Summary
Wir präsentieren ein Protokoll, um die Madagaskar nutzen Zischen Schabe als alternative nicht-Säugetier Tiermodell, bakteriellen Virulenz, Pathogenese Medikamententoxizität, Wirksamkeit von Medikamenten und angeborene Immunantwort Studien durchzuführen.
Abstract
Viele Aspekte der angeborenen Immunität sind zwischen Säugetieren und Insekten konserviert. Ein Insekt, das Madagaskar Zischen Kakerlake aus der Gattung Gromphadorhina, kann als alternative Tiermodell für das Studium der Virulenz, Wirt-Pathogen Interaktionen, angeborenen Immunantwort und Wirksamkeit von Arzneimitteln genutzt werden. Für die Aufzucht, Pflege und Zucht der zischende Kakerlake Angaben. Wir zeigen auch, wie es mit Bakterien wie die intrazelluläre Erreger Burkholderia Mallei, B. Pseudomallei, und B. Thailandensisinfiziert werden kann. Die zischende Kakerlake ist kostengünstig und überwindet Regulierungsfragen, die mit dem Einsatz von Säugetieren in der Forschung zu tun. Darüber hinaus sind die Ergebnisse mit dem zischenden Schabe Modell reproduzierbar und vergleichbar mit denen, die mit Säugetieren Modellen. Daher stellt die Madagaskar zischende Kakerlake einen attraktive Surrogat-Host, der bei der Durchführung von Untersuchungen an Tier untersucht werden sollte.
Introduction
Die Verwendung von Insekten als alternative nicht-Säugetier-Tiermodellen, bakterielle Pathogenese und angeborene Host Verteidigung zu studieren hat in den letzten Jahren an Dynamik gewinnt. Logistisch gesehen ist dies aufgrund der relativ preiswert Kosten und die Leichtigkeit in Beschaffung, Bearbeitung und Pflege von Insekten, die im Vergleich zu Säugetieren. Es gibt auch keine Ordnungspolitik für die Nutzung von Insekten in der Forschung; Es unterliegt nicht der Zuständigkeit oder Beschränkungen, die durch jedes mögliches Tier verwenden Ausschuss oder Regierungsbehörde. Insekten als Surrogat Tiermodelle sind besonders geeignet, um umfassende Screening-Studien für Virulenzfaktoren, Wirt-Pathogen Interaktionen und Einschätzungen der Wirksamkeit von Anti-mikrobiellen Medikamenten. Ihre Verwendung kann die Anzahl der Säugetiere, die für die Forschung dadurch überwinden einige der ethischen Dilemmata, die die Durchführung von Tierversuchen 1,2reduzieren.
Insekten können als Surrogat Gastgeber dienen, denn es ein hohes Maß an Übereinstimmung zwischen dem angeborenen Immunsystem von Insekten und Säugetiere 1,3 gibt. Plasmatocytes Insekten und Säugetieren Makrophagen phagozytieren Mikroorganismen 4. Das Insekt Gegenstück, die Neutrophilen ist die Hemocyte 5,6. Intrazelluläre oxidative Burst Signalwege im Insekt und Säugerzellen sind ähnlich; reaktive Sauerstoffspezies in beiden werden von ortholog p47Phox und p67Phox Proteine 5produziert. Die Signalisierung Kaskaden flussabwärts der Maut-Rezeptoren bei Insekten und Toll-Like-Rezeptoren und Interleukin-1 bei Säugetieren sind auch bemerkenswert ähnlich; Beide führen in der Produktion von antimikrobiellen Peptiden wie Defensine 7. Insekten können so genutzt werden, um allgemeine angeborene Abwehrmechanismen zu studieren, die von Metazoen geteilt werden.
Ein Insekt, genannt die zischende Kakerlake aus der Gattung Gromphadorhina, Madagaskar ist eines der größten Schabe-Arten, die vorhanden ist, in der Regel 5 bis 8 cm am Ende der Laufzeit zu erreichen. Es ist nur auf der Insel Madagaskar beheimatet und zeichnet sich durch das zischende Geräusch macht es - ein Geräusch, das entsteht, wenn die zischende Kakerlake Luft durch die Atemwege Öffnungen genannt Luftlöcher 8vertreibt. Das markante Zischen dient als eine Form der sozialen Kommunikation unter Zischen Kakerlaken für Balz und Aggression 9 und ist hörbar, wenn ein Mann in seinem Lebensraum gestört wird. Der Madagaskar Zischen Schabe wird langsam die amerikanische Schabe und anderen städtischen Schädlingsarten verglichen. Es ist leicht zu pflegen und zu züchten; eine schwangere zischende Kakerlake kann 20 bis 30 nachkommen zu einem Zeitpunkt zu erzeugen. Ein Baby, Zischen, Schabe, nannte eine Nymphe in 5 Monaten Geschlechtsreife erreicht nach 6 Häutungen unterziehen und leben können bis zu 5 Jahre in freier Wildbahn und in Gefangenschaft 8.
