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Developmental Biology

Zebrafish लार्वा के अनुकूलित Microinjection और इमेजिंग के लिए Microstructured उपकरण

Published: December 8, 2017 doi: 10.3791/56498
Automatic Translation
1, 1
1BioMEMS Resource Center, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital

Summary

zebrafish भ्रूण और लार्वा की Microinjection एक महत्वपूर्ण लेकिन चुनौतीपूर्ण तकनीक कई zebrafish मॉडलों में इस्तेमाल किया है । यहां, हम अतिसूक्ष्म उपकरण की एक सीमा के स्थिरीकरण और दोनों microinjection और इमेजिंग के लिए zebrafish के उंमुखीकरण में सहायता के लिए मौजूद हैं ।

Abstract

Zebrafish विभिंन मानव रोगों के एक शक्तिशाली मॉडल और प्रयोगात्मक अध्ययन की एक बढ़ती हुई सीमा के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में उभरा है, बड़े पैमाने पर आनुवंशिक और रासायनिक स्क्रीन के माध्यम से मौलिक विकास जीव विज्ञान फैले । हालांकि, कई प्रयोगों, विशेष रूप से संक्रमण और xenograft मॉडल से संबंधित उन, microinjection और भ्रूण और लार्वा, जो श्रमसाध्य तकनीक है कि कौशल और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है की इमेजिंग पर भरोसा करते हैं । परिशुद्धता और वर्तमान microinjection तकनीकों का प्रवाह में सुधार करने के लिए, हम microstructured उपकरणों की एक श्रृंखला को विकसित करने के लिए ओरिएंट और 2 दिन में zebrafish भ्रूण को स्थिर पोस्ट निषेचन (dpf) ventral में, पृष्ठीय, या पार्श्व उंमुखीकरण से पहले प्रक्रिया. भ्रूण की इमेजिंग में सहायता करने के लिए, हम भी चैनल के साथ एक सरल उपकरण है कि ओरिएंट 4 zebrafish एक गिलास कवर पर्ची के खिलाफ समानांतर में बाद में बनाया गया है । साथ में, उपकरण है कि हम यहां मौजूद photolithographic दृष्टिकोण की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करने के लिए zebrafish तकनीकों के अनुकूलन के लिए उपयोगी उपकरणों उत्पंन करते हैं ।

Introduction

Zebrafish कई क्षेत्रों के लिए एक शक्तिशाली मॉडल के रूप में उभरा है, मौलिक विकास जीव विज्ञान के अध्ययन से बड़े पैमाने पर आनुवंशिक और रासायनिक स्क्रीन1,2। इस तरह के जीन के रूप में नियमित आनुवंशिक जोड़तोड़, पछाड़ना, CRISPR/Cas9 mutagenesis, और transgenesis आनुवंशिक सामग्री के microinjection पर एकल सेल युग्मनज, जो सरल, आसान करने के लिए उपयोग के विकास के लिए नेतृत्व किया है में भरोसा, व्यावसायिक रूप से ओरिएंट और इंजेक्शन के लिए अंडे स्थिर3के लिए उपलब्ध उपकरण । प्रत्यारोपण और संक्रमण के रूप में अंय दृष्टिकोण, अक्सर बाद में मंच भ्रूण और बड़े गेज केशिका सुइयों4का उपयोग कर लार्वा में microinjection की आवश्यकता होती है । हालांकि, बड़ा गेज सुई का उपयोग महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौतियों प्रस्तुत करता है, क्योंकि यह धक्का या भ्रूण रोलिंग के बिना लक्ष्य ऊतक घुसना करने के लिए और अधिक कठिन है । इन शर्तों के तहत, उपयुक्त पानी के लिए भ्रूण को स्थिर जबकि प्रक्रिया के दौरान सुखाने से बचने के लिए आवश्यक तनाव प्राप्त करना मुश्किल है, और भ्रूण आदर्श के लक्ष्य ऊतक में इंजेक्शन के लिए उंमुख नहीं हो सकता है ।

microinjection के बाद, यह अक्सर करने के लिए उन है कि सफलतापूर्वक इंजेक्ट किया गया है, और प्रारंभिक समय बिंदु की छवियों को पकड़ने का चयन करने के लिए भ्रूण इंजेक्शन स्क्रीन करने के लिए उपयोगी है । इन चुनौतियों का समाधान करने के लिए, हम microstructured उपकरणों की एक श्रृंखला विकसित की है कि दोनों microinjection के लिए विभिंन झुकाव में 2 dpf भ्रूण को स्थिर करने में मदद5, और तेजी से छवि आधारित स्क्रीनिंग पोस्ट इंजेक्शन के लिए ।

इन उपकरणों में पर्याप्त संरचनात्मक संकल्प प्राप्त करने के लिए, हम photolithographic तकनीक का उपयोग किया । आमतौर पर microelectronic उद्योगों में इस्तेमाल किया और अधिक हाल ही में microfluidic निर्माण के लिए extrapolated, इन तरीकों ऊर्ध्वाधर 1 से लेकर संरचनाओं को प्राप्त कर सकते हैं-1000 µm, एक अच्छी तरह से zebrafish भ्रूण और लार्वा के हेरफेर के लिए अनुकूल पैमाने. सभी उपकरणों polydimethylsiloxane (PDMS) है, जो सस्ते, शारीरिक रूप से मजबूत, जैविक रूप से निष्क्रिय है, और पारदर्शी का उपयोग कर गढ़े थे ।

