs が含まれている、豚の胃粘液は、合成、一貫性、およびコスト削減の容易さの利益のための浄化された HBGA 炭水化物の代わりに使用されています。

ムーアらによって最近の出版17は、ヒトのノロウイルス キャプシド整合性を推定するための新しい技術のセットを導入しました。HBGAs、ムーアらの代わりに17広く反応性核酸アプタマー (M6-2)18 , 広く反応性モノクローナル抗体 (NS14)19熱処理 GII.4 シドニー ノロウイルス カプシド (ウイルス様粒子または群集) のバインドを調査し、これを比較して合成 HBGAs にバインドします。核酸アプタマーは、短い (20 ~ 80 nt) 単一鎖核酸 (一本鎖 Dna または RNA) それらの順序の結果としてユニークな立体構造に折るし、ターゲットをバインドします。核酸があり、彼らはより少なく高価です。簡単に化学的に合成、精製、および変更された;熱に安定しています。アプタマー ノロウイルスに対して生成のいくつかのレポートが存在するそれらのいくつかのさまざまな系統18,20,21,22に広範な反応性を示します。一例として、ムーアら17アプタマー M6 2 精製、組み立てられた人間ノロウイルス カプシド (群集) にバインドされのより高い順序 (例えば、二次、三次) タンパク質の構造を維持するためにウイルスのキャプシド依存 HBGA にも同様の振る舞いを示した発生するバインディング。その一方で、抗体にノロウイルス VLP バインディングのかなりの割合 NS14 は残った完全に変性させるとカプシド後です。ムーアらによる研究ではノロウイルスのバインディングの評価17が行われた elisa 法のような単純なプレート ベース メソッドを用いたアプタマーは抗体の代わりに使用する例外 (したがってメソッドが ELASA 呼び出された)。この高スループット実験法は、ノロウイルス カプシド、物理的または化学的ストレッサーへの露出にウイルス不活化の機構を理解する上で貴重な作品でさまざまな治療法の効果を評価する使用されました。ただし、このメソッドに欠点は、低感度とアプタマーによる非特異的結合を引き起こす可能性より高いレベルでの汚染物質のマトリックス関連の寛容の欠如です。

ムーアら17は、熱処理への応答でウイルス粒子の集合を監視するのに別の方法、動的光散乱法 (DLS) を使用しました。DLS は、ナノ粒子懸濁液のサイズを評価する使用され、蛋白質23,24やウイルス25,26,27に拡張されています。溶液中の粒子からの散乱光の強度は拡散係数と、確立された式を使用して粒径の計算を可能にする粒子の大きさの関数として変動します。DL 法は、サイズ27に基づいたウイルス集計や二量体、個々 のキャプシド分散されたウイルスの検出を可能にするナノスケールまで分散粒子の流体力学的直径を区別できます。粒子サイズの増加によって表される、ウイルスの集計はキャプシドの整合性の損失を表しています。カプシドの変性しその構造の破壊、疎水性残基さらされる、一緒にスティックし、集合体を形成する粒子を引き起こします。DLS は、指定した処理やリアルタイム17,28の集計速度後粒子サイズを測定する使用できます。このメソッド ソリューションのキャプシド挙動の観察を許可する利点がある完全自然の状態でウイルスを代表することができない精製キャプシドの高濃度が必要です。

ムーアらによって利用される最後の方法17は、透過型電子顕微鏡 (TEM) だった。このメソッドは、感度を欠いている、定量的データを生成しません、ウイルスのカプシド構造のさまざまな治療法の効果の可視化が可能です。まだ臨床/環境設定の理想的な組み合わせでこれらのメソッドの使用は人間のノロウイルス不活性化を理解する上で貴重です。プレート ベースの結合の試金 (ELASA)、DL の詳細なプロトコルを提供するこの記事の目的は、TEM の準備メソッドを使用してキャプシドに治療の及ぼす影響のコンテキストでノロウイルス キャプシドに及ぼす熱処理の効果を調査整合性・ ムーアらに提示されています。17。

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Protocol

1 です評価損失の高次ノロウイルス カプシド構造の結合アッセイのプレート ベース

注: ここで提示されるものに非常によく似た ELASA プロトコル公開 29 日となっています。研究の一部記事他 17 , 18 , 22 として以前と同様 ELASA アッセイを報告されているとします