Wir haben die Madagaskar genutzt, zischende Kakerlake als Surrogat Host für Infektion mit intrazellulären Erreger Burkholderia Mallei, B. Pseudomalleiund B. Thailandensis 10,11. Die Virulenz dieser Erreger in Zischen Kakerlaken war ihre Virulenz im Tiermodell Benchmark für Burkholderia, der syrischen Hamster verglichen. Wir fanden, dass die 50 % letale Dosis (LD50) von B. Pseudomallei und B. Mallei in beide Modelle 11ähnlich war. Interessanterweise ist B. Thailandensis, obwohl avirulent im Nagetier-Modell in die zischende Kakerlake 11tödlich. Dieser Unterschied in Bezug auf B. Thailandensis Infektion unterstreicht das Dienstprogramm des Modells zischende Kakerlake; B. Thailandensis mildernde Mutanten können leichter in die zischende Kakerlake als im Nager-Modelle behoben werden. Darüber hinaus B. Thailandensis oft als verwendet wird könnte der Modellorganismus für B. Pseudomallei und B. Mallei 10,12,13, Identifizierung mildernde Mutationen in es führen Sie zu ähnlichen Zielen in seine virulenteren Verwandten.
Trotz der Unterschied in der Virulenz von B. Thailandensis in die zischende Kakerlake im Vergleich zu den syrischen Hamster, Mutationen im kritischen Virulenzfaktoren, wie denen der Typ 6 Sekretion System-1 (T6SS-1), sind die in B. Mallei mildernde und B. Pseudomallei, sind in ähnlicher Weise für B. Thailandensis 11Dämpfung. Das zischende Kakerlake Modell wird weiter validiert, dass einzelne T6SS Mutanten (T6SS-2-T6SS-6) in B. Pseudomallei, die keinen Einfluss auf die Virulenz in syrischen Hamster haben, in die zischenden Kakerlaken 11virulent bleiben. Somit ist die zischende Kakerlake eine tragfähige Surrogat Tiermodell für die drei Burkholderia -Arten. Wir vor kurzem die zischende Kakerlake als ein Surrogat Tiermodell zu prüfen, die Wirksamkeit von Anti-Malaria-Medikament Chloroquin (CLQ) gegen Burkholderia Infektion 10 und seine Toxizität eingesetzt.
Hier beschreiben wir die Aufzucht und Pflege der Madagaskar Zischen Schabe und Einzelheiten darüber, wie dieses Insekt mit drei Burkholderia -Arten infizieren. Darüber hinaus zeigen wir, die zischende Kakerlake ist eine tragfähige Surrogat Modell zur Virulenz und Wirksamkeit von Arzneimitteln in Burkholderia Infektionen und, dass es wahrscheinlich auch als Surrogat Host für andere bakterielle Erreger in ähnlichen Studien dienen kann.
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Protocol
1. Vorbereitungen für die Aufrechterhaltung einer zischenden Schabe-Kolonie
- Bereiten Sie Käfige für die zischenden Kakerlaken zu Leben vor. Beantragen Sie eine dünne Schicht Vaseline, ca. 20 bis 30 mm in der Breite, an den Umfang der Innenwände im oberen Bereich des Käfigs, die zischenden Kakerlaken aus dem Käfig Klettern und Flucht zu verhindern.
Hinweis: Zischen Kakerlaken kann in einer Vielzahl von Containern untergebracht werden, die eine große Grundfläche haben, sind von ausreichender Höhe und Deckel haben. Verwenden Sie Maus Käfige (~ 43 x 23 cm x 20 cm). Gelten Sie für Käfige für 37 ° C bestimmt sind nicht Vaseline. - Ein Karton Eierkarton platziert kopfüber in den Käfig ein Versteck für die Natur aus schüchtern Insekten zu gehören. Ersetzen Sie Karton Eierkarton nicht mit einem aus Polystyrol-Hartschaum zur Einnahme von Kunststoff zu verhindern.
- Bieten Sie keine Bettwäsche für einfachere Reinigung und die Sichtbarkeit der frisch geschlüpften Nymphen zu erhöhen.
- Erhalten Sie Trockenfutter enthält eine Komposition von ~ 20 % Rohprotein. Grob mahlen das Hundefutter mit einer Küchenmaschine oder Mixer und Lagerung bei 4 ° C.
- Erhalten Sie mehrere flache Gerichte und Aquarium Steinen oder einem Schwamm für Futter und Wasser.
Hinweis: Petrischalen sind empfohlen.
(2) zischende Kakerlake Pflege und Zucht
- Outbred Madagaskar Zischen Kakerlaken (~ 5 cm) von einem kommerziellen Züchter erhalten. Es ist die Art, die in diesem Protokoll verwendeten Gromphadorhina Laevigata. Entpacken Sie die Versandverpackung mit zischenden Kakerlaken sofort nach Erhalt.
- Richtlinien Sie entsprechenden institutionellen für den Einsatz von persönlichen Schutzausrüstungen im Umgang mit Tieren.
