Summary
Bu iletişim kuralı ile nörotransmitter Glutamat wholemount sıçan retina vitro kimyasal neurostimulation bir tür inceleme için bir roman yöntemi açıklar. Kimyasal neurostimulation konvansiyonel elektrik neurostimulation retina nöronların tarafından photoreceptor dejeneratif hastalıklara neden geri dönüşü olmayan körlük tedavisinde umut verici bir alternatiftir.
Abstract
Photoreceptor dejeneratif hastalıklar photoreceptor hücrelerinin ilerici kaybı yoluyla onarılamaz körlüğü retinada neden. Retina protezleri yapay olarak anlaşılır görsel algı hastalarda alabilme umuduyla hayatta kalan retina sinir hücreleri uyararak vizyon geri yüklemek için aramak photoreceptor dejeneratif hastalıklar için gelişmekte olan bir tedavi vardır. Geçerli retina protezleri görme zorluğu hastalara elektriksel olarak retina teşvik ama yüksek keskinlik, doğal vizyon hastalara yeniden önemli fiziksel engelleri yüz için bir dizi elektrot kullanarak geri yükleme başarısı göstermiştir. Kimyasal neurostimulation yerli nörotransmitter kullanarak biomimetic seçimli-e doğru elektrik stimülasyon ve elektrik neurostimulation kullanarak retina protezler ile ilişkili temel sınırlamaları bypass. Özellikle, kimyasal neurostimulation daha doğal vizyon ile karşılaştırılabilir veya daha iyisi visual acuities hastalara nörotransmiterler, retina tarafından kullanılan iletişim aynı doğal maddeleri çok az miktarda enjekte edilerek geri potansiyeline sahiptir Geçerli elektrik protezleri çok ince çözünürlükte kimyasal synapses. Ancak, nispeten keşfedilmemiş stimülasyon paradigma olarak retina vitrokimyasal uyarılması elde etmek için oluşturulmuş hiçbir protokol var. Bu çalışmanın amacı kimyasal retina retina kimyasal neuromodulation, potansiyel veya benzer eğitim almak isteyen araştırmacılar için uyarılması gerçekleştirmek için detaylı bir çerçeve sağlamaktır sinir doku içinde vitro. Bu çalışmada deneysel kurulum ve retina ganglion hücre (RGC) spike yanıt benzer görsel ışık yanıtlarında vahşi tipi almak için metodoloji açıklayan ve hacimleri enjekte edilerek photoreceptor dejenere wholemount sıçan retina kontrol nörotransmitter Glutamat cam MİKROPİPETLER ve özel birden çok bağlantı noktalı mikrosıvısal aygıt kullanarak subretinal boşluğa. Bu metodoloji ve iletişim kuralı diğer nörotransmitter veya hatta diğer nöral dokular kullanarak neuromodulation için adapte olmak için genel.
Introduction
Retinitis pigmentosa ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu gibi photoreceptor dejeneratif hastalıkların devralınabilir görme kaybı nedenleri lider vardır ve şu anda tedavi edilemez1,2. Her ne kadar bu hastalıkların belirli Genetik mutasyonlar çeşitli ortaya, photoreceptor dejeneratif hastalıklar sonunda körlüğü neden retina photoreceptor hücrelerde ilerici kaybı bir grup olarak karakterizedir. Photoreceptors Tetikleyicileri retina remodeling ama iki kutuplu hücreler ve RGCs, dahil olmak üzere retina sinir hücreleri hayatta yaygın kaybı sağlam ve photoreceptor dejenerasyon3 , ileri evrelerinde bile nispeten durumda kalır ,4,5,6,7.
