Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

عزل وزراعة المتكفل العصبية تليها الكروماتين-إيمونوبريسيبيتيشن من هستون 3 يسين 79 مارك ديميثيليشن

Published: January 26, 2018 doi: 10.3791/56631
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

Summary

نحن نقدم طريقة فعالة واستنساخه لعزل وثقافة الخلايا العصبية السلف من الأنسجة الجنينية والولادة في الدماغ إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) من هستون 3 يسين 79 ديميثيليشن (H3K79me2)--علامة هيستون تقع داخل مجال كروي من هستون 3.

Abstract

نمو الدماغ هو عملية معقدة، التي يسيطر عليها التدرجات مورفوجينس والبرامج النسخي المختلفة بطريقة الصدغي مكانية. بالإضافة إلى ذلك، تعديلات جينية الكروماتين، مثل مثلايشن هستون، دوراً هاما لإنشاء والحفاظ على مصائر الخلية المحددة في إطار هذه العملية. تحدث الغالبية العظمى من هيستون مثلايشن على ذيل مرنة هستون، الذي الوصول إلى معدلات هستون، ومحايات والبروتينات هستون القارئ. وفي المقابل، مثلايشن H3K79 يقع في مجال كروي من هستون 3 والمتورطة في المهام الإنمائية المختلفة. مثلايشن H3K79 هي تقحم المصانة ويمكن أن تكون وجدت في طائفة واسعة من الأنواع من الإنسان العاقل إلى Saccharomyces cerevisiae. حدث التعديل في خلية مختلفة السكان داخل الكائنات الحية، بما في ذلك فروعه العصبية. موقع مثلايشن H3K79 في مجال كروي من هستون 3 يجعل من الصعب تقييم. هنا، فإننا نقدم طرق لعزل والثقافة القشرية السلف الخلايا (Cpc) من الأنسجة الجنينية الدماغ القشرية (E11.5-E14.5) أو فروعه الدماغ العصبية الحبيبية (كجنبس) من الأنسجة بعد الولادة (P5-P7)، وإلى كفاءة إيمونوبريسيبيتاتي H3K79me2 PCR الكمي (qPCR) وتسلسل الجينوم على نطاق المنظومة.

Introduction

الوظائف الحسية والحركية والإدراكية للدماغ معقدة للغاية وعرضه للتغيرات المادية والبيئية. يتكون الدماغ من ثلاثة أجزاء عامة هند-، منتصف، وفوريبرين، التي ترتبط عميق. ضمن forebrain، يمكن تقسيم تيلينسيفالون تيلينسيفالون الظهرية (DT) وتيلينسيفالون البطني (فاتو). DT الفئران يتكون من ست طبقات القشرية التي تتشكل بين E11.5 و E18.5 بطريقة "من الداخل إلى الخارج"1. ويشمل فاتو امينينسيس جانجليونيك في التنمية، التي تشكل في وقت لاحق2،ganglia القاعدية3. ويمكن تصنيف في الثدييات الجهاز العصبي المركزي مثل الخلايا العصبية، أستروسيتيس، أو أوليجوديندروسيتيس4، الذي وضع في طريقة الصدغي مكانية5العديد من أنواع الخلايا. أولاً، تثير الخلايا العصبية السلف (الشخصيات) لأنواع مختلفة من الخلايا العصبية، إينتيرنيورونس في فاتو، وإسقاط الخلايا العصبية في ديناراً، وفي وقت لاحق إلى الخلايا الدبقية (مثلاً، أستروسيتيس6). خلال التنمية القشرية، والطبقة الأكثر سطحية (طبقة أنا)، الذي يحتوي على خلايا ريتزيوس كيال، تتشكل أولاً. ثم، بين E12.5 و E14.5، تولد الشخصيات العصبية طبقات أعمق (الخامس والسادس) بينما بين 14.5 و 16.5، المتكفل تؤدي إلى الطبقة العليا (رابعا-ثانيا) من الخلايا العصبية7،8. يتم تحديد هوية الخلايا العصبية التي يسببها مورفوجين الصدغي المكانية النسخي البرامج المختلفة وبرامج جينية2بالإضافة إلى ذلك.

يقع في هيندبرين المخيخ، الذي تورط في التنسيق الحركي، وتطور بين E10 وتقريبا P20 في الفئران9. أنه يحتوي على قشرة الدماغ و نوى الدماغ10. قشرة الدماغ الكبار يتكون من ثلاث طبقات والطبقة الجزيئية الأبعد، طبقة خلايا بوركنجي والطبقة الحبيبية الأعمق التي تحتوي على الخلايا العصبية محبب10. الخلايا الحبيبية للدماغ الخلايا العصبية أصغر وتمثل حوالي 80 في المائة من جميع الخلايا العصبية في الدماغ الفقاريات11. وضع من السلائف التي تقع في منطقة جيرمنال الخارجية والهجرة من خلال طبقة خلايا بوركنجي إلى تلك الوجهة12. مثل ينظم وضع المخيخ في telencephalon، مورفوجينس مهمة عدة، التي لها وظائف محددة الوقت والفضاء التابعة والشروع في تعريف برامج النسخي10.

يتم التحكم في وضع الطبقات القشرية والدماغ النسخي التعبير عن مورفوجينس محددة، ومن ثم الدولة الكروماتين للحمض النووي. في طريقة عرض مبسط، يمكن تقسيم الدول الكروماتين euchromatin كنشاط ترانسكريبتيونالي وهيتيروتشروماتين كمناطق صامتة ترانسكريبتيونالي. نوكليوسومي كوحدة أساسية من الكروماتين يحتوي على نسختين من كل هيستون الأساسية H2A، H2B و H3 و H4، محاطة بزوج قاعدي 147 من الحمض الخلوي الصبغي13. يتم تعديل هيستونيس عالية بوستترانسلاتيونالي مثلايشن acetylation، الفسفرة، أوبيكويتينيشن، سومويليشن، ريبوسيليشن ADP، deamination وبرولين isomerization14،15. يعتبر مثلايشن يسين هستون تعديل هيستون الأكثر استقرارا التي تتحكم في النسخ والنسخ المتماثل وممارسو16، تلف الحمض النووي استجابة17وطابعه الجينوم18. ويمكن ليسينيس مونو-دي-أو ثلاثي ميثليته19 وتظهر ليس فقط في ذيول هيستون موجوداً ولكن أيضا داخل نطاق كروي histones20. ميثيليشنز المحددة في H3K4 و H3K36 ترتبط أساسا يوتشروماتين، ميثيليشنز محددة في H3K9، أو H3K27، أو H4K20 توجد أساسا في مناطق heterochromatic، على الرغم من أن جميع مخلفات تقع داخل الذيل هيستون14، 19،21. مثلايشن H3K79 يقع ضمن مجال كروي هيستون وارتبطت بنشاط النسخي، بل أيضا مع مناطق الجينوم خاملة ترانسكريبتيونالي22. هي تقحم حفظت التعديل نظراً لأنه قد لوحظ في الخميرة والغدة الصعترية العجل والدجاج و الإنسان23. H3K79 مونو ودي تريميثيليشن (H3K79me1، me2، me3) هي تحفزها هيستون ميثيلترانسفيراسيس DOT1L24،25 و النووية مجموعة المجال التي تحتوي على بروتين 2 (Nsd2)26. DOT1L المتورطة في الانتشار وإصلاح الحمض النووي الخلوي ريبروجرامينج27. فقدان Dot1l في الفئران يؤدي إلى وفاة قبل الولادة حوالي28،E10.5 المرحلة الإنمائية29. أثناء تطوير القلب والتمايز ميوكارديوسيتي، DOT1L ضروري ل تنظيم التعبير الجيني30. في الجهاز العصبي المركزي، وقد تورط الدالة DOT1L في الأنبوب العصبي التنمية31، وهي تشارك في قمع Tbr1-التعبير خلال forebrain التنمية32، وقد تعمل في تنظيم ER-الإجهاد استجابة الجينات33. تعتمد على سياق تنشيط أو عمل تقطعون من H3K79me، لا سيما مع حالات في فيفو مثل تطوير الجهاز العصبي المركزي، التاريخ فقط يفهم جزئيا32. منذ مثلايشن H3K79 يقع في مجال كروي من هستون 3، أنها ستيريكالي الوصول إليها أقل بالمقارنة مع تعديلات في ذيول هيستون مرنة23. هناك حاجة لفهم وظيفة مثلايشن H3K79، أساليب تحليل موثوق واستنساخه لتحديد موقعها وبيئة الجينوم. نقدم في هذه الورقة، وأساليب طرق عزل مختلف فروعه العصبية (Cpc للقشرة) وكجنبس المخيخ والعلاج مثبطات DOT1L الفعال وأسلوب رقاقة لتحليل مثلايشن H3K79 عن طريق قبكر أو التسلسل في وقت مختلف النقاط خلال التنمية القشرية والدماغ. لإلقاء نظرة عامة على البروتوكول وإمكانياتها، انظر الشكل 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وافقت لجان رعاية الحيوان من جامعة فرايبورغ والسلطات المحلية جميع التجارب الحيوانية (G12/13، G16/11) المشار إليها في البروتوكول التالية.