Hinweis: Verwenden Sie dicke Einweg-Handschuhe für den Umgang mit Kakerlaken, da die tarsal Klauen einer zischenden Kakerlake scharf sind. - Bis zu 75 große zischende Kakerlaken zu übertragen (> 3 cm) pro großen Käfig. Die neu geschlüpften und kleineren Nymphen zu übertragen (< 3 cm), einem separaten Käfig.
Hinweis: Halten Sie deutlich mehr als 75 große Zischen Schaben pro Maus Käfig könnte zu einer Verschlechterung der Gesundheit der Kolonie führen und könnte auch zu Todesfällen führen. - Behandeln Sie ein neu molted Schabe, die Natur in Farbe, sanft zu und vermeiden Sie zu quetschen. Alternativ ermöglichen Sie das Exoskelett zu verdunkeln und aushärten, bevor Sie sie berühren.
Hinweis: Es ist nicht notwendig, die Milben, Gromphadorholaelaps Schaeferi , die oft begleiten zischende Kakerlaken nach Erhalt von Züchtern zu entfernen. Die vorteilhaften Milben Zischen Kakerlaken sauber halten und sind für den Menschen harmlos. - Füttern sie zischende Kakerlaken mit Boden trocken Hundefutter in eine flache Schüssel einmal oder zweimal pro Woche. Bieten Sie genügend Hundefutter um sicherzustellen, dass die zischenden Kakerlaken bis zur nächsten Fütterung genügend Nahrung haben. Entsorgen Sie alle Lebensmittel, die feucht und schimmelig geworden ist.
- Neben Hundefutter bieten Sie zerschnittenen Früchte und Gemüse wie Äpfel, Kartoffeln oder Salat in eine flache Schüssel. Verschimmelt oder verdorbene Lebensmittel wegwerfen.
- Liefern Sie Trinkwasser einmal oder zweimal pro Woche in eine flache Schüssel, aber Überfüllen Sie nicht das Gericht um Verschütten in den Käfig zu verhindern. Kleines Aquarium Steinen oder einem Schwamm in der Schale einen Landeplatz für kleine Nymphen zu platzieren. Verwenden Sie die Umkehr-Osmose-Wasser, falls vorhanden.
- Zischen Sie halten Sie Kakerlaken im Dunkeln bei Temperaturen von 21 ° C bis 30 ° C. Halten Sie große zischende Kakerlaken bestimmt für Experimente mit einer niedrigeren Temperatur (~ 21 ° C) für ~ 2 Monate um Zucht und Schwangerschaft zu verringern. Im Gegensatz dazu halten Sie Nymphen bei höheren Temperaturen (28 ° C bis 30 ° C), um Wachstum zu beschleunigen.
Hinweis: Aufbewahren Sie Käfige bei Zimmertemperatur (21 ° C) in einem dunklen Schrank. - Bieten Sie Feuchtigkeit durch die Einbeziehung einer separaten Pfanne mit Wasser, wenn Zischen, dass Kakerlaken in einem Inkubator aufbewahrt werden.
- Reinigen Sie den Käfig durch Aushöhlung trockenen Kot regelmäßig oder durch die Übertragung Zischen Kakerlaken zu einem sauberen Käfig alle 2 bis 3 Wochen. Halten Sie der Boden des Käfigs trocken. Reinigen Sie den Käfig sofort, wenn überschüssiges Wasser erlaubt ist, zu sammeln und mischen mit dem Kot auf dem Boden des Käfigs.
(3) Schabe Vorbereitung für Experimente
- Übertragen Sie die entsprechende Anzahl an zischenden Kakerlaken in einem Käfig in einem befeuchteten Inkubator 37 ° C 1 bis 3 Wochen vor ein Experiment für die Akklimatisierung. Gehören Sie einer Kontrollgruppe für die Injektion. Dieser Zeit der Akklimatisierung ist entscheidend zur Vermeidung von Temperaturschock beim Experimentieren.
- Käfige für 37 ° C bestimmt sind, weil die höhere Temperatur das Gelee schmilzt nicht zuweisen Sie Vaseline.
- Überprüfen Sie die zischenden Kakerlaken alle 1 bis 2 Tage Nahrung und Wasser zu ersetzen und den Käfig zu reinigen.
- Erhalten Sie klare Einweg Kunststoff Essen-Container mit Deckel für die Gruppierung der zischenden Kakerlaken während der Experimente. Schlagen Sie für Lüftung Löcher in den Deckel oder die Seite des Behälters mit einem Nagel und hammer.
Hinweis: Verwendung Schraubverschluss Container über Snap cap Container in der Biosafety Level 3 Einstellung. Snap Cap-Container können mit Klebeband, ggf. verstärkt werden. - Am Tag der Injektion 6 bis 12 akklimatisierte zischende Kakerlaken in Gruppen pro Container, gleiche Verteilung nach Geschlecht verteilen und body-Mass.
- Bestimmen Sie das Geschlecht der einzelnen Zischen Kakerlaken. Bestimmen Sie das Geschlecht durch die Bekanntheit der Hörner auf Männchen und das Fehlen davon auf Weibchen gefunden.