Mekanizmaları ve bu hastalıkların patolojiler de karakterize3,4,5,6,7 ama etkili bir tedavi zor kalır. Son üç yılda bu gen terapisi8, kök hücre tedavisi9dahil olmak üzere photoreceptor dejeneratif hastalıklar ile etkilenen için vizyon geri yükleme yüklemek için tedavi tedaviler çeşitli araştırmacılar dünya çapında araştırdık, Retina nakli10ve hayatta kalan retina nöronların yapay stimülasyon11,12 . Bunlar geleneksel olarak bir dizi elektrot elektrikle amacı ile belirli desen iki kutuplu hücreler veya RGCs uyarmak için kullanılan yapay neurostimulation aygıtları olan retina Protezler, en klinik olarak kullanılabilir. yapay görsel algıları hastalar11' oluşturma. Şimdiki nesil elektrik Protezler, Argus II13 ve alfa-IMS14 aygıtlar gibi klinik onay ulaşmış ve ön çalışmalar belirtilmiştir var onlar yaşam kalitesini hastalar için geri yükleyerek geliştirmek olabilir bir Vizyon epiretinal (retina önü) ve subretinal (retina arkasında) kullanarak ölçü aygıtları15,16implante. Araştırma grupları dünya çapında başarılar bu ilk nesil cihazlar17,18,19,20 ötesinde retina protezleri ilerleyen üzerinde çalışıyoruz ama karşı karşıya kalmışlardır bir elektrik protezler hastalara yüksek keskinliği vizyon yasal körlüğü seviyesinin altında geri yükleme ve yetenekli tasarımı zorluklar. Son yıllarda yapılan çalışmalarda elektrik tabanlı protezleri zorlu tahakkuk enjeksiyon sınırı nedeniyle daha yüksek Uzaysal çözünürlük şimdiki nesil tarafından etkin daha ulaşmak, hangi güvenli bir şekilde uyarmak için büyük elektrotlar kullanımını gerektiren göstermiştir Retina nöronlar Uzaysal çözünürlük, Yani görme keskinliği11,21pahasına. Ayrıca, elektrik stimülasyonu daha da büyük ölçüde çünkü bu bir doğal olarak doğal olmayan stimülasyon paradigma21sınırlı, çünkü genellikle tüm yakındaki hücreleri uyarır ve bu nedenle hastaların, doğal olmayan ve kafa karıştırıcı algılamaları ortaya çıkarır. Yine de, elektrik stimülasyonu erken başarıları bu yapay neurostimulation photoreceptor dejeneratif hastalıklar için etkili bir tedavi olabilir göstermiştir. Bu daha da etkili bir tedavi nörotransmitter kimyasal madde, kimyasal sinapslar, iletişimin doğal maddeleri ile retina uyararak ulaşılabilir olduğu konusunda broşürüne birine yol açar. Bu raporda sunulan yöntemin amacı biomimetic seçimli-e doğru elektrik stimülasyon olarak retina sinir hücreleri arasındaki sinaptik iletişimin doğal sistem taklit amaçlayan kimyasal stimülasyon, terapötik fizibilite keşfetmek etmektir Retina protezi için.
Kimyasal olarak hedef retina nöronlar bir mikrosıvısal serbest Glutamat gibi yerel nörotransmitter küçük miktarlarda ile üstünde harekete geçirmek için kimyasal bir retina protez tedavi edici kimyasal uyarımı kavramının çeviri dayanır microports görsel stimülasyon yanıt olarak büyük bir dizi oluşan aygıt. Bu şekilde, kimyasal bir retina protez aslında doğal kimyasal sinyalleri retina ulaşan fotonların çeviren bir biomimetic yapay photoreceptor katman olur. Beri bu kimyasal sinyaller normal retina sinyal kullanılan aynı nörotransmitter kullanın ve hayatta kalan retina sinir hücreleri dejenere retinanın normal görme yolları, ortaya çıkan görsel tarafından kullanılan aynı Sinaptik yolları aracılığıyla teşvik kimyasal bir retina protez elde algı bir elektrik bir protez ile uyarılmış kıyasla daha doğal ve anlaşılır olabilir. Hangi aracılığıyla nörotransmitter are serbest bırakmak microports son derece küçük ve elektrotlar, aksine yüksek yoğunluklu olarak dizilmiş yapılabilir beri Ayrıca, potansiyel bir kimyasal protez daha fazla odak stimülasyon elde edebilecektir ve daha yüksek olabilir kayma çözünürlük daha elektrik bir protez. Böylece, bu potansiyel avantajları üzerinde bağlı olarak, kimyasal bir retina protez elektrik protezleri için çok umut verici bir alternatif sunuyor.
Retina, kimyasal uyarılması ancak, nispeten küçük yakın zamana kadar keşfedilmeyi. Retina elektriksel stimülasyon de işin içinde vitro22,23, in vivo23,24ve klinik çalışmalar13 yılda karakterize iken ,14, kimyasal stimülasyon üzerinde çalışmalar sadece birkaç vitro çalışmalar25,26,27,28için sınırlı olmuştur. Iezzi ve Finlayson26 ve Inayat vd. 27 tek bir elektrot ve bir multielectrode dizisi (MEA), sırasıyla, retina nöronların uyarılmış Glutamat yanıt-e doğru kaydetmek için kullanılarak retina vitro epiretinal kimyasal uyarılması gösterdi. Daha yakın zamanlarda, Rountree vd. 28 Glutamat subretinal yan ve bir MEA retina birden fazla sitede nöronal yanıtlarını kaydetmek için kullanma ve retina yolları fark uyarılması gösterdi.Bu eserleri birime kimyasal uyarımı fizibilite kurduk, daha fazla çalışmaları birçok araştırmak için gerekli olmakla birlikte, bu yaklaşım o ötesinde yönlerini ele defa25,26,27 , 28, yukarıda da açıklandığı gibi kimyasal bir retina protez bu kavramı tercüme önce tedavi edici stimülasyon parametreleri vitro ve in vivo hayvan modellerinde ince ayar. Ancak, şu anda edebiyat retinada kimyasal uyarılması yerine getirmeye için kurulan hiçbir metodoloji ve ikileştirici çalışmaları için gerekli olacaktır gibi önceki işlerde kullanılan yöntemleri böyle ayrıntılı olarak tarif edilmiştir değil. Bu nedenle, bu müfettişler ya bizim önceki çalışmalar27çoğaltılıyor baktılar için retina vitro kimyasal uyarılması yürütmek için iyi tanımlanmış bir çerçeve sağlamak için bu yöntemleri kağıt mantığı olduğunu, 28 ya da daha fazla kimyasal neurostimulation doğmakta olan bu kavramı ilerleyen.
