Summary
ここでは、乳腺細胞外マトリックス (ECM) 式および膵管の形態を検討する提案全体、そのままマウスの隔離のためのプロトコル。マウス #4 腹部腺は、8-10 週齢雌未マウス、中性緩衝ホルマリンで固定、断面、ECM 蛋白質の免疫組織化学を用いたステンド グラスから抽出されました。
Abstract
この手順の目的は、ECM 式と管のアーキテクチャを評価するために雌の未経マウスから #4 腹部乳腺を収穫するためだった。ここでは、皮膚の下の小さなポケットは、マヨはさみ、基になる腹膜から皮下組織内腺の分離を許可するを使用して作成されました。腺の可視化は、3.5 の使用によって助けられた x R 外科用マイクロ ルーペ。ペルトは逆になったし、ヘアケアのままの乳腺の脂肪パッドの識別。#4 腹部腺の皮下層と腺の間メスの刃を横方向に摺動によって切開しぶっきらぼう。、収穫後すぐに腺 10% 中性緩衝ホルマリン後続のティッシュの処理のために置かれました。それは主に膵管上皮細胞と部分生検で見逃される可能性が他のアイソレータケージ細胞集団の重要な組織全体の相互作用を除外するリスクを排除するため、全体の腺の切除は有利です。方法論の 1 つの欠点は、腺内の個別の場所に管の形態形成および蛋白質の表現の分析を制限する固定組織から連続切片の使用です。など、3 次元 (3 D) で管のアーキテクチャおよび蛋白質の表現の変更は容易に獲得可能ではないです。全体的にみて、手法は全体そのままマウス乳腺発達性膵管の形態や乳房癌など下流の調査のために必要とする研究に適用されます。
Introduction
乳がんは、実質的な組織線維症1,2,3,4度が特徴です。ECM と呼ばれる、この非携帯電話エンティティはすべての組織に様々 な程度で発見され維と非フィブリル型コラーゲン、エラスチンのに加えて、様々 なシグナル分子の糖タンパク質の複雑な網目の主に構成されていますこの行列で隔離。恒常性の条件の下で成膜と ECM の劣化が厳しく管理します。5乳腺腫瘍、ECM の沈着と分解のバランスが中断されます。そのため、コラーゲン、フィブロネクチン、テネイシン-C 他の中など豊富な ECM 蛋白質を表現する乳腺腫瘍が報告されています。6マトリックス架橋の増加パターンに加えてこれらの蛋白質の異常発現は乳房腫瘍の進行・転移・治療抵抗1,の3、を促進するために記載されている4,7,8,9。
ECM 組成および膵管の形態を評価するためにそのまま乳腺の分離を行った。ここでは、我々 欠乏未メスマウス カベオリン 1, 内在性膜タンパク質は積極的にリンクされている乳房の腫瘍署名10、11,12、女性未 B6 を制御マウス。組織学的処理およびこれらのティッシュの汚損、管形態の特性と共にいくつかの ECM タンパク質の同定を許可しました。
全体的にみて、全体をそのまま乳腺の分離は、研究者に, 外的あるいは内的要因に応答して発生する組織全体の形態や細胞の変化を調査する機会を与えます。技術の欠点は、膵のツリーの複雑な形態のより完全な画像をもたらすと 3 D 視点とは対照的の 2 次元 (2 D) 組織切片の解析に関連付けられます。乳腺で行われる細胞と細胞外マトリクスの相互作用の複雑さを考えると、全体、そのまま腺の分離が効率的にマウス乳腺の様々 な地域で膵管の形態とタンパク質発現の分析に有利です腺。
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Protocol
すべてのテクニックは厳密の下で実施された、このプロトコルでは動物を対象とする手順が審査し承認機関動物ケアおよび使用委員会フィラデルフィア オステオパシー医科大学の倫理的な指針
。1 です。 サンプルの調達・加工
- 選択適切な動物の対象と CO 2 室に場所。この実験では、8-10 週を使用して古い女性未 B6。Cg-Cav1tmMIs/J ・ C57BI/6 j.