- Wiegen Sie die einzelnen Zischen Kakerlaken. Um das wiegen einer zischenden Kakerlake auf die Waage zu erleichtern, legen Sie es in zwei wiegen-Boote, die tariert worden.
Hinweis: aus Gründen der Kohärenz zwischen Experimente verwenden Sie zischende Kakerlaken mit einem Gewicht von 4 bis 8 g. Jedoch wurden zwischen kleinen (1,5 bis 2 g) und groß (6 bis 8 g) Zischen Kakerlaken kein Unterschied in der Überlebensrate nach Infektion gefunden. Für Medikamentenstudien, verwenden zischende Kakerlaken mit einem Gewicht von ca. 5 g zu einer einheitlicheren Wirkstoffkonzentration pro Körper Masse. - Anstelle einer Wasserschale beinhalten Sie Hochwasser Content Obst oder Gemüse, wie z. B. ein Stück Apfel oder Kartoffel. Entsorgen Sie verdorbenes Essen. Bieten Sie keine zusätzliche Wasser um den Behälter trocken zu halten.
- Erst Injektionen zischende Kakerlaken auf 37 ° C zurück.
4. bakterielle Kultur und Vorbereitungen
Hinweis: Die in diesem Protokoll verwendeten Bakterienarten sind B. Mallei, B. Pseudomallei und B. Thailandensis. Alle Manipulationen mit B. Mallei und B. Pseudomallei in Klasse II durchgeführt werden müssen oder biologische Sicherheitswerkbänke der Klasse III in einem Biosafety Niveau (BSL) 3 Labor. Führen Sie Manipulationen mit B. Thailandensis in ähnlichen biologischen Sicherheit Schränke befindet sich entweder in einem BSL2 oder BSL3 Labor. Folgen Sie institutionelle Betriebsanweisung für BSL3 Arbeit. Folgen Sie institutionellen Richtlinien für die Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung beim Umgang mit Bakterien.
- Bereiten Sie einen master Teller mit Burkholderia mindestens 3 Tage vor der Infektion. Verwenden von Luria-Bertani (Lennox) (LB) Agar für B. Pseudomallei oder B. Thailandensis und Einsatz-LB-Agar mit 4 % Glycerin für B. Malleiergänzt. Streak Bakterien aus einem 25 % Glycerin bestand bei-80 ° c gelagert
Hinweis: Immer Streifen Sie die master Platte direkt aus dem gefrorenen Glycerin bestand; vermeiden Sie serielle Passage der Bakterien von Platte zu Platte wie diese reduzierten Virulenz verursachen. - 10 bis 20 mL LB-Brühe mit mehrere Kolonien von B. Pseudomallei oder B. Thailandensis aus der master Platte zu impfen. In ähnlicher Weise impfen Sie LB Brühe mit 4 % Glycerin für B. Malleiergänzt.
- Schütteln Sie die Bouillonkultur bei 175 bis 250 u/min bei 37 ° C für ~ 18 h.
- Zentrifugieren Sie 2 bis 3 mL der Kultur bei 5.000 x g für 10 min.
- Den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der bakteriellen Pellets in sterilen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7.4).
- Verdünnen Sie die Bakterien mit PBS zu erreichen, eine optische Dichte (OD) von 0,5, gemessen bei einer Extinktion bei 600 nm in einem Spektrophotometer.
- Verdünnen Sie den Bakterien seriell Zehnfache in PBS aus den Start OD von 0,5. Verwenden Sie diese Suspensionen für Infektion.
- Bestimmen Sie die Kolonie Bildenden Einheiten (KBE) des Inokulums durch serielle Verdünnung und Beschichtung von 100 µL-Aliquots auf Agar-Medien. Inkubieren Sie Platten bei 37 ° C für 24 bis 48 h.
(5) Medikament Vorbereitungen
- Bestimmen Sie die entsprechende Menge an Wirkstoff pro Körper gegeben werden Masse. Die CLQ Dosierung gegeben, die zischende Kakerlake stützte sich auf die standard-Dosierung für Säugetiere, die 50 mg/kg/Tag.
- Aufschwemmen Sie oder verdünnen Sie das Medikament von Interesse im Fahrzeug. Verdünnen Sie beispielsweise CLQ in PBS in einer Konzentration von 12 mg/mL. Diese Konzentration enthält 300 µg Droge auf ~ 6 g Zischen, Schabe in einem 25 µL Volumen injiziert.
- Bei Bedarf Sterilisieren der Wirkstofflösung durch einen 0,22 µm Spritze Filter durchlaufen.
- Speichern Sie die Drogenlösung bei 4 ° C bis zur Verwendung. Wärmen Sie die Wirkstofflösung auf mindestens 21 ° C (Raumtemperatur) vor Injektionen.
6. Montage des Injektors
- Setzen Sie den Zeiger auf die gewünschte Lautstärke (25 µL) durch Drehen der Einstellschraube auf einer sich wiederholenden Pipette.