。
  1. 人間ノロウイルス GII.4 シドニー カプシドの熱処理
    1. を得る精製人間ノロウイルス GII.4 シドニーの主要カプシド蛋白 (VP1) (加盟: JX459908) カプシドで組み立ています
      。 注: 研究のカプシド (薬の Baylor の大学、ヒューストン、TX) R. Atmar 礼儀得られた
      2. 。 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.2) 個々 の 15 μ L の最大ボリュームに × 1 で 50 μ g/mL に
    2. Dilute カプシドは、PCR チューブを頂いた。チューブに少なくとも 600 が含まれていることを確認キャプシドの ng。600 があることを確認治療配位子の組み合わせごとキャプシドの ng
      3. 。
    3. 予熱目的の熱処理サーマルサイクラー
      。 注: このプロトコルは、別の回の 68 ° C で治療の目的のため (0 - 25 分) 選ばれた
      4. 。
    4. は、即時の冷却のための 4 ° C に追加サーマルサイクラーを予熱します。希望の時間に、サーマルサイクラーにキャプシド ソリューションとチューブを追加します。すぐに加熱後 5 分間予冷 4 ° C サーマルサイクラーに転送します。
      1. 含める 95年 ° C 5 分治療を変性キャプシド対照として。肯定的な制御として未処理 (23 ° C) キャプシドのソリューションが含まれます。PBS は、追加のネガティブ コントロールとしてないのキャプシド
        2. 。
    5. 簡単にスピン ・ ダウン チューブの下にすべての滴を取得して希薄 PBS で扱われたキャプシド溶液 3 μ g/mL に、遠心分離機で。希薄化後、扱われたカプシド (100 μ L/ウェル) の少なくとも 200 μ L があることを確認します
      6. 。
  2. 治療あたり少なくとも 2 つの井戸があることを確認、各ウェルにキャプシド ソリューションの適用 100 μ L。さらに、それぞれの ligand; 100 μ L の PBS で 2 コントロール井戸があります。これは、アッセイのバック グラウンドの吸光度を提供します。カバー蓋付きプレート、シール パラフィンとエッジ蒸発量を削減する映画し、のまま一晩室温で 2 h、4 ° C で揺れインキュベーターにします
    3. 。
  3. 0.05% で PBS で脱脂乳固形分 5% (w/v) を行うことでブロックのバッファーを準備トゥイーン 20 (pbst;).
  4. は、プレートから扱われるキャプシド ソリューションを削除します。200 μ L/ウェルのブロック バッファーを追加します。2 時間室温で孵化させなさいまたは一晩、4 で密封 ° C
    5. 準備リガンド結合ビオチン アプタマー M6 2 18 , 29 のためのソリューションとビオチン標識合成 HBGA 血液型 A またはビオチン化型 h.
    1. Dilute ヌクレアーゼ フリー水 1 μ M にビオチン化アプタマー。各治療の合計 200 μ L の十分な解決策があることを確認します。30 μ g/ml ブロック バッファーに選ばれたビオチン HBGA を希釈します。各治療のため 200 μ L 容量の十分な解決策があることを確認します
      。 注: 少ない HBGA を使用するには、HBGA の 10 μ G/ml 0.25% スキムミルク PBST で置き換えることができます。ビオチン標識 M6 2 の HBGA 濃度の最適化で以前と、報告します
      2. 。
  6. ブロック バッファーを削除し、3 回で 200 μ L/ウェル PBST プレートを洗います。残留水分を乾燥滅菌ペーパー タオルに逆さまプレートをパットします
    7. 。
  7. 追加 100 μ L/ウェル リガンドの結合ソリューションは熱処理配位子の組み合わせごと 2 井戸が確実します。室温で 1 時間約 60 rpm で軌道シェーカーのふたで覆われているプレートをインキュベートします
    。 注: はそれぞれ正と負のコントロールとして未処理カプシドとそれぞれの ligand のため完全に変性カプシドの各 2 井戸を含めるようにしてください。さらに、2 を " ないキャプシド " プレートとしてそれぞれの ligand のための井戸背景コントロール
    8. 。
  8. は、リガンド ソリューションを削除し、200 μ L/ウェル PBST で 3 回洗浄します。プレートを逆さま残留水分を乾燥する滅菌ペーパー タオルでパットします
    9. 。
  9. 0.2 のソリューションの追加 100 μ L/ウェル μ G/ml ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ PBS で。軌道シェーカーで穏やかな揺れで室温で 15 分間インキュベートします
    。 注: 異なるストレプトアビジンを西洋わさびの過酸化酵素抱合体が異なる濃度を持っています。ユーザーを参照してください ' ELISA 用酵素の濃度の理想的な範囲のための s マニュアル必ずそれが最適と
    10. 。
  10. 共役ソリューションを削除します。200 μ L/ウェル pbst; 3 回洗います。プレートを逆さま残留水分を乾燥する滅菌ペーパー タオルでパットします
    11. 。
  11. 追加 100 μ L/ウェル 3, 3 ' 5, 5、'-テトラメチルベンジジン (TMB) 基板ができ、いずれかの 5-15 分観察ネガティブ コントロール井戸色し、必ずレプリケート平板間同時に一貫して開発していく色。プレート リーダーを使用すると、同様の吸光度範囲に注意してください
    。 注: 開発の回は使用する配位子/試薬の品質に基づいて異なる場合があります
    12. 。
  12. は、100 μ L/ウェル 1 M リン酸との反応の開発を停止します。板 450 で、すぐに読む nm。データを保存します
    。 注: 酸の導入は、一般的に大幅に反応が遅くなりますが、完全にそれを停止しません。吸光度の読み取りの前に時間の延長量停止板を放置しないでください
    13. 。

