Summary
Este protocolo paso a paso analiza el comportamiento de geotaxis negativa de Drosophila mediante un sistema automatizado de varios cilindro que aloja cientos de moscas y sincroniza su acción por un motor eléctrico. Sobre sincronización, es analizar comportamiento mosca geotaxis negativa, grabados digitalmente y analizados usando el software RflyDetection diseñado.
Abstract
Las enfermedades neurodegenerativas se asocia frecuentemente a una progresiva pérdida de capacidad de movimiento, menor vida útil y neurodegeneración dependiente de la edad. Para entender el mecanismo de estos celulares eventos y sus relaciones causales con otros, Drosophila melanogaster, con sus sofisticadas herramientas genéticas y características conductuales diversas, se utilizan como modelos de enfermedades para evaluar fenotipos de neurodegenerativas. Aquí describimos un método de alto rendimiento para analizar el comportamiento de adultos geotaxis negativa de Drosophila , como una indicación de posibles defectos motor asociado a la neurodegeneración. Una máquina automatizada es diseñado y desarrollado para sincronización de mosca en coche mediante un impulso eléctrico inicial, más adelante lo que permite la grabación de comportamiento geotaxis negativa en un transcurso de segundos a minutos. Imágenes de la video grabado digitalmente luego son procesadas con el software de RflyDetection diseñado para la manipulación de datos estadísticos. A diferencia del ensayo manualmente controlados geotaxis negativa basado en volar sola, este protocolo precisa, rápida y de alto rendimiento permite la adquisición de datos más que centenares de moscas al mismo tiempo, proporcionando un enfoque eficiente para avanzar en nuestra comprensión en el mecanismo subyacente del aparato locomotor déficit asociado a la neurodegeneración.
Introduction
Una variedad de protocolos y métodos han sido desarrollados para analizar comportamiento de escalada adultos de Drosophila . Bastante laborioso, el análisis tradicional sobre todo poner una sola mosca en un frasco individual y utiliza una fuerza manual para moscas abajo de sincronización1,2,3,4. Es tedioso y lento, inadecuado para grandes estudios de alto rendimiento y tiene posibles variaciones de la fuerza manual utilizada para golpear ligeramente las moscas así como otras limitaciones. Para mejorar el análisis, se desarrolló un ensayo rápido iterativo Geotaxis negativa (anillo) que permite el análisis de alto rendimiento en numerosas moscas en el mismo tiempo5. Sin embargo, el ensayo requiere todavía una fuerza ejercer manualmente para sincronizar la acción de volar. Nuestra versión de la prueba de anillo, revisada en el ensayo anterior, incluye una base metálica que aloja múltiples frascos que contienen la mosca controlados automáticamente por un motor eléctrico para conducir sincronización mosca6. A grabación, la mosca sube inmediatamente después de sincronización se graba entonces analizado usando un software de diseño propio. Nuestro análisis automatizado del anillo ha eliminado el proceso tedioso y requiere mucho trabajo en la recogida de datos de una sola mosca, uno a la vez y permitió el proceso de adquisición de datos ser más eficientes. Además, se ha empleado el análisis automatizado del anillo en un número de estudios para aclarar el mecanismo subyacente enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson, validar el enfoque con eficacia alta7,8,9 .
En este artículo, se demuestra el ensayo de anillo automatizado usando el DDC-Gal4 impulsado por moscas de RNAi. DDC-Gal4 es una línea de Gal4 expresando específicamente en dopaminérgicas (DA) y de neuronas serotoninérgicas, lo que representa una gran herramienta para el análisis de los efectos de gen de destino asociados a déficit locomotor acompañando a neurodegeneración10. Además, incorporamos Dicer2 UAS, una línea de mosca que mejora la eficacia de ARNi, para generar el UAS-Dicer2; DDC-Gal4 línea de la herramienta. Las moscas de RNAi que decide usar es auxilin (aux) v16182 de RNAi (auxR16182), un gen que previamente hemos identificado para exhibir un efecto de volar locomotor actividad8. auxGFP moscas también están preparados para analizar los efectos sobre la sobreexpresión de aux . Mostraremos cómo utilizar el análisis automatizado de anillo para medir fly geotaxis negativos, presentar los resultados y discutir cualquier implicación de los resultados.
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Protocol
1. colección de la mosca
- mantener las moscas en la comida mosca estándar a 25 ° C, humedad 70% y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h.
- Recoger UAS-Dicer2; DDC-GAL4 volar virginsunder anestesia de dióxido de carbono (CO 2).
- Cruz estas vírgenes a las moscas macho adulto 2 días de edad con los siguientes genotipos: UAS-mCD8GFP (control), auxR 16182 (aux ARNi) auxGFP (sobreexpresión de aux), y auxR 16182; auxGFP (de rescate), con un varón: cociente femenino de 1:2.