- 30-40% にガスの流れをオン。約 2 分後に動物が目に見えて意識なく、追加分の完全な圧力にガス栓をあけて
注: は、10 分の期間のための CO 2 配信停止後 (例えば 胸の動き) を呼吸の兆候を観察することによって動物の死を確認します。動物がまだ生きている場合は、CO 2 チャンバーに戻されます可能性があります。頚部転位も使えますが血液が乳腺の解剖結果と干渉して集まるよう勧めできません 。
- 次の犠牲、仰臥位で死体をピン留めし、70% エタノールで飽和します 。
- 鉗子を使用して恥骨のすぐ上毛皮をピンチし、小さな手術ハサミ ニックします。移動腹側正中線に沿ってペルト仙骨頭蓋にカットはさみを回転します 。
- 大きいはさみや、止血、にべもなく解剖皮下筋膜両側、腹膜を穴をあけることは注意を使用しています。切開の両方の遠位端の水平方向の余白に沿って裁断します 。
- ピン ペルト フラップを開き、70% エタノールで再度スプレーします
。 注: 70% のエタノールの使用には、腺と周囲の皮下組織の間よりよい視覚的な効果が認められて、このソリューションの使用の結果として組織の乾燥を避けるために注意します。乾燥を避けるため、4 分を超えない時間内腺を削除します。捜査官として 70% のエタノールの代わりに、組織の乾燥を避けるために、1 × PBS などの一般的な分離バッファーを置き換えることも 。
- 乳腺と関連付けられた皮膚脂肪真皮から自由を切断、ペルト フラップの内側に沿って #4 メスのブレードをスライドさせて、関心の乳腺を検索します
。 注: 外科用マイクロ ルーペ x 3.5 は腺の簡単に可視化に役立つ可能性があります 。
- はすぐに新たに単離した腺 10% 中性緩衝ホルマリン 24-48 h. のための 10:1 ソリューション組織ボリュームを含む円錐管を水没
注: 依存研究の意図が、多くの代替の定着剤を使用できますパラホルムアルデヒド、ゲノム研究と市販の RNA のバッファーを保持するためにエタノールなど 。
- は、パラフィン包埋用機関のプロトコルに従う、埋め込み処理、ベンダーにサンプルを提出、スライス/スライド マウント。5 μ m で組織をセクションします
。 注: 余分な脂肪の周囲腺による区分および染色する前に組織の 100-200 μ m の削除を検討します 。
2。組織染色
パラフィンを溶かす 1 h の 58 ° C で- ヒート ブロックに染色される 免疫組織化学
- 場所のスライドを設定します
。 注意: は、スライドをオフに実行可能性がありますパラフィン ワックスを溶融します。密接に監視または流出ワックスをキャプチャするスライド下のワイプを配置します
。 注: この手順は必須ではない、スキップする場合があります。この一歩を追加する可能性があります結果を向上させる結果が期待されていない場合 。
- 加温スライド スライドで jar 含むの 100% キシレン 30 分完全な水没を確保するためです。もう一度繰り返します
。 注: この時点で、目視検査対象となる脂肪組織のパラフィン切片が頂けますように。追加脂肪やワックスが明らかの場合、キシレンでスライドする必要があります再冠水しました。これは組織の収縮を引き起こす可能性があるキシレンに加えられた露出を最小限にする注意を使用します 。
- 10 分 100% のエタノールを含むスライド jar rehydrate 組織をもう一度繰り返します 。
- 10 分 95% のエタノールを含むスライドに移動スライドをもう一度繰り返します 。
- スライド、スライド瓶含む 75% のエタノールの 5 分に移動
- スライド、スライド瓶含む 50% エタノールに 5 分間を移動します。
- 10 mM クエン酸ナトリウム溶液 (pH 6.0) ホット プレートや電子レンジを茹でて Coplin jar に注ぐ