2。プレート ベースのアッセイの結果の解析

  1. は、スプレッドシート プログラムで生吸光度データを保存します。特定治療と配位子とよくペアごとに平均の結果を生成します。すべてのそれに続く分析のこれらの平均値を使用します
    。 注: 比較井戸のペアには大幅に異なる値がないことを確認する両方のよくカラムベッド
    2. 。 絶対キャプシド整合性 (すべてバインディング) を分析し、生の吸光度を差し引く
  2. 、" ないキャプシド " コントロールすべての他のサンプルの吸光度値から
    。 注: また、高次 (二次、第三、第四) 構造の喪失によるバインディングの損失直接分析できます。負 (カプシドない) コントロールの吸光度を差し引くではなく完全に変性キャプシド コントロールの値を減算します。この非特異的な装置へのバインドし同様、キャプシド シーケンスによるバインドによる信号のすべてのバインドを削除します。HBGA とアプタマー M6 2、どちらの方法でも同様の結果を生成するので、ほとんどのバインディングを完全に変性キャプシドに表示されます。アプタマーの非特異的な結合に起因する偽の肯定的な信号は使用する分析を選択するとき考慮必要があります
    3. 。
  3. と、負の値または変性制御調整結果、100 治療彼らのそれぞれ正 (無処理) によって吸光度吸光度を制御し、乗算で割る。これは未処理のコントロールを基準として扱われたキャプシドの信号の割合を提供します
    4. 。 カプシド シーケンスに起因するそれぞれの ligand 結合信号の程度を推定する
  4. を引く、" ないキャプシド " 負の初期の結果から制御および変性キャプシドの調整された吸光度を取る。肯定的な制御信号の調整後の吸光度でこれを割り、100 を掛けます。これは変性キャプシド/キャプシド シーケンスへのリガンドの結合により信号が明白な割合を与えます
    5. 。