1-الأعمال التحضيرية

  1. الأعمال التحضيرية لعزل Cpc
    1. قم بإعداد فواصل التزاوج للحصول على الأجنة في مراحل مختلفة من التنمية اللحاء (بين E11.5 و E14.5). استخدام فئران سلالة الرنين (معهد البحوث الطبية البحرية) التي على الأقل 8 أسابيع من العمر. بعد التزاوج، تنظر سداده مهبلية إيجابية في E0.5.
    2. للحصول على ما يكفي من المواد، استخدام القمامة واحد من الفئران الرنين لرقاقة H3K79me2 واحد من كورتيسيس من E12.5 أو E14.5. بعد المراحل الجنينية، استخدام القمامة واحد لمزيد من التحليلات رقاقة (متوسط حجم القمامة الرنين: 10 أجنة).
    3. بريكول Hank´s متوازن الملح الحل (حبس) والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى 4 درجة مئوية (التخزين الطويل الأجل في RT).
    4. حجته 4 درجات مئوية المخزنة يدتا التربسين (0.05% w/v) إلى 37 درجة مئوية.
    5. تحضير الخلية القشرية متوسطة (CCM): تكملة المتوسطة للخلايا العصبية (انظر الجدول للمواد) مع التركيزات النهائية الملحق B-27 2% (v/v)، 5 ميكروغرام/مل ترانسفيرين Apo، 1 ميكروغرام/مل الجلوتاثيون، 0.5 مم L-الجلوتامين، الفاءق دسموتاز 0.8 ميكروغرام/مل و 1% (v/v) خليط المضادات الحيوية البنسلين-ستربتوميسين-النيوميسين. تخزينها في 4 درجات مئوية. للتجربة، حجته المتوسط إلى 37 درجة مئوية.
    6. ذوبان الجليد مصل العجل الجنين (FCS)، الكوة من (50 مل في كل)، وحجته قاسمة واحد إلى 37 درجة مئوية (التخزين الطويل الأجل في-20 درجة مئوية).
    7. إعداد مخزون من الدناز 1 (10 مغ/مل) في ح2س لثقافة الخلية. تخزين مختبرين في-20 درجة مئوية.
    8. إذا لزم الأمر، حل مثبطات DOT1L محددة 5676 مناطق تجهيز الصادرات أو SGC0946 في [دمس] لتركيز أسهم من 100 ملم. يطبق بتركيز 1-5 ميكرومتر نهاية للخلايا في اليوم 0 وتطبيق المانع كل يومين.
    9. للحزب الشيوعي الصيني زراعة، معطف خلية ثقافة لوحات (بئر 6 أو 12 جيدا) مع هيدروبروميد بولي-L-ornithine (1 ملغ/مل في 150 مم الماء المقطر pH 8.4) على الأقل 1 ح في RT، وبعد ذلك مع laminin (1 ملغ/مل) في المتوسط CCM عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. الأعمال التحضيرية لعزل كجنب
    1. تنظيم التزاوج المناسب من الفئران لتوليد الحيوانات P5-P7 لعزل المخيخ (3-5 الحيوانات كل رقاقة والشرط).
    2. إعداد حبس/الجلوكوز عن طريق إضافة 6 مغ/مل الجلوكوز إلى حبس المخزن المؤقت.
    3. إعداد متوسطة الثقافة الخلية كجنب (الجمعية العمومية) بإضافة الملحق 1% (v/v) N2، 1% (v/v) البنسلين-ستربتوميسين-النيوميسين، 25 مم FCS بوكل و 10% دميم-F12. لزراعة كجنب إعداد متوسطة CGM دون FCS ولكن بما في ذلك 0.6 ميكروغرام/مل سونيك القنفذ (SHH) (CGM-SHH) وحجته أنه إلى 37 درجة مئوية عند الحاجة.
    4. معطف لوحات ثقافة الخلية 6-جيدا مع 100 ميكروغرام/مل بولي-د-يسين ح 1-2 على RT لإزالة خلايا إطلاق. بعد ذلك يغسل مرتين مع ddH العقيمة2س واسمحوا لوحات الجاف. تخزين اللوحات لمدة أسبوع واحد كحد أقصى عند 4 درجة مئوية.
    5. لزراعة كجنبس معطف الخلية جيدا 6 لوحات الثقافة مع بولي-L-أورنيثيني (0.1 مغ/مل) في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. بعد ذلك يغسل مرتين مع ح2س لخلية ثقافة واسمحوا لوحات الجاف.
      ملاحظة: يمكن تخزين اللوحات لمدة أسبوع واحد كحد أقصى عند 4 درجة مئوية.
    6. إعداد التربسين 0.025% (w/v) في حبس/الجلوكوز وحجته أنه إلى 37 درجة مئوية عند الحاجة.
  3. الأعمال التحضيرية لشريحة من H3K79me2
    1. إعداد منهاج عمل بيجين (1% في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 8) طازجة قبل crosslinking الكروماتين. إعداد منهاج عمل بيجين الحرارة 50 مل برنامج تلفزيوني في الموجات الدقيقة إلى الحد الأقصى من 65 درجة مئوية. أثناء التحريك المستمر إضافة 0.5 ملغ منهاج عمل بيجين إلى برنامج تلفزيوني. قم بإضافة 50 ميليلتر 10 M هيدروكسيد الصوديوم وانتظر حتى يتم حل منهاج عمل بيجين. بعد ذلك، أضف ميليلتر 42.5 HCl (37% v/v) للحصول درجة وضه 8. التحقق من درجة الحموضة مرة أخرى والسماح ثم حل منهاج العمل 1% الوصول إلى الرايت
    2. إعداد الأرصدة رناسي (1 ملغ/مل) و "بروتيناز ك" (20 ميكروغرام/ميليلتر) بشكل منفصل في ddH العقيمة تخزين2سين مختبرين في-20 درجة مئوية.
    3. إعداد الكواشف والمخازن المؤقتة التالية: برنامج تلفزيوني يتضمن 0.02 ٪ توين، تحلل العازلة، جليكاين، المخزن المؤقت، وتمييع رقاقة رقاقة العازلة 2 والرقائق العازلة 3، المخزن المؤقت 1 والمخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات وتخزينها في 4 درجات مئوية. إعداد المخزن المؤقت شطف طازجة في كل مرة.
      1. إعداد برنامج تلفزيوني يتضمن 0.02 ٪ توين. متجر لمعظم أسبوعا واحداً في 4 درجات مئوية.
      2. إعداد تحلل المخزن المؤقت باستخدام 50 مم تريس على درجة الحموضة 8.0، 10 مم يدتا والصوديوم 1% (w/v) دوديسيل كبريتات (SDS) 1 × مثبطات البروتياز.
      3. إعداد جليكاين 2.5 م.
      4. إعداد إضعاف المخزن المؤقت باستخدام 20 مم تريس في pH 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم يدتا، 1% (v/v) Triton X-100 والحزب الديمقراطي الصربي 0.25% (w/v) 1 × مثبطات البروتياز.
      5. إعداد الرقائق العازلة 1 استخدام 20 مم تريس في pH 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم يدتا، 1% (v/v) X-100 تريتون، و 0.2% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي.
      6. إعداد الرقائق العازلة 2 استخدام 20 مم تريس pH 8.0، 500 ملم كلوريد الصوديوم، 2 مم يدتا، 1% (v/v) X-100 تريتون، و 0.2% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي.
      7. إعداد الرقائق العازلة 3 استخدام 20 مم تريس pH 8.0، 250 ملم ليكل، 2 مم يدتا، 1% (v/v) NP-40، و 1% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي.
      8. تعد الشركة المصرية للاتصالات المخزن المؤقت باستخدام 20 مم تريس pH 8.0 و 2 مم يدتا.
      9. إعداد المخزن المؤقت شطف الطازجة التي تحتوي على 1% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي، 100 ملم ناكو3.