- Drücken Sie die Release-Bar der sich wiederholenden Pipette nach innen und ziehen Sie den Schieber nach außen. Die sich wiederholende Pipette ist nun bereit, eine geladene Spritze unterzubringen.
Hinweis: Kalibrieren Sie das Volumen durch sich wiederholende Pipette durch Messung der Menge an Wasser auf einem Gleichgewicht ausgeworfen ausgeworfen. - Füllen Sie eine 1 mL Spritze mit Federung, die entweder Bakterien oder Medikament.
- Spritze an eine sterile 26 oder 27 G x ½ Zoll (oder kürzer) Nadel.
- Tippen Sie auf die Spritze um die Luftblasen nach oben schweben und die Luftblasen und einige Aussetzung in einen Behälter gefüllt mit 10 % Bleichmittel zu vertreiben.
- Fangen Sie die Spritze auf die Spritze Clip der sich wiederholenden Pipette mit der Nadel schräge nach oben.
- Ziehen Sie die Release-Bar nach außen und drücken Sie Dispenser fest, leere Injektionen in einen Behälter mit 10 % Bleichmittel gefüllt, bis der Spritzenkolben gegen den Stopfer ist durchzuführen.
- Führen Sie 1 oder 2 zusätzliche leere Injektionen um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit aus der Spritze ausgeworfen wird. Die sich wiederholende Pipette ist bereit für Injektionen.
7. Kakerlake Injektionen
- Führen Sie alle Schabe Injektionen in eine Klasse II und Klasse III biologischen Sicherheitsschrank in einer BSL2 oder BSL3 Einstellung mit institutionellen persönlichen Schutzausrüstung empfohlen.
- Saubere Arbeitsflächen im Sicherheitsschrank, die in Kontakt mit den zischenden Kakerlaken kommen können. Verwenden Sie 10 % Bleichmittel gefolgt von 70 % Ethanol, passives Bleichmittel entfernen. Lassen Sie die Oberfläche an der Luft trocknen.
- Greifen Sie mit einer Hand die zischende Kakerlake an ihrer Seite. Eine zischende Kakerlake zu immobilisieren, so dass es nicht in der Lage, während der Einspritzung Rückstoß. Biegen Sie die zischende Kakerlake leicht, damit die kutanen Membranen zwischen den Bauch Terga ausgesetzt sind.
- Halten Sie mit der anderen Hand die sich wiederholende Pipette so, dass die Nadel bei 0 ° bis 30° Winkel von der Mittellinie dorsal-Ventral die zischende Kakerlake ist. Punktion der kutanen Membran neben 3rd, 4thoder 5th Tergum vom hinteren Ende.
Hinweis: Eintrag der Nadel in die zischende Kakerlake im angegebenen Winkel sorgt dafür, dass die Nadel nicht durchlaufen, und beenden Sie die zischende Kakerlake. Die Injektionsstelle wird sichergestellt, dass das ausgeworfene Material in den Bauchraum gefüllt mit Hämolymphe enthalten ist. Praxis hält die zischenden Kakerlaken und mit Wasser vor dem Unternehmen Injektionen mit lebender Bakterien oder Drogen injizieren. - Drücken Sie die Dispensierung fest, um die Lautstärke zu injizieren. Vorsichtig zurückziehen der Nadel unter dem gleichen Winkel wie verwendet für die Einreise.
- Legen Sie die injizierte zischende Schabe in einem separaten Behälter zur Unterscheidung von den zischenden Kakerlaken, die noch nicht gespritzt worden. Wischen Sie alle Hämolymphe, das aus der Injektionsstelle heraus quoll haben kann.
- Fahren Sie fort, andere Zischen Kakerlaken innerhalb einer Gruppe mit dem gleichen Spritze und Nadel injiziert. Stoppen Sie, bevor der Spritzenkolben den Boden des Fasses erreicht zu verhindern unvollständige Dosierung in der letzten Injektion einspritzen.
- Injizieren Sie für mehrere Injektionen in eine einzelne zischende Kakerlake, z. B. mit Bakterien und Droge an verschiedenen Seiten des Tergum an der dorsalen Seite der zischenden Kakerlaken. Alternativ führen Sie mehrere Injektionen durch die Injektion bei verschiedenen Terga (3rd , 5th).
- Stellen Sie sicher, dass die Deckel der Behälter sicher befestigt sind. Verstärken Sie den Deckel mit Klebeband, wenn nötig.
- Zischen Kakerlaken in einem Inkubator befeuchtete 37 ° C inkubieren.
8. Aufnahme Zischen Schabe Morbidität und Mortalität
- Führen Sie alle zischende Kakerlake Untersuchungen in einer Klasse II und Klasse III biologischen Sicherheitsschrank mit institutionellen persönlichen Schutzausrüstung empfohlen. Reinigen Sie die Oberflächen im Sicherheitsschrank mit 10 % Bleichmittel gefolgt von 70 % Ethanol. Lassen Sie den Arbeitsbereich an der Luft trocknen.
