Summary
Este protocolo descreve as várias técnicas necessárias para microscopia eletrônica de transmissão incluindo coloração negativa, seccionamento ultrafinos de estrutura detalhada e imuno-ouro rotulagem para determinar as posições de proteínas específicas em exosomes.
Abstract
Exosomes são nanométricas vesículas extracelulares secretadas por fluidos corporais e são conhecidos para representar as características das células que secretam-los. O conteúdo e a morfologia das vesículas secretadas refletem o comportamento celular ou estado fisiológico, por exemplo, crescimento celular, migração, decote e morte. Papel do exosomes pode dependem altamente tamanho e o tamanho de exosomes varia de 30 a 300 nm. O método mais utilizado para tratamento de imagens exossomo é coloração negativa, enquanto outros resultados baseiam-se na microscopia de elétron de Cryo-transmissão, microscopia eletrônica de varredura e microscopia de força atômica. Morfologia do exossomo o típico avaliada através de coloração negativa é uma em forma de taça, mas ainda mais detalhes ainda não estão claras. Um exossomo bem caracterizado por meio de estudo estrutural é especialmente necessário nas áreas médicas e farmacêuticas. Portanto, a morfologia função dependente deve ser verificada por técnicas de microscopia eletrônica, por exemplo marcando uma proteína específica da estrutura detalhada do exossomo. Para observar a estrutura detalhada, imagens secionadas ultrafinos e imagens negativas manchadas, de exosomes foram comparadas. Neste protocolo, sugerimos a microscopia eletrônica de transmissão para a imagem latente de exosomes incluindo coloração negativa, toda montagem imuno-coloração, preparação de bloco, seção fina e rotulagem imuno-ouro.
Introduction
Vesículas extracelulares (EVs) são vesículas de bicamada lipídica secretadas pelas células, e seu tamanho varia entre 30 e 300 nm. SVE foram relatados primeiramente em 1978, com evidência de vesículas de pacientes com doença de Hodgkin1. Essas vesículas foram relatadas para ser de 40 a 120 nanômetros de tamanho. Em 1980, foi relatado que EVs estão envolvidos no sistema de coagulação e trombose, formação de um coágulo de sangue dentro de um vaso sanguíneo no câncer pacientes2. Depois de 30 anos, registaram-se um fator importante para promover a invasão do tumor, fuga imune e angiogênese3EVs. Além disso, as funções de EVs têm sido estudadas como reguladores em interacções celulares nas áreas de inflamação, distúrbio imunológico, doenças neurológicas e câncer4. Desde EVs contêm biomoléculas específicas tais como proteínas e RNAm microRNA5, sua potencial aplicação no diagnóstico e terapêutica tem sido analisados6,7. Sve é uma categoria composta por subgrupos, incluindo exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, micropartículas, promininosomes, argosomes e exossomo como vesículas, dependendo da sua origem celular e função biológica3. Além disso, com base na sua biogênese, esses EVs podem ser divididos em aumentada (galpão aumentada, 100-1000 nm) e exosomes (30-300 nm)8,9. Entre estes, o exossomo tem sido relatado como um comunicador de célula para resposta imune10, câncer11,12e doenças infecciosas13.
Interesse no exosomes como um biomarcador para o diagnóstico precoce está a aumentar rapidamente, e a purificação e caracterização de exosomes devem ser acompanhados com técnicas de imagem moleculares. Os diferentes tamanhos e morfologias de exosomes, dependendo de sua origem e função14, podem ser distinguidas por técnicas de microscopia de alta resolução, tais como a microscopia eletrônica. Exosomes maioria dos foram visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) negativo manchada15,16,17, e esses resultados foram confirmados por immunolabeling de uma proteína específica em toda montagem vesículas 18. diversos grupos de pesquisa relataram a estrutura através de microscopia eletrônica de varredura, microscopia de força atômica19,20e21,de Cryo-TEM22. No entanto, enquanto estas técnicas são úteis para estudar a estrutura do exossomo, eles são insuficientes para observar a posição de proteínas específicas, localizado no interior do exossomo. Portanto, nós introduzimos um protocolo para exosomes com uma proteína específica rotulagem de imagem. Nós aplicamos a preparação do bloco, seccionamento ultrafinos e imunocoloração para determinar a localização detalhada da proteína do exossomo. Isso foi comparado com coloração negativa e todo imunocoloração de montagem, que é tradicionalmente utilizada para a caracterização do exossomo.