2-العصبية السلف العزلة من أنسجة المخ

  1. عزل وزراعة الاختياري Cpc
    1. Euthanize الحيوانات الحوامل بخلع سرطان عنق الرحم، ونقل الأجنة إلى حبس المثلج.
    2. إزالة الجمجمة مع المقص وعزل الدماغ، ثم إزالة السحايا، إذا كان ذلك ممكناً، مع ملقط صغير وعزل كورتيسيس (الجامعة، DT، أو فاتو) من كلا نصفي الكرة الأرضية عن طريق إزالة جميع أجزاء الدماغ الأخرى تحت مجهر نطاق استخدام الملقط الصغيرة، وإذا كان مقص اللازمة، والصغيرة. تخزين كورتيسيس معزولة في المخزن المؤقت لحبس 5 مل عند 4 درجة مئوية في أنبوب 15 مل.
    3. الطرد المركزي المواد المعزولة من المخ لمدة 5 دقائق ب 000 1 × ز و 4 درجة مئوية.
    4. أغسل كورتيسيس مع 5 مل حبس المثلج وتجانسه لهم مع تلميح ماصة 1 مل من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. إذا لزم الأمر، قص غيض غيض ماصة.
    5. الطرد المركزي العينة المتجانس لمدة 5 دقائق ب 000 1 × ز و 4 درجة مئوية. إزالة حبس.
    6. أضف 3 مل التربسين واحتضان العينة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    7. أضف 1 مل FCS ومل 5 CCM 30 ميليلتر من الدناز 1 للعينة وتجانسه مع ماصة زجاجية 5 مل العينة التي بيبيتينج بعناية صعودا وهبوطاً.
    8. الطرد المركزي الخلايا المعزولة لمدة 5 دقائق في 1000 x ز و 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وإضافة 5 مل CCM ومجانسة العينة مرة أخرى.
    9. تمييع قاسمة العينة وتعول عليه نويباور عد-دائرة. ومن المتوقع متوسط مبلغ 4.5 × 106 خلايا للجنين. لزراعة Cpc معزولة المضي قدما خطوة 2.1.10. للرقائق، تشرع فورا بالخطوة 3.
    10. للزراعة، والاطباق في كثافة بين 8 × 104 و 2.5 × 105 خلايا/سم2 في المتوسط CCM لوحة Cpc في بولي-L-أورنيثيني (0.1 مغ/مل) ولامينين (1 ملغ/مل) المغلفة واحتضانها لهم في 5% CO2, 37 درجة مئوية والرطوبة النسبية 100%.
    11. منذ البداية Cpc للتفريق في الخلايا العصبية في ثقافة الخلية (بعد 4 أيام تقريبا)، النظر في تاريخ التشريح كيوم في المختبر 0 (يوم 0). لمدة أطول من زراعة، تغيير نصف المتوسط كل يوم الرابع مع الطازجة CCM المتوسطة.
    12. تطبيق 1-5 ميكرومتر SGC0946 أو EPZ5676 حله في [دمس] في اليوم 0 (4-5 ح بعد عزل الخلية) وتحديثها كل يوم الثاني. استخدام [دمس] كعلاج لعنصر تحكم. اختبار كفاءة العلاج المانع عن طريق الأساليب القياسية إيمونوبلوت، إذا لزم الأمر.
  2. عزل وزراعة كجنبس اختياري
    1. Euthanize الحيوانات P5-7 بقطع الرأس باستخدام مقص. إزالة الجلد فروة الرأس وفتح الجمجمة وإزالة الدماغ باستخدام مقص صغير والملقط. عزل المخيخ وأنه نقل إلى هبس/السكر المثلج. إزالة كافة السحايا والأوعية الدموية ونقل سيريبيلا إلى 15 مل أنابيب مملوءة بالبرد هبس/الجلوكوز.
    2. أغسل سيريبيلا ثلاث مرات مع 10 مل هبس المثلج/الجلوكوز (جمع لهم بالطرد المركزي في 650 غ س لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية) ومجانسة سيريبيلا بعد ذلك بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً مع ماصة 1 مل (الحد الأقصى 2-3 مرات) للحصول على 0.5-1 ملم3 الشظايا.
    3. إضافة 5 مل التربسين 0.025% في حبس/الجلوكوز واحتضان الأنسجة تحت التحريك المستمر في حمام مائي 37 درجة مئوية عن 15 دقيقة توقف الهضم عن طريق إضافة 5 مل من الجمعية العمومية وجمع الأنسجة باستخدام الطرد المركزي في 650 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. إزالة المادة طافية وتريتوراتي الأنسجة مع تلميح بيبيت مل 1 في 1 مل CGM وتحويلها إلى أنبوب 15 مل جديدة.
      ملاحظة: من المهم تجنب فقاعات الهواء.
      1. إضافة 5 مل CGM واحتضان الخليط لمدة 2 دقيقة على الجليد لتسوية مخلفات الأنسجة. نقل المادة طافية في أنبوب 15 مل جديدة. إضافة 2 مل CGM إلى الأنسجة المتبقية وكرر الإجراء تريتوريشن.
    5. تجمع سوبيرناتانتس (بدون مخلفات الأنسجة، حوالي 10 مل في المجموع) والطرد المركزي في 650 غ س لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية لجمع خلايا الدماغ. ريسوسبيند بيليه في 10 مل CGM.
    6. منذ astrocytes التمسك بشكل أسرع وأقوى بولي-د-يسين من كجنبس، لوحة الخلايا على 100 ميكروغرام/مل بولي-د-يسين المغلفة 6-جيدا-لوحات (تصل إلى 4 مل في البئر) واحتضانها لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية لإزالة أستروسيتيس.
    7. هز اللوحة وجمع المادة طافية. ثم الطرد المركزي في 650 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في أنبوب 15 مل. ريسوسبيند بيليه في 10 مل CGM وعد الخلايا مع نويباور العد الدائرة.
      ملاحظة: كجنبس هي جولة، صغيرة، وتظهر هالة عند تصويرها باستخدام الطوري.
    8. إذا كان المطلوب، والبذور الخلايا في 37 درجة مئوية قبل استعد CGM على ألواح بولي-L-أورنيثيني-المغلفة (3 × 106 خلايا الواحدة 6-جيدا) واحتضانها لهم في 37 درجة مئوية و 5% CO2 الرطوبة النسبية 100%.
      ملاحظة: إذا لم يتم تنفيذ البذر، انتقل إلى الخطوة 3، 1.
      1. بعد 6-12 ساعة، تبادل المتوسط إلى CGM SHH. علاج ح 6 كجنبس معزولة (أو عند تغيير إلى CGM SHH) بعد عزلة مع مثبط DOT1L و [دمس] التحكم وتجديدها كل يوم الثاني (مقارنة مع 2-1-12). اختبار كفاءة العلاج المانع عن طريق الأساليب القياسية إيمونوبلوت إذا لزم الأمر. للرقائق، المضي في الخطوة 3، 3.
        ملاحظة: ترك CGM على اللوحات (ومع ذلك FBS) سيؤدي في التفريق بين كجنبس في الدماغ الخلايا العصبية الحبيبية (كنس).

3-تثبيت الخلايا والقص من الكروماتين

ملاحظة: إجراء الخطوات 3.1 و 3.2 إذا لم تستزرع خلايا، إذا لم تكن للانتقال إلى الخطوة 3، 3.