。 注意: 慎重に加熱しながらソリューションを監視、上の沸騰を避けるために世話をします。コンテナーは、とても暑くなるでしょう。やけどをしないように保護を使用します 。
- ゆっくり Coplin に場所スライド瓶、完全な水没の確保とエピトープを取得する 10 分間 100 ° C で孵化させなさい。削除し、慎重にスライドをドライします 。
- は、疎水性のマーカーと組織のまわりで障壁を描画します。十分な内因性酵素の阻害剤を追加 (過酸化水素とアジ化ナトリウム、利用可能な商業的) 組織を被覆し、10 分間インキュベート
- サブマージ スライド 1 x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 10 分間
- は、組織を被覆し、加湿チャンバーに室温で 1 時間インキュベート 1x PBS で十分な 10% ロバ血清を追加します
。 注: 実験をここで休止して一晩 4 ° C で加湿チャンバ内のスライドを保存することによってできます。ロバ血清最適な染色結果が得られることがわかった、最適な結果を決定するための馬の血清やヤギ血清ウシ血清アルブミン (BSA) など異なる血清をテストする調査官しれません。捜査官が使用する前にこの新鮮なを準備する必要があります BSA を使用している場合 。
- は、スライドから余分なブロッカーを捨て、組織がソリューションで均等に覆われていることを確保するスライドに直接 1% 血清中正しく希釈した一次抗体を追加します。加湿チャンバーに室温で 30 分間インキュベートします
。 注: この手順続けられるかもしれません時間期間が長くなると湿気のある商工会議所の 4 に格納されている ° c. をこの段階で適切なネガティブ コントロール スライド (例えば ない一次抗体、抗原陰性組織等 を知られているとスライド) を含めるようにしてください 。
- 慎重に式行先方向 2 O ティッシュの上に約 1 mL を流すことによりスライドを洗って 1 5 分の 1 の x PBS の変化でインキュベート
- 過剰 PBS を捨て、ティッシュをカバーし、加湿チャンバー内で 30 分間インキュベートする十分な西洋わさびペルオキシダーゼ ラベルを追加します
。 注: この手順では、捜査官が蛍光蛍光共役二次抗体を用いた染色へ進学を希望する可能性があります。次の手順を適宜変更する必要がありますこれを希望する場合 。
- 慎重に式行先方向 2 O ティッシュの上に約 1 mL を流すことによりスライドを洗って 1 5 分の 1 の x PBS の変化でインキュベート
- は製造元の推奨比率に従ってクロモーゲン ソリューション プラス ジアミノベンジジン (軽打) を行い渦によるミックスします
。 注: 多くの既製のキットは別にこのプロトコルで使用される市販 。
- デカント過剰スライドからバッファーし、組織に直接発色染色の 2 〜 3 滴 (10-50 μ L) を追加し、湿気の多い部屋で 5 分間インキュベートします。慎重に組織を流れる約 1 mL 式行先方向 2 O でスライドを洗うです
。 注意: DAB 発色は非常に有毒です。有害廃棄物を皮膚や収集のフローで汚れの直接接触を回避します 。
- 場所のスライドを設定します
- ヘマトキシリンとエオシン (H & E)
- 1-2 分の水道水の下で軽く 2 〜 2.5 分リンス スライドのハリス ヘマトキシリンでスライドを水没クロモーゲン インキュベーション後最終すすぎ、次
注: 組織の上に水の直接噴流を避けるために世話します 。
- 埋没スライド分化溶液 (70% エタノール 100 mL に塩酸の 0.25 mL) 2-3 s 用。約 1-2 分間水道水で優しくスライドをリンス
- の 95% のエタノール 30 の 60 s. リンス スライド ブルー エージェント (pH 9.4 を水道水 100 mL で 4.5 mg 炭酸カルシウム) のスライドを水没 s.