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Protocol
1. bloco preparação, corte, coloração e imagem do exossomo
- Pelota a exosomes do sobrenadante de cultura de células HCT116 por centrifugação a 100.000 x g durante 1,5 h23. Remover a sobrenadante de cultura e fixar cuidadosamente a pelota exossomo purificado com 1 mL de glutaraldeído 2,5% em solução de cacodylate de sódio 0,1 M (pH 7.0) para 1 h a 4 ° C. Para cacodylate de sódio 0,1 M, dissolva ácido cacodílico 4,28 g em 160 mL de água destilada (DW). Ajuste o pH para 7,4 com 0.1 M HCl, em seguida, fazer a 200 mL com água destilada.
- Retire o fixador e enxágue as pelotas com 1 mL de tampão de cacodylate de sódio 0,1 M à temperatura ambiente. Repita três vezes com cada alteração de duração de 10 min.
- Fixar as amostras com 1 mL de tetróxido de ósmio de 2% para 1 h a 4 ° C.
- Retire o fixador e lavar três vezes com cacodylate de sódio 0,1 M buffer cada 10 min.
- Incubar durante 10 min com uma série de classificados acetona (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, respectivamente) no agitador.
- Remover a acetona e incubar a solução da mistura incorporação de 3:1 acetona: baixa viscosidade durante 30 min. A pelota exossomo está no tubo.
- Remover o meio e adicionar médio de encastre mistura 1:1 acetona: baixa viscosidade, e incube por 30 min.
- Remover o meio e adicione 3:1 acetona: baixa viscosidade encastre mistura média e, em seguida, incube durante 30 min.
- Remover o meio e adicione 100% baixa viscosidade, incorporando a mistura e incubar durante uma noite em temperatura ambiente.
- Incorporar a amostra em pura baixa viscosidade, incorporando a mistura usando o molde de encastre e asse por 24 h a 65 ° C.
- Prepare-se seções com espessura de 60 nm através de um ultramicrótomo.
- Duplo-mancha com 2% de acetato de uranilo por 20 min e levar citrato por 10 min.
Para solução de chumbo de Reynolds, adicione 1,33 g de nitrato de chumbo e 1,76 g de citrato de sódio para um total de 50 mL de água destilada. - Observar a grade sob microscopia eletrônica de transmissão em 80 kV.
- Clique em "Adquirir" e clique em "Arquivo" e "Salvar como" sistema de câmera CCD sob o microscópio de elétron em 80 kV. Siga as configurações automáticas para o tempo de exposição.
2. imuno-coloração de seções e de imagem (Figura 1)
- Corte 60 seções ultra-finas nm usando um ultramicrótomo e recolher a grelha de níquel.
- Incube grades em 50 gotas de µ l de glicina de 0,02 M por 10 min saciar os grupos aldeído livre.
- Enxague em 100 μL de DW três vezes cada 10 min. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h em PBS contendo 1% de BSA.
- Incubar as grades em gotas de 50-100 µ l de anti KRS anticorpo24 (1: 100 em PBS contendo 0,1% BSA) para 1h (se for necessário, que nesta etapa deve ser efectuada a 4 ° C durante a noite.)
- Lave as grades com cinco gotas separadas (50 μL) de PBS contendo BSA de 0,1% por 10 min cada.
- Transferência de grades para gotas de 2nd anticorpo por 1h (anti-coelho IgG conjugada com partículas de ouro nm 10 (1: 100) em PBS contendo 0,1% BSA).
- Grades de lavagem com cinco separam gotas (50 μL) de PBS contendo 0,1% BSA cada 10 min.
- Duplo-mancha com acetato de uranilo 2% por 20 min em condições escuras e com citrato de chumbo de Reynold para 10 min, respectivamente.