  1. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقة 4 في 1,000 س ز وإضافة 1.3 مل برنامج تلفزيوني. نقل العينة إلى أنبوب 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقة 4 في 1,000 ز x عند 4 درجة مئوية. تغسل العينة مرتين مع 1.3 مل برنامج تلفزيوني.
  2. الخطوة الحاسمة: إضافة 350 ميليلتر 1% منهاج عمل بيجين للعينة واحتضان عليه لمدة 5 دقائق عند 22 درجة مئوية. للتوقف عن رد فعل، أضف 18.4 ميليلتر جليكاين، وبرنامج تلفزيوني 1 مل. الطرد المركزي العينة لمدة 5 دقائق في 1,000 ز x عند 4 درجة مئوية.
    1. تغسل العينة مرتين مع برنامج تلفزيوني المثلج. جمع الخلايا الثابتة عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1,000 س ز و 4 درجة مئوية. تبقى العينات على الجليد من الآن فصاعدا.
      ملاحظة: يجب أن يكون وقت التثبيت 5 دقيقة بالضبط للحصول على أفضل النتائج. أرقام خلية مختلفة قد تتطلب تعديلات الوقت.
  3. الخطوة الحاسمة: كجنبس المستزرعة (أو Cpc)، إضافة إلى 1 مل 1% منهاج عمل بيجين إلى الآبار لوحة الثقافة الخلية مباشرة. بعد 5 دقيقة حضانة عند 22 درجة مئوية، إضافة مبلغ مناسب جليكاين وبرنامج تلفزيوني وحصاد الخلايا مع مكشطة خلية.
    1. نقل الخلايا في أنابيب 1.5 مل والطرد المركزي العينة لمدة 5 دقائق ب 000 1 × ز و 4 درجة مئوية. تغسل العينة مرتين مع برنامج تلفزيوني المثلج. جمع الخلايا الثابتة عن طريق الطرد المركزي لابتداء 5 1,000 ز x عند 4 درجة مئوية. تبقى العينات على الجليد من الآن فصاعدا.
  4. الخطوة الحاسمة: إضافة 700 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت (+ مثبطات البروتياز) واحتضان العينة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. دوامة العينة كل دقيقة 5 القص الكروماتين الخلايا ليسيد 3 × 10 دقيقة في سونيكاتور (30 s نبض، 30 s وقفه) في الحد الأقصى من الطاقة.
    1. تأكد من أن وحدة التخزين لا تتجاوز 350 ميليلتر كل أنبوب. دوامة فحص العينات كل دقيقة 10 للنوى المتبقية مع مجهر تباين مرحلة.
      ملاحظة: من المهم للحصول على أفضل النتائج القص (مقارنة مع الشكل 1B) لتحليلها في وقت لاحق. في حالة استخدام أساليب أخرى للقص الكروماتين، تحسين القص إلى شظايا الكروماتين الحجم بين 200-500 bp.
  5. بيليه مخلفات الخلية عن 10 دقيقة، 13,000 س ز، 4 درجة مئوية. استخدام المادة طافية لخطوة بريكليرينج 5.2. تجميد العينة في-20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق، إذا لزم الأمر.

4-إعداد الخرز وبريكليرينج

  1. أغسل 45 ميليلتر البروتين A المغناطيسي الخرز/رقاقة و 20 ميليلتر المغناطيسي الخرز/عينة مع برنامج تلفزيوني المثلج 1 مل تحتوي على 0.02% توين ثلاث مرات استخدام موقفا مغناطيسية. ثم أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني المثلج الخرز.
  2. 1 مل المثلج برنامج تلفزيوني والخرز ميليلتر 45/رقاقة، إضافة 3 ميكروغرام من جسم/تشيب (H3K79me2 أو أرنب مفتش). احتضان العينات ح 2 في 4 درجات مئوية في دوار لربط الأضداد الخرز. اعتماداً الضد، استخدم ~ 3 ميكروغرام جسم/رقاقة.
  3. أغسل الجسم-منضم-الخرز ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني المثلج 1 مل تحتوي على 0.02% توين. إضافة حجم حبة المناسبة (ابتداء من حجم الخرز المغناطيسية المستخدمة) لبرنامج تلفزيوني المثلج ليغسل الجسم-إلى جانب-الخرز.
  4. إضافة 600 ميليلتر من المخزن المؤقت لتمييع و 20 ميليلتر من حبات مغناطيسية غسلها للعينة بريكليرينج (الحجم الإجمالي 1,320 ميليلتر) واحتضانها ح 2 في 4 درجات مئوية في دوار. إزالة الخرز استخدام موقفا مغناطيسية. تأخذ 5% (33 ميليلتر) من ليساتيس كنماذج الإدخال وتجميدها في-20 درجة مئوية.

5-الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن

  1. تقسيم استخراج بريكليريد أنبوبين (حوالي 643.5 ميليلتر)، وإضافة نفس حجم المخزن المؤقت لتمييع والجسم-منضم-الخرز (45 ميليلتر في العينة؛ H3K79me2 أو أرنب مفتش). احتضان العينات عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها في دوار.
  2. تغسل الخرز مع المثلج الرقائق العازلة 1 والرقائق العازلة 2 والرقائق العازلة 3 لكل 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في دوار. وبعد ذلك يغسل ثلاث مرات مع المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في دوار.
  3. الوت الخرز مع شطف المخزن المؤقت لح 1 1,400 لفة في الدقيقة في شاكر في درجة حرارة الغرفة.
  4. إضافة 10 ميكروغرام رناسي (1 ملغ/مل) كل عينة رقاقة و 5 ميكروغرام لنماذج الإدخال واحتضان هذه العينات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية (1,400 لفة في الدقيقة).
  5. إضافة 100 ميكروغرام "ك البروتيناز" (20 ميكروغرام/ميليلتر) كل رقاقة عينة و 50 ميكروغرام كل المدخلات واحتضان بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية في 1,400 في الدقيقة.

6-تنقية العينات رقاقة

  1. تنقية شرائح وعينات الإدخال مع تنقية الحمض النووي كيت (انظر الجدول للمواد) وفقا للدليل. استخدام أعمدة تنقية أكثر عندما يتوقع أكثر من 5 ميكروغرام من الحمض النووي. الوت العينة مع 2 × 15 ميليلتر من المخزن المؤقت شطف الحمض النووي المنصوص عليها في هذه المجموعة.
  2. إجراء التقدير الكمي لهذه العينات (استخدام 1 ميليلتر) باستخدام fluorophore نحققها ومن فلوروسبيكتروميتير (انظر الجدول للمواد).