- Por separado recientemente recoger eclosed machos y hembras en 3 frascos para cada grupo por experimento, colocando 10 moscas en cada frasco mosca regular con alimentos estándar a 25 ° C.
- Según el experimento, mantenga la recogida vuela hasta 35 días y utilizarlos para el análisis automatizado de anillo en el día 5, 15, 25 y 35.
2. Automatizado de ensayo de anillo
- transferencia 10 moscas (unisex) recogidos por genotipo en cada frasco, luego fije el frasco con un tornillo. Analizar el control de moscas y moscas llevar diferentes genotipos para cada conjunto de experimentos (hasta 10 simultáneamente, frascos 10 moscas en cada frasco).
- Encender la cámara digital situada en frente del aparato, e inicie la grabación una vez moscas es todo cargado y listo.
- Después de permitir 1 minuto para moscas en frascos, encienda el regulador de paso que controla el conductor paso; esto conduce el pequeño motor eléctrico para el control de la palanca para que consecutivamente se levanta y golpea el aparato 4 veces en 2 s. Vea la figura 1.
- Después de golpear ligeramente, tenga en cuenta que las moscas comienzan a ascender a la pared. Asegurarse de que grabación.
- Repita la sincronización como se describe en el paso 2.3 intervalo 60-s en ensayos consecutivos de 3 a 5.
- Repetir el experimento para 5, 15, 25 y 35 días de edad moscas. Realizar al menos 3 experimentos independientes para cada grupo, cada experimento con al menos 30 recogidos vuela (3 frascos).
3. Análisis de datos
- importar el vídeo grabado en el ordenador.
- Tomar una instantánea del vídeo en 6 s después de golpear ligeramente, para cada juicio.
- Importar la imagen instantánea en el software de RflyDetection (ver figura 2), usando el ' archivo ' menú.
- Establecer las líneas de base superiores e inferiores del frasco, precisamente usando el icono de referencia en la barra de herramientas y luego utilizando el cursor para marcar las líneas de base superiores e inferiores en la imagen.
- De entrada el número de moscas por frasco (p. ej., 10 aquí) en el ' vuela en rect ' campo y vial longitud (p. ej., 14 cm aquí) en el ' altura tubo ' campo dentro de la barra de opciones.
- Nota que las posiciones individuales de la mosca son detectadas y marcadas con puntos sobre la pantalla para cada frasco de.
Nota: La figura 2 indica las posiciones de los clics de botón de menú.
- Nota que las posiciones individuales de la mosca son detectadas y marcadas con puntos sobre la pantalla para cada frasco de.
- Nota que el software automáticamente determina la distancia escalada para cada mosca y muestra los valores promedio de 10 moscas en cada frasco en una tabla en el panel derecho. (Ver figura 2)
- El número sube con programas estadísticos (por ejemplo, prisma) para su posterior análisis estadístico del proceso.
- Presente los datos como promedio ± SEM.
- Calcular la p-valores de importancia (señalados con asteriscos, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001) con una vía ANOVA Bonferroni test de comparación múltiple
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Representative Results
Este artículo muestra el uso de un ensayo de anillo automatizado en la evaluación de comportamiento mosca geotaxis negativa. A diferencia del anterior ensayo de anillo, nuestro análisis incluyen un aparato automatizado que proporciona una fuerza eléctrica para sincronizar la acción de moscas y analiza cientos de moscas al mismo tiempo (figura 1). Análisis de Dicer2; DDC > auxR16182 moscas demostraron una disminución dependiente de la edad en la distancia escalada en un plazo de 6-s para las moscas machos y hembras, sugiriendo que aux expresión en las neuronas de DA es crucial para la actividad locomotriz mosca. Capacidad que sube parece no afectarse a sobreexpresión de auxGFP en las neuronas de DA y coexpresión de auxR16182 y auxGFP en las neuronas de DA rescató el fenotipo de RNAi (figura 2 y figura 3). Además de validar el análisis automatizado del anillo como un enfoque de alto rendimiento y eficiente para evaluar defectos motor asociados con la degeneración de la neurona DA, estos resultados también indican que este enfoque automatizado es útil en la identificación de potencial Riesgo de la enfermedad de Parkinson factores y ofrece una pista sobre su función de neurodegenerativas.