3。熱処理後のウイルスの凝集を検出するための DLS

注。以下の手順は、ソフトウェアに固有かもしれないと計測器を使用するが、適応でき同様のデバイスに適用します

。
  1. DL に新しいサイズ SOP を作成する計測器ソフトウェアを使用して: 材料タンパク質分散剤を = = PBS、温度 = 25 ° C、平衡時間 0 秒、電池の種類を = = 使い捨てのキュベット (小さい容積、ZEN0040)、測定角 = 173 ° 後方散乱、測定期間自動測定の数 = 3、測定間の遅延を = = 0 秒、データ処理: 解析モデル汎用 (標準解像度) を =。他のすべてのパラメーターの既定の設定を使用します
    2. 。
  2. ソフトウェアでは、緑の実行ボタンを選択し、サンプルの名前します
    3. 。
  3. 1.1.1 群集の熱処理のための 1.1.4 からの手順に従います
    4. 。
  4. Dilute 熱は、群集を 1:10 に最終濃度 5 μ g/mL の 1x PBS で扱われます。(省略可能)ダスト粒子を削除する 1 μ m の細孔径とサンプルのフィルターを適用します。DLS は、大きな粒子は小さな粒子黒より多く光が散乱、ほこりに非常に敏感です
    5. 。
  5. 使い捨ての小さなボリュームに希釈した群集の転送 50 μ L のキュベットです。楽器のサンプル室にキュヴェットを挿入します
    6. 。
  6. 実行] を起動し、使用、' コレログラム '、' キュムラント フィット ' と ' エキスパート アドバイス ' データの品質を評価するためのタブ。
    1. 分散インデックス値よりも小さいことを表す、品質測定で 0.3 チェックの実行、中に、‘ マルチビュー ’] タブで、相関係数が定数と、閉じるが短時間で、1 以上を確認。・保存時は粒子の粒径特性 0 急激に低下。使用、‘ エキスパート アドバイス ’ 測定中にデータの品質に関するフィードバックのタブ
      2. 。 測定が完了したら、
    2. は分散インデックス値が 0.3 未満であることを再確認します。キュムラント適合データ ポイントに密接にライン次のようであることを確認してください、‘ フィット キュムラント ’] タブ
  7. 各サンプルの粒度として測定ごとに報告された Z 平均粒子径の平均を取る。プロットの温度 ° C 対 nm の直径

4。リアルタイムで検出ウイルス集計の DLS

注: 以下の手順ソフトウェアにある可能性があります、楽器を使用するが、適応でき同様のデバイスに適用されます

。
  1. DL に新しいサイズ SOP を作成する計測器ソフトウェアを使用して: 材料タンパク質分散剤を = = PBS、温度 = 目的、平衡時間として 0 秒、電池の種類を = = 石英キュベット測定角 = 173 ° 後方散乱、測定期間 = 自動、測定の数 = 50 (増加又は減少によって凝集率があります)、測定間の遅延 = 0 秒、データ処理: 解析モデル複数の狭いモード (高解像度) を =。他のすべてのパラメーターの既定の設定を使用します
    2. 。
  2. を開き、新しいサンプルの名前をソフトウェア内で実行の矢印を選択でき、温度平衡に到達する計器
    3. 。
  3. 濃度 5 μ G/ml と 200-500 μ L 間ボリュームで微量遠心チューブに 1x PBS で、群集を中断渦停止します
    4. 。
  4. スピン ・ ダウン解消ガス卓上遠心分離機で 5-10 s 用 VLP ペンション。サイズの測定と干渉する熱処理中に気泡を防ぐことができます
    5. 。
  5. 転送 VLP サスペンションが少量の石英キュベットは、泡を避けるため、キュヴェットの壁にゆっくりピペットします。計測器は、温度平衡に達した、キュヴェット試料室に挿入します
    6. 。 サンプル温度平衡に
  6. を待つ 10 秒は、実行を開始します。実行の開始時にタイマーを開始します。最初の測定の最後にタイマーを停止します。最初の時点として、この時間を取る。ソフトウェアによって記録された測定時間から後にポイントを取得します
    7. 。
  7. 、実行を開始し、コレログラム、フィット、配布、データの品質を評価するための専門家のアドバイスを監視します
    。 注: PDI が必ずしもサンプルとしてこれらの測定値の 0.3 未満は集計中多をする予定です。
    1. 相関係数は定数と、閉じるは短時間で 1 以上と 1 つまたは複数の後の時代、粒子の粒径特性でが激減していることを確認します
      2. 。
    2. 分布適合データ ポイントを密接にラインの次を確認してください
      3. 。
  8. サイズ データを分析します。 各計測と初期時点の時間の違いから
    1. を決定するたびにポイント。測定期間は、まったく同じではありません
      2. 。
    2. 強度分布を使用して記録計測/時間の各ポイントの最大領域とピークのサイズ
      3. 。
    3. 対分時間 nm のピークの直径をプロット

