Summary
Onlangs we toegewezen de driedimensionale (3D) ruimtelijke locaties van transportroutes voor verschillende eiwitten translocating binnen de primaire cilia in levende cellen. Hier leven de details van dit papier de experimentele opzet, het proces van biologische monsters en de data-analyses voor de 3D super resolutie fluorescentie imaging aanpak nieuw toegepast in primaire cilia.
Abstract
De primaire cilium is een uitsteeksel microtubulus-gebaseerd op het oppervlak van vele eukaryotische cellen en een unieke aanvulling van eiwitten bevat die functie kritisch in cel beweeglijkheid en signalering. Aangezien cilia niet in staat hun eigen eiwit synthese zijn, moeten bijna 200 unieke Ciliaire eiwitten worden verhandeld tussen het cytosol en primaire cilia. Het is echter nog steeds een technische uitdaging om driedimensionale (3D) locaties van vervoer trajecten voor deze proteïnen in levende primaire cilia vanwege de beperkingen van de huidige kaart technieken. Om te veroveren de uitdaging, hebben onlangs we ontwikkeld en ingezet een snelle virtuele 3D super resolutie microscopie, zogenaamde single-punts rand-excitatie microscopie van de sub diffractie (snelheid), om de 3D ruimtelijke locatie van vervoer opleidingstrajecten te bepalen beide cytosolische en membraaneiwitten in primaire cilia van levende cellen. In dit artikel zullen we laten zien van de gedetailleerde opzet van snelheid microscopie, de voorbereiding van cellen uiten fluorescentie-eiwit-geëtiketteerden Ciliaire eiwitten, de real-time tracking van de single-molecuul van afzonderlijke proteïnen in levende cilium en de verwezenlijking van 3D ruimtelijke waarschijnlijkheid dichtheid kaarten van transportroutes voor Ciliaire eiwitten.
Introduction
Omdat verklaarde door Ernst Abbe in 1873, heeft de resolutie van de lichte microscopie van conventionele is geloofd te worden beperkt tot ongeveer 200 nm als gevolg van lichte diffractie van de objectieve1,2. Momenteel super resolutie de lichte microscopie technieken breken deze beperking en toestaan dat de vangst van dynamische afbeeldingen met een resolutie van de sub diffractie (< 200 nm). De technieken in het algemeen vallen in twee brede categorieën: gestimuleerd emissie uitputting (STED) microscopie gebaseerde benaderingen, die sub diffractie verlichting volume als gevolg van niet-lineaire optische reactie van fluorophores te in monsters3 genereren; en de lichte microscopie van photoactivated (PALM) en stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM)-op basis van super resolutie technieken, die gebruik maken van wiskundige functies om de centroids van fluorophores te lokaliseren en vervolgens reconstrueren deze centroids naar formulier super resolutie beelden4,5. Momenteel, als gevolg van de relatief ongecompliceerde optische setup, zijn PALM en STORM uitgebreid werkzaam bij slechts een kleine ondergroep van fluorophores in elk frame van een lange video van een biologische preparaat te activeren. Dit zorgt voor de nauwkeurigere lokalisatie door 2D Gaussian aanbrengen van fluorescerende plaatse genoemd van het punt verspreiden functie (PSV), van fluorescently gelabelde proteïnen in elk frame van de video. De 2D locatie van elke fluorescently gelabelde molecuul kan vervolgens worden bovenop een enkele imaging vliegtuig naar een super-resolutie afbeelding van de biologische voorbereiding1,2te produceren. Terwijl de lokalisatie van deze single-molecuul, super resolutie benaderingen van microscopie zeker een revolutie teweeggebracht in hoe beeldvorming van biologische monsters werd uitgevoerd, zijn er nog uitdagingen moeten worden overwonnen. Bijvoorbeeld, kunnen STORM en PALM bereiken hun beste ruimtelijke resoluties na fixatie van biologische monsters en dus een statische weergave van de fluorescently gelabelde proteïnen, die is een soortgelijke beperking van elektronenmicroscopie. Bovendien, om te bereiken hoge ruimtelijke resolutie voor elke fluorescently-geëtiketteerden proteïne in levende cellen, moeten monsters worden beeld bij zeer lange framerates die niet kunnen vangen van eiwit dynamiek. Daarom moet deze belangrijkste technische hindernissen overwinnen.