- Punkten Sie zischende Kakerlaken ein-bis zweimal täglich über einen Zeitraum von 1 bis 2 Wochen mit der Morbidität scoring-Tabelle (Tabelle 1).
- Entfernen Sie tote zischende Kakerlaken aus dem Behälter zu, und notieren Sie die Anzahl der Überlebenden.
- Übertragen Sie verbleibende Leben Kakerlaken in einem sauberen Behälter Zischen, wenn überschüssige Feuchtigkeit an der Unterseite des Behälters angesammelt hat. Alternativ verwenden Sie Einweg Papiertüchern abwischen überschüssige Feuchtigkeit.
- Verdorbenes Essen täglich und Rückflug Zischen Kakerlaken in den Inkubator befeuchtete 37 ° C zu ersetzen.
- Am Ende der Studie verbliebenen Überlebenden in ein Biohazard-Tasche und Einfrieren bei-80 ° C, einzuschläfern.
- Statistisch analysieren die Daten14 LD50 ermitteln und von Kaplan-Meier und Log-Rank Analyse für das Überleben. Wie bei allen Insekten experimentieren, können einige Todesfälle auftreten, in der Kontrollgruppe. Diese Todesfälle sind auf die natürliche Sterblichkeit von Insekten 15zurückzuführen. Für eine ausführlichere Diskussion zum Konto für Todesfälle in der Kontrollgruppe siehe Referenz15.
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Representative Results
In diesem Abschnitt veranschaulicht die Ergebnisse, die erzielt wurden, bei Madagaskar zischende Kakerlaken mit B. Mallei, B. Pseudomallei, oder B. Thailandensisinfiziert waren; die Ergebnisse zeigen, dass dieses Insekt gefügig Tiermodell für verschiedene Arten von Burkholderia im Studium der Virulenz, Medikamententoxizität und Wirksamkeit von Medikamenten gegen bakterielle Infektionen. Mehr Zischen Kakerlaken überlebt in Gruppen, die mit der abgeschwächten Mutanten (Δhcp1) als in Gruppen infiziert waren, die mit Wildtyp B. Pseudomallei K96243, elterliche B. Mallei infiziert waren SR1 oder B. Thailandensis DW503 () ( Abbildung 1). Im Gegensatz dazu getötet Infektionen mit virulenten Mutanten (Δhcp2 oder Δhcp3) die zischenden Kakerlaken ähnlich wie der Wildtyp B. Pseudomallei (Abbildung 1). Infektion mit avirulent Burkholderia Säugetierarten, B. Thailandensis E264 und deren Aminoglykosid sensible Ableitung DW503, zeigen, dass das zischende Kakerlake Modell besonders geeignet für die Aufklärung von Mutationen im B. Thailandensis , die zu einer Dämpfung (Abbildung 2). So ist es eine weitere passende Tiermodell für B. Thailandensis Studien als Nager-Modelle. Erhöhung der Konzentrationen oder mehrere Injektionen von CLQ töten nicht die zischenden Kakerlaken; Dies zeigt, dass Medikamententoxizität auch das zischende Kakerlake Modell (Abbildung 3)getestet werden kann. Darüber hinaus ist die Wirksamkeit von CLQ Infektionsschutz B. Thailandensis in Abbildung 4dargestellt. Wichtige Aspekte der Zischen Schabe Pflege und Infektion sind in Abbildung 5dargestellt. Tabelle 1 lässt sich die Morbidität der Zischen Kakerlaken während der Experimente zu erzielen.
Abbildung 1: Zischende Kakerlake Überleben nach der Injektion mit virulenten und abgeschwächte Burkholderia . Acht zischende Kakerlaken pro Gruppe wurden mit 25 µL Bakteriensuspension injiziert. Zischende Kakerlaken wurden zum Überleben einmal täglich für 5 Tage überprüft. (A) zischende Kakerlaken wurden mit elterlichen B. Mallei injiziert SR1 (Platz) oder die Δhcp1 Mutante (quadratische geschlossen) bei 100 KBE. (B) zischende Kakerlaken wurden mit Wildtyp B. Pseudomallei K96243 injiziert (Platz), Δhcp1 (quadratische geschlossen), Δhcp2 (offenes Dreieck), oder Δhcp3 (offener Kreis) Mutant auf 10 KBE. (C) zischende Kakerlaken wurden injiziert mit elterlichen B. Thailandensis DW503 (Platz) oder Δhcp1 Mutant (quadratische geschlossen) bei 100 KBE. Abbildung originally published in Referenz 11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Zischen Schabe Überleben nach Injektion von steigenden Konzentrationen von B. Thailandensis für LD50 Bestimmung. Acht zischende Kakerlaken pro Gruppe wurden mit Wildtyp B. Thailandensis E264 injiziert (A) oder die Aminoglykosid sensible Ableitung DW503 (B) und überleben erzielte er für 7 Tage. Die LD-50 ist 3 KBE für E264 und 6 KBE für DW503. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Zischen Schabe Überleben nach der Injektion mit Chloroquin. Fünf zischende Kakerlaken pro Gruppe wurden einmal injiziert (A) oder zweimal an zwei aufeinanderfolgenden Tagen (B) mit 250 (Diamant), erzielte (Quadrat), 500 oder 1.000 µg (Dreieck) CLQ oder PBS (Kreis) und das Überleben für 7 Tage. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Zischende Kakerlake Überleben nach Infektion mit B. Thailandensis und Behandlung mit Chloroquin. 10-12 zischende Kakerlaken pro Gruppe mit B. Thailandensis DW503 infiziert waren und nicht behandelt (Quadrat), mit B. Thailandensis DW503 infiziert und behandelt mit CLQ ( Dreieck), behandelt mit CLQ allein (Diamant), oder waren nicht infizierten und unbehandelt (Kreis). Überleben war für 7 Tage aufgezeichnet. Die überleben Kurve, ein Verbund aus 4 separaten Experimente ist ausgedrückt als Prozentsatz entspricht der Gesamtzahl der Überlebenden geteilt durch die Gesamtzahl der zischenden Kakerlaken für jede Behandlung an den Tagen angegeben. Die KBE-Inokulum gegeben reichte von 10 bis 20 LD50. Abbildung originally published in Referenz 10. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Bilder rund um das zischende Kakerlake Modell. (A) A weiblich Zischen Schabe fehlt Vorsprünge auf den Kopf. (B) ein männlicher zischende Kakerlake kann durch die Anwesenheit von Hörnern identifiziert werden. (C) eine zischende Kakerlake muss aus seiner Exoskelett wachsen mausern. Das aufstrebende Insekt ist in der Farbe weiß, aber allmählich verdunkelt sich wie das neue Exoskelett härtet. (D) Zischen Kakerlaken kann in einem Snap-Cap Plastikbehälter mit Belüftungsöffnungen während eines Experiments untergebracht werden. (E) unter BSL3 Bedingungen, Zischen Kakerlaken in Schraube untergebracht sind cap Kunststoffbehälter. (F) A große Maus Käfig wird verwendet, um eine zischende Kakerlake Kolonie Haus. Es sollte Nahrung, Wasser und ein Karton Eierkarton zu verstecken. (G) zischende Kakerlaken sind mit einer 1 mL Spritze mit einer sich wiederholenden Pipette verbunden injiziert. (H) A zischende Kakerlake ist durch Injektion durch die kutane Membran zwischen den Bauch Terga geimpft. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| 1 | Leben, Normal | -aktiv mobil -in der Lage zu begreifen und Finger festhalten, wenn zischende Kakerlake abgeholt wird |
| 2 | Leben, lethargisch | -unbeweglich aber kriecht wenn stieß |
| 3 | Leben, sterbenden | -immobile mit Beinen versteckt in -bewegt sich nicht bei stieß -Antennen und / oder Beine bewegen, wenn stieß |
| 4 | Toten | -immobile mit Beinen versteckt in -Antennen bei stieß nicht bewegen -Beine bewegen sich nicht, wenn stieß |
Tabelle 1: Zischen Schabe Morbidität scoring-System. Der Gesamt-Score für eine Gruppe von Zischen Kakerlaken basiert auf das zischende Kakerlake mit der höchsten Punktzahl in der Gruppe.
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Discussion
Optimale Versuchsbedingungen beginnen mit einer gesunden Zischen Schabe Kolonie, die eine minimal, aber konsequente Zeitaufwand erfordert. Obwohl Zischen Kakerlaken für einen relativ langen Zeitraum gehen kann (~ Wochen) ohne Nahrung und Wasser, wöchentlich oder zweiwöchentlich Käfig Wartung zur Verfügung gestellt werden muss. Dies schließt Überprüfung der Nahrung und Wasser-Versorgung und um sicherzustellen, dass der Käfig trocken ist. Pflege trockener Lebensbedingungen ist besonders wichtig während der Akklimatisierung und Inkubation bei höheren Temperaturen; Wir finden, dass mehr zischende Kakerlaken sterben und mit einer schnelleren Rate bei höheren Temperaturen als Container nicht täglich gereinigt wurden.
Der Schlüssel für konsistente Dosierung oder Impfung die zischende Kakerlake ist, drücken die Schaltfläche "Spender" auf die sich wiederholenden Pipette fest. Wir empfehlen üben dieser Technik, die Spritze auf die sich wiederholenden Pipette laden und leere Injektionen durchführen. Die zeitaufwändigste Schritt des Verfahrens für einen Operator neu, die Technik ist halten oder Immobilisierung der zischende Kakerlake beim Einspritzen. Daher empfehlen wir auch die Technik der holding und Injektion mehrere zischende Kakerlaken vor der Bewältigung eines ambitionierten Projekts üben. Dies kann erreicht werden, durch die Aufrechterhaltung einer kleinen Gruppe von Zischen Kakerlaken, die ausschließlich für Injektionsgepflogenheiten verwendet wird. Obwohl wir festgestellt haben, dass Injektion schnell ausgeführt werden kann, wenn Sie die zischende Kakerlake auf seiner Seiten, andere Techniken für die Holding Zischen Kakerlaken (z.B. Immobilisierung eine zischende Kakerlake auf einer gekrümmten Oberfläche, Sitzstangen, die Zischen halten Kakerlake auf dem Mittelfinger und dem Zeigefinger und dem Daumen zu immobilisieren) möglicherweise bevorzugten und von verschiedenen Betreibern untersucht werden sollten.