7-تحليل "العينات رقاقة" عبر قبكر

  1. التصميم التمهيدي لتحليل قبكر، استرداد تسلسل الجينوم للفائدة من المستعرض عارض الجينوم التكاملية (IGV)34. تصميم كبسولة تفجير حول موقع بدء النسخي (TSS) الجينات، حيث H3K79me2 من المحتمل أن يكون موجوداً هناك. كعنصر تحكم، تنظر غير ترميز الجينوم الأقاليم أو المناطق حوالي 10 كيلو بايت المنبع لخدمات الدعم التقني أو 10 كيلو بايت المصب نهاية النسخي الموقع (قسم التدريب والامتحانات).
    1. توليد الإشعال باستخدام https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/مسبقاً بحجم منتج بين 70 و 200 شركة بريتيش بتروليوم، ودرجة حرارة مثلى من 60 درجة مئوية. لأغراض المحاكمة، استخدم كبسولة تفجير لمناطق الجينوم Aft4، Ddit3، Scd1، Aft3، و Npm1 المدرجة في الجدول 1.
  2. اختبار الإشعال المصممة حديثا مع البرنامج قبكر التالية ومزيج الرئيسي تدرج درجة الحرارة انلينغ بين 58 و 63 درجة مئوية، وتحديد درجة حرارة انلينغ بأعلى المنتج كمية ونوعية.
    1. تطبيق الحمض النووي جل التفريد التحكم في حجم الناتج المتوقع. لتحليل قبكر، واستخدام "نظام الكشف عن PCR الوقت الحقيقي" (انظر الجدول للمواد).
    2. إعداد مزيج الرئيسي باستخدام 10 ميليلتر بوليميراز الدنا الرئيسي ميكس التمهيدي ميليلتر 0.5 إلى الأمام (10 ميكرون)، 0.5 ميليلتر التمهيدي عكس (10 ميكرون)، 4 المياه خالية من نوكلاس ميليلتر والحمض النووي 5 ميليلتر (1 نانوغرام/ميليلتر).
    3. استخدام برنامج قبكر 2-خطوة على النحو التالي: 5 دقيقة عند 95 درجة مئوية، 50 x (30 s عند 95 درجة مئوية، 30 s في 58 درجة مئوية-63 درجة مئوية)، والانحدار تمسخ باستمرار عند 4 درجات مئوية.
  3. إنشاء سلسلة تمييع للجينوم والمنفصمة وتنقية عينات من الحمض النووي (2 نانوغرام/ميليلتر و 1 نانوغرام/ميليلتر، 0.5 نانوغرام/ميليلتر، 0.25 ng/ميليلتر و 0.125 نانوغرام/ميليلتر) واستخدام 5 ميليلتر لاختبار كفاءة استخدام قبكر. تحديد منحدر المنحنى المعياري وحساب كفاءة التمهيدي بالصيغة التالية:
    الكفاءة (%) = (^(-1/slope)-1 من 10) * 100.
    1. استخدام أجهزة الإشعال مع الفعالية بين 90% و 105% في حالة مثالية، أو في الأقل مع الكفاءة بين 85% و 115%.
  4. لتحليل شرائح وعينات الإدخال، قم بتطبيق 0.1-1 نانوغرام من "رقاقة الحمض النووي" مختلطة مع كل منهما إلى الأمام وعكس التمهيدي والمياه خالية من نوكلاس بوليميريز الحمض النووي الرئيسي في وحدة تخزين نهائي من 20 ميليلتر لكل رد فعل qPCR مزيج.
  5. تحديد قيم العتبة دورة (Ct) شرائح ونماذج الإدخال وتطبيع العينة جر إلى قيمt C من المدخلات لحساب تخصيب (الإدخال %) بالصيغة التالية. استخدام جر القيم التي تم الحصول عليها من مراقبة مفتش لتحديد مستوى الخلفية.
    الإدخال % = 100-2^(norm. − الإدخال هو القاعدة. رقاقة)
    القواعد والمعايير. الإدخال = جر (مدخلات) − سجل2(عامل التخفيف)
    القواعد والمعايير. رقاقة = جر (رقاقة) − سجل2(عامل التخفيف)
    ملاحظة: القاعدة. = تم تسويتها

8-تحليل عينات رقاقة عبر التسلسل

  1. نقل العينات رقاقة (الإدخال وإيمونوبريسيبيتاتيد عينة الحمض النووي) إلى مرفق لتسلسل.
  2. لإعداد باستخدام مكتبة مسبقاً، إعداد مكتبة مناسبة كيت (انظر الجدول للمواد)، وتحويل 2 نانوغرام المدخلات الحمض النووي وكل شيء من الحمض النووي إيمونوبريسيبيتاتيد في المكتبات المفهرسة للجيل القادم متعدد التسلسل في وأشارت إلى منصة (انظر الجدول للمواد).
  3. الخطوة الحاسمة: اتباع الإرشادات كيت، اضطر محولات التسلسل (مع تركيز عمل من 15 ميكرون) لوضع حد لإصلاحه والذيل دا شظايا من الحمض النووي. محولات التسلسل وبكر استخدام كبسولة تفجير أوليجوس المناسبة (انظر الجدول للمواد). لهذا المبلغ لإدخال الحمض النووي، استخدام دورات بكر 6-9 لإثراء شظايا من الحمض النووي محول متصلة.
    ملاحظة: عادة، فإنه لا يلزم القيام بتحديد حجم الحمض النووي محول متصلة. فمن الأفضل لاستخدام عدد قليل من PCR دورات ممكن، منذ التضخيم بكر العديد من دورات نتيجة في التكرارات بكر وتحيز GC عالية.
  4. لإجراء فحص نهائي مكتبة، تأخذ 0.5 ميليلتر من رد فعل مجموع إلى تصور حجم التوزيع على جهاز مناسب للتحليل (انظر الجدول للمواد). للتحديد الكمي، استخدام صبغة نحققها في تركيبة مع فلوروسبيكتروميتير أو الأساليب الأخرى (انظر الجدول للمواد).
  5. حيث يبدو أن H3K79me2 تعديل هستون، الذي ينتشر على نطاق واسع على مناطق الجينوم أكبر، تسلسل العينات المزدوجة-النهاية مع طول قراءة من 50 بي بي ومع عمق 75 ميو يقرأ تسلسل.
  6. تحليل البيانات seq رقاقة مع "الملقم فرايبورغ" المجرة/يوني (galaxy.uni-freiburg.de).
  7. أداء مراقبة الجودة مع تشيبسيق التي تم الحصول عليها مع فاستقك، وإذا كان ذلك مناسباً، خريطة لهم مباشرة مع Bowtie2 الإصدار 2.2.035 مع أو بدون اقتطاع. استخدام الجينوم الجمعية كمرجع mm9 أو mm10 الإصدار الأحدث؛ ومرجع تعليق توضيحي الإصدار FTP انسيمبل 79.
  8. اختياري: قراءة إزالة التكرارات باستخدام "ماركدوبليكاتيس بيكار" (http://broadinstitute.github.io/picard) قبل استدعاء الذروة.
  9. استدعاء قمم مع MACS2 الإصدار 2.1.036 استخدام الخيار 'الواسع' ل H3K79me2.
  10. للحصول على نسبة2 سجل بين رقاقة وإدخال عينة، سجل2 عدد من يقرأ يقرأ استخدام نسبة من كلا عينات بامكوفيراجي وبامكومباري.
  11. لجميع الأخرى seq شرائح محددة من التحليل المتعمق، تطبيق deepTools2 النسخة 2.3.5 أو 2.4.137، أي لتوليد تغطية مسار الملفات (بامكوفيراجي لشرائح فقط، بامكومباري للمقارنة رقاقة للإدخال)، لتقدير رقاقة استخدام الأداء بلوتفينجيربرينت وتوليد استخدام لمحة عامة كومبوتيماتريكس، بلوثياتماب. حدد K-يعني تجميع أثناء عملية كومبوتيماتريكس إلى الكتلة مناطق الجينوم وفقا للتوزيع H3K79me2.
  12. استخدام seq رقاقة البيانات المنشورة ك H3K79me2 DT E14.5 أودعت في نكبي لأغراض المحاكمة (رقم الانضمام: SRP057733).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

المخطط العام لعزل السلف العصبية، زراعة، وأساليب التحليل رقاقة H3K79me2 والرقائق: ويبين الشكل 1 مخطط انسيابي لأداء رقاقة H3K79me2 الخلايا القشرية السلف عند نقاط زمنية مختلفة خلال نمو الدماغ الجنينية أو فروعه العصبية الحبيبية الدماغ في المراحل اللاحقة للولادة. وكخطوة أولى، الدماغ يجب أن تكون معزولة وتيلينسيفالون (بين E11.5 و E14.5) أو المخيخ (P5-P7) المراد استردادها. فمن الممكن لتحليل مختلف مناطق telencephalon بتقسيمه إلى DT و vt. بعد ذلك سوف يكون تجانس الأنسجة وفصل المتكفل العصبية. الآن، من الممكن للثقافة الخلايا السلف، وتعاملها مع مثبطات DOT1L. إمكانية أخرى هي إصلاح المتكفل شكل مباشر وإخضاعها للإجراء رقاقة. للرقائق، سيتم المنفصمة إلى شظايا من 200-500 bp الكروماتين والمحتضنة في وقت لاحق مع الضد المغناطيسي إلى جانب الخرز ضد H3K79me2. بعد الغسيل الخرز واسترجاع الحمض النووي، يمكن تحليل الحمض النووي سرع بالتتابع أو بواسطة qPCR (الشكل 1A). من الضروري أن يكون توزيع حجم جيد من الشظايا الكروماتين بعد القص، ولذلك من المستحسن التحقق من حجم جزء مع الحمض النووي جل التفريد أو بطرق أخرى (أمثلة في الشكل 1B). عند اختيار تسلسل الجينوم على نطاق المنظومة، ستقدم رقاقة-seq-فيما يلي نص لشغل H3K79me2 كملف فستق لمزيد من التحليل (الشكل 1). يقرأ نوعية التسلسل يحتاج إلى تقييم من خلال تطبيق فاستقك، وإذا لزم الأمر، يمكن اقتطاعها من الملفات فاستق باستخدام تريمجالوري. ويمكن تنفيذها مع Bowtie2 رسم خرائط الجينوم موس موسكولوس mm9 أو mm10 والسيطرة عن طريق بلوتفينجيربرينت. فمن المستحسن لإزالة التكرارات مع ماركدوبليكاتيس وتطبيع على ما يلي من بامكوفيراجي وقارن رقاقة لنماذج الإدخال مع بامكومباري. بعد ذلك يمكن قراءة رقاقة seq تصور الجينوم واسعة في heatmaps أو جينوس في جلسات عمل المستعرض عارض الجينوم التكاملية (IGV).