Voor het verkrijgen van een hoge Spatio resolutie die is geschikt voor het opsporen van snelbewegende proteïnen of RNAs in levende cellen, hebben we super resolutie snelheid microscopie in ons laboratorium (Figuur 1)6,7, 8. verschillende grote technische vooruitgang in snelheid microscopie hebben eerder ingeschakeld ons om bij te houden met succes nucleocytoplasmic vervoer van kleine molecules, eiwitten, mRNA en virus via native nucleaire porie complexen (NPC)6, 7 , 8. kort, de volgende functies van snelheid microscopie worden gebruikt voor het bijhouden van snelbewegende macromoleculen via sub micrometer rotatie symmetrische structuren in levende cellen, zoals NPC's en primaire cilia: (1) een geneigd of een verticale verlichting PSF maakt de excitatie van afzonderlijke moleculen binnen een kleine diffractie-limit volume in het brandvlak (Figuur 1); (2) de geneigd PSF kan sterk voorkomen out-of-focus fluorescentie en dus de signal-to-noise verhouding te verbeteren. (3) de optische dichtheid van 100-500 kW / cm2 in de verlichting PSF maakt duizenden fotonen worden verzameld uit één fluorophores met snelle detectie snelheden (> 500 Hz). (4) de snelle detectie snelheid vermindert ook aanzienlijk de single-molecuul ruimtelijke lokalisatie fout (< 10 nm) bij het bepalen van de ruimtelijke trajecten van fluorescerende moleculen bewegen in levende cellen, omdat Moleculaire diffusie een van de belangrijkste factoren is veroorzaakt door onvolkomenheden van single-molecuul lokalisatie voor het bewegen van moleculen. (5) bekendere 2D naar 3D-transformatie-algoritmen kunnen wij leveren 3D ruimtelijke waarschijnlijkheid dichtheid kaarten van transportroutes voor moleculen in de NPC of de primaire cilium. Het is opmerkelijk dat onze conversieproces tussen de cartesiaanse en de cilindrische coördinatiesysteem wordt gebruikt voor het genereren van een 3D ruimtelijke waarschijnlijkheid dichtheid kaart in plaats van 3D single-molecuul tracking (Figuur 2). Eerder, elektronenmicroscopie gegevens is gebleken dat de NPC9,10 en de primaire cilium11 beide een rotatie symmetrische structuur hebben. In principe moeten willekeurig verspreiden moleculen bewegen door de NPC of primaire cilium ook rotatie symmetrische distributies. Zoals blijkt uit Figuur 2, een groot aantal willekeurig verspreiden moleculen in de cilinder rotatie symmetrische distributies op de dwarsdoorsnede bekijken als die zou genereren in de NPC, verder resulterend in een ongeveer eenvormige ruimtelijke distributie binnen elke zeer kleine subregio tussen twee naburige ringen(Figuur 2). Deze uniforme verdeling leidt dat de ruimtelijke spreiding langs θ dimensie in het cilindrische systeem constant is. Vervolgens kunnen de 3D-coördinaten (X, R, θ) worden vereenvoudigd om de 2D-coördinaten (R, X, constante). Eigenlijk is onze conversieproces tussen de Cartesische en cilindrische systemen van 2D (X, Y) aan 2D (R, X, constante). De constante θ, verwijst naar de ruimtelijke dichtheid p in Figuur 2E, wordt berekend met behulp van de vergelijking A
.
Uiteindelijk, single-molecuul tracking heeft een brede toepassing in biologisch onderzoek, dus het is logisch dat een overvloed aan technieken worden ontwikkeld om te vullen specifieke biologische niches12,13,14. Dit is het geval met snelheid microscopie. Eerder, wanneer in combinatie met een 3D-transformatie-algoritme, deze techniek werd ontwikkeld om op te lossen 3D transportroutes van doorvoer van de moleculen door de NPC's, een sub-diffraction en middelgrote rotatie symmetrische biologische structuur-6. In dit document, zijn primaire cilia uitstekende model organellen zo goed aangetoond. Primaire cilia zijn cilinder-, antenne-achtige organellen (~ 125 nm radius) dat van het oppervlak van de meeste zoogdieren cellen15,16,17 project. Zij zijn verantwoordelijk voor het ontvangen van externe signalen en verzenden van een intracellulair reactie meestal verband met groei en metabolisme15,16. Daarom, flux van structurele proteïnen, recycling van transmembraan receptors, en doorgeven van intracellulaire boodschappers zijn essentiële verantwoordelijkheden van primaire cilia. Bij het verbindingspunt tussen de primaire trilharen en de cel lichaam is een kritische selectiviteit barrière, genaamd de overgangszone of TZ, waardoor alle dit eiwit transport11,18,19, moet voorkomen 20. Naast de gating functie van de TZ, worden ten minste twee transportprocessen, intraflagellair vervoer en passieve diffusie, verondersteld te zijn die verantwoordelijk zijn voor het verkeer van eiwitten door middel van deze regio16,21, 22. vanuit een oogpunt van de menselijke gezondheid, het verlies van primaire cilia en verdere deregulering van de stroomafwaartse signalering is kenmerkend voor veel kankers. Daarnaast zijn veel genetische ziekten, zoals het syndroom van Bardet-Biedl en polycysteuze nierziekte, geassocieerd met defecte eiwit vervoer23. Zowel de grootte van het beperken van de sub diffractie en het complexe proces van selectieve eiwit transport via de TZ maken de primaire cilia een belangrijk doelwit voor deze techniek. In deze paper methoden zullen we laten zien dat het volgen van een Ciliaire transmembraan eiwit, Somatostatine receptor 3 (SSTR3)24, extern gelabeld met Alexa Fluor 647 en een onderdeel van IFT, IFT2025, gemarkeerd met een gesmolten GFP-molecuul.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. NIH-3T3 cel voorbereiding voor snelheid microscopie uit voorraad
- 1,5 weken vóór het experiment, een nieuwe cultuur van NIH-3T3 cellen herstellen uit een bevroren voorraad door ontdooien bij 37 ° C en de overdracht van de cellen in een maatkolf van 25 cm2 cel cultuur met 3 mL van de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 110 mg/mL natrium pyruvaat, 2 mM glutamine, foetale runderserum 10% en 1% penicilline/streptomycine.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
- Splitst u cellen op 80% confluentie, ongeveer elke twee dagen, ten minste driemaal voor experimentele dag om de homogeniteit van de celcyclus. Trypsinize cellen met 0,25% trypsine gedurende 2 minuten bij 37 ° C, gecombineerd trypsine en 2 mL medium te vervangen. Pipetteer het medium om breken van clusters van de cel, het gewenste aantal cellen verwijderen en totale hoeveelheid media brengen terug tot 3 mL.