5。TEM のサンプル準備

TEM 用に設計された
  1. 取得カーボン サポート フィルム (ニッケル) グリッド
    。 注: 相談施設顕微鏡で推奨される試薬および使用のために処理の中核施設。乾燥や湿気への露出を最小限に抑えるための真空チャンバーを含むボックスのグリッドを保存してください
    2. 。
  2. は、フィルター ペーパーの約 5 cm × 5 cm 部分を引き裂きます。ガラス シャーレを取得し、適切な自己終了逆ピンセット顕微鏡で使用するために設計されています
    3. 。
  3. は、パラフィン膜の約 2.5 cm × 5 cm 部分をカットします。ベンチトップ場所
    4. 。
  4. ノロウイルス GII.4 シドニー カプシドの熱処理
    1. 1.1.1 - 1.1.5 以外の手順で説明したとおりに熱処理の手順に従います: PBS ではなく治療のため 10 mM HEPES (pH 7.4) を使用し、カプシドを更に希釈していません。(50 μ G/ml に維持液) の治療後。ピペットのパラフィン フィルム上に扱われたキャプシド ソリューションの全体 ~ 15 μ L ドロップします
      2. 。
  5. グリッドを保持するために端に閉じることができますピンセットでグリッド エッジをつかむし、グリッド炭素側-ダウン処理溶液の一滴の上に配置します。グリッドにアタッチするカプシドを許可する 10 分間インキュベートみましょう。
    1. キャプシド準備の純度によって扱われたキャプシド液滴後線に置く 10-15 μ L 液滴の形で必要な場合に 10 mM HEPES ソリューションの洗浄を追加します
      2. 。
    2. 後 10 分は、液滴とグリッドを拾います。液滴を離れて放出するろ紙の部分にほぼ垂直グリッドを配置します。グリッドに 10-15 μ L HEPES 緩衝液の液滴をピックアップ、フィルター紙ワシントン州の別の部分で 30 秒、その後、芯先の保持
  6. 空の領域でのパラフィン映画のウラニル 2% 酢酸溶液の 15 μ L の液滴を配置。
    1. グリッドと酢酸ウランの液滴をピックアップし、保持 45 s. 芯先の酢酸ウラン、ソリューションの大部分を削除することを確認されています。グリッド炭素側にグリッドがしないように注意しながら、フィルター紙の " スティック " ピンセットで湿気に。オープン ガラス シャーレに濾紙グリッドを配置します
      。 注: は、グリッドはそれらに静電気的に引き付けられる、立ち往生になるプラスチック シャーレを使用しないでください皿にします
      2. 。
  7. すべての治療を繰り返します。Tem 観察の前に乾燥して一晩乾燥器で、グリッドを使用してシャーレ半分を配置します
    8. 。
  8. 相談顕微鏡施設それぞれの施設で準備されたグリッドの観測について。いくつかの施設の設備の操作に関するトレーニングを受けるユーザーに許可 ' 秒計測器。セットアップおよび特定の顕微鏡の観察に関する詳細は beyond この資料のスコープします
    9. 。

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Representative Results

人間ノロウイルス GII.4 シドニー カプシド (群集) の構造の整合性は、ムーアらによって表されるいくつかの手法を使用して評価されました。17。 で実験が最初に行われていたと推定される受容体/共同-factor (HBGA) を一本鎖 Dna アプタマー (M6-2) を結合する機能の機能として、カプシドの整合性であった (図 1) を比較。表示される結果は、以前ムーアらによって提示されています。17、アプタマー M6 2 カプシド バインディング動作様々 な露光時間に 68 の ° C の熱処理への暴露ウイルス HBGA 拘束に類似していたことを示す。HBGA バインディング信号が少し以前よりも失われるのアプタマー M6 2、M6 2 表示信号の損失の計算後に群集が 65 ° C にさらされた、様々 な時間のための 68 の ° C の (表 1)17ポイント同様の割合。HBGA とアプタマー M6 2 バインドの両方が同様に廃止されたことが示唆されました。

DLS 測定を示したタンパク質変性の可能性が高いため集計がリガンド結合信号 (図 2) の損失に対応した流体力学的直径 100 を超える 68 ° C で治療の約 18 分後に nm が観察されました。これらあった HBGA バインディングおよびバインディング アプタマー M6 2 信号のほぼすべての損失の完全な損失で条件 (> 80%) (図 1)17が発生しました。TEM の結果サポート形態学的変化としてこれらの観察と、温度が 60 ° C 〜 80 ° C 1 分 (図 3 a) 段階的大きくなったますます明らかになった、カプシドの群生します。まで 25 分、68 ° C でカプシドを加熱後似たような現象が観察されたが、TEM の解像度は、以下の発音 (図 3 b)17だった。