الحزب الشيوعي الصيني الثقافة وتثبيط DOT1L: Cpc كانت معزولة وتعامل مع 5 ميكرومتر DOT1L مثبط SGC0946 في اليوم 0 واليوم 2. واستخدمت في [دمس] المذيبات كعنصر تحكم. في اليوم الثالث، كانت تحصد Cpc، تم عزل البروتينات، كمياً، وتحليلها عن طريق إيمونوبلوت (الشكل 2A). ويبين الشكل 2A أن مستويات H3K79me2 فعالية انخفضت بعد ثلاثة أيام من استزراع الحزب الشيوعي الصيني وتثبيط DOT1L مخطط علاج مثبطات فعالة لضمان. وبالتالي لم كمية البروتين H3 أو جابده Tubulin-ألفا يعملون كتحميل عناصر التحكم البصر. Immunostaining Cpc الثابتة مع الأجسام المضادة ضد caspase النشطة 3 (CASP3 +) للكشف عن المبرمج وهوك/د لتصور الخلايا العصبية أشارت إلى أن معالجة Cpc مع مثبط DOT1L أدى إلى موت الخلية زيادة بعد ثلاثة أيام في الثقافة، كما هو موضح في الشكل 2. التقدير الكمي للخلايا التي يتم CASP3 + DAPI + أو هوك/د/+ DAPI + داخل ثقافة الحزب الشيوعي الصيني كشفت عن ارتفاع كبير CASP3 + خلايا الكشف عن برمجة موت الخلايا على تثبيط DOT1L. ومع ذلك، ظل عدد الخلايا العصبية هوك/د-إيجابية، دون تغيير (الشكل 2).

رقاقة H3K79me2-قبكر من Aft4، Ddit3، Scd1، Aft3، و Npm1 من Cpc تعامل مع مثبط DOT1L: لاختبار ما إذا كانت معاملة مثبط SGC0946 DOT1L كفاءة وأدت إلى الحد H3K79me2 في محددة الجينات، ونحن أجرى تحليلاً رقاقة تليها qPCR للحزب الشيوعي الصيني تعامل لمدة 3 أيام. مفتش أرنب كعنصر تحكم رقاقة. إذ من المعروف أن H3K79me2 يقع في الجينات تستجيب للإجهاد اندوبلاسماتيك Aft4، Ddit3، Scd1، و Aft3 ، وكذلك في النقل النووي الجينات Npm133،38، قمنا باستخدام قبكر كبسولة تفجير تغطي خدمات الدعم التقني، وقسم التدريب والامتحانات، ومناطق الجينوم داخل الهيئات الجينات لتحديد الاختلافات في توزيع H3K79me2 بعد تثبيط DOT1L (الشكل 3A). الجينات مع مستويات عالية من H3K79me2 في المقام الأول مثل Atf4، Ddit3، و Npm1 كانت الأكثر استجابة للعلاج المانع حيث أن مدة ثلاثة أيام لتثبيط DOT1L أدى إلى كبير نقصان H3K79me2. وأظهرت الجينات مع تغطية H3K79me2 السفلي، مثل Atf3 و Scd1، أي تغيير ملموس في مستويات H3K79me2.

تحليل نظرة عامة H3K79me2 رقاقة-seq: وكشف تحليل المجين على نطاق المنظومة لمستويات H3K79me2 في Cpc من E14.5، يؤديها وتحليلها وفقا للمخططات المقدمة وبروتوكولات (الشكل 1)، جودة عالية جداً رقاقة. في حين التهم بند، مصنفة وفقا لتواتر القراءات الإدخال في حركتك بصمات الأصابع (الشكل 4 أ)، ووزعت بالتساوي، التهم H3K79me2 أظهرت تخصيب اليورانيوم في مناطق محددة (صناديق المرتبة مع 1)، الذي يعرض نجاح تراكم من الشظايا الكروماتين تعديل في H3K79. Heatmap H3K79me2 على طول الجينات بين على خدمات الدعم التقني، وعلى قسم التدريب والامتحانات و +/-10 كيلوبايت المنبع أو المصب (الشكل 4 باء) ويبين أن قمم H3K79me2 حول خدمات الدعم التقني، وانخفضت نحو تدريب الإحصائيين الأوروبيين صفة عامة. وهناك الجينات، التي تغطيها تماما مع H3K79me2، والجينات، والتي لها ذروة فقط داخل منطقة خدمات الدعم التقني. اندوبلاسماتيك--الإجهاد المتعلقة بالجينات مثل Atf4، Ddit3، والميناء Npm1 نوكليوفوسمين، على سبيل المثال، ارتفاع مستوى H3K79me2 في خدمات الدعم التقني، الذي يتناقص إلا بشكل طفيف على طول الجسم كله الجينات (الشكل 4). وفي المقابل، قد Scd1 شغل H3K79me2 انخفاض في خدمات الدعم التقني، ولا H3K79me2 داخل الجسم الجينات. وقد Atf3 كمثال آخر مختلف حاد وتدني مستوى H3K79me2 الحدود القصوى على طول الجسم الجينات.