Opmerking: NIH-3T3 waren eerder genetisch gemanipuleerde om uit te drukken van NPHP-4, een eiwit dat de TZ26 lokaliseert, gesmolten in het C-terminus aan mCherry. mCherry is een fluorophore die kan worden opgewekt met 561 nm verlichting aan de TZ selectiviteit barrière kwantitatief te lokaliseren en oriënteren van de primaire cilia. - Twee dagen voor het experiment, plaat de cellen in een 35 mm glazen bodem schotel op 60-70% confluentie met 1,5 mL hetzelfde medium als stap 1.1 en de cellen terug naar de incubator.
- Één dag voor het experiment, chemisch transfect de cellen met de gewenste plasmide. Meng 500-1000 ng van de gewenste plasmide (Zie de Opmerking hieronder) in een verhouding van de 1:2.5 met transfectiereagens in 0,25 mL verminderde serum media zonder antibiotica voor 30 min. Aspirate media uit de 35 mm glas onder schotel en het vervangen van de plasmide 0,25 mL / transfectie reagens mengeling plus een extra 1,25 milliliters verminderde serum media zonder antibiotica. Verminderde serum media heeft tot doel te vergemakkelijken van een geslaagde transfectie, inducerende primaire cilia groei, evenals het levend houden van de cellen lang genoeg voor het uitvoeren van experiment. Cellen aan de incubator voor het experiment op de volgende dag retourneren.
Opmerking: Bij het uitvoeren van single-molecuul tracking van IFT20, een plasmide met die een genetisch gemodificeerde IFT20 in de C-terminus aan GFP gesmolten gebruikte25is. Bij het uitvoeren van single-molecuul volgen van SSTR3, een plasmide dat met een genetisch gemodificeerde SSTR3 gesmolten in de N-terminus een acceptor peptide (AP)-domein en C eindpunt aan GFP is gebruikte22. Naast de SSTR3-constructie, een plasmide met de Biotine ligase BirA moet mede worden uitgedrukt en de transfectie media moet worden aangevuld met 10 µM biotine. Biotine BirA vervolgens gekoppeld aan het domein van de AP van de nieuw samengestelde AP-SSTR3-GFP moleculen op het niveau van de ER. Alexa647 geconjugeerd met drie van de vier Biotine-bandplaatsen op daar, gemiddeld, kan vervolgens worden aangevuld tot de media voorafgaand aan imaging fluorescently label de AP-SSTR3-GFP moleculen op het buitenoppervlak van de cel22,27 . GFP en AlexaFluor647 worden gebruikt bij deze methode; andere tl sondes kunnen echter worden gebruikt als ze ook hebben hoge foto-stabiliteit en quantum opleveren. - Als met behulp van de extern-label SSTR3 constructie, verwijderen de media van de glazen bodem schotel 1 h voor experiment, wassen van de cel 5 keer met 1 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg 1 mL van verminderde serum media aangevuld met 1 µM Alexa647 geconjugeerd daar.
- Niet meer dan 15 minuten voordat het experiment, verwijder medium van de glazen bodem schotel en wassen van de cellen transfected en gelabelde 5 keer met 1 mL PBS.
- 1 mL van imaging buffer (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7.3) in de glazen bodem schotel plaatsen.
Opmerking: In de beeldvorming buffer, cellen zijn levensvatbaar is voor niet langer dan 3 h. Daarom worden slechts 2 h van experimenten uitgevoerd op elk gerecht.
2. snelheid microscopie
Opmerking: De snelheid microscopie setup bevat een omgekeerde fluorescentie Microscoop uitgerust met een 1.4-NA 100 × olie-immersie apochromatische doelstelling, een 35 mW 633 nm hij-Ne laser, 50 mW vaste toestand 488-nm en 561-nm lasers, een winst op de chip vermenigvuldiging Charge-combinatie-apparaat camera en een Microscoop softwarepakket dat voor data acquisitie en verwerking (Figuur 1). Voor individueel kanaal imaging, GFP, mCherry en Alexa647 zijn opgewonden door 488 nm, 561 nm of 633 nm lasers, respectievelijk. Voor één molecuul volgen, wordt aanspreekpunt verlichting gebruikt voor het bijhouden van de individuele fluorescently gelabelde moleculen. Voor epifluorescence imaging, is een concave lens geplaatst in de laser verlichting pad naar het uitbreiden van de lichtbundel naar een uniforme gebied van verlichting. De fluorescentie-emissies zijn verzameld door de dezelfde doelstelling, gefilterd door een dichroïde filter (405/488/561/635) en een uitstoot-filter (405/488/561/635) en beeld met de bovenstaande CCD camera op 500 Hz voor enkel molecuul tracking of 2 Hz voor epifluorescence imaging.