Der Umgang mit dem zischenden Schabe Modell bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Insektenmodelle (z. B. Wachs Wurm Larve Galleria Mellonella und der Fruchtfliege Drosophila Melanogaster), die zuvor als Tiermodelle mit verwendet wurden Burkholderia Infektion 16,17,18. Beispielsweise reicht das experimentelle Fenster für eine zischende Kakerlake von Monaten bis Jahre Flexibilität der Forscher, während das für ein Wachs-Wurm-Larve nur fünf Tage 19,20 ist. Für ein Wachs-Wurm-Larve deckt sich der Zeitraum von fünf Tagen auch mit Cocoon-Ummantelung; Entfernung des Kokons ist ein arbeitsintensiver Prozess, der körperliches Trauma zu den Larven 20verursachen können. Noch wichtiger ist, eine B. Thailandensis T6SS-1-Mutante, die in beiden abgeschwächt wird der syrischen Hamster und die zischende Kakerlake 11, war in der Galleria, die darauf hindeutet, dass die Galleria ist kein gutes Modell für die Untersuchung von virulent einige Mutanten wie z. B. T6SS in B. Thailandensis (Daten nicht gezeigt).
Die Verwendung von zischende Kakerlake präsentiert mehrere Vorteile gegenüber der Fruchtfliege. Die zischende Kakerlake ist groß und eine erhebliche Körpermasse mit einem harten Exoskelett, die es ermöglicht, sich während der Injektionen behandelt werden. Im Gegensatz dazu die Fruchtfliege ist klein und erfordert speziellen Ausrüstung für die Impfung. Während die zischende Kakerlake natürlich lebt bei Temperaturen, die ähnlich sind oder Temperatur des menschlichen Körpers zu übertreffen, ist auch die optimale Temperatur für die Fruchtfliege zwischen 22 bis 28 ° C. Dies macht die Fruchtfliege von begrenztem nutzen, im Rahmen des Studiums Prozesse, die Temperatur des menschlichen Körpers (z. B. Multi-kernhaltigen Riesen Zellbildung Burkholderia 10) abhängig sind.
Einige Nachteile der Verwendung von Zischen Kakerlaken sind vorhanden. Die Genetik die zischende Kakerlake sind nicht ebenso wie Drosophila oder sogar Galleriauntersucht. Die zischende Kakerlake hat auch eine erhebliche "Ick" oder grober Faktor. Jedoch bleibt die zischende Kakerlake eine attraktive und tragfähige Surrogat-Host für Burkholderia , indem klare Vorteile für den Einsatz in Forschung, die einzigartig für die Spezies. Wie wir, die gezeigt haben das Madagaskar Zischen, Kakerlake gefügig Surrogat Host für Burkholderiaist, kann es sehr wahrscheinlich auch als Surrogat Host für andere bakterielle Erreger dienen und wir nutzen es derzeit in solchen Studien.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
J. Chua, N.A. Fisher, D. DeShazer und Uhr Friedlander entwickelt, in das Manuskript beschriebenen Verfahren. J. Chua, N.A. Fisher, S.D. Falcinelli und D. DeShazer durchgeführt die Experimente. J. Chua schrieb das Manuskript.
Die Autoren danken Joshua J. W. Roan, Nora D. Doyle, Nicholas R. Carter und Steven A. Tobery für die hervorragende technische Unterstützung und David P. Fetterer und Steven J. Kern für die statistische Analyse.
Die Arbeit wurde durch die Verteidigung Bedrohung durch Reduzierung der Agentur Vorschlag #CBCALL12-THRB1-1-0270 A.M.F und #CBS unterstützt. MEDBIO.02.10.rd.034, D.D.
Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind diejenigen der Autoren und nicht unbedingt unterstützt werden von der US Army.
Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Department of Defense, noch erwähnt von Handelsnamen, kommerzielle Produkte oder Organisationen die Billigung der US-Regierung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Madagascar hissing cockroach |
Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC | 143668 | |
| Kibbles n Bits, any flavor | Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA | UPC #079100519378 | |
| Snap on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7F71RETCHIL | |
| Screw on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7J0000TCHIL | |
| Tridak STEPPER series repetitive pipette | Dymax Corporation www.dymax.com |
T15469 | |
| Syringe (1 mL) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 309659 | |
| Needle (26 or 27G x 1/2) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109, 305111 | |
| Chloroquine diphosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6628 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD | 10010023 | |
| Difco Luria- Bertani (Lennox) | Becton Dickinson, Sparks, MD | 240230 | |
| Agar | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G6279 |
References
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