Microstructured सतह arrays (MSAs) एक नमूनों शीर्ष सतह के साथ PDMS के ब्लॉक के रूप में स्वरूपित किया गया, आमतौर पर अंडे microinjection के लिए इस्तेमाल किया agarose ब्लॉकों में सरल चैनलों के अनुरूप । इंजेक्शन के बाद स्क्रीनिंग के लिए, 6 इमेजिंग उपकरणों एक मानक गिलास तली हुई 6-अच्छी तरह से थाली में arrayed जा सकता है । इन उपकरणों के भ्रूण के आसान लदान के लिए डिजाइन किए हैं, जबकि अनलोडिंग प्रक्रिया को आसानी से विशिष्ट भ्रूण के बचाव की अनुमति देता है, एक अधिक उपयोगकर्ता के अनुकूल तरीके से पहले से विकसित उन उपकरणों से छवि आधारित स्क्रीनिंग दृष्टिकोण को सुविधाजनक बनाने Beebe प्रयोगशाला6.

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Protocol

Microinjection के तहत मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल उपसमिति द्वारा अनुसंधान पशु देखभाल पर प्रोटोकॉल 2011N000127 के तहत लार्वा की मंजूरी दी गई थी ।

1. डिवाइस निर्माण

नोट: सभी कंप्यूटर असिस्टेड ड्राइंग (सीएडी) फ़ाइलें photolithography मास्क डिजाइन करने के लिए इस्तेमाल किया यहां वर्णित (चित्र 1) डाउनलोड के लिए उपलब्ध हैं । लिंक के लिए सामग्री की तालिका देखें ।

  1. एक वर्ग १,००० स्वच्छ कमरे में मास्टर मोल्ड वेफर बनाना मानक photolithographic तकनीक7का उपयोग कर । microstructure arrays और चैनल के लिए, पैटर्न epoxy आधारित नकारात्मक photoresist 3 परतों में क्रमिक रूप से 3 अलग मास्क का उपयोग कर, निर्माता के निर्देश के अनुसार: उथले सुविधाओं के लिए १०० µm, मध्यम सुविधाओं के लिए २०० µm, और ४०० µm के लिए गहरी सुविधाओं । इमेजिंग डिवाइस के लिए, पैटर्न दो उथले सुविधाओं के लिए ४०० µm और गहरी सुविधाओं के लिए ६०० µm का उपयोग परतें ।
  2. ढलाई के लिए एक 15 सेमी पेट्री डिश के आधार करने के लिए पूरा वेफर टेप (चित्रा 2) ।

2. Microstructured सतह arrays की तैयारी-PDMS

  1. प्रयोग करने योग्य उपकरणों, कास्ट polydimethylsiloxane (PDMS), एक सांचे में ढालना के रूप में गुरु वेफर का उपयोग कर । PDMS मोनोमर के 5 जी के साथ ५० जी का मिश्रण और एक प्लास्टिक कांटा के साथ एक प्लास्टिक वजनी पकवान में अच्छी तरह से मिलाएं ।
  2. मिश्रण ध्यान से मोल्ड पर डालो ।
  3. 1 ज के लिए 16-25 inHg (54-85 केपीए) पर एक वैक्यूम desiccator में Degas ।
  4. PDMS का इलाज करने के लिए, ६५ ° c पर सेंकना कम 3 ज के लिए । PDMS एक फर्म लेकिन लचीला ठोस करने के लिए इलाज करना चाहिए ।
  5. ध्यान से गुरु वेफर पर डिवाइस के आसपास कटौती एक स्केलपेल का उपयोग कर, स्केलपेल और वेफर सतह के टिप के बीच संपर्क बनाए रखने के लिए सुनिश्चित कर रही है । संदंश का प्रयोग, PDMS प्रतिकृति दूर वेफर और एक साफ 10 सेमी पेट्री डिश को हस्तांतरण से, सुविधा की ओर (चित्रा 3) ।
  6. hydrophobicity को कम करने के लिए ३५ s के लिए एक प्लाज्मा ओवन का उपयोग ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ डिवाइस समझो ।
  7. एथिल 3-aminobenoate methanesulfonate (MS-२२२, pH ७.५) के १६८ मिलीग्राम/L युक्त zebrafish भ्रूण माध्यम (E3) के साथ कवर करें । एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कर डिवाइस की सतह पर पानी बहने से गहरी सुविधाओं से किसी भी बुलबुले निकालें.