Figure 1
رقم 1: مخطط بروتوكول رقاقة H3K79me2 من عزلة Cpc أو كجنبس ومخطط انسيابي لتحليل التسلسل. (أ) نظرة عامة على البروتوكول المقدم. لعزل الحزب الشيوعي الصيني، سوف يكون أول E14.5 العقول معزولة وكورتيسيس ويمكن تقسيم DT وفاتو، إذا لزم الأمر. وقد سيريبيلي كجنبس، المراد استردادها من الفئران P5-P7. سوف تكون الأنسجة تجانس، المتكفل الفصل بين الجنسين، وثم مثقف الخلايا ويعالجون مثبطات مناسبة أو استخدامها مباشرة لشريحة. للرقائق، تبعتها تثبيت الكروماتين القص وإيمونوبريسيبيتيشن مع الأجسام المضادة H3K79me2 وارنب مفتش كعنصر التحكم. بعد تنقية الحمض النووي، عينات رقاقة يمكن تحليلها عن طريق إعداد مكتبة وتسلسلها أو يمكن تحليلها عن طريق قبكر. (ب) أمثلة على الكروماتين النوعية الملائمة وغير الملائمة. ويرد توزيع جزء الحمض النووي في شركة بريتيش بتروليوم. (ج) النتائج seq رقاقة يمكن أن تخضع لخط أنابيب تحليل على الملقم فرايبورغ/المجرة. وبعد مراقبة الجودة (فاستقك)، قد قلصت مع تريمجالوري ما يلي: وثم تعيينها عن طريق Bowtie2 إلى جينوم الفأر (في mm9 الحالات المقدمة). بلوتفينجيربرينت يتم تقييم نوعية الرقاقة. لتعريف الحدود القصوى ل H3K79me2، يمكن تطبيق ماكسبيكس. لتطبيع بامكوفيراجي ومقارنة بامكومباري الإدخال قابلة للاستخدام. لتصور النتائج IGV المستعرض و heatmaps مناسبة. تنسيقات الملفات المتوقع بالخط المائل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: ثقافة السلف القشرية وتثبيط DOT1L. إيمونوبلوتس (أ) تبين مستويات H3K79me2 في الحزب الشيوعي الصيني في E14.5 بعد تثبيط DOT1L لمدة 3 أيام (يوم 3، n = 3-11) بالمقارنة مع السيطرة [دمس]. واستخدمت ألفا H3 وجابده Tubulin كتحميل عناصر التحكم. (ب) إيمونوسيتولوجيكال تلطيخ ثقافة الحزب الشيوعي الصيني في أيام 2 و 3. تفعيل Caspase 3 (CASP3 الخضراء)-إيجابية الخلايا والخلايا العصبية (هوك/d: الأحمر) كانت الملون. تم استخدام DAPI (أزرق) لتصور نواة الخلية. شريط الحجم: 100 ميكرومتر. القياس الكمي (ج) إيمونوستينينجس قدم في (ب). نسبة الخلايا إيجابية ل CASP3 + DAPI + أو هوك/د/+ DAPI + في المئة تعطي. وأجريت للتحليل الإحصائي، تي-الاختبارات الطالب مزاوج. ف < 0.01 * *. تم تعديل هذا الرقم من رويدل et al. 33 , 38 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: رقاقة H3K79me2-قبكر من Aft4، Ddit3، Aft3، Scd1، و Npm1 من تكلفة النقرة تعامل مع مثبط DOT1L. Cpc E14.5 مشتقة من (أ) تعامل مع مثبط DOT1L مكم 5 ح 4-5 بعد عزلة، ومرة ثانية في اليوم الثاني في الثقافة. كانت ثابتة Cpc في اليوم الثالث، الذي أعقبه استخراج الكروماتين وتجربة رقاقة qPCR. النتائج التي يتم تمثيلها ك % يعني (+/--ووزارة شؤون المرأة) مدخلات (n = 3). مفتش واستخدمت كعنصر سلبي. ويرد متوسط مستوى مفتش كخط متقطع. للتحليل الإحصائي، طبق ANOVA ثنائي الاتجاه. ف < 005 *؛ ف < 0.01 * *، ف < 0.001 * * *؛ موقع بدء النسخي خدمات الدعم التقني، وقسم التدريب والامتحانات نهاية النسخي موقع. تم تعديل هذا الرقم من رويدل et al. 33 , 38 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: نظرة عامة على التحليل H3K79me2 رقاقة-seq. (أ) يبين بصمات الأصابع H3K79me2 رقاقة-seq من Cpc المستمدة من E14.5 مقارنة بالمدخلات إثراء شظايا من الحمض النووي ل H3K79me2 كفالة عالية جودة seq رقاقة. (ب) نتائج H3K79me2 رقاقة-seq المرسومة في heatmap. يتم عرض مناطق الجينوم المخصب بشدة باللون الأزرق. تحجيم 0 (أحمر داكن)-45 (أزرق داكن). H3K79me2 قمم القرب من خدمات الدعم التقني، والانخفاضات في اتجاه 3´ لقسم التدريب والامتحانات. (ج) تم تعيينها إلى الجينوم mm9 رقاقة-seq H3K79me2 ما يلي: وتصور مع عارض الجينوم التكاملية (IGV). يتم عرض شغل H3K79me2 الجينات ك log2 عدد من نسبة ما يلي بين رقاقة ويقرأ الإدخال الواحد كيلوباسي الواحدة مليون (المقياس: 09:50 ص). ويمثل الهيكل الجيني ريفسيق بينما يشير مربع أحمر إكسون الأولى بما في ذلك خدمات الدعم التقني. تظهر الجينات Aft4، Ddit3، Scd1، Aft3، و Npm1 . للمقارنة، يتم عرض إشارة H3K4me3 من نفس المنطقة الجينوم. موقع بدء النسخي خدمات الدعم التقني، وقسم التدريب والامتحانات نهاية النسخي موقع. تم تعديل هذا الرقم من رويدل38. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجينات المنطقة التمهيدي إلى الأمام 5 '-3' عكس التمهيدي 5 '-3'
Aft4 خدمات الدعم التقني جاكجاتكتكتاكجككاكا جكككتااكككجكككتتات
Aft4 خدمات الدعم التقني + 1500 كتكككجاتاتجاكاتجاككج تككاتكجااكاجاجكاتكج
Aft4 قسم التدريب والامتحانات ككجتاتاججتاجتكاجتجك آآجاتجاكاكتجاااكككاكا
Ddit3 خدمات الدعم التقني جتاكتجكتككجتكتاككك كاجاجاججككتجتاجكا
Ddit3 خدمات الدعم التقني + 2500 تكاجكاجككجتكتكاتاج كتكاجاتكككككاتجكت
Ddit3 خدمات الدعم التقني + 4500 جاجكتجاجككتجتاتجا تكاككتكتكجتتككتجج
Ddit3 قسم التدريب والامتحانات كاككاجكاتجاكاجتجج جتاككجتكتاتجتجكاجكك
Aft3 خدمات الدعم التقني آكتجاجاجكجكاكتككتك جكتجككجتكتاجكتجتا
Aft3 قسم التدريب والامتحانات كتجتجكاكااجتجكتك ججاتكتجككاتجتجاا
Scd1 خدمات الدعم التقني تاجتجاككاكاكاكاااجكتك كككاجتجتاتتجاتجاتتكك
Npm1 خدمات الدعم التقني تكككككتككاجتكاجتاكك كجتككتتككتجكجتجا
Npm1 قسم التدريب والامتحانات أججاكاتاكتاجاكاجككاج أجاتجاجكاجاكتجتكات
خدمات الدعم التقني: موقع ابدأ النسخي
تدريب الإحصائيين الأوروبيين: موقع نهاية النسخي

الجدول 1: قائمة بأجهزة الإشعال المستخدمة لرقاقة qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك طريقتان الرئيسي لأداء إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين للكشف عن الجينوم شغل التعديلات هستون، عوامل النسخ، هستون رمز القراء، والكتاب، أو ومحايات. واحد هو الأسلوب رقاقة الأصلي باستخدام nuclease هضمها، الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن، والآخر هو أن أسلوب عرضها باستخدام الكروماتين ثابتة في منهاج عمل بيجين، والمنفصمة، التي في نوكليوسوميس وغيرها من البروتينات المرتبطة الحمض النووي تساهمي ملزمة للحمض النووي 39-"رقاقة الأصلي" مع معدل الكشف عن الأجسام المضادة عالية ينبغي أن تنطبق على مثلايشن هيستون منذ الكروماتين وميثيلاتيونس هيستون مستقرا نسبيا طوال الرقاقة. ولكن حيث هناك حاجة إلى كمية كبيرة من ابتداء من المواد، فإنه لا ينطبق على دراسة التنمية القشرية أو الدماغ، حيث عدد الخلايا من العقول الماوس يقتصر عادة. على الرغم من أن عادة يتم رفع الأجسام المضادة ضد المواد غير ثابت، ونحن يمكن أن تثبت أن الجسم على وجه التحديد الكشف عن H3K79me2 منذ تثبيط محددة DOT1L يؤدي إلى انخفاض إشارة H3K79me2 في تحليل رقاقة--قبكر وفي إيمونوبلوتس (الشكل 2 ألف و الشكل 3A). شريحة باستخدام مواد cross-linked قد تكون غير فعالة، ولكن يضمن البروتوكول قدم المخصب بما فيه الكفاية على وجه التحديد المواد قبكر وتحليل تسلسل.

لرقاقة إلكترونية فعالة، يمكن أن تركيز الحزب الديمقراطي الصربي من المخزن المؤقت تحلل حاسمة، أن الحزب الديمقراطي الصربي ديناتوريس البروتينات ويجعلها متاحة لربط جسم. هذه الميزة أهمية خاصة بالنسبة H3K79me2، الذي تعديل هيستون تقع داخل المجال كروي من هستون 3 وجوهر الكروماتين في أصغر وحدة22نوكليوسومي. وهكذا، ل H3K79me2، أعلى تركيز الحزب الديمقراطي الصربي (حوالي 0.3% w/v) أثناء الفحص مطلوب لضمان وصول antigene الأمثل. نحن مع هذا التركز الحزب الديمقراطي الصربي، يمكن إثراء H3K79me2 عالية الضوابط مفتش (الشكل 3)، وعلى المدخلات (الشكل 4). وهكذا، نوعية المواد الرقاقة لتسلسل ملائم والإثراء عبر إدخال مشابهة لتلك التي H3K4me3 (الشكل 4). ونحن نتوقع أن ضرورة تركيز الحزب الديمقراطي الصربي نفسه لشريحة من علامة أحادية أو تريميثيليشن H3K79. وبصفة عامة، أكثر صرامة رقاقة المخزن المؤقت، شظايا الكروماتين أقل إيجابية كاذبة إيمونوبريسيبيتاتيد، إذا كانت نوعية الأجسام المضادة لا تتأثر بالمنظفات المستخدمة. في المستقبل، قد يكون ممكناً تطبيق البروتوكول المقدم إلى تعديلات أخرى هيستون داخل المجال كروي من هيستونيس.