- Brengt de glasplaat van de bodem tot het stadium van de Microscoop en ga naar een cel die is de gewenste constructies goed uiten. Zodra een geschikt cel is gevonden, de NPHP4-mCherry plek aan de voet van de primaire cilia met de locatie op de imaging vliegtuig dat correspondeert met de laser's aanspreekpunt verlichting uitlijnen
- Opname van een epifluorescence van NPHP4-mCherry en IFT20-GFP of AP-SSTR3-GFP gebruikend de "Module"-functie in de "Camera" tabblad van het venster "Focus" als het softwarepakket digitale microscopie (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: Deze beelden zal fungeren als een referentie voor de latere enkel molecuul locaties. - Zodra de verwijzing beelden worden verkregen, lokaal verminderen de concentratie van gelabelde afzonderlijke moleculen. Foto-bleekmiddel de TZ met 1 mW laser verlichting voor 20 s of totdat de intensiteit van de fluorescentie dicht bij die van achtergrond fluorescentie is.
Opmerking: Wanneer de exacte concentratie kan worden gecontroleerd, 0,1-1 nM label van afzonderlijke moleculen worden gebruikt. - Ter voorbereiding van een enkel molecuul bijhouden, verminderen de laser verlichting op ~0.15 mW voor afzonderlijke moleculen aangeduid met GFP of ~0.5 mW voor moleculen aangeduid met Alexa647.
- Zodra de kracht van de laser en imaging parameters ingesteld, maximale winst en intensivering en 2 ms framesnelheid zijn, voor enkel molecuul imaging, gaan de juiste verlichting laser en opnemen van niet-photobleached, afzonderlijke moleculen aangeduid als ze worden vervoerd door de photobleached van de TZ door te klikken op de knop "Stream" in de "Camera" tabblad van het venster "Focus".
Opmerking: Niet meer dan 2 min van video moet worden vastgelegd om te minimaliseren van de effecten van Ciliaire drift naar een te verwaarlozen niveau. - Na het vastleggen van de video van één molecuul, verwerken van de video's met behulp van een 2D Gaussian montage-algoritme, zoals glimp door de Gelles Lab, die juist het zwaartepunt van elke één molecuul excitatie PSF in een omvattende ruimte van belang (AOI lokaliseert).
- Selecteer alle enkel molecuul locaties met precisie < 10 nm en het centrum van cilia gebaseerd op distributie van één molecuul locaties uitgerust met een 2D Gauss functie te corrigeren.
Opmerking: Met behulp van 2D naar 3D-transformatie-algoritme, de 3D transportroutes van IFT20-GFP en AP-SSTR3 routes worden duidelijk weergegeven op Ciliaire axonemal of Ciliaire membraan, respectievelijk.
3. 2D naar 3D-transformatie
- Zodra de verschillende taalversies van de duizend voor doorvoer van moleculen (signaal-ruis verhouding > 11) in de cilium worden verzameld, selecteer de lengteas van de cilium als de X-dimensie. Maken van een histogram Y dimensie van de locaties en het verkrijgen van de bedragen van de bin in stappen van 10 nm.
Opmerking: De 2D naar 3D-transformatie kan worden geëvalueerd door hand of software of programmeertaal. De auteurs hebben de transformatie geïmplementeerd in zowel Matlab en Python 2.7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze sectie toont de gegevens uit het uitvoeren van snelheid microscopie in de TZ van primaire cilia te bestuderen van de transportroute van SSTR3 verbonden door een ~ 15 nm externe linker aan Alexa647 (Figuur 3A). Het serveert het tweeledige doel van de verificatie van de 3D-transformatie-algoritme. Alexa647 moeten alleen label het buitenoppervlak van de primaire cilium en dus de 3D transportroute een high-density transportroute op die locatie onthullen moet. NIH-3T3 stabiel uiting van NPHP3-mCherry op de TZ moet transfected met AP-SSTR3-GFP en geïncubeerd volgens het bovenstaande protocol met daar-geconjugeerd Alexa647. Breed veld beeldvorming van het mCherry-label wordt gebruikt voor het lokaliseren van de TZ terwijl het GFP wordt gebruikt om ervoor te zorgen dat een cel de gewenste SSTR3-construct heeft uitgesproken. Daarnaast is breed veld beeldvorming van het label van de Alexa647 met behulp van 633 nm verlichting nodig om te bevestigen dat de cel het BirA plasmide goed heeft uitgedrukt en voldoende Biotine uit de media heeft geabsorbeerd. Positieve bevestiging wordt gekenmerkt door een zichtbaar cilium los van de achtergrond fluorescentie (Figuur 3B). Efficiënte etikettering van de AP-SSTR3-GFP constructie met daar-geconjugeerde Alexa647 kan alleen plaatsvinden onder deze omstandigheden. Zodra positieve bevestiging van selectieve labelling van de primaire cilium door Alexa647 is verkregen, kunnen photobleaching en aanspreekpunt voor de TZ met een 633 nm laser verlichting afzonderlijke moleculen te worden gevisualiseerd. Voor data-analyse is boven elkaar plaatsen de video enkel molecuul op de brede veld verlichting een nuttig validatie stap (Figuur 3C). Bijvoorbeeld als de laser is niet correct uitgelijnd, verschijnt geen afzonderlijke moleculen samen met de TZ lokaliseren. Een andere pre data analyse validatie stap om een voldoende signaal-/ ruisverhouding is het controleren van de intensiteit bij de TZ over de lengte van de enkel molecuul video (Figuur 3E). Een dergelijke analyse kan snel worden uitgevoerd in ImageJ met behulp van de functie 'plot z as profiel'. De pieken in Figuur 3F komen overeen met de verschijning van een enkel molecuul op de TZ met een signaal-ruis voor ~ 5.0. Deze grafiek is ook in staat om ervoor te zorgen dat voldoende photobleaching heeft plaatsgevonden, zoals blijkt uit de goed gescheiden frequentie van afzonderlijke moleculen. Figuur 3 G toont een lage signaal-ruisverhouding van < 0,5. Een verklaring hiervoor zou zijn dat de laser niet rechtstreeks op de TZ wordt uitgelijnd. Een andere reden kan zijn dat de laser verlichting macht te laag is. Beide verklaringen leiden tot lage excitatie en, dus, lage uitstoot van de fluorophores aan de TZ. Nadat deze controles hebben plaatsgevonden, zullen 2D Gaussian montage van de afzonderlijke moleculen produceren hun trajecten in de TZ (Figuur 3H). Boven elkaar plaatsen veel trajecten zal produceren de transportroute van het gelabelde eiwit van belang in de TZ (Figuur 3ik). Aangezien de 2D Gaussian montage komt met de pixelwaarden op de detector, de x overeen, kunnen y enkel molecuul gegevens worden samengevoegd met het beeld van de brede veld van de TZ en primaire cilia ter verdere illustratie van de proteïne van belang van lokalisatie (Figuur 3J ).