Figura 1. El aparato de anillo automatizado. (A y B) frontal y vista trasera del aparato: zócalo (1), barra vertical de acero (2), un tornillo para fijar el tubo en el marco (3) frascos de plástico transparentes (4), espuma (5), base de metal (6), conductor del micro-paso (7), regulador electrónico (8), el conmutador (9), pequeño motor eléctrico (10) y la palanca conectada al pequeño motor eléctrico (11). El tamaño de la estructura metálica rectangular es 46 cm × 26 cm × 16 cm, con 10 frascos transparentes de plástico (2,1 cm de diámetro, 14,5 cm de altura) fija con tornillos. Para encender el aparato, primero haga clic en el conmutador (9), que se convierte en (8), (7) y (10) en consecuencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Análisis de un representante instantánea imagen por RflyDetection. Imagen instantánea es importada en el software de RflyDetection y acción para cada icono en la interfaz se indica con el texto a la derecha. Después de fijar las bases superior e inferior, el software automáticamente detecta y marca la posición de la mosca dentro del frasco. La distancia escalada (cm) en 6 s para cada mosca y los valores promedio para cada frasco se muestran en una tabla. Estos números son importados en el software estadístico para su posterior análisis estadístico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Gráficos estadísticos de barras mostrando una disminución dependiente de la edad de volar capacidad cuando aux expresión es regulada en las neuronas DA. El análisis automatizado del anillo fue utilizado para analizar el comportamiento de la geotaxis negativa para moscas con los siguientes genotipos: auxR16182/ + (no Gal4), UAS-Dicer2; DDC-Gal4 moscas cruzaron a w1118 (control), UAS-mCD8GFP (control), auxR16182, auxGFPy auxR16182; auxGFP (rescate). Tenga en cuenta que las moscas machos y hembras subieron significativamente más lento con el tiempo cuando aux expresión se redujo en las neuronas de DA. Los déficit locomotor fueron rescatados al introducir la expresión de aux . Moscas de 5, 15, 25 y 35 días de edad fueron evaluados. Hombre (A) y femenino (B) moscas se muestran por separado. Leyendas con etiquetas genotipo correspondiente a los colores de barra diferentes aparecen en la derecha. Datos se muestran como media ± SEM. p-valores de importancia (señalados con asteriscos, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, ns: no tiene importancia, una barra fue dibujada por debajo de los asteriscos para indicar los objetos que Comparar) se calcularon en comparación con el control de mCD8GFP o aux ARNi con unidireccional ANOVA Bonferroni prueba de comparación múltiple. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El análisis automatizado de anillo descrito aquí permite un análisis de alto rendimiento del comportamiento de la mosca geotaxis negativa por cientos de moscas al mismo tiempo. Previamente las estrategias existentes para el análisis de escalada adulto implican observaciones de una sola mosca en un frasco individual y posición de volar manualmente es detectado por el ojo. Este proceso algo tedioso a veces puede causar mala interpretación o mala interpretación de los datos, así como trabajos que requieren mucho trabajo. Nuestro análisis automatizado del anillo comienza con un simple clic, y el aparato automáticamente sincroniza y evalúa la capacidad de hasta 100 moscas. La sincronización eléctrica proporciona un medio más preciso para controlar el tiempo y otros parámetros, para la captación general de volar escalada adulto proceso puede medirse cuidadosamente.
A continuación, con nuestro software RflyDetection diseñado, puede identificarse la posición exacta de la mosca. El software toma en consideración el 2D general vial zona (determinada por el marco rectangular) y las líneas de base superior e inferior, antes de adquirir posiciones para todas las moscas dentro del área señalada y los presenta como puntos. Además, el cálculo automático de los valores promedio y distancia escalada permite la manipulación de datos más rápida y fácil. Conjuntos de datos sobre un gran grupo de las moscas puede ser plausible recogidos y analizados dentro de un marco de tiempo razonable de8,7,9.
Aunque un dependiente de la edad baja en la actividad de escalada asociada a la neurodegeneración es descrita aquí, este ensayo es igualmente efectiva en el análisis del aparato locomotor actividad relevante a defectos de desarrollo. Para ello, el ensayo automatizado de anillo es un enfoque útil y eficiente para el análisis de Drosophila geotaxis negativa en cualquier etapa adulta y ya sea el estado normal o patológico de la función cerebral. Sin embargo, el ensayo ha limitado uso en analizar completamente todas las moscas a pesar del software de RflyDetection de capacidad para identificar manualmente cualquier accidentalmente uncaptured, unos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al centro de Stock de Bloomington y el centro de Viena Drosophila RNAi para las poblaciones de mosca. La patente para el aparato de anillo pertenece a Instituto de investigación de avanzada de Shanghai, Academia China de Ciencias. Las solicitudes para el software de RflyDetection debe hacerse a Huang Fu-de (ver lista de autor). Este trabajo fue financiado por becas del programa nacional de investigación básica de China (973 programa 2013CB945602) y la Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (31270825 y 31171043). Agradecemos a los miembros de laboratorio de Ho para discusión y comentarios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
References
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