- アルコール エオシン Y 2-3 分で埋没、スライド
- 脱水 1 分の 95% エタノールが 2 変化組織 。
- Dehydrate 組織 1 で 100% のエタノールの 1 分の変更
- - リントフリーの乾燥を慎重にスライドします。1 滴を適用 (約 100-200 μ L) の合成、非水溶媒、樹脂ベースのスライドし、coverslip を適用するメディアをマウントします
。 注: 異なる染色法が選ばれた場合、メディアを別のマウントが、要求されるかもしれない。例えば、調査官が蛍光標識二次抗体を場合、水性マウントより理想的である 。
- 室温で一晩を設定するスライドを許可します 。
- 1-2 分の水道水の下で軽く 2 〜 2.5 分リンス スライドのハリス ヘマトキシリンでスライドを水没クロモーゲン インキュベーション後最終すすぎ、次
- Picrosirius 赤 (PSR) 染色
- 染色、免疫組織化学プロトコル手順 6 (50% エタノール浸漬) に従うスライドを選択します 。
- 1 h. の PSR の埋没、スライドを染色
- 染色を区別するために 2 回の 1-2 秒の 0.5% 酢酸のスライドが水没します 。
- 脱水 1 分の 95% エタノールが 2 変化組織 。
- Dehydrate 組織 1 で 100% のエタノールの 1 分の変更
- スライドをオフに簡単にについての 100% キシレンの沈没によって 3-4 s ・
- - リントフリーの乾燥を慎重にスライドします。1 滴を適用 (約 100-200 μ L) の合成、非水溶媒、樹脂ベースのスライドし、coverslip を適用するメディアをマウントします 。
3。サンプル分析
- 管解析
- 選択スライド染色 α SMA。20 倍の倍率で代表的な画像を収集カメラ マウントの目的を搭載光学顕微鏡を使用しています 。
- 使用 ImageJ (NIH) を区別し、各画像のダクトをカウントします。これらは手動で列挙することができます。 または 1 つは個々 のダクトに数値のスコアを割り当てる可能性があります。数値スコアを割り当てる、ImageJ を開き、プラグインを選択します。次に分析を選択し、ドロップ ダウン メニューからセルのカウンターを選択します。初期化をクリックし、ダクトのラベリングを開始するタイプ 1 をハイライト表示します。完了したら、管のカウントを表示する結果を選択します
。 : 注意して構造が乳管癌と血管がないことを確認します。 - で ' 設定測定 ' オプション、チェック ' 境界 ' と ' エリア " です 。
- 筋上皮区画 (α SMA 汚れ援用可視性) で各ダクトの周りに線を描くフリーハンド多角形ツールを使用して。選択 ' メジャー ' 境界と領域を記録します 。
- 再び内部に内腔の上皮の根尖側に沿ってラインを描くフリーハンド多角形ツールを使用しています。選択 ' メジャー ' 境界と領域を記録します 。
- は、上皮のまわりを得るために筋上皮区画の境界から内腔の区画の境界を減算します。上皮の領域を取得する上皮区画の面積から内腔の区画の面積を減算します 。
- 免疫組織化学分析
- ImageJ やフィジー スイートなどの分析ソフトウェアに明視野画像をアップロードします
。 注: このプロトコルは ImageJ と IHC ツールボックス プラグインを使用して分析の汚損のため手順をについて説明します 。
- は、プラグイン メニューから IHC ツールボックスを開きます。" モデルの選択 " 適切な染色を選択コンボ ボックス (すなわち H-DAB、PSR、等)。選択、" 色 " 汚れを分離します。結果ウィンドウが表示されます
。 注: 興味の蛋白質細胞外や細胞内スペースにある血しょう膜にバインドされている場合、このメソッドは適切です。興味の蛋白質が核の場合を選択する " 核 " 積極的に汚された核の画像を分析するプラグインが要求されます 。
- 色選択スライドを使用して、背景の追加または過剰な染色除外せず汚れの適切な分離を確保するためです
。 注: 自動モードは汚れを検出することができるまたは許容範囲の画像は発生しません、正方形を描く関心領域 (ROI) 識別上領域を染色します。IHC ツールボックス ウィンドウで、選択 " 鉄道 " 適切なターゲットにプラグインを直接にします 。
- は、画像を 16 ビットに変換します。画像 → タイプ → 16 ビット 。
- しきい値画像。画像 → 調整 → 自動しきい値 。