IFT20 is een onderdeel van de IFT complex, dat bestemd is voor lading langs microtubuli binnen primaire cilia25. Arl13b-mCherry, een veel gebruikte Ciliaire marker eiwit werd gebruikt om de label primaire cilia19. Breed-gebied epi-fluorescentie microscopie werd gebruikt om het imago van de primaire cilium uiting geven aan zowel de Arl13b-mCherry en de IFT20-GFP en vervolgens overgeschakeld op snelheid microscopie voor het bijhouden van de individuele IFT20-GFP eiwitten in primaire cilia na een pre-photobleaching van GFP fluorescentie tot één-molecuul niveau op het gebied van verlichting van snelheid microscopie (Figuur 4A-4 C).
Uiteindelijk, kunnen honderden single-molecuul IFT20-GFP locaties met een nauwkeurigheid van de planmatige lokalisatie van < 16 nm worden verkregen bij de primaire cilium van een levende cel (Figuur 4D). Volgens onze simulatie, 250 één molecuul locaties met een radius van 95 nm was genoeg voor het genereren van een betrouwbare 3D transportroute (Figuur 5). Een definitieve vaststelling van IFT20-GFP transportroute is gebaseerd op duizenden single-molecuul IFT20-GFP locaties verzameld uit tien cilia (Figuur 4E). Aangezien primaire cilia een structuur met draaisymmetrie bezitten, werd de 2D naar 3D-transformatie algoritme toegepast op de 2D verwachte gegevens. Interessant is dat de kaarten van de 3D ruimtelijke dichtheid van de waarschijnlijkheid van IFT20 aangegeven dat slechts één enkele high-density regio met een breedte van ~ 60 nm piek op ~ 95 nm langs de straal van primaire cilia (Figuur 4E). Deze high-density regio waarschijnlijk lokaliseert samen met de axonemal microtubuli, in overleg met de bekende locatie van de IFT route (Figuur 4F).
Figuur 1 . Vereenvoudigde schema van snelheid microscopie. Een verticale (pad 1) of een geneigd (pad 2) punt spreiding functie wordt gebruikt voor het verlichten van enkele fluorophore moleculen in het brandvlak. "d" verwijst naar de afstand tussen verticale verlichting laserstraal die loopt door het midden van het doel en schuine verlichting die is bereikt door de verlichting laser gericht op de rand van het doel. Twee of meer lasers gereguleerd door een optische chopper te hebben een aan / uit-excitatie-modus worden gebruikt voor het bijhouden van de afzonderlijke moleculen bij het transitovervoer door de NPC of de primaire cilium. De af tijd is ten minste tien keer langer dan de photobleaching tijd van het fluorophore-label op de gerichte moleculen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Grafische demonstratie van 2D naar 3D conversieproces. Schema's aantonen de 2D naar 3D-transformatie algoritme voor moleculen, bijvoorbeeld indien zij binnen de centrale lumen (A-F) of een perifere regio (G-L) van een buis verspreiden. (A) de ideale 3D ruimtelijke locaties voor willekeurig verspreiden moleculen binnen een buis kunnen in een cilindrische coördinatiesysteem (X, R, θ) worden gecoördineerd. In snelheid, alleen de 3D dichtheid kaart is uiteindelijk berekend op basis van de 2D ruimtelijke locaties. Dit is echter een geïdealiseerde geval om te illustreren dat de dichtheid van de 3D-kaart is gelijk of de 2D- of 3D-ruimtelijke locaties zijn bekend. (B) de 3D moleculaire locaties in A worden geprojecteerd op een 2D-vlak in een Cartesiaans coördinatiesysteem (X, Y, Z) door microscopie imaging. (C) een zeer dun plakje (Δx) gesneden uit de cilinder in A langs x-afmeting. (D) de 3D ruimtelijke locaties in het segment weergegeven in C kunnen worden geprojecteerd in een smalle 2D regio. (E) dwarsdoorsnede weergave van alle locaties in het dunne segment weergegeven in C. Deze locaties kunnen worden gegroepeerd in de subregio's tussen concentrische ringen. Gegeven de hoge-nummer willekeurig verdeelde moleculen in de cilinder en de gesneden zeer dunne segment, de ruimtelijke dichtheid van locaties (pik) in elke subregio (Si) tussen twee naburige ringen zullen rotatie symmetrisch en uniform. Deze locaties kunnen verder worden geprojecteerd in 1D langs de Y-dimensie. Als de locaties langs Y dimensie worden geclusterd in een histogram met j kolommen. Het totale aantal locaties in elke kolom (Aj) is gelijk aan 