Figure 1
図 1: ノロウイルス GII.4 シドニー カプシドに 2 つの異なる配位子の構造依存的結合は、熱処理を施した。時間の量が異なるため精製 GII.4 シドニー カプシド (群集) 68 ° C で熱処理を受けたし、血液型 A HBGA とアプタマー M6 2 へのバインドはプレート ベース ELASA 結合の試金を使用して評価されました。Y 軸は、未処理キャプシド コントロールの割合として観察 (露光時間) の治療のため吸光度信号を表示します。この図は以前提示されており、この図は、ムーアらから変更されています。17誤差範囲 ± 1% の信号の標準偏差を表します。データは、少なくとも 3 つの複製版です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 例の DL 熱処理ノロウイルス GII.4 シドニー カプシドの理想的なあいまいな/低品質の結果を示すためのデータです。カプシド (群集) 65 ° C、68 ° C で加熱処理を行ったし、のサイズがリアルタイムで監視されました。パネル (、) は高品質の明確な相関係数測定に対応します。(b) 低品質、あいまいな相関係数測定に。パネル (c) 68 ° C で扱われるカプシドの明確な集約プロフィールを見せ、粒子サイズのデータが表示されます。(d) 熱処理カプシドのあいまいな粒子サイズのデータを示しています。これらのデータの一部が表示されます、ムーアらからこのイメージを変更するため17 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: さまざまな熱治療を受けるノロウイルス GII.4 シドニー カプシドの TEM 。精製されたカプシド (群集) 各種の熱処理を受けるし、透過型電子顕微鏡を用いて観察。パネル (、) 異なる温度で加熱カプシドのデータを示しています (60、65、70、75、および 80 ° C) 1 分パネル (b) 右側写真表します 100 nm の 68 ° C 0 - 25 分スケール (バー) の治療を受けるカプシドを示しています。これらのイメージは、ムーアらで表示されます。17 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

指数減衰率 (% 信号/分)
温度 65 ° C 68 ° C
配位子
HBGA タイプ A 2.50 ± 0.24 13.30 ± 1.15
アプタマー M6 2 2.47 ± 0.66 13.18 ± 0.47

表 1: ノロウイルス GII.4 シドニー カプシドの指数関数的減衰率が 65 ° C および 68 で扱われる ° Cカプシドは 65 ° C で様々 な回と 68 ° C、4 ° C、および合成 HBGA または評価アプタマーを結合する機能で冷却熱処理を受けた。各温度のそれぞれのリガンドと時間 (減衰率)、信号の損失の率を算出しました。これらのデータは、以前ムーアらで提示されています。 17% 信号/分 ± 1 標準偏差 % 信号のデータが掲載されています。

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Discussion

プロトコルとここで説明する手法は、人間ノロウイルス キャプシドの整合性/機能を評価する手段を提供します。これらのメソッドは、機械論的洞察、ウイルスに対する不活性化処理の効果を得るため使用することができ、Rt-qpcr またはプラーク アッセイなどのより伝統的な不活化評価方法を補うことができる可能性があります。たとえば、ウイルスの不活性化の程度のその不活性化の基になるメカニズムではなく単独でプラクの試金による化学的又は物理的不活化の評価を提供します。また、ウイルス集計できます価の過小評価の結果、したがって治療効果30を過大評価します。これらのメソッドは、ノロウイルス キャプシドの整合性に治療薬の効果についての情報を提供することによってこのような研究を知らせることができるさらに。最近では、2 つの in vitro (細胞培養) 栽培方法人間ノロウイルスのされている報告された5,6;これらにまだ頼った PCR ウイルス列挙の TCID50 の提示した enteroid モデルが利用される可能性が理論的には、相対的な減少を決定するため染色抗体を用いたします。紹介した方法は、ちょうど熱治療を超えて治療法の複数の異なる種類のウイルス不活化法の完全な機構を理解するためのユーティリティ可能性があります。プレート ベースのリガンドおよび TEM がツールとして銅表面31,32リン酸銀への露出にノロウイルス不活性化のメカニズムを決定する際に RT qPCR とプラークのアッセイ データを補完する使用されたなどクエン酸33、および高静水圧処理14。