- は、長さを割り当てるイメージ スケール バーの上に直接ラインの投資収益率を描画することによって画像の計測スケールを設定します。スケール バーを設定するに移動 分析 → スケールを設定します。(例えば 120 ピクセル/50 μ m) の長さの単位あたりのピクセル数を入力します 。
- は、結果の領域を測定し、平均グレー値。分析 → 設定測定 をクリックして測定を収集し、分析 → 測定 。
- ImageJ やフィジー スイートなどの分析ソフトウェアに明視野画像をアップロードします
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Representative Results
雌マウス乳腺の 5 ペアがあります。具体的には、子宮頸部腺 (#1)、腹部腺 (#4)、呼吸器の腺 (#2 および #3) 1 組と鼠径腺 (#5) (図 1A) の 1 ペアの 2 つのペアの 1 つのペアがあります。ここでは、彼らは容易に識別可能、#4 腺を分離しました。状況によっては、#4 と #5 腺分離した一緒に両者の区別が困難です.そのまま #4 腹部を分離するには、乳腺、ペルトは固定され (図 1B) の矢印で示される #4 腺の場所を明らかに、基になる腹膜から慎重に分離します。#4 腺慎重に切除され任意の残留皮下または筋肉ティッシュの存在を検査します。私たちの分離腺 (図 1C) 個人を特定できるこれらがなかったら、我々 はフィブロネクチン ステンド腺を組織していた区分する前に削除されていないティッシュのブロックからの大幅により多くの皮下組織に注意してください (など浅) (図 1D) と腺組織から組織のどの 100-200 μ m のブロックの断面 (例えば深い) (図 1E) 前に削除されていた。調査官が線維化を比較すると, 外的あるいは内的要因の応答の乳腺組織線維化のより良い理解を得るために腺の大幅な削減と表面的な。その他の分析組織スライスし染色場合相当の皮下や筋肉組織に進む次の腺の解剖がある前に半分に組織ブロックをセクションに捜査に有利な場合があります。
分離、次、腺が 10% 中性緩衝ホルマリンで固定された処理、染色の断面します。興味の他の蛋白質に加えコラーゲン発現解析のための手順は、図 2 aに描かれています。ECM タンパク質コラーゲン、フィブロネクチンとテネイシン-C からの代表的なサンプルは、図 2Bに表示されます。画像の各矢印は、これらのティッシュ (図 2B) ダクトの存在を示しています。
管の形態学的特徴を定量化するには、不適切な取り扱いがあります損傷した組織と管を測定ではありません注意して組織学的セクションの治療に重要です。不適切な処理の例としては、不適切な温度でバッファーを使用してまたはプロトコルで指定されているよりも時間の長い期間のためクエン酸ナトリウムや酢酸など過酷なバッファーで組織サンプルを残して、組織に直接バッファーまたは水実行可能性があります。図 3Aで、どの組織に損傷が発生した組織切片の例です。ここでは、(図 3A) ダクトの破損のポイントとして、組織に甚大な被害を容易に観察できます。このセクションは、管構造の分析に使用できません。図 3Bにダクト、測定と定量化可能なそのままの組織標本の例を示します。ここで、ダクトはない周囲のフィブロネクチン染色質によって特徴付けられるだけでも (図 3B) 管の内腔の上皮細胞の密な人口の存在によって特徴付けられます。開発中にマウスの乳腺を含む単一ダクト分岐と各発情周期回帰のシリーズを受けるより複雑な膵ツリーを形成する側の二次枝芽から出生時に注意することが重要です。13。 捜査官が発情周期の独立管番号に関する情報を取得するためにかもしれませんが、私たちはありません考慮これらの実験の動物の発情周期を撮影しました。捜査官のプロトコル Caligioni14周期の段階こと目に見えて決定によって呼ばれます。ダクトを定量化についてこれらの組織学的セクションの複数管構造の存在が複数のユニークなダクトを示すものではありませんが、管伸長の結果より発展した膵ツリーの説法は。ダクトを列挙するには、1 つはティッシュ セクションで個々 のダクトに番号を割り当てる画像解析ソフト ImageJ (NIH) などを使用可能性があります。調査官は発達異常や病的な状態を示す管番号の変化としてダクトを列挙するがあります。本研究に関して我々 は可能性がありますドライブの異常発現インスリン成長因子などの成長因子 (IGF-1) マウス膵の知られている調停カベオリン 1 の損失に関連は管、管伸長の結果数の増加を信じて成長15.
加えそのままダクトの存在、いくつかダクト枝、フィブロネクチン ステンド セクション (図 3C) の矢印で示されています。この分析の目的のためこれらの管の分岐はありません別の管構造として。評価およびダクトを測定、血管構造からダクトを区別することが重要です。血管構造ないだけ以内に識別できます、内腔内皮膜の存在の核、好酸性の構造を示す赤い血球 (RBC) の存在によってもルーメン (図 3D)。ルーメン内好酸球性構造の存在は、RBC を示し、血管を示唆している、組織切片中の腺コレクション中に赤血球の変位が考えられます。CD31 の内皮細胞のマーカーを使用して血管の構造を確認することをお勧めします。CD31 染色組織切片の例を示します (図 3D)。管の円周と面積を定量化するために筋上皮境界 (円周) と α SMA 染色組織切片の内腔の境界を輪郭をベクトル ImageJ (NIH) を割り当てることができます。それ汚れダクトを並べる上皮細胞、平滑筋細胞のマーカー α SMA が使用されました。示されているイメージ、ブルーライン (図 3E) の内腔の境界を示しています、赤い線は筋上皮の境界を示しています。回路図に示すように、内腔とストローマ細胞コンパートメントの間の領域は、合計の間質組織に加えて、膵管上皮細胞 (図 3E) によって占められる領域です。
図 1: 全体、そのまま乳腺組織学的分析のための分離します。(A)次の動物の犠牲、ペルトが慎重に除去し、真皮と腹膜の間にある乳腺を公開する背中を固定します。回路図は子宮頸 (#1) の相対的な位置を示しています呼吸器 (# ' s 2 と 3)、腹部 (#4)、鼠径 (#5) 腺。(B) 、#4 腹部腺、切り裂かれた動物で、赤矢印で示したが分離されました。(C) #4 腹部腺未雌 B6 マウス由来の代表的な例。(D)実質的な皮下腺の組織があった断面 (例えば浅) 前にパラフィン ブロックから削除されていないからは明らかに次の ECM 蛋白質フィブロネクチンの染色します。(E) Considerably 少ない皮下組織と間質組織を染色以上のフィブロネクチンが 100-200 μ m 組織の断面 (例えば深い) 前にパラフィン ブロックから削除されていた腺から観察されました。組織切片は、代表的なサンプルからです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:組織学的処理と染色します。(A)組織学的処理のための手順の概略です。異なる一連の手順は、コラーゲン発現解析のために利用されました。(B) ECM タンパク質コラーゲン、フィブロネクチンとテネイシン-C 女性未カベオリン 1 欠乏動物の腺からの代表的なイメージ。コラーゲン、フィブロネクチン、テネイシン C の矢印は、ダクトをライニング密な質を示しています。PSR: Picrosirius 赤。Fn: フィブロネクチン。10 c: テネイシン-c.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:管建築の解析。(A)セクションを染色フィブロネクチンは、広汎な組織の損傷を示しています。これは管の構造 (矢印) の改の存在によって示されます。(B)セクションを染色フィブロネクチンは、上皮細胞の 1 つまたは複数のレイヤーや周囲の間質に囲まれたルーメンの存在によってマークされているそのままの管構造物の存在を示しています。矢印は、個々 の管構造を示しています。(C)フィブロネクチン ステンド グラスのイメージは、矢印で示された管の枝の存在を強調表示します。これらより大きい管構造の内腔との連続性に注意してください。(D)しばしば血管構造 (赤矢印)、細胞の単一の層と、核好酸球性構造の赤い血球を示すものの存在によって特徴付けられるがダクト (黒い矢印) との近さで観測されます。低倍率は左の図のように、対応する高倍率画像が右側に表示されます。これらのイメージは、H に染まっていた & E, テネイシン-CCD31 は、血管内皮細胞、血管のライニングの陽性マーカーとして使用されました。どの CD31 陽性細胞が血管の内腔表示されます大きな血管の構造は、示されています。低倍率は左の図のように、対応する高倍率画像が右側に表示されます。(E)管の円周は中膵領域は、内腔のコンパートメントを概説する (青で示されている) ベクトルを用いて測定した筋上皮区画の概要を説明するベクトル (赤で示されている) を使用して α SMA 染色画像で測定しました。間質と内腔のコンパートメントの間に地域は、膵領域として分類されました。スケールバー = 50 μ m. 境界と領域で測定した範囲が強調表示管構造の模式図。10 c: テネイシン-c.図 E の組織切片から変更された: トンプソン Cら16 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
論文では, ECM 式および膵管の形態の下流組織学的解析のためそのままマウス乳腺を分離する方法を説明しました。膵管の形態の分析に関しては、この手法は、染色標本に基づいて管建築の迅速な調査を可能。 にします。管分析の他の方法は技術的に挑戦的で、時間がかかるかもしれない方法管のツリーの視覚化を有効にする染料の注射に依存します。
乳癌で ECM を異常と報告されています。1,2,6,9具体的には、ECM の豊かさおよび/または架橋結合パターンの変化腫瘍進行・転移・治療抵抗3,4,6,7 に影響を与えると報告されています。 ,8,9。また、ECM 環境の変化は、膵管上皮細胞形態と増殖17腫瘍の開始を支持する状況につながる可能性がありますを変更するも報告されています。ECM 式とカベオリン 1 の損失に続く管の形態の変化を評価するためにカベオリン 1 欠乏動物モデルを利用した、1 つには任意のマウスのモデルにこの方法が適用されます。ECM の発現パターンと管のアーキテクチャを評価するために下流の組織学的解析の全体をそのまま乳腺を分離する手法について述べる。この方法から結果 ECM 式と腺の形態のロバスト解析されます。その分析の ECM 式、特にフィブロネクチン、セクショニングおよび腺線維化のより完全な画像を得られた染色する前に削除されていました表面組織の 100-200 μ m のセクションからわかった。また、BSA ではなくロバ血清の使用に、非特定の染色大幅に減った良い品質組織学的試料が得られたことがわかった。
管のアーキテクチャの分析セクションの組織はそのままとダクトの破損のポイントは、組織が不適切な処理の結果を含む、断面で明らかに重要です。さらに、管分岐、調査官が、測定する別のパラメーターと、単層の内皮細胞で容易に識別することができます血管構造にし内好酸球の構造を正しく区別することが重要だ、CD31 染色に加えてルーメン。ECM タンパク質、筋上皮マーカー αSMA と H するためのセクションでダクトをみながら & E counterstaining、ダクト、ダクトの列挙体の細胞成分を強調し、任意の関連付けられた枝は H で達成可能な & E染色組織切片だけで。膵管の形態のより詳細な分析や中古腫瘍や腫瘍性の病変の存在の分析は、調査官はライブex vivo組織を評価する共焦点イメージングを活用するがあります。このインスタンスで、固定と処理手順を排除組織全体の腺が切除が同じ手法を適用できます。
このプロトコルの重要なステップは、#4 腹部腺の正確な同定を有効になっているだけでなく、さらに覆う真皮基になる腹膜から腺の解剖を許可する外科用マイクロ ルーペの使用を含みます。実質的な皮下組織や筋肉の除外は、染色および組織学の脂肪による干渉を低減しました。さらより腺の ECM 式変化を識別する、分かった残留脂肪の除去を助けた組織ブロックの 100-200 μ m を取り去るに役立ちます。乳腺全体の分離では、間質蛋白発現および膵管の形態の広い変化の組織について説明します、記載した技術は固定から連続切片の解析に限定、パラフィン埋め込まれた組織。管の変更程度を確立するには、分岐が発生しましたが、ライブ、 ex vivo組織の全台紙イメージングが必要になります。ここでは、調査官は腺特定蛋白質の相互作用を研究する18のイメージングの前に管のツリーを点灯するための染料を活用動詞をカスタム、条件付き蛍光レポーターを設計するのに Cre Lox を使用できます。これに加えて、さらに腺の全体の興味の蛋白質の解析が必要になる西部のしみや質量分析法や免疫沈降 (クリップ) やクロマチンの架橋など他の高速技術の使用免疫沈降 (チップ)。このインスタンスで、全体の腺が解剖小さな部分に区分けされ、それに応じて下流解析の処理。さらに、1 つはまたティッシュ セクションの蛍光イメージングを使用可能性があります。この手法は複数のタンパク質と同じ体内タンパク質式共局在を解析するために理想的であります。
要約すると、全体をそのまま乳腺の急速な隔離を提供し、組織学的処理・管解析にそれ以上の細部を提供手法について述べる。この技術の応用は、ECM 式および担癌動物の膵管の形態に関連する変更を調べることができます。さらに、コラーゲンの配向と繊維径、組織密度を分析するために役に立つかもしれない情報の解析は、PSR のセクションを染色で実行する可能性があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、それぞれ動物の剖検と腺の分離について 4 月と博士ロジャー ・ Broderson を認めたいと思います。この仕事のための資金は、慢性疾患の高齢化のためフィラデルフィア大学整骨医学センターによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
References
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L.
- Caligioni, C. S.
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