3. Microstructured सतह arrays की तैयारी-Agarose

  1. एक नकारात्मक PDMS मोल्ड बनाने के लिए, पहले ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ एक PDMS डिवाइस का इलाज ।
  2. एक निष्क्रिय सतह8बनाने के लिए 1 एच, 1एच, 2एच, 2एच-Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) silane वाष्प के साथ PDMS डिवाइस समझो । थोडक्यात:
    1. PDMS प्लेस के लिए सुविधा का इलाज किया ओर एक वैक्यूम कक्ष में एक धुएं हुड के भीतर ।
    2. PDMS के बगल में, एक छोटे से खुले गिलास या एल्यूमीनियम पकवान जगह है, और ध्यान से पकवान में PFDTS (९८% silane) के पिपेट २०० µ एल ।
      चेतावनी: PFDTS silane अत्यधिक अस्थिर है, पानी के साथ हिंसक प्रतिक्रिया, ज्वलनशील है, और गंभीर त्वचा और संपर्क पर आंख क्षति का कारण बनता है । उपयोग करने से पहले विस्तार में MSDS पढ़ें ।
    3. वैक्यूम चैंबर बंद करें और 15-30 मिनट, या PFDTS silane पूरी तरह से काफूर हो गया है जब तक के लिए निर्वात लागू होते हैं ।
  3. एक पेट्री डिश में डिवाइस प्लेस और ताजा PDMS के लिए एक सांचे में ढालना के रूप में इस्तेमाल करते हैं, 2.1-2.3 चरण में वर्णित तैयार ।
  4. ६५ डिग्री सेल्सियस से कम 3 घंटे के लिए सेंकना, तो इलाज डिवाइस और एक ताजा पेट्री डिश में जगह से ताजा PDMS की पूरी परत छील । यह तो कास्ट agarose के लिए एक नकारात्मक मोल्ड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  5. agarose तैयार करने के लिए, agarose पूरी तरह से भंग है जब तक एक माइक्रोवेव में E3 में कम तालमेल तापमान agarose का एक 2% समाधान फोड़ा.
  6. PDMS नकारात्मक मोल्ड पर गर्म agarose डालो और एक स्थानांतरण पिपेट के साथ सुविधाओं पर गर्म agarose बह द्वारा डिवाइस को कवर agarose में किसी भी बुलबुले को हटा दें ।
  7. एक बार बुलबुले निकाल दिए जाते हैं, agarose सेट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सर्द ।
  8. नकारात्मक PDMS मोल्ड से हाथ से नीचे से PDMS विकृत द्वारा agarose ब्लॉक निकालें, एक नया पेट्री डिश के लिए agarose ब्लॉक हस्तांतरण, और एमएस-२२२ युक्त E3 के साथ गीला ।

4. PDMS इमेजिंग उपकरणों की तैयारी

  1. प्रयोग करने योग्य उपकरणों, कास्ट PDMS, एक सांचे में ढालना के रूप में गुरु वेफर का उपयोग कर । PDMS मोनोमर के 5 जी के साथ ५० जी का मिश्रण (२.१ चरण में इस्तेमाल के रूप में ही) और एक प्लास्टिक कांटा के साथ एक प्लास्टिक वजन पकवान में अच्छी तरह से मिश्रण ।
  2. मिश्रण ध्यान से मोल्ड पर डालो ।
  3. 1 ज के लिए 16-25 inHg (54-85 केपीए) पर एक वैक्यूम desiccator में Degas ।
  4. PDMS का इलाज करने के लिए, ६५ ° c पर सेंकना कम 3 ज के लिए । PDMS एक फर्म लेकिन लचीला ठोस करने के लिए इलाज करना चाहिए ।
  5. मास्टर वेफर से उपकरणों में कटौती और एक १.५ mm पंच का उपयोग कर बंदरगाहों बाहर पंच ।
  6. उपकरणों और एक 6-अच्छी तरह से ग्लास नीचे ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ अच्छी तरह से प्लेट ३५ एस के लिए, जैसा कि चरण २.६ में वर्णित समझो ।
  7. बांड एक डिवाइस सुविधा-पक्ष-नीचे 6 के प्रत्येक गिलास coverslip के लिए-अच्छी तरह से थाली यह एक ८५ डिग्री सेल्सियस पर रखकर 10 मिनट के लिए चूल्हा ।
    नोट: सफल संबंध की पुष्टि करने के लिए, संदंश का उपयोग कर बंधुआ डिवाइस के एक तरफ करने के लिए फर्म दबाव लागू होते हैं । यह डिवाइस ग् coverslip से जुड़ी रहनी चाहिए ।

5. Zebrafish कल्चर

  1. संस्कृति zebrafish 2 dpf को भ्रूण मानक तकनीक का उपयोग कर3।
  2. Dechorionate संदंश का उपयोग कर भ्रूण या 1 मिलीग्राम/एमएल चिढ़ाने के मिश्रण (सामग्री तालिका देखें)3 पर डिवाइस लोड करने से पहले कम से 30-60 मिनट, उंहें सीधा करने के लिए अनुमति दें ।
  3. Anaesthetize भ्रूण का उपयोग (१६८ mg/L) एमएस-२२२ (पीएच ७.५) उनके पेट्री डिश में E3 के लिए 25X स्टॉक समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़कर ।

6. Microstructured सतह पर Zebrafish का उंमुखीकरण-Divot arrays

  1. २.७ कदम से PDMS ब्लॉक तैयार (चित्रा 3) अपनी पेट्री डिश में ऐसी है कि यह एक पतली (1-2 mm) E3 की परत है, जो भ्रूण के आसान हेरफेर की अनुमति देता है द्वारा कवर किया जाता है ।
  2. स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कर PDMS ब्लॉक की सतह पर भ्रूण के अपेक्षित संख्या (आम तौर पर शर्त प्रति 10-20) हस्तांतरण ।
  3. एक micromanipulation उपकरण (बाल पाश या इसी तरह) का उपयोग करना, microstructured divots (चित्रा 3) में भ्रूण धक्का । divots का उपयोग विशेष रूप से पृष्ठीय और ventral झुकाव के लिए अनुकूल है ।
    नोट: एक चुस्त फिट (पृष्ठीय और ventral) के साथ divots के लिए, divot के समानांतर में ब्लॉक की सतह पर भ्रूण स्थिति की कोशिश करो, और फिर उंहें स्थिति में एक बाल पाश का उपयोग कर रोलिंग । उंहें divot में गहरा धक्का उंहें स्थिर रखने में मदद मिलेगी ।