方法論的細部への注意が非常に重要であるこれらのプロトコルの多くのステップがあります。具体的には、バインディングのリガンドを希釈するために使用されるバッファーに、版の試金のため細心の注意を支払わなければなりません。アプタマー M6-2、および一本鎖 Dna アプタマーは一般に、塩濃度およびバッファーの状態に敏感です。アプタマーと非最適なバッファーを使用してバインディングをアブレーションがあります。アプタマー M6 2 で正常に使用されている希釈人間の便があまりにも多くの便/マトリックス干渉干渉バインディングでは、他のヒトのノロウイルス アプタマー18,22の観測と一致している使用される場合があります。これを引き起こしている 1 つの主要な要因はアプタマーが正荷電の分子に非特異的な結合度を表わすことができます。このため、ある程度ここで説明アッセイの偽肯定的な信号の可能性があります。これには、ウイルスのない複雑なマトリックスまたは無関係な蛋白質否定的なコントロールを選択して説明できます。同様に、HBGA 濃度と結合バッファーで使用されている脱脂乳固形分の量は、大きく肯定的な影響およびバック グラウンド信号します。異なる HBGAs がヒトのノロウイルスの異なる系統への親和性の程度結合バッファー HBGA 型14,31,33に応じて最適化する必要がありますのでください。異なった製造業者からの濃度が異なることができます;、ストレプトアビジン西洋わさびの過酸化酵素共役に使用するバッファーに同じような考察を与えられるべきただし、あまり変動が与えられた期待される34ストレプトアビジン-ビオチンの相互作用の親和性が高い。このプレート方式の適応性の高いのため最適ではない結果のトラブルシューティングは比較的簡単です。たとえば、場合、高いバック グラウンド信号、スキムミルク濃度と減少のリガンド濃度を調べることができますの増加と逆平板低の肯定的な信号の最適化。最も重要な考慮事項の 1 つは非静的 (ガラス) のような材料の使用、TEM とき保存する/処理グリッド、グリッドは、使い捨てのシャーレなどの材料を処理する非常に困難。そのような材料を使用している場合、グリッドは「ジャンプ」と素材にこだわる傾向があります。さらに、多くの注意は、グリッドには残留水分がないようにすべき。理想的には、使用可能な場合は、真空デシケーターを使用ください。

DLS を使用して実験を実行すると、サンプルの純度が非常に重要な考慮事項です。光散乱強度の直径の変更を関連付けるために使用する関数は monomodal に依存または複合粒子分布を絞り込みます。蛋白質を含む、ナノスケールまで不純物は多分散性を紹介し、サイズ計算を変更します。またの強度は、ほこりなどの大きな粒子は実質的に測定を妨げるので、6 の累乗の直径に比例して光散乱です。気泡のリアルタイムの熱処理中に変動の泡からの散乱光により無意味な結果で起因します。カプシド (VLP) 濃度は、DLS を使用する場合にも考慮されなければなりません。サンプル濃度が十分に高く十分な信号を生成する多重散乱を避けるために十分に低い必要があります。また、正しい材料を入力する重要だし、分散剤プロパティは、これらの値としてソフトウェアによって使用されます、サイズ計算の。特に、分散剤の粘度は温度の関数で、それに応じて調整する必要があります (使用しているソフトウェアに建てられた水の温度依存粘性) 熱処理。