إذا هي مناسبة لرقاقة الأجسام المضادة وهي مستقرة في أعلى تركيزات المنظفات، يتضمن البروتوكول أساسا اثنين من الخطوات الحاسمة. أولاً، تثبيت الخلايا والقص اللاحقة من الكروماتين ينبغي أن يكون الأمثل لكل نوع من الخلايا وكل أولتراسونيكاتور. العابرة للربط المطول يؤدي إلى تثبيت القطع الأثرية وقد خفض معدل الكشف عن الأجسام المضادة منذ المستضدات قد يكون مقنعا. القص الكروماتين اللازمة لتؤدي إلى توزيع حجم الحمض النووي بين 200 و 500 شركة بريتيش بتروليوم (الشكل 1B). تحتوي 147 من nucleosomes bp للحمض النووي. الكروماتين الشظايا التي تكون طويلة جداً سيؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة في قبكرس. أثناء تسلسل الجينوم على نطاق المنظومة، توزيع حجم غير صحيحة سيؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة، حيث تعتبر غالباً إلا أجزاء صغيرة. الخطوة الحاسمة الثانية هي إعداد المكتبة لتسلسل الجينوم على نطاق المنظومة. خطوة تضخيم الحمض النووي يحتاج إلى إجراء باستخدام PCR-دورات من 6-9. تجنب العديد من دورات بكر ضروري نظراً لأنها قد تؤدي إلى تحيز GC عالية وكثير من بكر التكرارات. مع البروتوكول المقدم، يمكن استرداد الحمض النووي ما يكفي إبقاء عدد اللازمة PCR دورات منخفضة.

أنسجة المخ يتكون من كمية متنوعة جداً من أنواع الخلايا مثل الخلايا العصبية و oligodendrocytes، وإطلاق الخلايا4. أثناء تطوير هذه الخلايا مستمدة من الخلايا الجذعية العصبية وبناء مناطق محددة في الدماغ ب طريقة تعتمد على وقت ومكان3. الخلايا قشرة الدماغ، فعلى سبيل المثال، يجري بين E11.5 و E18.5 في الفئران. في مراحل سابقة مثل E11.5 و E12.5 الخلايا تقريبا جميع السلف الهوية1، لكن التنوع الخلوي في وقت لاحق يجب أن يؤخذ في الاعتبار. ولذلك يمكن أن تكشف عن H3K79me2 أو أي تعديل هيستون الأخرى عند نقطة زمنية معينة أن شريحة من الأنسجة القشرية في E14.5 لكن يتعذر عرض ميزات محددة الكروماتين نوع الخلية. يمكن حل هذه المسألة بإثراء خلايا معينة مع خلية تنشيط Fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) أو خلية تنشيط مغنطيسية الفرز (فرز أجهزة ماكينتوش)40، وعملياً بعد تجانس المخ. مع أجهزة ماكينتوش--فرز الخلايا العصبية السلف التي تحمل علامات سطح خلية محددة يمكن تسميته بالخرز المغناطيسية وعزلها ثم استخدام حامل مغناطيسي40. وبعد ذلك يمكن مثقف الخلايا أو استخدامها مباشرة لشريحة. يمكن استخدام البروتوكول المقدم ليس فقط للخلايا العصبية السلف، بل أيضا لسائر السكان خلية متجانسة. وبالإضافة لنظام مراقبة الأصول الميدانية أو أجهزة ماكينتوش، يمكن تطبيق البروتوكول لكافة الخلايا إيسولاتابل داخل الكائن حي.

أخذت معا، البروتوكول قدم يجعل من الممكن للتحقيق هستون تعديل H3K79me2 في نقاط زمنية مختلفة للتنمية القشرية والدماغ بطريقة تتسم بالكفاءة واستنساخه. أنها يمكن أن تنطبق على تعديلات هيستون أخرى تقع ضمن صميم هيستون ويمكن تطبيقها على أنواع أخرى من الخلية متجانسة داخل الكائن الحي. منذ H3K79me2 تعديل هيستون مصانة23، قد يكون البروتوكول أيضا مناسبة لتحليل H3K79me2 ليس فقط في الفئران ولكن عبر الأنواع المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية

Acknowledgments

ونحن نشكر هنرييت بيرتيميس للمساعدة على إنشاء البروتوكول زراعة CGN داخل المختبر. وأيد هذه الورقة أسلوب "التخلق الطبية" الممولة من DFG CRC992 بتمويل للتلفزيون. يعترف الكتاب الدعم من "فريق غالاكسي فرايبورغ": فيديم بافانكومار، بيورن Grüning، والبروفيسور رولف باكوفين، المعلوماتية الحيوية، جامعة فرايبورغ، ألمانيا تمول "التعاونية أبحاث المركز 992 الطبية اللاجيني" (منحة DFG SFB 2012 992/1) والوزارة الألمانية الاتحادية للتعليم والبحوث (الفدرالية منحة 031 A538A ربك (دي. مبادرة حوض النيل)).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-GAPDH Abcam ab8245 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3 Abcam ab1791 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2 Diagenode pAb-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2 Abcam ab-051-050 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgG Diagenode C15410206 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alpha Abcam ab108629 Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml) Sigma-Aldrich T1147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x) Life Technologies 17504044 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Bioanalyzer Agilent technologies G2940CA Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGen Diagenode B01020001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4 Sigma Aldrich B6768 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection System Bio-Rad 1855201 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12 Life Technologies 11320-033 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein A Invitrogen 10001D Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676 Selleckchem S7062 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acid SERVA 39760.01 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v) Gibco 10082147 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
Glucose Sigma-Aldrich G5767 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml) Sigma-Aldrich G4251 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Glycine Carl Roth 3187 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermix Promega A6002 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt Solution Life Technologies 14025-100 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM) Life Technologies 25030081 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chloride Sigma-Aldrich L4408 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplement Life Technologies 17502048 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300 Thermo Fisher 3300 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NEB E7645S Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina NEB E7335 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal medium Gibco 21103049 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 Alternative Calbiochem 492016 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Paraformaldehyde Carl Roth 335 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) Life Technologies 15640055 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered saline Life Technologies 10010023 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen Kit Thermo Fisher P11496 Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma Aldrich P3655 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chloride Thermo Fisher AM9640G Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitor Roche 4693159001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase K Sigma-Aldrich 3115879001 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinElute Qiagen 28004 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAse Sigma-Aldrich R6513 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946 Selleckchem S7079 Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonate Carl Roth 8551.1 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chloride Carl Roth 9265 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfate Carl Roth 183 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH) Sigma-Aldrich SRP6004 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml) Sigma-Aldrich S7571 Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Carl Roth 9090 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100 Carl Roth X100 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) Sigma Aldrich 59417C Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20 Carl Roth 28320 Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
  2. Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
  3. Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327 (2005).
  4. Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
  5. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
  6. Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
  7. McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
  8. Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
  9. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  10. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
  11. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  14. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  15. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  16. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
  17. Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
  18. Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
  19. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
  20. Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
  21. Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
  22. Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
  23. Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
  24. van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
  25. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  26. Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485 (2015).
  27. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
  28. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  29. Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
  30. Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
  31. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  32. Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
  33. Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
  34. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  35. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
  36. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
  37. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
  38. Roidl, D. Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
  39. Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , Institut national de la santé et de la recherche médicale. (2001).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).

Tags

علم الأعصاب، العدد 131، الثقافة خلايا الدماغ، ثقافة الخلية القشرية، قشرة التنمية والتنمية الدماغ ومثلايشن H3K79، DOT1L، رقاقة، تثبيط DOT1L
عزل وزراعة المتكفل العصبية تليها الكروماتين-إيمونوبريسيبيتيشن من هستون 3 يسين 79 مارك ديميثيليشن
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S.,… More

Bovio, P., Roidl, D., Heidrich, S., Vogel, T., Franz, H. Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark. J. Vis. Exp. (131), e56631, doi:10.3791/56631 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter