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Neuroscience

यांत्रिक उत्तेजना और सी. एलिगेंस के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए एक Microfluidics डिवाइस का उपयोग करना

Published: February 19, 2018 doi: 10.3791/56530
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2, 4
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University, 2Department of Mechanical Engineering, Stanford University, 3Department of Bioengineering, Stanford University, 4Group of Neurophotonics and Mechanical Systems Biology, The Institute of Photonic Sciences (ICFO)
* These authors contributed equally

Summary

mechanobiology अनुसंधान के लिए नए उपकरणों को समझने की जरूरत कैसे यांत्रिक तनाव जैव रासायनिक रास्ते को सक्रिय करता है और जैविक प्रतिक्रियाओं को बटोरता है । यहां, हम एक microfluidic सेलुलर प्रतिक्रियाओं के उच्च संकल्प इमेजिंग की अनुमति जाल के साथ स्थिर पशुओं के चयनात्मक यांत्रिक उत्तेजना के लिए एक नई विधि का प्रदर्शन ।

Abstract

mechanobiology का एक केंद्रीय लक्ष्य प्रोटीन और कोशिकाओं पर यांत्रिक तनाव के पारस्परिक प्रभाव को समझने के लिए है । इसके महत्व के बावजूद, सेलुलर समारोह पर यांत्रिक तनाव के प्रभाव को अभी भी खराब समझ है । भाग में, इस ज्ञान अंतर मौजूद है क्योंकि कुछ उपकरण ऊतक और कोशिकाओं के एक साथ विरूपण सक्षम, जीवित पशुओं में सेलुलर गतिविधि की इमेजिंग, और अंयथा उच्च मोबाइल मॉडल जीवों में गतिशीलता के कुशल प्रतिबंध, जैसे निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस। सी. एलिगेंस के छोटे आकार उंहें microfluidics आधारित अनुसंधान उपकरणों के लिए एक उत्कृष्ट मैच बनाता है, और स्थिरीकरण के लिए समाधान microfluidic उपकरणों का उपयोग कर प्रस्तुत किया गया है । हालांकि इन उपकरणों उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं, पशु पूरी तरह से polydimethylsiloxane (PDMS) और कांच में, यांत्रिक बल या electrophysiological रिकॉर्डिंग के वितरण के लिए भौतिक अभिगम सीमित है । हाल ही में, हम उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ संगत है कि एक फँसाने डिजाइन के साथ वायवीय प्रेरक एकीकृत करता है कि एक डिवाइस बनाया. actuation चैनल एक पतली PDMS डायाफ्राम द्वारा कीड़ा फँसाने चैनल से अलग है । इस डायाफ्राम एक बाहरी स्रोत से दबाव लागू करने से एक कीड़ा के पक्ष में विक्षेपित है । डिवाइस व्यक्तिगत mechanosensitive ंयूरॉंस को लक्षित कर सकते हैं । इन ंयूरॉंस के सक्रियकरण आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतकों के साथ उच्च संकल्प पर imaged है । यह आलेख सामांय विधि को उनके स्पर्श रिसेप्टर न्यूरॉन्स (TRNs) में कैल्शियम के प्रति संवेदनशील गतिविधि संकेतक (GCaMP6s) व्यक्त C. एलिगेंस उपभेदों का उपयोग कर प्रस्तुत करता है । विधि, तथापि, TRNs करने के लिए और न ही एक जांच के रूप में कैल्शियम सेंसर करने के लिए सीमित नहीं है, लेकिन अन्य यांत्रिक संवेदनशील कोशिकाओं या सेंसर करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है.

Introduction

स्पर्श की भावना अपने पर्यावरण के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी के साथ पशुओं को प्रदान करता है । लागू बल पर निर्भर करता है, स्पर्श अहानिकर, आनंददायक, या दर्दनाक के रूप में माना जाता है । संपर्क के दौरान ऊतक विकृति विशेष mechanoreceptor त्वचा है कि एक्सप्रेस रिसेप्टर प्रोटीन, सबसे अधिक आयन चैनल में एंबेडेड कोशिकाओं द्वारा पता लगाया है । स्पर्श और दर्द के दौरान आयन चैनल सक्रियण के लिए बल धारणा को जोड़ने कदम पूरी तरह से समझ नहीं कर रहे हैं । इससे भी कम के बारे में जाना जाता है कैसे त्वचा ऊतक यांत्रिक विकृति फ़िल्टर और चाहे mechanoreceptors तनाव या1,2,3में परिवर्तन का पता लगाने । समझ में यह अंतर उठता है, भाग में, उपयुक्त उपकरणों की कमी से एक जीवित जानवर की त्वचा की सतह के लिए सटीक यांत्रिक उत्तेजना लागू करते हुए सेलुलर स्तर पर प्रतिक्रियाओं को देख । जबकि परमाणु बल माइक्रोस्कोपी बड़े पैमाने पर लागू करने के लिए और अलग कोशिकाओं4,5 में बलों को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है और भी जीवित कोशिकाओं6में Piezo1 रिसेप्टर्स को सक्रिय करने के लिए, समान प्रयोगों जीवित पशुओं का उपयोग, विशेष रूप से C. एलिगेंस, इस विषय की आंतरिक गतिशीलता के कारण बेहद चुनौतीपूर्ण रहा है । इस चुनौती को परंपरागत रूप से पशु चिकित्सा-या शल्य चिकित्सा ग्रेड cyanoacrylate गोंद का उपयोग कर आगर पैड1,7,8,9पर व्यक्तिगत पशुओं को स्थिर करने से दरकिनार कर रहा है । यह दृष्टिकोण उत्पादक है, लेकिन gluing द्वारा स्थिरीकरण और यांत्रिक अनुपालन पर नरम आगर सतह के लिए आवश्यक कौशल से संबंधित सीमाएं हैं । एक microfluidics रणनीति एक मानार्थ विकल्प है कि gluing से जुड़ी जटिलताओं के कुछ बचा जाता है ।

निमेटोड सी एलिगेंस एक पूरी तरह से मैप तंत्रिका तंत्र के साथ एक आनुवंशिक मॉडल जीव है कि, जानवर के आकार के कारण, microfluidics प्रौद्योगिकी के लिए एक अच्छी फिट है । Microfluidics-आधारित उपकरणों उच्च संकल्प इमेजिंग और प्रासंगिक तंत्रिका-modulatory उत्तेजनाओं के वितरण प्रदर्शन करते हुए अन्यथा अत्यंत मोबाइल जानवरों को रोका जा सकता है कि लाभ प्रदान करते हैं । microfluidic प्रौद्योगिकियों की मदद से, जीवित पशुओं को नुकसान पहुंचाए बिना10,11, पूरे जीवनकाल में12,13 और उच्च-रिज़ॉल्यूशन पर व्यवहार गतिविधि की निगरानी सक्षम कर सकते हैं न्यूरॉन गतिविधि की इमेजिंग14,15,16,17. इसके अलावा, कई mechanoreceptor को छूने और दर्द की भावना के लिए आवश्यक ंयूरॉंस उनके शारीरिक1,8, यांत्रिक4,18,19, और आणविक पर विशेषता हो सकती है तर२०,२१,२२.

C. एलिगेंस होश कोमल यांत्रिक उत्तेजनाओं अपने शरीर की दीवार के लिए छह TRNs, जिनमें से तीन अंदर आना है पशु पूर्वकाल (ALML/आर और एवीएम) और तीन जिनमें से पशु के पीछे अंदर आना (PLML/ आयन चैनल एक जैव रासायनिक संकेत में एक लागू बल transducing के लिए आवश्यक अणुओं को बड़े पैमाने पर अपनी TRNs8में अध्ययन किया गया है । इस अनुच्छेद के एक microfluidic मंच23 प्रस्तुत करता है कि शोधकर्ताओं ने एक मैटीरियल सी एलिगेंस roundworm की त्वचा के लिए सटीक यांत्रिक बलों को लागू करने के लिए, जबकि ऑप्टिकल इमेजिंग द्वारा अपने आंतरिक ऊतकों की विकृति को पढ़ने के लिए सक्षम बनाता है । अच्छी तरह से परिभाषित यांत्रिक उत्तेजनाओं पेश करने के अलावा, कैल्शियम यात्रियों mechanoreceptor न्यूरॉन्स में उपसेलुलर संकल्प के साथ दर्ज किया जा सकता है और रूपात्मक और संरचनात्मक सुविधाओं के साथ संबंधित. उपकरण एक केंद्रीय फँसाने चैनल है कि एक ही जानवर रखती है और छह वायवीय actuation चैनलों के बगल में अपनी त्वचा प्रस्तुत करता है (चित्रा 1 और चित्रा 2) के होते हैं । छह चैनल कीड़ा छह TRNs में से प्रत्येक के लिए यांत्रिक उत्तेजनाओं देने के लिए ट्रैपिंग चैनल के साथ तैनात हैं । ये चैनल पतला PDMS डायाफ्राम, जो एक बाहरी हवा के दबाव स्रोत (चित्रा 1) द्वारा संचालित किया जा सकता द्वारा ट्रैपिंग चैंबर से अलग कर रहे हैं. हम दबाव और इस लेख में माप प्रदान करने के लिए संबंध के साथ झुकाव पर तुले हुए हैं । प्रत्येक गति व्यक्तिगत रूप से संबोधित किया जा सकता है और पसंद की एक mechanoreceptor को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया । दबाव एक पीजो चालित दबाव पंप का उपयोग कर दिया है, लेकिन किसी भी वैकल्पिक उपकरण इस्तेमाल किया जा सकता है । हम बताते हैं कि दबाव प्रोटोकॉल TRNs vivo में सक्रिय करने और वयस्क C. एलिगेंसकरने के लिए यांत्रिक उत्तेजनाओं देने, उपकरणों में वयस्क जानवरों लोड करने के लिए उपयुक्त ऑपरेटिंग उपकरणों का प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, कैल्शियम इमेजिंग प्रदर्शन प्रयोगों, और परिणामों का विश्लेषण । उपकरण निर्माण के दो मुख्य कदम होते हैं: 1) photolithography SU-8 से एक मोल्ड बनाने के लिए; और 2) मोल्डिंग PDMS एक डिवाइस बनाने के लिए । संक्षिप्तता और स्पष्टता के लिए, पाठकों को पहले प्रकाशित लेख और प्रोटोकॉल24,25 के लिए कैसे मोल्ड और उपकरणों के उत्पादन पर निर्देशों के लिए भेजा जाता है ।

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Protocol

1. डिवाइस निर्माण

  1. अनुलग्न मास्क फ़ाइल (पूरक फ़ाइल 1) डाउनलोड करें और एक व्यावसायिक सेवा या घर में सुविधा का उपयोग करके chrome मास्क बनाएं । डिवाइस पर सबसे छोटा आयाम के रूप में 10 µm (गति झिल्ली मोटाई) है, सुनिश्चित करें कि मुखौटा पर्याप्त उच्च संकल्प है, ± ०.२५ µm के भीतर, मज़बूती से सुविधाओं का उत्पादन करने के लिए.
  2. मानक SU-8 photolithography विधियों का पालन करें (उदा., संदर्भ24,25,26) PDMS उपकरणों के बाद के उत्पादन के लिए मोल्ड बनाना; चरणों का सारांश नीचे सूचीबद्ध है ।
    नोट: SU-8 एक सहज सामग्री है, जो पराबैंगनी प्रकाश (अधिकतम अवशोषण ~ ३६५ एनएम) के लिए जोखिम पर crosslinks है । नरम सेंकना, एक्सपोजर (यूवी), और पोस्ट-सेंकना के लिए प्रसंस्करण मापदंडों का निर्धारण करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में निर्माता निर्देशों का उपयोग करें ।
    1. जमा SU-८ २००२ पर एक सिलिकॉन वेफर और स्पिन-कोट यह 2 µm की एक अनुमानित मोटाई के लिए, छोटे संरचनाओं के बेहतर आसंजन के लिए । नरम-९५ ° c पर 1 मिनट के लिए एक गर्म थाली पर सेंकना, थोड़ा अधिक बेनकाब (यूवी) पूरी सतह (~ १०० माइकल/cm2), और 2 मिनट के लिए एक गर्म थाली पर पोस्ट-सेंकना ९५ ° c ।
    2. स्पिन-कोट एक ४७-µm की मोटी परत एसयू-८ २०५० डिवाइस सुविधाओं को परिभाषित करने के लिए । 15 एस के लिए ५०० rpm की एक स्पिन गति का प्रयोग करें (१३० rpm/एस त्वरण) और फिर ९० s के लिए २,००० rpm (२६० rpm/एस त्वरण) । यदि आवश्यक हो, दोहराने और photoresist की उचित मोटाई प्राप्त करने के लिए स्पिन की गति को समायोजित करें ।
    3. नरम-६५ डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए एक गर्म थाली पर सेंकना, और फिर ९५ डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए । निर्माता के निर्देशों के अनुसार photoresist बेनकाब (~ १६०/cm2) एक क्रोम मास्क और लंबे समय से गुजारें फिल्टर का उपयोग सीधे पक्ष की दीवारों को सुनिश्चित करने के लिए ।
    4. ६५ डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए एक गर्म थाली पर वेफर और पोस्ट-सेंकना निकालें, और ९५ डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए ।
    5. डेवलपर के साथ उजागर सु-8 भंग, और 2-propanol के साथ साफ.
    6. photoresist सुविधाओं को स्थिर करने के लिए 30 मिनट (हार्ड सेंकना) के लिए १८० डिग्री सेल्सियस पर एक चूल्हा पर वेफर बनाओ ।
  3. मानक प्रतिकृति मोल्डिंग विधियां27का उपयोग कर SU-8 मॉडल से एक PDMS प्रतिकृति बनाएं ।
    1. PDMS आसंजन (silanization) को कम करने के लिए trichloromethylsilane (TCMS) वाष्प के साथ एसयू-8 मोल्ड का इलाज करें ।
      सावधानी: TCMS विषाक्त और जल-प्रतिक्रियाशील है ।
      1. प्लेस एक वेफर रैक में एक बेल-जार वैक्यूम desiccator भीतर एक धुएं डाकू पानी या पानी में घुलनशील रिएजेंट के मुक्त में patterned वेफर ।
      2. हुड के तहत, एक ड्रॉपर का उपयोग करने के लिए एक गिलास पकवान और desiccator के अंदर जगह TCMS की 1 बूंद लागू होते हैं ।
      3. desiccator ढक्कन बंद करो और TCMS भाप की अनुमति के लिए ंयूनतम 20 मिनट के लिए वेफर कोट ।
      4. भड़ास निकाली और फिर desiccator को सलाम । बेल जार ढक्कन खोलें और प्लास्टिक चिमटी का उपयोग कर वेफर को हटा दें । PDMS प्रतिकृति मोल्डिंग के लिए एक पेट्री डिश या एल्यूमीनियम पंनी नाव में जगह है । उचित खतरनाक अपशिष्ट में TCMS-लेपित सामग्रियों का निपटान ।
    2. मिश्रण PDMS (10:1 का अनुपात) का उपयोग कर ४० ग्राम के आधार बहुलक और 4 जी PDMS इलाज एजेंट.
    3. SU-8 मोल्ड पर मिश्रण डालो और एक निर्वात चैंबर में कम से कम 30 मिनट के लिए मिश्रण degas ।
    4. एक ओवन में ७० डिग्री सेल्सियस से कम 6 घंटे के लिए इलाज ।
  4. एक सपाट सतह पर वेफर क्षैतिज की स्थापना और ध्यान से PDMS बंद छीलने से वेफर PDMS लिफ्ट । इस कदम के दौरान वेफर ऊपर की ओर झुकना मत करो, के रूप में यह मोल्ड तोड़ सकते हैं ।
    नोट: एसयू-8 के अपूर्ण आसंजन या अपूर्ण silanization को इस चरण के दौरान एसयू-8 संरचनाओं के विनाश में परिणाम कर सकते हैं ।
  5. इस तरह के उपकरणों एक 24 मिमी x ६० mm coverslip पर फिट होगा कि व्यक्तिगत चिप्स में उपकरणों के आसपास कट PDMS ।
  6. एक 1-mm बायोप्सी पंच का प्रयोग, प्रवेश, दो दुकानों में छेद करते हैं, और छह एक 1-mm बायोप्सी पंच का उपयोग कर प्रेरक । डिवाइस के किनारों के आसपास 2 मिमी व्यास हलकों के लिए निशाना लगाओ ।
  7. बांड PDMS चिप्स ग्लास कवर फिसल जाता है ।
    1. बेनकाब दोनों सतहों को ८० W ऑक्सीजन प्लाज्मा (30 एस) ।
    2. धीरे एक अनुरूप मुहर के लिए कवर पर्ची के उजागर सतह पर उजागर PDMS सतह जगह है ।
    3. एक गर्म प्लेट (१०० डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) पर डिवाइस एनएन ।
      नोट: अपर्याप्त संबंध रिसाव के कारण डिवाइस की विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

2. माइक्रोस्कोप की तैयारी

नोट: ट्रांसजेनिक पशु: ब्याज (उदा., TRN) के ंयूरॉन (ओं) में GCaMP6s28 या अंय आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग गतिविधि जांच के रूप में एक कैल्शियम संकेतक व्यक्त; co-एक्सप्रेस एक गतिविधि-स्वतंत्र फ्लोरोसेंट एक अलग तरंग दैर्ध्य में उत्सर्जक छोटे पार्श्व और बाहर के लिए सही आंदोलन कलाकृतियों कि यांत्रिक उत्तेजना के कारण उत्पंन करने के लिए ठीक है । स्वचालित विश्लेषण सॉफ्टवेयर पटरियों और गतिविधि जांच की तीव्रता में आंदोलन प्रेरित परिवर्तन के लिए क्षतिपूर्ति । कीड़ा उपभेदों GN69223 (या AQ323629) एक्सप्रेस GCaMP6s (या GCaMP6m) और tagRFP-7 मोटर के नियंत्रण के तहत कैल्शियम स्वतंत्र mec । इसके अतिरिक्त, GN692 उत्परिवर्तन लाइट-1 (ce314)है, जो ब्लू लाइट सेंसर लाइट-1के उत्तेजना के दौरान30 GCaMP6s प्रतिदीप्ति23के कारण TRNs के सक्रियकरण रोकता है ।

  1. GCaMP और आरएफपी के एक साथ उत्तेजना के लिए एक माइक्रोस्कोप प्रणाली की स्थापना की ।
    1. या तो एक सतत प्रकाश स्रोत और एक दोहरी बैंड उत्तेजना फिल्टर है कि केवल सियान और पीले प्रकाश पहुंचाता का उपयोग करें, या एक साथ सियान (०.७७ मेगावाट) और पीले (१.२१ मेगावाट) के लिए नेतृत्व उत्तेजना स्रोतों के रूप में एक परिभाषित बैंडविड्थ में केवल तरंग दैर्ध्य का उत्सर्जन करता है कि एक प्रकाश स्रोत का उपयोग कैल्शियम के साथ-साथ उत्तेजना के आश्रित और स्वतंत्र प्रतिदीप्ति क्रमशः ।
    2. एक डिजिटल कैमरा का प्रयोग करें माइक्रोस्कोपी छवियों की रिकॉर्डिंग सक्षम करने के लिए ।
      नोट: अधिकांश कैमरों छवि अधिग्रहण के लिए एक सॉफ्टवेयर के साथ आते हैं । वैकल्पिक रूप से, वहां स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर है कि कैमरे और संभवतः भी सूक्ष्म प्रणाली के अंय भागों को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    3. उत्तेजना तीव्रता प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर कैमरा संतृप्ति से बचने के लिए समायोजित करें ।
  2. एक प्रतिदीप्ति घन का प्रयोग करें कि उत्तेजना स्रोत के विकल्प के आधार पर एक उत्तेजना फिल्टर से सुसज्जित किया जाना चाहिए ।
    नोट: एक ४८८-एनएम GFP और ५८०-एनएम mCherry उत्तेजना फिल्टर यहां इस्तेमाल किया गया था ।
    1. सियान और पीले प्रकाश को दर्शाती है और हरे और लाल प्रकाश संचारण के लिए घन के लिए एक बीम अलगानेवाला जोड़ें ।
    2. नमूना पर उत्तेजना प्रकाश ध्यान केंद्रित करने के लिए एक 10x उद्देश्य और एक उच्च आवर्धन उद्देश्य के साथ माइक्रोस्कोप लैस (उदा., 63X/1.32 ना तेल).
  3. GCaMP और कैल्शियम-स्वतंत्र संकेत के एक साथ रिकॉर्डिंग के लिए कैमरे के सामने एक बीम अलगानेवाला माउंट । सुनिश्चित करें कि बीम अलगानेवाला एक dichroic दर्पण है (लंबे पास, कट-५७० एनएम पर बंद) हरे रंग के लिए एक उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग हरी और लाल बत्ती अलग करने के लिए (५० एनएम चौड़ाई के साथ ५२५ एनएम पर केंद्रित passband) और लाल बत्ती के लिए एक उत्सर्जन फिल्टर (passband ६० एनएम के साथ ६३२ एनएम पर केंद्रित चौड़ाई) ।
  4. परियोजना हरे और लाल प्रतिदीप्ति ऊपरी आधे पर (हरा) और निचले आधे (लाल), क्रमशः कैमरा चिप ( चित्रा 3देखें). यह ओरिएंटेशन प्रदान किए गए विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के लिए एक पूर्वावश्यकता है ।

3. पशु तैयारी

  1. Porta-de-la-रिवा एट अल द्वारा पहले बताए गए अनुसार आयु-सिंक्रनाइज़्ड युवा वयस्क या वयस्क दिन एक C. एलिगेंसतैयार करें । 31
  2. microfluidic चिप तैयार करें ।
    1. गुरुत्वाकर्षण प्रवाह जलाशय (~ ६० सेमी ऊपर चिप स्तर) फ़िल्टर युक्त (०.२-µm polyethersulfone सिरिंज फिल्टर) M9 बफर चिप के एक आउटलेट के लिए कनेक्ट करें । एक दो आउटलेट अपशिष्ट कंटेनर, यानी, एक फिल्टर कुप्पी के एक आउटलेट के लिए अन्य आउटलेट कनेक्ट. एक सिकुड़नेवाला पंप करने के लिए अपशिष्ट कंटेनर के अंय आउटलेट से कनेक्ट करें ।
      नोट: सभी कनेक्शन के लिए पॉलीथीन (पीई) टयूबिंग का उपयोग करें और चिप के लिए पीई टयूबिंग कनेक्ट करने के लिए धातु ट्यूब फिटिंग का उपयोग करें । इस तरह सभी अपशिष्ट समाधान चिप से बाहर निकाल दिया जाएगा और अपशिष्ट कंटेनर में एकत्र की । आउटलेट चैनलों के माध्यम से प्रवाह एक सौंय सक्शन कि बाद में फँसाने की प्रक्रिया के दौरान सुखद कीड़ा रखना होगा बनाता है ।
    2. दोनों सिरों पर धातु टयूबिंग (गेज आकार 23TW, ०.६३५ मिमी आयुध डिपो) के साथ ५० मिमी लंबे पीई टयूबिंग (०.९६५२ मिमी आयुध डिपो, ०.५८४२-mm आईडी) से मिलकर एक तैयार करें । प्रेस-फिट इन छह actuation उंगलियों में से प्रत्येक में और कीड़ा प्रवेश में जोड़ता है ( चित्रा 1देखें) । चिप में इन संयोजीओं छोड़, दोहराया हटाने के रूप में PDMS छेद पर पहनने की ओर जाता है ।
  3. माइक्रोस्कोप पर चिप लगाएं । 2 उठाओ-(०.२-µm सिरिंज फ़िल्टर) M9 बफर फ़िल्टर की एक बूंद में 5 कीड़े और एक 1-एमएल सिरिंज का उपयोग करने के लिए उंहें एक पीई ट्यूबिंग में आकर्षित (०.९६५२ मिमी आयुध डिपो, ०.५८४२ मिमी आईडी) एक 1 एमएल सिरिंज से जुड़ा गोताख़ोर धीरे खींच कर । पीई ट्यूब में जानवरों और सिरिंज में नहीं रखें ।
    नोट: बहुत सारे कीड़े या फ़िल्टर्ड समाधान चिप में कॉलेस्ट्रॉल के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
  4. कीड़ा प्रवेश (चित्रा 1 और चिप के चित्र 2) पर आपस में करने के लिए सिरिंज के पीई टयूबिंग कनेक्ट । वाल्व खोलने और सिकुड़नेवाला पंप शुरू करके गुरुत्वाकर्षण प्रवाह को सक्रिय करें । फिर धीरे brightfield मोड में एक 10x लेंस के साथ एक खुर्दबीन के नीचे चैनल देख जबकि ट्रैपिंग चैनल में जानवरों को स्थानांतरित करने के लिए सिरिंज के सिरिंज गोताख़ोर दबाएँ.
    नोट: कभी-कभार दिखने वाले हवा के बुलबुले एक समस्या पैदा नहीं करते; वे आम तौर पर आउटलेट में स्वचालित रूप से चले जाते हैं । कई जानवरों ' वेटिंग चैंबर में खड़ी ' किया जा सकता है और क्रमिक रूप से इस्तेमाल किया ।
    1. ट्रैपिंग चैनल में जानवर लोड करने के बाद ( यह भी चित्र 2देखें), धीरे धक्का या सिरिंज के गोताख़ोर खींच द्वारा अपनी स्थिति को समायोजित करने के लिए चैनल के सामने के पतला आकार में जानवर के सिर की स्थिति ।
    2. सुनिश्चित करें कि कीड़ा (वयस्क दिन 1) सही आकार के लिए चिप में फंस सकता है ।
      1. यदि कीड़ा पूरी पार नहीं नाक से चैनल के अनुभाग के शरीर के अंत के पास (पूंछ की नोक सहित नहीं) या गोताख़ोर सिरिंज के बिना चैनल की धुरी के साथ ले जाने के लिए कीड़ा के साथ , यह ट्रैपिंग चैनल से गायब हो जाता है और एक नया एक लोड (चरण ३.८ देखें) जब तक सिरिंज के गोताख़ोर दबाकर कीड़ा निकालें.
    3. माइक्रोस्कोप और एक उच्च आवर्धन लेंस के प्रतिदीप्ति मोड में स्विच करें (40X या उच्चतर) और जांच करें कि क्या ब्याज के ंयूरॉन के neurite के एक डायाफ्राम के पार झूठ करने के लिए आता है । यदि नहीं, खींच या गोताख़ोर धक्का द्वारा पशु की स्थिति को समायोजित करें । अगर वह मदद नहीं करता है, कीड़ा निकालें और एक नया लोड ।
  5. ब्याज के न्यूरॉन के सेल शरीर पर ध्यान केंद्रित करने और पीई टयूबिंग का उपयोग कर एक प्रोग्राम दबाव पंप करने के लिए सेल शरीर के पूर्वकाल ओर ंयूरॉन करने के लिए निकटतम प्रेरक की आपस में कनेक्ट ।
    1. यदि प्रयोग के बीच दूरी को मापने की आवश्यकता है और ंयूरॉन, देखने के क्षेत्र में कदम तो दोनों को देखने के क्षेत्र में है और channelwall छवि के ऊपरी और निचले किनारे के समानांतर है ।
  6. प्रोग्राम दबाव पंप का उपयोग कर एक दबाव प्रोटोकॉल को परिभाषित करें ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल वांछित प्रयोग करने के लिए समायोजित किया जा सकता है ।
    1. एक समय के लिए संगत 0 केपीए के एक निरंतर दबाव के साथ शुरू करने के लिए इसी छवि अनुक्रम के कम से ५० छवियों (सामान्य के लिए आवश्यक). के लिए एक इमेजिंग दर 10 हर्ट्ज के लिए यह संगत 5 s. एक वांछित उत्तेजना तरंग और दबाव जोड़ें और एक दूसरे कदम के रूप में उत्तेजना की लंबाई को परिभाषित.
      नोट: TRNs, (यानी, ७५ केपीए, 10 हर्ट्ज) एक कदम (यानी, २७५ केपीए) के साथ आरोपित के एक sinusoidal तरंग उत्तेजक के लिए के रूप में यह एक बड़ी न्यूरॉन की प्रतिक्रिया उत्पन्न करता है की सिफारिश की है.
    2. अगर प्रयोग में अतिरिक्त उत्तेजनाओं की आवश्यकता होती है, तो कम से 10 एस की अवधि में 0 केपीए के लगातार दबाव के बीच उत्तेजनाओं को शामिल करें । पर दबाव पंप स्विचन से पहले, सुनिश्चित करें कि साधन दबाव लगातार 0 केपीए पर है करने के लिए वास्तविक प्रयोग से पहले कीड़ा की आकस्मिक उत्तेजना से बचने के ।
  7. इमेजिंग और दबाव प्रोटोकॉल चलाएँ ।
    1. कैमरे की छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, 10 हर्ट्ज पर एक छवि अनुक्रम सेट अप दबाव प्रोटोकॉल की अवधि के लिए १०० ms के एक जोखिम समय का उपयोग कर । उत्तेजना तीव्रता ऐसी है कि अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति वृद्धि कैमरे संतृप्त नहीं है समायोजित करें । सामांय के लिए पहली उत्तेजना से पहले कम से ५० छवियों के साथ एक *. tif फ़ाइल के रूप में छवियों को बचाओ ।
    2. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और प्रोग्राम पंप के सॉफ्टवेयर में दबाव प्रोटोकॉल में इमेजिंग प्रोटोकॉल शुरू करो । रिकॉर्डिंग के दौरान, निरीक्षण करें कि क्या ब्याज का ंयूरॉन 10 x 10 पिक्सेल के किसी क्षेत्र में सबसे उज्जवल स्थान है, अनुक्रमिक छवियों में 10 पिक्सेल से आगे कदम नहीं है, और रिकॉर्डिंग के दौरान देखने के क्षेत्र में रहता है ।
      नोट: यदि यह नहीं किया जाता है, तो विश्लेषण सॉफ़्टवेयर विफल हो जाएगा । उज्ज्वल धब्बे (यानी, autofluorescence) के चारों ओर न्यूरॉन्स मुश्किल न्यूरॉन्स की साफ रिकॉर्डिंग करते हैं. इसे सही करने के लिए, जाल से कीड़ा निकालें और चिप में एक नया कीड़ा लोड । अगर कीड़ा बहुत ज्यादा चलता है, एक ही कीड़ा की एक नई रिकॉर्डिंग की कोशिश करो और कीड़ा गति का निरीक्षण । यदि समस्या बनी रहती है तो कीड़ा फंस जाने के लिए बहुत छोटा हो सकता है । इस मामले में इस कीड़ा निकालें और जाल में एक थोड़ा बड़ा कीड़ा लोड ।
    3. यदि वांछित, एक साथ देखने के क्षेत्र में कई ंयूरॉंस से रिकॉर्ड संकेतों के रूप में लंबे समय के रूप में न्यूरॉन्स के रूप में कम से अलग कर रहे है पूरी रिकॉर्डिंग के दौरान 10 पिक्सल ।
    4. आदी होना की जांच करने के लिए, एक जानवर पर दोहराया प्रयोग प्रदर्शन करते हैं ।
  8. ट्रैपिंग चैनल से कीड़ा निकालें ।
    1. यदि इसके बाद के अध्ययनों के लिए कीड़ा रखने के लिए वांछित है, गुरुत्वाकर्षण प्रवाह और अपशिष्ट कंटेनर की ओर चिप के आउटलेट को डिस्कनेक्ट कर दें । पूरे कीड़ा प्रवाह चैनल में ट्रैपिंग चैनल के माध्यम से धक्का दिया है जब तक धीरे सिरिंज के गोताख़ोर दबाएँ.
    2. सिरिंज गोताख़ोर दबाकर जारी रखें जब तक जानवर चिप के बाहर एक छोटी बूंद में प्रकट होता है । कीड़ा प्रवेश से पीई टयूबिंग सहित सिरिंज डिस्कनेक्ट, यह छोटी बूंद में कीड़े महाप्राण और एक आगर प्लेट पर स्थानांतरण करने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं ।
    3. यदि यह कीड़ा रखने के लिए वांछित नहीं है, तब तक सिरिंज के गोताख़ोर दबाकर इल्ली को निकाल दें जब तक कि संपूर्ण कृमि प्रवाह चैनल में ट्रैपिंग चैनल के माध्यम से धकेल दिया जाता है; गुरुत्वाकर्षण प्रवाह और सिकुड़नेवाला पंप के सक्शन के पशु चिप से बाहर ले जाएगा और अपशिष्ट कंटेनर में ।

4. विश्लेषण

  1. नवीनतम फ़िजी का संस्करण३२डाउनलोड और स्थापित करें ।
  2. डाउनलोड करें और नवीनतम जावा SDK संस्करण स्थापित करें ।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो हटाएँ या नए स्थापित जावा कंपाइलर का उपयोग करने के लिए फिजी फ़ोल्डर के अंदर जावा फ़ोल्डर का नाम बदलें ।
  3. फिजी सॉफ़्टवेयर खोलें ।
    1. जांच करें कि क्या सॉफ्टवेयर ' खोलने Plugins द्वारा नव स्थापित जावा संकलक चल रहा है । उपयोगिताएं । ImageJ | गुण ' ।
  4. pokinganalyzer*. java फ़ाइल (https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer, अनुपूरक फ़ाइल 2) डाउनलोड करें ।
  5. खींचें और एक प्लगइन के रूप में खोलने के लिए सॉफ्टवेयर विंडो में. java फ़ाइल ड्रॉप.
  6. संकलित करें और फिजी में Ctrl + R कुंजी दबाकर pokinganalyzer*. java फ़ाइल चलाएँ; ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस (Poking विश्लेषक) खुलेगा (चित्र 3) ।
    1. "मदद" टैब पर क्लिक करें और सॉफ्टवेयर की आवश्यकताओं के बारे में पढ़ा है और कैसे विश्लेषण करने के लिए । आरंभ करने के लिए, "वीडियो खोलें" टैब का चयन करें. विश्लेषक के लिए वीडियो फ़ाइल स्थान निर्दिष्ट करें: "एक वीडियो खोलें" बटन पर क्लिक करके, वीडियो के स्थान पर नेविगेट करके उसे खोलें.
      नोट: सॉफ़्टवेयर इस टैब के साथ प्रारंभ होता है खोला । यदि यह खुला नहीं है जब एक नया विश्लेषण शुरू "वीडियो खोलें" टैब पर क्लिक करें । यदि वीडियो. tif स्वरूप में है, तो प्रोग्राम आंतरिक रूप से वीडियो खोलेगा और इंटरफ़ेस के निचले भाग में पहली छवि प्रदर्शित करेगा । यदि छवि वीडियो की जरूरत है कि विश्लेषण किया जा करने के लिए नहीं है, "एक वीडियो खोलने के लिए" एक और वीडियो खोलने के लिए बटन पर क्लिक करें.
    2. जारी रखने के लिए, "परिभाषित ROIs" टैब पर क्लिक करें । इस टैब में, TRN की स्थिति निर्धारित करें । ध्यान दें कि खोला वीडियो की पहली छवि इस टैब के निचले भाग में प्रदर्शित किया जाता है. "परिभाषित TRN" बटन पर क्लिक करें, और प्रदर्शित छवि है जो GCaMP प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करना चाहिए के ऊपरी भाग में ंयूरॉन पर क्लिक करें ।
    3. वैकल्पिक: यदि प्रेरक छवि कार्यक्रम के ऊपरी आधे में दिख रहा है स्वचालित रूप से ंयूरॉन और अगर वांछित के बीच की दूरी को ट्रैक कर सकते हैं । इस के लिए, जांच "परिभाषित करने के लिए? -बॉक्स, "परिभाषित गति" बटन पर क्लिक करें, और छवि के ऊपरी आधे में प्रेरक पर क्लिक करें ।
    4. "विश्लेषण" टैब पर क्लिक करें छवि अधिग्रहण दर को परिभाषित । या तो संख्या को बढ़ाने या घटाने के लिए फ़ील्ड में कोई संख्या दर्ज करें या ऊपर या नीचे बटंस क्लिक करें । पिछले टैब में अगर "को परिभाषित करने के लिए? -बॉक्स की जाँच की है, कैमरा सेल आकार, बढ़ाई, और बिन्नी कारक को परिभाषित, तो कार्यक्रम दूरी की गणना कर सकते हैं.
    5. "प्रारंभ विश्लेषण" बटन पर क्लिक करें ।
      नोट: कार्यक्रम अब ऊपरी छमाही में छवि अनुक्रम में अपने प्रतिदीप्ति द्वारा ंयूरॉन ट्रैक (कैल्शियम निर्भर) और कम आधे में (कैल्शियम स्वतंत्र छवि अनुक्रम के) होगा । कार्यक्रम की रिकॉर्डिंग के विमान में ंयूरॉन गति के लिए खाते में 10 x 10 पिक्सेल के स्थान के आसपास के एक क्षेत्र की जांच करेंगे पिछले छवि में ंयूरॉन की स्थिति को खोजने के लिए निंनलिखित छवि में । यह दोनों हिस्सों में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (एफबीजी) और पहले ५० छवियों (एफ0) में प्रतिदीप्ति द्वारा विभाजन के लिए सही द्वारा प्रतिदीप्ति की गणना करेगा:
      Equation 1
      प्रतिदीप्ति हरे, गतिविधि पर निर्भर चैनल में परिवर्तन (चCa2 +) है कि ंयूरॉन के विमान से बाहर reकोडिंग के कारण होते है तो लाल, गतिविधि-स्वतंत्र चैनल में प्रतिदीप्ति का उपयोग कर सही (एफ corr) और कैल्शियम के पूर्व उत्तेजना मानक विचलन-निर्भर (एसडीसीए2 +) और स्वतंत्र प्रतिदीप्ति (एसडीcorr) द्वारा:
      Equation 2
    6. कार्यक्रम अंतरफलक के निचले हिस्से में स्थिति पट्टी में अपनी प्रगति दिखाएगा; जब स्थिति पट्टी १००% तक पहुंच जाती है, तो "परिणाम" टैब पर क्लिक करें । यदि स्थिति पट्टी १००% से पहले बंद कर देता है, तो प्रोग्राम वीडियो का विश्लेषण नहीं कर सका कारण इंगित करते हुए एक त्रुटि संदेश देगा ।
      1. शोर अनुपात करने के लिए संकेत बहुत कम है, तो प्रोग्राम ंयूरॉन की पहचान नहीं कर सकते; क्रमिक रिकॉर्डिंग में इमेजिंग पैरामीटर्स को समायोजित करें ।
      2. यदि ंयूरॉन रिकॉर्डिंग के दौरान देखने के क्षेत्र में छोड़ देता है, प्रोग्राम अब और ट्रैक नहीं कर सकते है और बंद हो जाएगा । बाद की रिकॉर्डिंग के लिए, ंयूरॉन रिकॉर्डिंग की शुरुआत में देखने के क्षेत्र के बीच में जगह है ।
      3. यदि दृश्य के क्षेत्र में कुछ क्षेत्र अधिक संतृप्त हैं, तो स्वचालित विश्लेषण अमांय परिणाम देगा । बाद की रिकॉर्डिंग के लिए, सुनिश्चित करें कि प्रतिदीप्ति संकेत कैमरा सेंसर संतृप्त नहीं है ।
    7. ' परिणाम ' टैब में, परिणाम ऊपरी भाग में प्रदर्शित किया जाता है । "परिणाम तालिका सहेजें" पर क्लिक करके परिणाम तालिका के किसी टैब-पृथक *. txt फ़ाइल सहेजें ।
      नोट: यह तालिका सेकंड और सामान्यीकृत कैल्शियम-निर्भर प्रतिदीप्ति (कैल्शियम-स्वतंत्र प्रतिदीप्ति द्वारा सही) में समय के होते हैं । यदि पहले से परिभाषित, यह भी TRN और µm में प्रेरक और TRN और µm में चैनल की दीवार को सीधा के बीच की दूरी के बीच कुल दूरी शामिल हैं । प्रतिनिधि के परिणाम प्रतिदीप्ति तीव्रता वृद्धि के बाद सेल शरीर की दूरी के निकटतम को गति देने बनाम उत्तेजना चित्रा 4में रची जाती है ।
    8. यदि एक रिकॉर्डिंग में एकाधिक ंयूरॉंस रहे है (10 से अधिक पिक्सल से अलग), "परिभाषित ROIs" टैब पर फिर से क्लिक करें और दूसरा ंयूरॉन के साथ 4.6.2 कदम पर लौटें ।

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Representative Results

एसयू-8 लिथोग्राफी और चिप बॉन्डिंग
लिथोग्राफी प्रोटोकॉल और PDMS मोल्डिंग मानक प्रक्रियाओं का पालन करें । विवरण23,24,25,26कहीं और पाया जा सकता है । PDMS इलाज के बाद समस्याओं के बिना वेफर बंद छील चाहिए । su-8 सुविधाओं PDMS छीलने के दौरान बंद चीर, तो एसयू-8 आसंजन परत या silanization अपर्याप्त था । यदि प्लाज्मा-कांच coverslips और PDMS चिप्स के सक्रियकरण पर्याप्त नहीं है, कमजोर संबंध फंसाने चैनल या वायवीय प्रदर्शन क्षरण और उत्तेजना के अभाव में जिसके परिणामस्वरूप से बाहर रिसाव में परिणाम कर सकते हैं । यदि द्रव रिसाव स्पष्ट है, चिप अनुपयोगी है ।

प्रदर्शन को गति देनेवाला
PDMS के सभी प्रेरक और हवा जलाशय के लिए चिप को जोड़ने ट्यूबिंग ठीक से डायाफ्राम की वायवीय actuation सुनिश्चित करने के लिए बंद होना चाहिए । दोहराया प्रविष्टि और पीई टयूबिंग हटाने (नलसाजी) PDMS छेद को नुकसान और दबाव में कमी के लिए नेतृत्व करेंगे । दबाव के इस तरह के एक नुकसान को गति देने के विक्षेपन सीमा और बल मैटीरियल पशु की त्वचा के लिए लागू होगा । डायाफ्राम के विक्षेपन वांछित दबाव के साथ कई actuation चक्र प्रदर्शन और सैद्धांतिक भविष्यवाणियों के साथ मात्रात्मक मूल्यों की तुलना करके एक खाली चिप (कोई जानवर मौजूद) का उपयोग कर मापा जा सकता है । डायाफ्राम के झुकाव को ट्रैपिंग चैनल में एक जानवर की उपस्थिति में मापा नहीं गया था, क्योंकि झिल्ली और कीड़ा सीमा कल्पना करना मुश्किल है । यह संभव नहीं एक फंस जानवर के साथ परिशुद्धता अंशांकन बनाता है । तालिका 1 दबाव के एक समारोह के रूप में अपेक्षित झुकाव को सूचीबद्ध करता है । इन मूल्यों की गणना लोचदार प्लेट सिद्धांत का उपयोग कर रहे थे और विवरण Nekimken एट अल में पाया जा सकता है । 23 इस रिश्ते को डायाफ्राम चिप कास्टिंग और चिप और कांच और दबाव स्रोतों के लिए चिप को जोड़ने के जवानों के बीच संबंध की अखंडता के रूप में अंय कारकों के दौरान उत्पंन मोटाई में अंतर के साथ भिंन होने की उंमीद है । यहां, मूल्यों के दबाव के ४५० केपीए पर 1 µm से अधिक नहीं मामूली भिंनता के साथ reproducible थे । हम सभी तीन अलग उत्तेजना प्रोफाइल के लिए डायाफ्राम के प्रदर्शन की विशेषता है और Nekimken एट अलकरने के लिए इच्छुक पाठक का उल्लेख है । 23 संक्षेप में, वहां कई कारकों पर विचार कर रहे है अगर मूल्यों 1 तालिकासे विचलित: 1) टयूबिंग या टयूबिंग connectors में एक रिसाव, 2) PDMS एक अलग लोच है, जो आधार बहुलक और इलाज एजेंट का एक वैकल्पिक अनुपात से परिणाम कर सकते हैं, या 3) PDMS वृद्ध है और समय के साथ crosslink जारी रखा । इसलिए, चिप्स जो अपने आवेदन के एक महीने के भीतर तैयार किया गया है का उपयोग की सिफारिश की है ।

ट्रैपिंग प्रदर्शन
चिप के प्रवेश में कीड़े डालने के बाद, सिरिंज के साथ एक कोमल दबाव ट्रैपिंग चैनल के अंदर एक ही जानवर जगह चाहिए और छह के साथ अपनी त्वचा मौजूद (चित्रा 1) । महत्वपूर्ण बात यह है कि पशुओं की नाक को बफर जलाशय में बहर लगाने की जरूरत नहीं पड़ती । इसके बजाय, यह और अधिक महत्वपूर्ण है कि पशु की स्थिति के लिए इस तरह की है कि neurite निकटतम के निकट गति देनेवाला है और उसके सेल शरीर माइक्रोस्कोप के दृष्टिकोण के क्षेत्र में है । इष्टतम ंयूरॉन सक्रियण प्राप्त करने के लिए, और सेल शरीर के बीच की दूरी समायोजित किया जाना चाहिए कि इस तरह के प्रेरक सेल के शरीर के लिए पूर्वकाल निहित है ब्याज की । हमारे अनुभव में, न्यूरॉन्स कोशिका शरीर के पीछे उत्तेजित के लिए, कोई सक्रियण जगह ले जाएगा और कैल्शियम यात्रियों अनुपस्थित हो जाएगा. उचित स्थिरीकरण युवा वयस्क या एक दिन पुराने hermaphrodites के साथ प्राप्त किया जा सकता है (इन दो युगों के लिए अनुकूलित उपकरणों एक ही मुखौटा पर उपलब्ध हैं) । छोटे जानवरों संग्रह जलाशय में पर्ची या ट्रैपिंग चैनल के अंदर बाद में ले जाएगा । जानवरों है कि बहुत बड़े है चैनल में निचोड़ा जाएगा, जो इसके TRNs और बाद में mechanoreceptor यात्रियों का पता लगाने के लिए विफलता के समय से पहले सक्रियण में परिणाम हो सकता है । इसके अलावा, बड़े कीड़े को हटाने को चुनौती दे रहा है, पशु की मौत के लिए अग्रणी और/या डिवाइस के कॉलेस्ट्रॉल । इस डिजाइन के साथ, PLM न्यूरॉन आमतौर पर पूरी तरह से मैटीरियल नहीं किया जा सकता है, तो यह बाद में और खड़ी स्थानांतरित करने के लिए स्वतंत्र है. हालांकि हम सफलतापूर्वक PLM न्यूरॉन्स सक्रिय है, इन न्यूरॉन्स में कैल्शियम यात्रियों की रिकॉर्डिंग पूंछ के ऊर्ध्वाधर आंदोलन के कारण मुश्किल है. एक और फँसाने डिजाइन PLM३३से रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।

कैल्शियम यात्रियों और विश्लेषण की इमेजिंग
एक बार जगह में, जानवरों छह प्रेरक में से एक का उपयोग कर उत्तेजित किया जा सकता है । छह प्रेरक छह TRNs में से प्रत्येक के लिए यांत्रिक उत्तेजनाओं देने के लिए तैनात हैं । एक microfluidic प्रवाह नियंत्रक से जुड़े एक ४५०-केपीए घर में दबाव स्रोत के लिए पशु एक प्रोत्साहन एक 2-एस २७५ केपीए कदम से मिलकर प्रोटोकॉल को देने के लिए इस्तेमाल किया गया था, एक 2-s 0-275 केपीए रैंप, और एक 2-s बज़ (एक ७५ केपीए, एक २७५ केपीए कदम के साथ 10 हर्ट्ज साइन आरोपित) , प्रत्येक एक 10-s प्रतीक्षा अवधि के द्वारा अलग । कैल्शियम यात्रियों की एक साथ दर्ज की छवि दृश्यों फिजी में विश्लेषण किया गया, हमारे GitHub खाते पर उपलब्ध एक कस्टम-लिखित सॉफ्टवेयर का उपयोग (ऊपर और https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer देखें) । हमने पाया है कि दबाव रैंप और दबाव कदम TRNs सक्रिय केवल अगर उत्तेजनाओं ४०० केपीए ऊपर दबाव हासिल की । इसके विपरीत, सभी TRNs के एक मजबूत सक्रियण एक sinusoidal का उपयोग करने के लिए प्रेरित किया, 10 हर्ट्ज के दबाव पर चर्चा < २७५ केपीए (चित्रा 4) मनाया गया था । सामांय में, TRNs एक संक्षिप्त sinusoidal उत्तेजना को बेहतर जवाब (कहा जाता है ' ' बज़ '), पिछले विभिंन तरीकों से 1का उपयोग कर रिपोर्ट के साथ समझौते में,9। एक चर्चा के साथ उत्तेजना अत्यधिक कुशल है, के लिए अग्रणी ~ सक्रियण के ९०% सभी ंयूरॉंस और परीक्षण (चित्रा 4) में जांच की । आश्चर्य की बात है, वहां कोई मजबूत सहसंबंध था कि क्या उत्तेजना पृष्ठीय या ventral पक्ष को लागू किया गया था, और सेल शरीर और neurite पर उत्तेजना की स्थिति के बीच की दूरी से स्वतंत्र था । भविष्य के अध्ययन के लिए अधिकतम प्रतिक्रिया की देरी उत्तेजना दूरी के साथ संबद्ध है कि क्या जांच करने के लिए होगा ।

Figure 1
चित्रा 1: चिप डिजाइन का अवलोकन. (एक) photomask के योजनाबद्ध लेआउट और सभी connectors के साथ परिणामस्वरूप चिप संकेत दिया । वहां छह actuation उंगलियों, तीन केंद्रीय ट्रैपिंग चैनल के प्रत्येक पक्ष पर हैं । स्केल बार = 3 मिमी. (ख) coverslip के लिए बंधुआ PDMS के साथ microfluidic डिवाइस की तस्वीर और कीड़ा प्रवेश और कीड़ा दुकानों में टयूबिंग से जुड़ा । actuation अंगुलियों में से केवल एक ही प्रेशर सोर्स से जुड़ा है, जबकि अन्य पांच का कब्जा नहीं है । क्रिएटिव कॉमन लाइसेंस के अंतर्गत संदर्भ से23 के भागों का पुनरुत्पादन किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: केंद्रीय ट्रैपिंग चैनल और ट्रैपिंग प्रक्रिया के बंद-अप. (एक) फंसाने चैनल के योजनाबद्ध ड्राइंग । कीड़ा प्रवेश पक्ष में खंभे को कीड़ा ओरिएंट और पशुओं की लोडिंग की सुविधा मदद करते हैं । actuation उंगलियों दबाव डाला जा सकता है और फंस नमूना में एक पतली डायाफ्राम इंडेंट । स्केल बार = २०० µm. (B) एक वर्म का प्रतिनिधि वीडियो फ़्रेम क्षैतिज चैनल में फंस जा रहा है । चैनल इस तरह बनाया गया है कि कीड़ा छह वायवीय प्रेरक भर में रखना आता है । पूंछ को छोड़ दिया है, सिर को सही है । व्यक्तिगत स्पर्श रिसेप्टर न्यूरॉन्स (TRNs) के स्थान तीर और चित्रा में लेबल द्वारा संकेत कर रहे हैं. स्केल बार = १०० µm (सभी पैनलों में) । क्रिएटिव कॉमन लाइसेंस के अंतर्गत संदर्भ से23 के भागों का पुनरुत्पादन किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: इस प्रोटोकॉल के साथ अधिग्रहीत कैल्शियम निशान का विश्लेषण करने के लिए प्रदान की फिजी प्लगइन का अवलोकन. सॉफ्टवेयर एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस शुरू होता है । उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस का पहला टैब ("खुला वीडियो") एक वीडियो खोलने के लिए बटन दिखाता है, यह पथ और खुले वीडियो के पहले फ्रेम को प्रदर्शित करता है । दूसरा टैब ("परिभाषित ROIs") बटन को एक स्पर्श रिसेप्टर ंयूरॉन, बटन को सक्रिय करने के लिए एक चेकबॉक्स को परिभाषित शामिल है "को परिभाषित करें" और बटन "परिभाषित करने के लिए". निचले भाग में, वीडियो के पहले फ्रेम प्रदर्शित किया जाता है । तीसरे टैब के ऊपरी भाग में ("विश्लेषण"), छवि विश्लेषण के लिए समायोज्य मापदंडों प्रदर्शित कर रहे हैं । मध्य भाग "प्रारंभ विश्लेषण" बटन दिखाता है । निचले भाग में, एक प्रगति पट्टी वर्तमान विश्लेषण की प्रगति को दिखाता है । चौथे टैब में, "परिणाम", परिणाम समय के साथ सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता के ग्राफ के रूप में प्रदर्शित किया जाता है. निचले हिस्से में रिजल्ट टेबल को सेव करने का बटन है । पांचवें टैब में, "मदद", एक मदद पाठ विश्लेषण सॉफ्टवेयर और इसका इस्तेमाल करने के लिए कैसे पर अनुदेश के लिए आवश्यकताओं दिखा प्रदर्शित होता है । चित्र क्रिएटिव कॉमन लाइसेंस के अंतर्गत संदर्भ23 से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: व्यक्तिगत ंयूरॉंस यांत्रिक उत्तेजनाओं का जवाब । (क) प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति micrograph GCamP6s के लेबल एवीएम स्पर्श रिसेप्टर ंयूरॉन पहले और बाद में एक चर्चा के साथ यांत्रिक उत्तेजना । स्केल बार = 10 µm. Color स्केल = 1500-3500 ग्रे मान । (ख) 2 एस डायाफ्राम उत्तेजना एक २७५ केपीए कदम, एक २७५ केपीए रैंप का प्रतिनिधित्व, और एक साइन (७५ केपीए; 10 हर्ट्ज) आरोपित एक २७५ केपीए कदम (बज़) के साथ सहित प्रोत्साहन प्रोटोकॉल । (ग) सामान्यीकृत GCamP6s तीव्रता ट्रेस (अर्थ ± SEM छायांकित क्षेत्र के रूप में) एवीएम से दर्ज जंगली प्रकार जानवरों के बी में दिखाया प्रोफाइल के साथ उत्तेजित (हरा, n = 14) और mechanoreceptor चैनल उपइकाई mec-4 (ब्लू, एन = 10) में जानवरों उत्परिवर्ती, कि है यांत्रिक तनाव के लिए प्रतिक्रियाओं की सुविधा के लिए जाना जाता है । यह यात्रियों लागू यांत्रिक उत्तेजनाओं द्वारा प्रेरित कर रहे हैं कि इंगित करता है. क्रिएटिव कॉमन लाइसेंस के अंतर्गत संदर्भ से23 के भागों का पुनरुत्पादन किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

दाब (केपीए) मतलब विक्षेप (µm) एसडी अपेक्षित विक्षेपन (µm)
0 -०.०१ ०.०१ 0
५० ०.७७ ०.२६ ०.६०७१४३
१०० १.५७ ०.५८ १.२१४२९
१५० २.३२ ०.६५ १.८२१४३
२०० ३.१३ ०.७४ २.४२८५७
२५० ३.८६ ०.७९ ३.०३५७१
३०० ४.६१ ०.७९ ३.६४२८६
३५० ५.३ ०.८२ ४.२५
४०० ५.९२ ०.८२ ४.८५७१४
४५० ६.४३ ०.७५ ५.४६४२९

तालिका 1: लागू किए गए दबाव के लिए अपेक्षित प्रायोगिक विक्षेपन मूल्यों से लेकर 0 – 450 केपीए और उनके सैद्धांतिक पूर्वानुमान. एक कदम उत्तेजना के लिए व्युत्पंन डेटा । मतलब ± एसडी । ये डेटा एक खाली ट्रैपिंग चैनल के साथ अधिग्रहीत किया गया था ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल एक microfluidic चिप में फंस roundworm की त्वचा के लिए सटीक यांत्रिक उत्तेजना देने के लिए एक विधि को दर्शाता है । यह जैविक प्रश्नों का उत्तर देने के लिए शारीरिक उत्तेजनाओं के एकीकरण की सुविधा का उद्देश्य है और जैविक प्रयोगशालाओं में mechanobiology अनुसंधान को कारगर बनाना है । यह विधि पिछले परख बढ़ाता है mechanosensory न्यूरॉन्स के समारोह का आकलन करने के लिए C. एलिगेंसमें । पिछले मात्रात्मक और अर्द्ध मात्रात्मक तकनीक मापा बलों1,३४ और व्यवहार३५, लेकिन ंयूरॉंस गतिविधि के उच्च संकल्प इमेजिंग के साथ एकीकृत करने के लिए मुश्किल थे । हम इस प्रकार का मानना है कि इस चिप का उपयोग वर्तमान अनुप्रयोगों का विस्तार और उसके प्रदर्शन कोमल स्पर्श के लिए आवश्यक ंयूरॉंस की उत्तेजना के लिए अनुकूलित है । हम 5 µm है, जो एक मजबूत पर्याप्त उत्तेजना के लिए लगभग अधिकतम न्यूरॉन प्रतिक्रियाओं तक पहुंचने है तक पहुंचने के लिए प्रक्षेपण अनुकूलित । मामूली बदलाव के साथ, हमें विश्वास है कि इस डिजाइन इस तरह के PVD nociceptors कि शरीर की सतह३६अंदर आना के रूप में कठोर स्पर्श रिसेप्टर्स, उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

संशोधन और समस्या निवारण
यदि एसयू-8 लिथोग्राफी के लिए कोई स्वच्छ कक्ष उपलब्ध नहीं है, तो यूवी लैंप, प्रोग्राम hotplates से सुसज्जित एक benchtop क्लीन बॉक्स या एसयू-8 सॉफ्ट-लिथोग्राफी स्टेशनों का इस्तेमाल किया जा सकता है । स्वच्छ कक्ष सुविधाओं के उपयोग से बचते microfluidic उपकरणों के उत्पादन के लिए एक कम लागत विकल्प भी26का पालन किया जा सकता है ।

डिजाइन में, हमने मौजूदा ट्रैपिंग तकनीक लागू की है, जो एक microfluidic चैनल में एक जानवर को स्थिर कर रही है । जाल डिजाइन एक डिवाइस है कि कीड़ा३६में घ्राण सनसनी अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है से अनुकूलित है, लेकिन यह कीड़ा आंदोलन को दबाने के लिए केवल व्यवहार्य विकल्प नहीं है. अंय रणनीतियों के लिए microfluidic उपकरणों में कीड़े पकड़ रिपोर्ट किया गया है: CO2, electrophoretic, और संपीड़न स्थिरीकरण11,३७,३८ इस्तेमाल किया गया है, और एक संशोधित में एकीकृत किया जा सकता है डिजाइन.

हम actuation एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, piezoelectric दबाव पंप जो नियंत्रण और एक बाहरी दबाव स्रोत से ८०० केपीए तक उद्धार कर सकते है का उपयोग कर चैनलों को दबाव दिया । हम अनुसंधान के निर्माण में संपीड़ित हवा के लिए पंप जुड़ा है, जो ~ ४५० केपीए पहुंचाने में सक्षम है । यदि संपीड़ित हवा का कोई स्रोत उपलब्ध है, एक टैंक संकुचित, निष्क्रिय गैस (जैसे, एन2) इस्तेमाल किया जा सकता है । यह उच्च दबाव देने और बड़े विरूपण पैदा करने का जोड़ा लाभ होगा, लेकिन यह भी चिप के लिए दबाव नियंत्रक से कनेक्ट करने के लिए उच्च दबाव फिटिंग की आवश्यकता होगी । नरम PDMS से चिप निर्मित करने के लिए दबाव प्रेरित विकृतियों को बढ़ाने के लिए वैकल्पिक तरीका है ।

इस प्रयोग में, दबाव पंप के आउटलेट के माध्यम से PDMS चिप से जुड़ा है 1-मिमी प्राप्त खुलने (उदा., पंच छिद्रों) एक प्रेस से मिलकर चिपकने वाला मुक्त और प्रतिवर्ती संयोजी के साथ खामियों को दूर किया-फिट 20 जी धातु-ट्यूब एक पीई में डाला टयूबिंग. ये ७०० केपीए३९के लिए दबाव का विरोध करने के लिए दिखाया गया है । देखभाल दोहराया प्रविष्टि के दौरान लिया जाना चाहिए, तथापि, के रूप में छेद के आसपास PDMS के लिए आंसू जाता है और इस तरह के प्रदर्शन को सीमित या चिप अनुपयोगी बना । इस कारण से, धातु टयूबिंग एक बार डाला गया था और छोड़ दिया चिप में खामियों को दूर करने और इसे डालने के बार के बिना ।

महत्वपूर्ण कदम
उत्तेजना एक दबाव actuation चैनल, जो त्वचा इंडेंट द्वारा दिया जाता है । जिसके परिणामस्वरूप विरूपण और mechanoreceptor ंयूरॉन सक्रियण एक ऑप्टिकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और/या फोकल सेट अप पर उच्च संकल्प के साथ imaged किया जा सकता है । कई कारकों GCaMP प्रतिक्रियाओं का पता लगाने में बाधा हो सकती है । पहले, सी एलिगेंस कई ंयूरॉंस में एक नीली बत्ती रिसेप्टर30 एक्सप्रेस, TRNs21,23है, जो नीले (४८८ एनएम) प्रकाश के साथ रोशनी के बाद कोशिकाओं को सक्रिय करता है सहित । इस प्रकार, इमेजिंग सी. एलिगेंस आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम सेंसर GCaMP6s का उपयोग कर रोशनी पर अपने ंयूरॉंस को सक्रिय करेगा, कैल्शियम यांत्रिक उत्तेजना द्वारा सक्रिय यात्रियों अस्पष्ट23। लाइट-1 उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में कार्य करना या लाल-स्थानांतरित कैल्शियम गतिविधि सेंसर का उपयोग कर इस पाया से बचा जाता है । दूसरा, यांत्रिक रूप से प्रेरित कैल्शियम क्षणिक नहीं पाया जा सकता है अगर उत्तेजना प्रोफ़ाइल mechanoreceptors की संवेदनशीलता से मेल नहीं खाता । हम उच्च आयाम कदम और रैंप के लिए सक्रियण का पता लगाने में विफल रहा है, लेकिन मध्यम गतिशीलता उत्तेजनाओं के साथ उत्तेजना के बाद बेहद उच्च संकेतों पैदा (उदा, २००-केपीए बज़) । अंत में, TRNs habituate कम (< 60 s) उत्तेजना अंतराल के साथ दिया एक दोहराया उत्तेजनाओं के लिए । इस प्रकार, यह उत्तेजना अनुक्रम है कि मामलों में जहां आदी होना अध्ययन किया जा रहा है सिवाय आदी होना को कम करने के लिए डिजाइन करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

हम सभी समाधानों को छानने की सलाह देते हैं, बफ़र्स में मलबे और धूल के रूप में आसानी से छोटे ट्रैपिंग चैनल को रोकना कर सकते हैं । इसके अलावा, जानवरों की उम्र सिंक्रनाइज़ और चिप के डिजाइन करने के लिए आकार-मिलान किया जाना चाहिए; युवा वयस्कों की तुलना में छोटे जानवरों डिवाइस के माध्यम से स्लाइड या रोका जा करने के लिए असफल हो जाएगा और बड़ा जानवरों फँसाने चैनलों में प्रवेश नहीं कर सकते और फोड़ा और/या कॉलेस्ट्रॉल चिप के खतरे में हैं । कॉलेस्ट्रॉल के मामले में, कीड़ा या गुरुत्वाकर्षण प्रवाह प्रवेश करने के लिए अत्यधिक दबाव के आवेदन चैनलों को साफ कर सकते हैं, लेकिन यह भी फिटिंग की विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

परिणाम अनुभाग में उल्लेखित के रूप में, कई कारक विश्लेषण प्रोग्राम में विफलता का कारण बन सकते हैं । यदि समस्याओं को संकलित कोड में सामना कर रहे हैं, कि सबसे हाल फिजी सॉफ्टवेयर चल रहा है की पुष्टि करने और फिजी नवीनतम जावा संकलक का उपयोग कर रहा है की सिफारिश की है । यदि प्रोग्राम चल रहा है, लेकिन अनपेक्षित परिणाम है कृपया सुनिश्चित करें कि रिकॉर्ड किए गए चलचित्र है ५०-फ़्रेम बफ़र से पहले वास्तविक यांत्रिक उत्तेजना आधारभूत और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का एक उचित अनुमान सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है । इसके अलावा, हरे, गतिविधि पर निर्भर (GCaMP6s) और लाल, गतिविधि स्वतंत्र (tagRFP) चैनल के देखने के क्षेत्र के लिए कैमरा चिप के ऊपरी और निचले आधे पर अनुमानित माना जाता है, क्रमशः । यदि ऑप्टिकल बीम अलगानेवाला सेंसर के बाएं और दाएं आधे पर छवियों परियोजनाओं, कैमरा ९० ° बारी रिकॉर्डिंग के दौरान वांछित अभिविन्यास प्राप्त करने के लिए या एक पूर्व प्रसंस्करण कदम में छवि ढेर घुमाएँ. इसके अलावा, इस कार्यक्रम के अपने प्रतिदीप्ति द्वारा ंयूरॉन पहचानता है और अगर संकेत करने वाली शोर अनुपात या इसके विपरीत बहुत कम है असफल हो जाएगा । इस स्थिति में, उत्तेजना तीव्रता और/या एक्सपोज़र समय बदलने से समस्या का समाधान हो सकता है । कार्यक्रम भी बंद हो जाएगा अगर न्यूरॉन रिकॉर्डिंग के दौरान देखने के क्षेत्र छोड़ देता है, जो मामले में ंयूरॉन एक नया अधिग्रहण शुरू करने से पहले देखने के क्षेत्र के केंद्र में तैनात किया जाना चाहिए ।

तकनीक की सीमाएं
वर्तमान डिजाइन PVD nociceptors और TRNs की तरह शरीर की दीवार mechanoreceptor न्यूरॉन्स की उत्तेजना में सक्षम बनाता है, लेकिन mechanoreceptors है कि कीड़ा प्रमुख क्षेत्र, अंदर आना और ऐश के रूप में इस तरह की है कि नहीं. यह दबाव < 700 केपीए तक ही सीमित है । बड़े दबाव के लिए, विभिंन ट्यूब फिटिंग के लिए रोजगार की जरूरत है । के बाद से दबाव की आपूर्ति यहां ५०० केपीए से अधिक नहीं था, अधिकतम लागू करने के लिए संभव दबाव ४५० केपीए तक ही सीमित था । यहां मनाया कैल्शियम यात्रियों की संभावना संकेत की ऊपरी सीमा के निशान । हमारे प्रेरक के डिजाइन के लिए एक और सीमा उनके पहलू अनुपात है । सिद्धांत रूप में, पतले डायाफ्राम बड़ा विकृति सक्षम होगा, लेकिन उच्च पहलू अनुपात के साथ संरचनाओं को मज़बूती से बनाना मुश्किल है । यदि बड़ा विकृति आवश्यक हैं, दोनों पक्षों से व्यापक प्रेरक या समानांतर विकृतियों उपयोगी हो सकता है, के रूप में चो एट अल द्वारा प्रस्तुत । 29

हालांकि हम डायाफ्राम विकृति की निगरानी कर सकते हैं, यह actuation चैनलों की वायवीय उत्तेजना के दौरान लागू बलों को मापने के लिए मुश्किल है. सिद्धांत सीमा है कि प्रेरक के संपर्क क्षेत्र में अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है । इसका कारण यह है कि खुद को actuation के दौरान लोचदार और विकृति है, जो बढ़ती विक्षेपन के साथ संपर्क त्रिज्या में परिवर्तन । मन में इन निरंतर के साथ, हम अनुमान लगा सकते है कि एक 5 µm इंडेंट (एक खाली चिप में ३०० केपीए actuation दबाव के आसपास) के बारे में लागू करने के लिए भविष्यवाणी की है ३.८ कीड़ा को Petzold एट अल के कीड़ा अनुमान के अनुसार µN । ३४ के बाद से न्यूरॉन के बल निर्भरता अलग stiffnesses के साथ कीड़े में बदलता है1,३४, तथापि, के बजाय बल की उत्तेजना तीव्रता का एक उपाय के रूप में निगरानी इंडेंट की सिफारिश की है.

हमें उंमीद है कि इस प्रोटोकॉल के प्रसार में मदद मिलेगी उपयोगकर्ताओं के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में एलिगेंस का उपयोग कर mechanobiology अनुसंधान के लिए microfluidics का लाभ ले, और इस तरह क्षेत्र में इस महत्वपूर्ण विषय पर विज्ञान की उंनति में तेजी लाने के ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम सैंड्रा N Manosalvas-Kjono, प्युरीम Ladpli, फराह योगेंद्र, दिव्या Gopisetty, और डिवाइस डिजाइन और उत्परिवर्ती जानवरों की पीढ़ी में समर्थन के लिए वेरोनिका सांचेज धंयवाद । इस शोध को NIH पलाश R01EB006745 (टू BLP), R01NS092099 (टू MBG), K99NS089942 (एमके को), F31NS100318 (टू ALN) द्वारा समर्थित किया गया और यूरोपियन रिसर्च काउंसिल (ईआरसी) से यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम के अंतर्गत धन प्राप्त हुआ ( ग्रांट एग्रीमेंट नंबर ७१५२४३ से एमके).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chrome mask Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chrome mask Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chrome mask Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
4'' Silicon wafer (B-test) Stanford Nanofabrication Facility
SU-8 2002 MicroChem
SU-8 2050 MicroChem
Spin-coater Laurell Technologies WS-400BZ-6NPP/LITE
Exposure timer Optical Associates, Inc OAI 150
Illumination controller Optical Associates, Inc 2105C2
SU-8 developer MicroChem
2-Propanol Fisher Scientific A426F-1GAL
Acetone Fisher Scientific A18-4
Trichloromethylsilane (TCMS) Sigma-Aldrich 92361-500ML Caution: TCMS is toxic and water-reactive
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS prepolymer
Biopsy punch, 1 mm VWR 95039-090
Oxygen Plasma Asher Branson/IPC
Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW New England Small Tube Corporation NE-1300-01
Nalgene syringe filter, 0.22 μm Thermo Scientific 725-2520 to filter all solution, small particles would clog the chip
Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID Solomon Scientific BPE-T50
Syringe, 1 ml BD Scientific 309628 for worm trapping and release
Syringe, 20 ml BD Scientific 309661 for gravity-based flow
Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump Gilson to suck solutions and worms out of the chip
Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel Elveflow OB1 MK3 pressure delivery
Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD McMaster-Carr 5195 T52 connection from house air to pressure pump
Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD McMaster-Carr 5195 T51 connect pressure pump to small tubng
Push-to-Connect Tube Fitting for Air McMaster-Carr 5111K468 metric - imperial converter
Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD McMaster-Carr 5779 K258
Leica DMI 4000 B microscopy system Leica
63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective Leica 506081
Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera Hamamatsu C11440-42U
Lumencor Spectra X light engine Lumencor With cyan and green/yellow light source
Excitation beam splitter Chroma 59022bs in the microscope
Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics Hamamatsu A12801-01 to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip
Emission beam splitter Chroma T570lpxr in the image splitter
Emission filters GCamp6s Chroma ET525/50m in the image splitter
Emission filters mCherry Chroma ET632/60m in the image splitter

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References

  1. Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
  2. Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
  3. Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
  4. Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
  5. Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
  6. Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
  7. Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
  8. O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
  9. Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
  10. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  11. Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).
  12. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  13. Li, S., Stone, H. a, Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
  14. Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
  15. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998 (2014).
  16. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  17. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
  18. Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
  19. Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172 (2017).
  20. Arnadóttir, J., O'Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
  21. Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
  22. Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O'hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
  23. Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
  24. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).
  25. Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
  26. Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
  27. Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
  28. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  29. Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
  30. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
  31. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
  34. Petzold, B. C., Park, S. -J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
  35. Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).
  36. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  37. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  38. Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599 (2011).
  39. Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
  40. Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३२ Microfluidics शीतल-लिथोग्राफी सी. एलिगेंस mechanobiology mechanosensation कैल्शियम गतिशीलता
यांत्रिक उत्तेजना और <em>सी. एलिगेंस</em> के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए एक Microfluidics डिवाइस का उपयोग करना
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Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim,… More

Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans. J. Vis. Exp. (132), e56530, doi:10.3791/56530 (2018).

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