7. Microstructured सतह पर Zebrafish का उन्मुखीकरण-Microstructured चैनल

  1. microstructured चैनलों के साथ नमूनों PDMS ब्लॉक से e3 ड्रा (चित्र बी) ब्लॉक के किनारे से नीचे E3 के स्तर तक एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर, लेकिन अभी भी जलाशय और चैनलों में और PDMS पर एक पतली परत में मौजूद है.
  2. स्थानांतरण पिपेट एक स्थानांतरण का उपयोग कर जलाशय में ५.३ कदम से 10 भ्रूण, किनारों को ओवरफ्लो नहीं सावधान किया जा रहा है ।
  3. एक बाल पाश का उपयोग करना, उपयुक्त चैनल के द्वार पर कीप में प्रत्येक भ्रूण हेरफेर और ओरिएंट ऐसी है कि भ्रूण के सिर चैनल की ओर है और भ्रूण उचित अभिविंयास के रूप में यह चैनल में प्रवेश करती है ।
  4. एक बाल पाश का उपयोग कर चैनल नीचे प्रत्येक भ्रूण स्लाइड जब तक यह चैनल दीवारों में ओरिएंट microfeatures कि यह जगह में रखने के लिए मदद पहुंचता है । microstructured चैनलों का उपयोग विशेष रूप से पार्श्व अभिविन्यास के लिए सिफारिश की है.
    नोट: microinjection के दौरान फिसलने भ्रूण को कम करने के लिए, जलाशय से E3 ड्राइंग द्वारा सतह तनाव की राशि का समायोजन करने की कोशिश ।

8. Microinjection का Zebrafish

  1. तैयार microinjection सुई ।
    1. पहले4वर्णित के रूप में एक micropipette खींचने का उपयोग कर borosilicate ग्लास microcapillary सुई बनाओ । परिणामस्वरूप सुई एक छोर पर एक बिंदु के लिए पतला होना चाहिए, लगभग 10 मिमी की एक शंकु लंबाई के साथ.
    2. इंजेक्ट किया जा करने के लिए समाधान तैयार करें, इस मामले में १०० एनएम chemoattractant (एन-Formylmethionine-leucyl-फेनिलएलनिन (fMLP) या Leukotriene B4 (LTB4)) और १०० एनएम के ७० केडीए Rhodamine dextran अनुरेखक में पंजाब.
    3. एक पतले पतला पिपेट टिप का उपयोग कर सुई में समाधान के 5 µ l लोड (सामग्री तालिका देखें).
    4. एक micromanipulator में सुई माउंट एक चुंबकीय स्टैंड पर घुड़सवार और एक picopump microinjector से जुड़े ।
  2. संदंश के साथ पतला टिप चुटकी द्वारा एक ४५ ° कोण पर सुई की नोक तोड़ ।
  3. इंजेक्शन बोल्स आकार को 1 nL पर picopump कंट्रोलर पर इंजेक्शन के समय एडजस्ट करके एडजस्ट करें ।
  4. microinjection सुई के कोण समायोजित करें । micromanipulation नियंत्रक पर ४५ ° की एक सुई कोण आम तौर पर एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है, सुई भ्रूण की लंबाई के समानांतर के साथ. एक खड़ी कोण microinjection के दौरान भ्रूण के पार्श्व आंदोलन को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  5. बाएं हाथ और सही के साथ सुई micromanipulator के साथ पेट्री डिश को नियंत्रित करने, सुई microinjection का इरादा साइट के लिए संभव के रूप में बंद के रूप में लाने के लिए, इस मामले में भड़काऊ पुटिका.
    नोट: भड़काऊ पुटिका दो छोटे अलग अंधेरे आयताकार संरचनाओं (otoliths) युक्त आंख के पीछे आयताकार अंग के रूप में पहचाना जा सकता है ।
  6. micromanipulation नियंत्रक का उपयोग करना, लक्ष्य ऊतक घुसना (इस मामले में भड़काऊ पुटिका) कि सुई की नोक पुटिका के भीतर है, और picopump पैर स्विच का उपयोग कर पूर्व निर्धारित मात्रा इंजेक्षन.
    नोट: यदि ऊतक पैठ का विरोध करता है, धीरे micromanipulation नियंत्रक घुंडी दोहन की कोशिश करो ।
  7. को भ्रूण जारी करने के लिए, ऊपर से नीचे की सतह पर प्रवाह e3 एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर, या पकवान ऐसी है कि भ्रूण आसपास के E3 में जारी कर रहे है घूमता द्वारा ।
  8. एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कर MS-२२२ के बिना E3 के एक वसूली डिश के लिए भ्रूण स्थानांतरण ।