, die kan worden experimenteel gemeten zoals aangegeven in de (F). (G-L) Net als het bovenstaande, het transformatieproces wordt gepresenteerd voor moleculen verspreiden binnen een perifere regio van een buis. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . 3D ruimtelijke plaats van de transportroute voor SSTR3 op levende primaire cilia toegewezen door snelheid microscopie. (A) grafische weergave van de snelheid microscopie bijhouden van GFP-gelabeld SSTR3 via de TZ gekenmerkt door NPHP4-mCherry wordt toegepast. (B) Epifluorescence beeld van NPHP4-mCherry (rood), AP-SSTR3-GFP (groen), Alexa647 gebruikt om extern label AP-SSTR3-GFP (wit), en de uiteindelijke samengevoegde afbeelding. Schaal bar: 2 µm. (C) volgen van een enkele Alexa 647-geëtiketteerden AP-SSTR3-GFP (wit) die het punt verlichting veld voor vier frames (2 ms/frame passeert). Schaal bar: 2 µm. (D) enkel molecuul traject (witte) van (C) bovenop het beeld van de epifluorescence van NPHP4-mCherry (rood) en AP-SSTR3-GFP (groen). Schaal bar: 2 µm. (E) witte streepjes vierkante hoogtepunten in het gebied van aanspreekpunt verlichtingssterkte gecentreerd op de TZ. Schaal bar: 2 µm. (F) foton graaf vs Frame nummer grafiek voor een enkel molecuul video met een hoge signaal / ruisverhouding bepaald door het verdelen van de maximale fluorescentie van de enkel molecuul gedeeld door de achtergrond fluorescentie. (G) foton graaf vs Frame nummer grafiek voor een enkel molecuul video met een lage signaal / ruisverhouding. (H) traject van (E) en (D) gelokaliseerd in elk frame door 2D Gaussian aanbrengen en bovenop een nauwkeurige grafische weergave van de TZ, ook gelokaliseerd door 2D Gaussian aanbrengen. De 2D Gaussian montage proces past een Gauss functie naar de X- en Y-afmetingen van het profiel van de intensiteit van een gebied van belang (AOI) omvat de enkel molecuul PSF.(I) 2D super resolutie ruimtelijke verdeling van 220 individuele Alexa Fluor 647-label AP-SSTR3-GFP locaties bijeengezocht uit een enkele primaire cilium. (J) Super resolutie enkel molecuul locaties van (I) bovenop het beeld van de epifluorescence van NPHP4-mCherry (rood) en AP-SSTR3-GFP (groen). Schaal bar: 2 µm. (K) van een 2D naar 3D-transformatie-algoritme, de verdeling van de ruimtelijke waarschijnlijkheid dichtheid van Alexa Fluor 647-geëtiketteerden AP-SSTR3-GFP op primaire cilia langs de R-dimensie werd verkregen. Op basis van Gauss functie passen, Alexa Fluor 647-geëtiketteerden AP-SSTR3-GFP voornamelijk gelegen op de Ciliaire membraan op een straal van 131±3 nm met een volle breedte op halve maximum (FWHM) van 24±1 nm. (L) dwarsdoorsnede weergave van de verdeling van de ruimtelijke waarschijnlijkheid dichtheid (groene wolk) van Alexa Fluor 647-geëtiketteerden AP-SSTR3-GFP op primaire cilia. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . 3D ruimtelijke locatie van de transportroute voor IFT20 binnen live primaire cilia toegewezen door snelheid microscopie. (A-C) Representatief beeld van Arl13b-mCherry (A) en IFT20-GFP (B) mede uitgedrukt in een cel van de NIH3T3 en de samengevoegde (C). Het rondje (cyaan) geeft aan dat de locatie van single-point verlichting van snelheid microscopie op een primaire cilium groeide aan de zijkant van een cel (witte streepjeslijnen) waarvan de randen worden bepaald door IFT20-GFP fluorescentie in de cel lichaam en heldere veld verlichting (niet Zie afbeelding). Schaal bar: 10 µm. (D) 2D super resolutie ruimtelijke verdeling van 286 individuele IFT20-GFP locaties verzameld uit een enkele primaire cilium. (E) door een 2D naar 3D-transformatie-algoritme, wordt de verdeling van de ruimtelijke waarschijnlijkheid dichtheid van IFT20-GFP binnen primaire cilia langs de R-dimensie verkregen. Op basis van Gauss functie montage, zoeken IFT20-GFP vooral in een straal van 95±1 nm met een volle breedte op halve maximum (FWHM) van 56±5 nm. (F) dwarsdoorsnede weergave van de ruimtelijke waarschijnlijkheid dichtheid verdeling (groene wolken) van IFT20-GFP in primaire cilia, bedekt met het schema in de bar van de H. schaal: 100 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Simulatie werd gebruikt voor het schatten van het minimum aantal 2D single-molecuul locaties voor het genereren van een betrouwbare 3D ruimtelijke waarschijnlijkheid dichtheid kaart voor de 2D naar 3D-transformatie algoritmen. (A) 100 computationeel gegenereerde single-molecuul locaties monster willekeurig uit een radiale dichtheid normaalverdeling