- Clique em "Adquirir" e clique em "Arquivo" e "Salvar como" no sistema de câmera CCD sob uma temperatura de 80 kV. Tempo de exposição seguido configurações automáticas.
Figura 1: processo de preparação da amostra e imunocoloração. (A) duplo fixo exossomo é desidratado e infiltrado com baixa viscosidade, incorporação de resina de mistura. (B) a incorporação de resina. (C) seção ultra fina com faca de diamante. (D) configuração para rotulagem de imuno-ouro. As grades com as seções ultra-finas são colocadas sobre as gotas de líquido em um parafilm, que é colocado com a toalha de papel molhada. Cada seção é incubada com gotículas de anticorpo de 50-100 µ l e, em seguida, lavada com tampão. (E) dupla coloração com acetato de uranilo e citrato de chumbo. A tampa é coberta com papel alumínio para a coloração de heavy metal. (F) solução de coloração é removido pelo filtro de papel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. coloração negativa
- Brilho da descarga-a película fina formvar/carbono revestido 200 grades de EM malha de cobre para 1 min de descarregador de brilho.
- Fix exosomes purificado com 1ml de 2% paraformaldeído (PFA) por 5 min.
Cuidado: Paraformaldehyde vapores são tóxicos. Todo trabalho deve ser feito em uma coifa ventilada. - Carregar 5-7 µ l exossomo suspensão solução da grelha e incubar durante 1 min. Se a concentração do exossomo é muito elevada, dilua a concentração de 1/2 - 1/5.
- Imediatamente a mancha com as ~ 20 gotas de solução de acetato (UA) de uranilo 1% filtrada na superfície da grade EM por seringa.
- Remova a excesso solução UA na grelha entrando em contato com a borda de grade com papel de filtro.
- Rapidamente lave a grelha com uma gota de água. Esta etapa irá remover a solução de coloração em excesso.
- Coloque a grelha na mesa, segurando com uma pinça e cobrir a grade parcialmente com um prato de cultura para secar por 10 minutos em temperatura ambiente.
- Armazenar a grade em uma caixa de grade EM para futura observação por um TEM 80 kV.
4. toda montagem para imunocoloração
- Brilho da descarga-a película fina formvar/carbono revestido 200 grades de EM malha de cobre por 30 s.
- Fix exosomes purificado com 1ml de 2% paraformaldeído (PFA) por 5 min.
Cuidado: Paraformaldehyde vapores são tóxicos. Todo trabalho deve ser feito em uma coifa ventilada. - Carga de 5 a 7 µ l solução de exossomo fixo na grade e incubar por 5 min. enxaguar com 100 µ l de PBS três vezes cada um por 10 min.
- Trate de grades com 50 µ l de glicina de 0,05 M para 10 min saciar os grupos aldeído livre.
- Transferência de grades a uma queda do tampão de bloqueio (PBS contendo 1% de BSA) por 30 min.
- Incube as grades com 50-100 µ l anti anticorpo PD-L1 (1: 100 em PBS contendo 0,1% BSA) por 1h (se for necessário, que nesta etapa deve ser efectuada a 4 ° C durante a noite).
- Lave a grade com 5 gotas separadas (50 μL) de PBS contendo BSA de 0,1% por 10 min cada.
- Transferi a grade para uma gota de anticorpo dend 2 por 1h.
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Representative Results
Atualmente, exosomes são classificados em categorias de tamanho e forma por microscopia eletrônica de transmissão. A Figura 2 mostra negativo manchado exossomo e imunológico-rotulados exossomo no monte todo status. A Figura 3 mostra exossomo secionado e imuno-rotulados exosomes após corte fino. Usando anticorpos de proteínas específicas de coloração imuno-ouro é usado positivamente identificar um exossomo e classificar os tipos de proteínas do exossomo. O protocolo neste artigo usa toda montagem imunocoloração e imunocoloração com plástico exossomo seccionado.