メソッドは、ここで説明キャプシドの整合性を評価するために改善された方法を複数の機会を提供するが、彼らは完璧ではないです。これらのメソッドは、非常に高濃度のウイルスを必要とするためは、ネイティブ ウイルス感染の代わりに精製、組み立てのカプシドを使用する必要があります。ここで使用される群集は、ウイルス核酸をもたずノロウイルス キャプシドにアセンブル人間ノロウイルス (VP1) の主要カプシド蛋白で構成されます。これらの群集は伝染性のウイルスのカプシドを抗原と同様の挙動を示す不活化されやすいことがあります。さらに、群集は生成し、浄化が困難と容易に多くの研究者にご利用いただけません。浄化された人間ノロウイルス (例えば、超遠心法を使用して) の使用が可能ですが、ノロウイルス陽性ひと糞便検体の可用性が限られ、浄化でも、ウイルス力価はメソッドに対応するために十分に高いかもしれないここで説明しました。便中半精製感染ウイルスの使用のための試金を最適化することで今後の作業が現在進行中です。実際には、これはプレート アッセイ18,22、すでに実証されているが、間違いなく dl がより複雑になります。これらのメソッドが物理 (熱) の適用後キャプシドの整合性を評価にだけ適用されたことを指摘する必要があります不活化アプローチでは、カプシドに直接影響を与える知られています。結果は、これらの技術は、化学物質やウイルスのゲノムの破壊を主対象とするメソッドなど、他の不活化アプローチを使用してキャプシドの整合性を評価するために使用されたよりあいまいなかもしれません。ただし、いくつかのレポートは好意的評価化学的不活性化31,33,35,36,37HBGA バインディングのパフォーマンスを実証しています。現在の時間にここで報告されるプロトコルを RT qPCR や pl のような伝統的な活かした実践的とのコンサートで使用最高aque はサロゲート ウイルスの試金します。

これらのプロトコルは、ヒトのノロウイルス物理ウイルス不活化法 (熱) の効果を理解するの簡単な代替手段を提供します。高次タンパク質構造の損失の検出の全体的な原理は同じで、(例えばA 型肝炎と E のウイルス)、その他の非エンベロープ ウイルスで使用するこれらのメソッドを展開可能性が高いでした。また、キャプシドの整合性の損失を示すため他の配位子の行動と潜在的な使用を評価します。複雑なサンプルマトリクスをプロトコルの適応とその感度 (検出限界) の向上も論理の今後の方向性です。全体的に、ここで説明する方法は、人間ノロウイルス キャプシド整合性を決定し、この重要な病原体に対する不活性化処理の影響に機械論的洞察力を得るのより使いやすい手段を提供します。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品は、NoroCORE プロジェクトを通じて農業と食品研究イニシアチブ競争グラント号 2011-68003-30395 からアメリカ合衆国農務省、国立食品研究所、農業によって支えられました。オープン アクセス料金のための資金は、米国農務省によって提供されました。ロバート Atmar (薬の Baylor の大学、ヒューストン、TX) 提供いただきありがとうございます親切私たち精製カプシドとヴァレリー Lapham の TEM 画像で彼女の援助したいと思います。提示実験を開始私たちを助けるためフランク N. バリーに感謝も申し上げます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure
96-well, medium-binding polystyrene EIA plate Fisher (Costar) 07-200-36
Lid for 96-well plate Thermo Fisher 3098
Paraffin film (Parafilm) Thermo Fisher PM999
1x PBS (pH 7.2) Life Technologies 20012-050
Polysorbate 20 Sigma-Aldrich P9416
1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 N/A N/A
Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids N/A N/A
Individual 0.2 ml PCR tubes Genesee Scientific 22-154G
2 thermocyclers Bio-Rad 1861096
Tabletop mini centrifuge Fisher Scientific 12-006-901
Skim milk solids Thermo Fisher LP0031B
Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated Glycotech 01-017
Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 Life Technologies SNN2004
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature Thermo Fisher 50-76-00
1 M phosphoric acid N/A N/A
Microplate reader capable of reading 450 nm Tecan Infinite m200 Pro
Name Company Catalog Number Comments
Analysis of Plate-Based Assay Results
Microsoft Excel or similar program N/A N/A
Name Company Catalog Number Comments
Dynamic Light Scattering Experiments
Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument Malvern Instruments N/A
Vortex Fisher Scientifc 02-215-365
Quartz cuvette Hellma 104-002-10-40
Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) Malvern Instruments ZEN0040
Name Company Catalog Number Comments
Transmission Electron Microscopy Sample Preparation
Nickel electron microscopy grids with carbon support film Ladd Research 10880-100
Self-closing reverse electron microscopy tweezers Ted Pella 5372-NM
Qualitative filter paper Sigma-Aldrich (Whatman) WHA1002055
Glass petri dishes Sigma-Aldrich BR455743
100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) N/A N/A
2% uranyl acetate N/A N/A

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References

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免疫学 問題 129、ウイルス キャプシド、ノロウイルス、アプタマー、感染性、動的光散乱 透過型電子顕微鏡
代替<em>体外</em>ウイルスのカプシド構造健全性の定量方法
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