gecentreerd op 95 nm (overeenkomend met de primaire transportroute van IFT20 bepaald in onze experimenten). Lokalisatie precisie van 16 nm voor elke vestiging één-molecuul wordt gesimuleerd door middel van steekproeven van een normale verdeling met σ = 16 nm. Zoals aangegeven in Figuur 2C, een zeer dun plakje (Δx) in de X-dimensie wordt gebruikt voor transformatie algoritmen en daarom de X-dimensie wordt niet weergegeven op de locaties 2D single-molecuul computationeel gegenereerd. (B) transformatie tussen Y-dimensionale projectgegevens en 3D R-dimensionale dichtheid genereren histogrammen van 3D R-dimensionale dichtheden voor vijf verschillende gesimuleerde datasets (elk met 100 punten). Het bovenstaande getal is de piek positie ± montage fout. (C-D) Simulatieresultaten op basis van 250 single-molecuul locaties. (E-F) Simulatieresultaten op basis van 500 single-molecuul locaties. (G-I) Gemiddeld respectievelijk 3D dichtheid histogrammen van 100 - 250- en 500-punten simulaties. Foutbalken vertegenwoordigen variabiliteit in het histogram bin hoogten terwijl het getal boven de piek de gemiddelde piek positie ± standaardafwijking is. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft de toepassing van de microscopie van de snelheid op de primaire cilium, een cellulaire signalering organelle dat is sterk afhankelijk van efficiënte Eiwittransport. SNELHEID microscopie bieden hoge resolutie (< 10 nm) locaties voor fluorescently gelabelde moleculen als ze de aanspreekpunt verlichtingssterkte gecentreerd op de TZ passeren. Het is eerder toegepast om te bestuderen van de proteïne die handel tot en met de NPC6,7,8. Echter, zij kan worden uitgebreid om te bestuderen van de handel door middel van een sub diffractie cellulaire holte. Deze techniek heeft een voordeel ten opzichte van andere hoge resolutie beeldvormende technieken dat het vastleggen van de dynamiek van één Eiwittransport in levende cellen systemen met een ruimtelijke en temporele resolutie van < 10 nm en < 2 ms, respectievelijk. Een ander voordeel is dat men moet enige fluorescently-label een proteïne van belang en de constructie via transfectie, een gemeenschappelijke aanpak van de moleculaire biologie aan het bestuderen van eiwit lokalisatie, om te beginnen met het uitvoeren van snelheid microscopie express. Men moet houden in het achterhoofd dat het aanspreekpunt verlichting met een high-power laser is de functie waarmee de locaties goed gescheiden, hoge resolutie enkel molecuul. Echter dit ook limiteert het gebied van verlichting en laat de techniek niet geschikt is voor breed veld lokalisatie. Gelukkig zijn er vele breed terrein super resolutie technieken voor onderzoekers om uit te kiezen indien gewenst. Een ander punt om te overwegen is dat snelheid microscopie alleen locaties vastlegt van het verplaatsen van afzonderlijke moleculen. Combinatie met FRAP, die de Fractie van de totale moleculen die mobiel zijn bepalen kan, kan dus een zinvolle aanvulling op analyse.
De conversie tussen de cartesiaanse en de cilindrische coördinatiesysteem is het genereren van een virtuele 3D waarschijnlijkheid dichtheid kaart in plaats van een 3D-weergave op basis van 3D single-molecuul bijhouden. In detail, elektronenmicroscopie gegevens gebleken dat de primaire cilia hebben een rotatie symmetrische structuur die zou kunnen een uniforme molecuul distributie langs bepaalde straal genereren. Deze uniforme verdeling leidt dat de ruimtelijke spreiding langs θ dimensie in het cilindrische systeem constant is. Vervolgens kunnen de 3D-coördinaten (X, R, θ) worden vereenvoudigd om de 2D-coördinaten (R, X, constante). Eigenlijk is onze transformatie proces tussen de Cartesische en cilindrische systemen van 2D (X, Y) aan 2D (R, X, constante). De constante θ, verwijst naar de ruimtelijke dichtheid p, wordt berekend met behulp van de vergelijking A
(Figuur 2). Gebruik een matrix-calculator voor het berekenen van de vector 
, die overeenkomt met de relatieve gebieden tussen naburige concentrische ringen in de dwarsdoorsnede weergave6,7Aj s de totale interactie sites in het positie-j gemeten rechtstreeks vanaf experimenten; Dus, pi, de ruimtelijke dichtheid van de waarschijnlijkheid van de sites van de interactie op rik, kan worden berekend door het oplossen van de matrixvergelijking van A.