9. PDMS इमेजिंग डिवाइस का उपयोग कर भ्रूण की स्क्रीनिंग

  1. प्रधानमंत्री द्वारा कदम से युक्ति ४.७ E3 (+ एमएस-२२२) बंदरगाह के माध्यम से बह । यह या तो एक १,००० µ l पिपेट या एक संकीर्ण-टिप हस्तांतरण पिपेट का उपयोग किया जा सकता है ।
  2. E3 + MS-२२२ के साथ अच्छी तरह से भरें जब तक डिवाइस कवर किया जाता है ।
  3. उद्धार 4 एक अच्छी तरह से एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करने में ८.७ कदम से इंजेक्शन भ्रूण । भ्रूण हो सकता है पूर्व anesthetized यदि E3 + MS-२२२ में मशीनिंग द्वारा वांछित 1-2 मिनट (चरण ५.३) लोड करने से पहले के लिए ।
  4. एक micromanipulation उपकरण (बाल पाश या समान) का उपयोग करना, ओरिएंट वांछित अभिविंयास में इमेजिंग चैनलों के प्रवेश द्वार पर भ्रूण (पूंछ पहले या सिर-पहले, डिवाइस का इस्तेमाल किया पर निर्भर करता है), और उन्हें आंशिक रूप से डिवाइस में पुश (चित्र 4a). यह मदद मिलेगी उन्हें समान रूप से डिवाइस में आकर्षित ।
  5. या तो एक १,००० µ l पिपेट या स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कर बंदरगाह से डिवाइस के माध्यम से E3 ड्रा जब तक भ्रूण इमेजिंग के लिए सही अभिविन्यास में चैनलों में तैयार कर रहे हैं (चित्रा 4B).
    नोट: ट्रैपिंग बिंदु पिछले भ्रूण को चूसना नहीं सावधान, इस भ्रूण को नुकसान और उनके उंमुखीकरण बदल जाएगा ।
  6. इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप के लिए अच्छी तरह से प्लेट हस्तांतरण (चित्र 4c) ।
  7. छवि एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ।
    1. उचित लेंस का चयन करके आवर्धन समायोजित करें । 10x आमतौर पर इमेजिंग zebrafish न्युट्रोफिल प्रवास के लिए एक उपयोगी इज़ाफ़ा है ।
    2. प्रत्येक संकेत स्पष्ट है, लेकिन संतृप्त नहीं है ताकि प्रत्येक चैनल के लिए प्रकाश स्रोत तीव्रता और जोखिम समय समायोजित करें ।
    3. प्रत्येक चैनल के लिए छवियों पर कब्जा । यहां, हम ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन का इस्तेमाल किया (GFP, उदा: 470/22, em: 525/50), टेक्सास लाल (TxRed, उदा: 585/29, Em: 628/32) और संचारित चैनल । मल्टीचैनल छवियां पोस्ट-प्रोसेसिंग (फिगर 4B-I) के दौरान संयोजित की जा सकती हैं ।

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Representative Results

यहां वर्णित दृष्टिकोण डिजाइन (चित्रा 1) और 2 dpf zebrafish के साथ उपयोग के लिए उपकरणों के निर्माण को दर्शाता है, photolithographic (चित्रा 2) और नरम-lithographic (चित्रा 3) तकनीक का उपयोग कर । इस विधि कई डिजाइन पुनरावृत्तियों और संशोधनों के तेजी से परीक्षण की अनुमति देता है, और परिवर्तन और विकास के अंय चरणों में zebrafish के साथ प्रयोग के लिए microstructure आयामों का अनुकूलन उनके आवेदन का विस्तार कर सकते हैं ।

हम चुनौतीपूर्ण microinjection तकनीक और सुविधाजनक इमेजिंग के लिए इन उपकरणों का उपयोग प्रदर्शित करता है । भड़काऊ पुटिका (चित्रा 4d, सफेद धराशाई रूपरेखा) zebrafish9में न्युट्रोफिल भर्ती के परीक्षण के लिए एक उपयोगी, प्रतिरक्षा-विशेषाधिकार प्राप्त और पृथक साइट प्रदान करता है । zebrafish न्यूट्रोफिल की क्षमता का परीक्षण करने के लिए मानक chemoattractants, fMLP और LTB4 के १०० एनएम का जवाब 2 microinjected भड़काऊ भ्रूण के dpf बुलबुले में zebrafish थे (चित्रा 4F, जे), microstructured चैनल डिवाइस का उपयोग ( चित्रा 1G) पार्श्व अभिविन्यास में भ्रूण को स्थिर करने के लिए. इंजेक्शन उच्च आणविक वजन Rhodamine dextran के साथ पता लगाया गया था, और टीजी (mpx: EGFP) भ्रूण न्युट्रोफिल भर्ती के दृश्य को सुविधाजनक बनाने में प्रदर्शन किया । इंजेक्शन भ्रूण (चित्रा 4d, एच) और Rhodamine अकेले के साथ इंजेक्शन भ्रूण (चित्रा 4E, मैं) नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । निंनलिखित microinjection, भ्रूण इमेजिंग चैनल डिवाइस (चित्र 1a, ख) में स्थानांतरित किया गया और 30 मिनट में एक EVOS फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (चित्रा 4c) का उपयोग कर imaged (चित्रा 4d-जी और चित्रा 4H-K, क्रमशः). आशा के रूप में, फ्लोरोसेंट न्यूट्रोफिल की एक छोटी संख्या जल्दी timepoint (चित्रा 4i) पर नकली इंजेक्शन भड़काऊ पुटिका के लिए भर्ती किया गया, की संभावना क्षति मध्यस्थता भर्ती के कारण. दिलचस्प है, Rhodamine dextran अनुरेखक प्रयोग के दौरान otoliths में जमा करने के लिए मनाया गया था. दोनों chemoattractants (चित्रा 4F, जे) के लिए, न्यूट्रोफिल उच्च संख्या में भर्ती किए गए, विशेष रूप से LTB4 (चित्रा 4F) के जवाब में ।