Figura 2: negativo coloração e toda montagem imuno-manchando. (A) exossomo morfologia é observada pela coloração negativa. Exosomes mostra sua morfologia em forma de taça. (B, C) Toda montagem imuno-ouro coloração mostra a localização da proteína específica (anti CD274 humana; PD-L1) em exossomo. Setas brancas indicam a localização do ouro. Setas pretas indicam a localização do sinal de fundo. (D) controle de imunocoloração resultado negativo. Isotipo controle foi usado por anticorpo primário neste processo de imunocoloração. Barra de escala = 100 nm.
Figura 3: micrografia eletrônica de seccionado exosomes. Morfologia de forma redonda dos Exosomes (A) . (B) in a box exossomo usando a ferramenta "boxer" no programa EMAN. (C, D) Imuno-ouro rotulados exossomo com coloração de heavy metal. Setas pretas indicam a escala (A-D) com partículas de ouro bar = 100 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo apresenta um protocolo para observar a estrutura do exossomo a detalhada e rotulagem de suas proteínas específicas. Coloração negativa tem sido considerado como o melhor método para exossomo de imagem17. Esta técnica convencional mostrou-se estrutura de forma de Taça dos exosomes. No entanto, esta forma de xícara é uma forma de artefato que pode ocorrer devido ao processo de secagem. Cryo-TEM resultados têm mostrado que o exosomes tem uma estrutura perfeitamente esférica em solução aquosa25,26. A técnica de cryo-TEM é um método muito poderoso para examinar a estrutura natural, mas é difícil de aplicar o método de imuno-ouro. Raso e colegas de trabalho apontadas para secagem no método convencional (toda montagem negativo método de coloração) resultaram em uma morfologia em forma de taça. Neste estudo, o método padrão para a preparação da pilha (EM rotina; fixação, desidratação, incorporação e seccionamento) foi aplicado para reduzir o efeito de secagem exossomo. A rotina EM usando a incorporação de plástico pode evitar ou reduzir artefatos (mudanças no volume e forma), causados pela desnaturação. Para a fixação química, glutaraldeído (GA) foi usado para o cross-linking (covalentes interações entre grupos aminoácidos). Geralmente, tetróxido de ósmio (OsO4) é usado para a fixação de lípidos, bem como melhor contraste.
Neste estudo, coloração negativa ajudou a confirmar a morfologia típica de exosomes que tem sido relatada em anteriores trabalhos21,,27,28,29. Além de coloração negativa, bloco de corte também é um bom método para observação de exosomes (Figura 2). Quando secionadas imagens mostraram a estrutura interna do exossomo, em contraste, negativo TEM manchado mostrou principalmente a superfície da exossomo. Em imagens seccionadas (Figura 3), as vesículas mostraram a estrutura do lúmen que é conhecida como uma característica estrutural da exosomes30. Neste protocolo, usamos o bloco de corte, coloração imuno e TEM imagem. Especialmente, o seccionamento do bloco é útil para a análise em um momento posterior, quando as imagens podem ser necessárias em diferentes ampliações, para a técnica de microscopia diferentes e para outras análises tais como rotulagem imuno-ouro. Após o corte, seções da grelha podem ser armazenadas na caixa de grade, que pode ser usada para imuno-coloração para classificação de exosomes. Por exemplo, detectamos o conhecido exossomo marcadores14 na exosomes isolada para estudar as funções do exosomes.
Métodos de rotulagem do immunogold têm algumas dificuldades técnicas, incluindo sem rotulagem ou etiquetagem de fundo elevado. Quando experimentando sem rotulagem, recomendamos que verifique a concentração do anticorpo primário e tempos de incubação primário. No caso de baixas concentrações de anticorpos primários, titulação de anticorpos pode ser útil para encontrar a imunorreatividade otimizada. Também pode ser útil aumentar os tempos de incubação de 4 ° C durante a noite. Em contraste, se a concentração do anticorpo primário é muito alta ou o tempo de incubação é muito longo na alta temperatura, o sinal de fundo será aumentado.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo Bio & programa de desenvolvimento de tecnologia médica da Fundação Nacional de pesquisa (NRF) & financiado pelo governo coreano (MSIP & MOHW) (n º 2016M3A9B6904244). Agradecemos também a membros do centro de pesquisa Bioconvergence de medicamentos para a purificação do exossomo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
References
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