Een cruciale stap in het protocol is te minimaliseren elke verstoring van de microscopie setup tussen de verwijzing Beeldacquisitie en enkel molecuul video. Als elke beweging optreedt, is het niet mogelijk om vol vertrouwen de enkel molecuul locaties worden toegewezen aan de ultrastructuur van de primaire trilharen die is verkregen via epifluorescence imaging. Een andere essentiële stap is photobleach het gebied van verlichting genoeg om lokaal de concentratie van fluorescently geëtiketteerde afzonderlijke moleculen, maar niet zozeer dat de bevolking is volledig photobleached. In het geval van SSTR3, de diffusie-coëfficiënt is traag in vergelijking met oplosbare moleculen en de beweging van een populatie van VN-photobleached SSTR3 moleculen terug naar het photobleached gebied zullen langer dan twee minuten, de tijd waarboven de Ciliaire drift is een niet te verwaarlozen factor. Als het juiste niveau van photobleaching moeilijk is te bereiken en een hoog niveau van achtergrond fluorescentie nog steeds aanwezig is, een hoekige verlichting laser kan worden gebruikt om het bedrag van fluorescently geëtiketteerde afzonderlijke moleculen die zijn opgewonden boven en onder de Imaging vliegtuig. Dit zal verminderen de achtergrond en verbeteren van de signaal-/ ruisverhouding voor elk gevangen enkel molecuul.
Kortom vermag snelheid microscopie op conventionele microscopie opstellingen door toevoeging van een verlichting van de laserbron, bijbehorende spiegels en hoge snelheid CCD camera gemakkelijk worden geïmplementeerd. De belangrijkste vooruitgang over andere soortgelijke technieken zijn de geneigd laser die sterk de fluorescentie van de achtergrond vermindert en de 2D-3D-transformatie-algoritme dat Hiermee reconstrueert u de kaart 3D ruimtelijke dichtheid van de waarschijnlijkheid van de 2D single-molecule locaties. Vanuit biologisch oogpunt, is geen extra labeling naast een fluorophore-geconjugeerde proteïne van belang nodig. Deze functies laten snelheid microscopie voor het bijhouden van afzonderlijke moleculen met hoge Spatio (5-10 nm, 0,4-2 ms) resolutie zoals ze het verkeer via een sub micrometer bio-holte of bio-kanaal met rotatie symmetrische structuren. In combinatie met een algoritme van de transformatie 3D waarschijnlijkheid dichtheid, kunnen de 3D transportroutes van de tagged eiwitten worden bepaald door de holte of het kanaal. De toepassing van deze techniek is eerder gebruikt om te onderscheiden van 3D transportroutes van eiwitten en RNAs door de NPC en hier, laten we zien dat het 3D vervoer van een transmembraan eiwit, SSTR3 en een cytosolische eiwit, IFT20, kan worden bereikt in de TZ van primaire cilia. Andere super resolutie technieken, zoals 3D-STORM, hebben verkregen x, y, z posities voor afzonderlijke moleculen door het plaatsen van een cilindrische lens in de optische weglengte van die creëert een asymmetrische vervorming van de single-molecuul PSF afhankelijk van de positie boven of onder het brandvlak28. Een ander voorschot mag proberen uit te voeren virtuele pinhole technologie om de breedte van de PSF-emissie te reduceren en aldus resolutie nog verder te verhogen. De bovengenoemde technieken kunnen worden toegepast op snelheid microscopie heel gemakkelijk. Over het geheel genomen biedt snelheid microscopie een unieke aanpak bij het gelijktijdig bepalen van vervoer kinetiek op single-molecuul niveau- en 3D-plattegrond van vervoer trajecten met super hoge Spatio resolutie voor inter - of intra-organel moleculaire mensenhandel onder bepaalde omstandigheden in de levende cel systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Kristen Verhey (Universiteit van Michigan, Ann Arbor) en Dr. Gregory Pazour (medische faculteit van de University of Massachusetts) voor het verstrekken van sommige plasmiden. Het project werd gesteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH GM097037, GM116204 en GM122552 naar W.Y).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25x36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
References
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X.
- Leung, B. O., Chou, K. C. Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology. Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3, 793-796 (2006).
- Ma, J., Yang, W. Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).
- Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).
- Ma, J., et al. High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore. Nat Comm. 4, (2013).
- Akey, C. W., Radermacher, M. Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 122, 1-19 (1993).
- Akey, C. W. Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 109, 955-970 (1989).
- Czarnecki, P. G., Shah, J. V. The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicine. Trends Cell Biol. 22, 201-210 (2012).
- Elf, J., Li, G. -W., Xie, X. S. Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell. Science. 316, 1191-1194 (2007).
- Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. 3D orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles. J Vis Exp. , (2014).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitscheck, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PloS one. 5, 11639 (2010).
- Marshall, W. F., Nonaka, S. Cilia: tuning in to the cell's antenna. Curr Biol. 16, 604-614 (2006).
- Scholey, J. M., Anderson, K. V. Intraflagellar transport and cilium-based signaling. Cell. 125, 439-442 (2006).
- Yang, T. T., et al. Superresolution pattern recognition reveals the architectural map of the ciliary transition zone. Sci Rep. 5, 14096 (2015).
- Craige, B., et al. CEP290 tethers flagellar transition zone microtubules to the membrane and regulates flagellar protein content. J Cell Biol. 190, 927-940 (2010).
- Kee, H. L., et al. A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia. Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).
- Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).
- Nachury, M. V., Seeley, E. S., Jin, H. Trafficking to the ciliary membrane: how to get across the periciliary diffusion barrier. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 59-87 (2010).
- Ye, F., et al. Single molecule imaging reveals a major role for diffusion in the exploration of ciliary space by signaling receptors. Elife. 2, 00654 (2013).
- Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).
- Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89, 909-926 (1999).
- Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly. Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).
- Awata, J., et al. NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone. J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).
- Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