यहां दिखाए गए प्रतिनिधि परिणाम zebrafish के microinjection और इमेजिंग के लिए इस विधि के सफल प्रयोग को प्रदर्शित करते हैं । zebrafish न्युट्रोफिल भर्ती परख के संदर्भ में, विस्तृत लाइव इमेजिंग तकनीकों और परिष्कृत सेल माइग्रेशन विश्लेषण10 के साथ संयोजन में इन उपकरणों के अनुप्रयोग इस क्षेत्र में भविष्य के प्रयोगों के लिए एक उपयोगी मंच प्रदान कर सकते हैं ।

Figure 1
चित्र 1: photolithography मास्क के कंप्यूटर असिस्टेड आरेखण (CAD) डिज़ाइन. (A-C) पार्श्व में स्थिति के लिए microstructured सतह divots के लिए सीएडी डिजाइन (एक), ventral (ख), और पृष्ठीय (ग) झुकाव । अलग रंग की लाइनें हरी १०० µm, नीले २०० µm, और लाल ४०० µm सुविधा ऊंचाइयों के साथ, विभिन्न सुविधाओं के लिए सीएडी मुखौटा डिजाइन का प्रतिनिधित्व करते हैं । स्केल पट्टी = ५०० µm. (d-F) पार्श्व में स्थिति के लिए microstructured चैनलों के लिए सीएडी डिजाइन (डी), ventral (ई), और पृष्ठीय (F) झुकाव । विभिन्न रंगीन लाइनें हरे १०० µm, नीले २०० µm, और लाल ४०० µm सुविधा ऊंचाइयों के साथ, विभिन्न सुविधाओं के लिए मुखौटा डिजाइन का प्रतिनिधित्व करते हैं । स्केल बार: ५०० µm. (g-I) हेड-फर्स्ट (g) या पुच्छ-प्रथम (H और I) लोड करने के लिए डिज़ाइन किए गए इमेजिंग डिवाइसेस के लिए CAD डिज़ाइन । ब्लू लाइनों ४०० µm सुविधाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि लाल लाइनों ६०० µm सुविधाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । तीर उस दिशा को दिखाते हैं जिसमें लार्वा लोड किए जाते हैं । स्केल बार = २०० µm । यह आंकड़ा Ellett एट अल से संशोधित किया गया है । 5 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सिलिकॉन मास्टर वेफर. (एक) मास्टर वेफर के शीर्ष अनुभाग divots में व्यक्तिगत लार्वा ओरिएंट के लिए सुविधाओं से पता चलता है । (ख) मास्टर वेफर्स के नीचे अनुभाग microstructured चैनलों के लिए डिजाइन दिखा । यह आंकड़ा Ellett एट अल से संशोधित किया गया है । 5 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: Microstructured PDMS डिवाइस. (A) PDMS मास्टर वेफर से व्यक्ति लार्वा ओरिएंट के लिए divots दिखा ब्लॉक डाली । (B) microstructured चैनलों को दिखाने वाले मास्टर वेफर से PDMS ब्लॉक कास्ट । यह आंकड़ा Ellett एट अल से संशोधित किया गया है । 5 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि परिणाम: zebrafish न्यूट्रोफिल की इमेजिंग भर्ती भड़काऊ पुटिका में chemoattractants के microinjection प्रसव के बाद । (A-B) लोडिंग और इमेजिंग के लिए बढ़ते भ्रूण । (क) सिर-पहले डिवाइस के साथ लोड करने के लिए तैयार भ्रूण, बंदरगाह के साथ संकेत (काला तीर) । (ख) लोडेड भ्रूण के बाद वे स्थिति (पीला तीर) में तैयार किया गया है । (ग) 6-अच्छी तरह से माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग उपकरणों के साथ कांच के नीचे प्लेट । इस प्रारूप 4 बाद में अच्छी तरह से (24 भ्रूण कुल) प्रति उंमुख भ्रूण के इमेजिंग की अनुमति देता है, एक मानक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर । (डी-जी) न्यूट्रोफिल (EGFP-green) में एक इंजेक्शन (D) भ्रूण और निम् भड़काऊ पुटिका microinjection का Rhodamine dextran (red, ओपन वाइट ऐरोहेड) अलोन (ई), १०० एनएम LTB4 (एफ), और १०० एनएम fMLP (जी) 30 मिन पोस्ट इंजेक्शन (mpi) । (ज-K) न्यूट्रोफिल (EGFP-green) में एक इंजेक्शन (H) भ्रूण और 5 ज म् भड़काऊ पुटिका microinjection of Rhodamine dextran (red, ओपन वाइट ऐरोहेड) अलोन (I), १०० एनएम LTB4 (J), और १०० एनएम fMLP (K) 5 एच पोस्ट इंजेक्शन ( hpi) । स्केल बार = २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ, हम हम हाल ही में 2 dpf zebrafish microinjection की सुविधा के लिए विकसित उपकरणों के उपयोग का वर्णन5, और भ्रूण के सुविधाजनक इमेजिंग के लिए एक सरल agarose मुक्त बढ़ते उपकरण परिचय । इन उपकरणों zebrafish तकनीकों के लिए उपयोगी उपकरणों के निर्माण के लिए photolithographic तकनीकों की उपयोगिता पर प्रकाश डाला ।

हम microinjection सुई, जैसे कवक conidia या मानव कैंसर कोशिकाओं, जो प्रसव के लिए एक बड़ा बोर सुई के उपयोग की आवश्यकता के भीतर एकत्रीकरण की संभावना कोशिकाओं या कणों के इंजेक्शन के लिए विशेष रूप से उपयोगी एमएसए उपकरणों पाया है । भड़काऊ पुटिका में इंजेक्शन (चित्रा 4) एक विशेष चुनौती प्रस्तुत करता है, के रूप में भ्रूण अक्सर सुई के साथ संपर्क पर रोल । हम पाते है कि microstructured चैनल का उपयोग करें कि ओरिएंट और स्थिर एक पार्श्व अभिविंयास में zebrafish बहुत दोनों का प्रवाह और हमारे हाथ में इस तकनीक की सटीकता में सुधार ।

न्युट्रोफिल भर्ती या xenograft मेटास्टेसिस के आकलन के रूप में विभिन्न समय बिंदुओं पर बाद में उन्मुख zebrafish की तेजी से इमेजिंग के लिए, agarose भ्रूण के बीच बढ़ते स्थिरता और नुकसान की संभावना कम के बीच बढ़ती पोस्ट-इमेजिंग बचाव । इन उपकरणों को भी विस्तारित समय चूक इमेजिंग के लिए वादा दिखाने के लिए, और सफलतापूर्वक 12 ज पर ंयूनतम मछली आंदोलन के साथ मल्टीचैनल, multiplane छवियों पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । क्योंकि वे agarose से विवश नहीं हैं, इस अवधि के दौरान लार्वा के सक्रिय बढ़ाव (~ ३०० µm से 54-78 hpf)11 अप्रतिबंधित है और सामान्य रूप से आगे बढ़ सकते हैं ।

तैयारी और इन उपकरणों के उपयोग में सबसे महत्वपूर्ण कदम सबसे PDMS आधारित microfluidic उपकरणों के उपयोग के लिए आम हैं: उपकरणों पूरी तरह से गीला किया जाना चाहिए और बुलबुले से परहेज । इस तरह के मुद्दों से बचने के लिए, के बाद वे गढ़े हैं, जबकि सतह hydrophilicity ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार द्वारा संमानित अभी भी मौजूद है E3 में गीले उपकरणों । ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ पुनः उपचार भी क्षणिक वृद्ध PDMS उपकरणों के लिए hydrophilicity बहाल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

सटीक geometries यहां इस्तेमाल photolithographic तकनीकों के उच्च संकल्प का लाभ ले लो, लेकिन मौजूदा डिजाइन सीमा दूसरे दिन के बाद निषेचन के दौरान zebrafish का उपयोग करें । वर्तमान मंच पर आधारित geometries के पुनः डिजाइन microinjection के लिए 1 dpf और 3 dpf के सफल अभिविन्यास की अनुमति होगी । अधिक बोया के उंमुखीकरण के साथ 4 dpf लार्वा फुलाया तैरना मूत्राशय की संभावना अधिक चुनौतीपूर्ण होगा, और उच्च जल तनाव के साथ संयोजन में सुखद geometries की आवश्यकता होती है । प्रवाह या निर्वात एकीकृत जटिल उपकरणों के विकास के चरणों की एक व्यापक रेंज के लिए लागू एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान हो सकता है, लेकिन यह भी पंप और टयूबिंग के उपयोग की आवश्यकता होती है, लागत और डिवाइस विफलता के जोखिम में वृद्धि.

PDMS एक लागत प्रभावी, यहां वर्णित उन लोगों की तरह उपकरणों के निर्माण के लिए उपयोगी सामग्री है, और असंगति, पारदर्शिता, और प्रयोज्य प्रदान करते हैं । zebrafish के लिए PDMS उपकरणों का उपयोग करने का एक दोष hydrophobicity है, जो उपकरण चुनौतीपूर्ण की सतह पर E3 के उथले परतों का रखरखाव कर सकते हैं । इस समस्या को agarose में microinjection उपकरणों कास्टिंग से बचा जा सकता है, हालांकि इस प्रयोज्य सीमा और उपकरणों की कमजोरी बढ़ जाती है । एक पसंदीदा विकल्प एक सुसंगत सतह के उपचार है कि PDMS के hydrophilicity बढ़ जाती है की पहचान की जाएगी12, या एक उपयुक्त प्लास्टिक सब्सट्रेट का उपयोग करें ।

2 dpf पर zebrafish के microinjection के लिए वर्तमान तरीके या तो पानी तनाव4 या सरल agarose में डाली चैनल का उपयोग करने के लिए वाणिज्यिक molds का उपयोग करने और लार्वा की स्थिति । इन तरीकों अभिविंयास के सीमित नियंत्रण प्रदान करते है और भ्रूण के तेजी से सुखाने से जटिल हो सकता है । divots और चैनलों में एकीकृत microstructures यहां इस्तेमाल किया ओरिएंट और पानी के तनाव पर पूरी तरह निर्भर बिना लार्वा स्थिर करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं, इस प्रकार सुखाने के जोखिम को कम करने । Divots 3 डी मुद्रित molds का उपयोग किया पहले इमेजिंग प्रयोजनों के लिए भ्रूण के उंमुखीकरण के लिए इस्तेमाल किया गया है13, हालांकि इन Divots की गहराई उंहें microinjection के लिए दुर्गम बना दिया ।

zebrafish इमेजिंग के लिए microfluidic प्रणालियों का उपयोग तेजी से आम14होता जा रहा है ।
एकाधिक प्रवाह के माध्यम से प्रणालियों के लिए मांग पर यौगिकों शुरू करने की क्षमता के साथ समय के साथ zebrafish विकास के अवलोकन की अनुमति विकसित किया गया है15,16,17। अधिक जटिल उपकरणों सरणी भ्रूण के लिए डिजाइन किया गया है, जबकि अभी भी उनके घर का काम है, जो एक सरल गोलाकार ज्यामिति कि आसानी से इन प्रणालियों में अपेक्षाकृत उच्च प्रवाह के साथ हेरफेर किया जा सकता है प्रदान करता है के भीतर18,19। कई समूहों सरणी और इमेजिंग लार्वा चरण zebrafish विभिंन झुकाव में6,20के लिए प्लेटफार्मों विकसित किया है, सबसे अधिक उपयोगकर्ता के अनुकूल निष्क्रिय micropump संचालित "ज़ेबरा" Beebe लैब 6 द्वारा विकसित प्रणाली जा रहा है . ज़ेबरा प्रणाली के विपरीत, उपकरण है कि हम यहाँ का वर्णन चूषण का उपयोग करता है, एक मानक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर उत्पन्न, चैनलों में लार्वा आकर्षित करने के लिए, जबकि समानांतर बजाय लार्वा के अनुक्रमिक लोडिंग के द्वारा व्यक्तिगत लार्वा के बचाव की अनुमति देता है पोस्ट-इमेजिंग द्वारा एक ही बंदरगाह के माध्यम से सकारात्मक प्रवाह लागू । इसके अलावा, हमारे दृष्टिकोण एक छोटे पदचिह्न की आवश्यकता है, तो PDMS उपकरणों पारंपरिक कांच के लिए बंधुआ जा सकता है-नीचे 6-अच्छी तरह से इमेजिंग के लिए प्लेटें ।

वर्तमान प्रयोगात्मक डिजाइन microinjection और इमेजिंग के लिए अलग उपकरणों का इस्तेमाल मुख्य रूप से इतना है कि वे पारंपरिक microinjection उपकरण और मानक औंधा सूक्ष्मदर्शी के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । zebrafish अंडे के स्वचालित microinjection के लिए Microfluidic दृष्टिकोण पहले से ही21मौजूद है, और "मछली जाल" के साथ संयोजन में अत्यधिक सटीक सरणी और लार्वा20के उन्मुखीकरण के लिए प्रकार के तरीकों, यह निकट है कि उपकरणों को एकीकृत स्वचालित लार्वा इंजेक्शन और इमेजिंग भी एक दिन एक वास्तविकता बन सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

लेखकों को उदारता से मछलीघर अंतरिक्ष प्रदान करने के लिए डेविड Langenau शुक्रिया अदा करना चाहूंगा; एरिक स्टोन, जॉन सी मूर और zebrafish रखरखाव और रिएजेंट के साथ मदद के लिए किन तांग, और ऐनी Robertson और इलियट Hagedorn लियोनार्ड है Zon लैब से zebrafish यहां इस्तेमाल किया तनाव की खरीद के लिए । वे भी photolithographic तकनीकों पर सलाह के लिए ओक्टेवियो Hurtado शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । FE बच्चों और अमेरिकी ऑस्ट्रेलियाई एसोसिएशन के लिए है Shriner अस्पताल से फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया । यह काम NIH ग्रांट GM92804 द्वारा वित्त पोषित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhsives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator
Low gelling temperature agarose Sigma Aldrich A9414-10G For casting agarose devices
PFDTS silane Sigma Aldrich 448931-10G For casting of negative PDMS molds
Tricaine (MS-222) Sigma Aldrich E10521-10G To anesthetize zebrafish
Rhodamine Dextran 70,000 Da ThermoFisher D1818 To trace microinjections
Leukotriene B4 (LTB4) Cayman Chemicals 20110 Neutrophil chemoattractant
N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) Sigma Aldrich F3506-50MG Neutrophil chemoattractant
15 cm Petri dish Fisher scientific 08-757-148 For Casting from the master wafer
Glass-bottom 6-well plates MatTek P06G-0-20-F For imaging devices
Borosilicate glass microcapillaries World Scientific Instruments TW-100-4 For microinjection needles
Transfer pipettes Sigma Aldrich Z350796 For transferring zebrafish embryos
Microloader tips Fisher scientific E5242956003 For loading the microinjection needles
Harris Uni-Core 1.5 mm punch Ted Pella Inc. 15111-15 To punch ports in PDMS imaging devices
No. 11 Scalpel Fine Science Tools 10011-00 For cutting PDMS
Dumont No. 5 Forceps Fine Science Tools 11252-10 For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips
Marzhauser Micromanipulator ASI MM33-R For manipulating microinjection needle
Magnetic stand MSC SPI - 87242624 For mounting micromanipulator
MPPI-3 Picopump controller ASI MPPI-3 To control microinjection volume and timing
EVOS inverted fluorescent microscope ThermoFisher EVOS FL To image injected embryos
Dissecting microscope Nikon SMZ745 For visualizing microinjecion
AutoCAD software Autodesk Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki  

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References

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विकास जीव विज्ञान अंक १३० Zebrafish microinjection इमेजिंग microfluidics संक्रमण xenograft
Zebrafish लार्वा के अनुकूलित Microinjection और इमेजिंग के लिए Microstructured उपकरण
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Ellett, F., Irimia, D. Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (130), e56498, doi:10.3791/56498 (2017).

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