Burada biz vahşi tipi fareler ve yakından photoreceptor dejeneratif ilerlemesini taklit eden bir photoreceptor dejenere fare modeli wholemount retina retina nöronlarda vitro kimyasal uyarılması yürütmek için bir yöntem göstermek hastalıkların insanlarda. Tedavi aralıkları çeşitli stimülasyon parametreleri değerlendirmek ve imkansız veya içinde içinde gözlemlemek zor olurdu nöral yanıt özellikleri çalışma için bu stimülasyon yöntemi vitro modelleri geliştirmek arkasındaki mantığı olduğunu vivo modelleri, özellikle ilk çalışmalar sırasında odaklı bu yaklaşımın fizibilite değerlendirme. Bu yordam, biz 1 mM Glutamat hedef yolu ile piyasada bulunan tek bağlantı noktalı cam MİKROPİPETLER ve özel bir retina nöronlar yakınındaki küçük miktarlarda sunarak hem tek siteler ve eşzamanlı multi-yer kimyasal elektrodlar, retina göstermek micromachined çok bağlantı noktalı mikrosıvısal aygıt, anılan sıraya göre. Tek-site ve Multi-yer elektrodlar kimyasal neuromodulation tedavi edici fizibilite araştıran temel hedefi başarmak iken, her benzersiz bir avantaj ile farklı bir amaca hizmet eder. Piyasada bulunan önceden çekti cam MİKROPİPETLER ile başarılı, tek-site stimülasyon doğrudan içine tek bir site, retinanın yeraltı Kimyasalları enjekte için kullanılan ve gözlemlenebilir RGC oranı spike araştırmak için hizmet vermektedir görsel olarak uyarılmış ışık yanıt benzer yanıt focally enjeksiyon yeri altında elde edildi. Öte yandan, özel fabrikasyon birden çok bağlantı noktalı mikrosıvısal baðlantýsýnýn, multi-yer stimülasyon, retina yüzey üzerinde birden çok sitelerde dağınık şekilde kimyasal enjekte için kullanılan ve ne kadar iyi Glutamat uyarılmış RCG araştırmak için hizmet vermektedir Yanıt desen desen stimülasyon çalışmalarında Glutamat enjeksiyon kalıpları karşılık gelir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları için Ulusal Araştırma Konseyi Kılavuzu tarafından özetlenen yönergelere uygun olarak yapılmıştır. Hayvan işleme ve ötenazi protokolleri gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Chicago, Illinois Üniversitesi tarafından onaylanmış.
1. hayvan modelleri
- Vahşi tipi uzun-Evans fareler
- 24-32 gün eski vahşi tipi uzun Evans kukuletalı sıçan bir standart 12 h gündüz/gece ritmi ile harekete geçirilen her iki cinsiyetten temin etmek.
- Karanlık uyum sıçan deney başlamadan önce 1 h için tamamen karanlık bir odada yerleştirerek.
- S334ter-3 fareler
- Mutant rhodopsin gen photoreceptor dejenerasyon sergi Pigmentli heterozigoz S334ter-3 fareler üretmek için Pigmente vahşi tipi uzun-Evans fare ile iki kopyasını ifade transgenik albino homozigoz S334ter-3 fare (her iki cinsiyetten), çizgiyi ilerleme insan retinitis pigmentosa29,30benzer.
- Standart 12 h gündüz/gece ritim ile heterozigoz çoluk çocuk yetiştirmek ve deneyler aşağıdaki photoreceptor dejenerasyon aşamaları için karşılık gelen aşağıdaki yaş için fareler her iki cinsiyetten kullanın: erken sahne dejenerasyon: 14-20 gün eski; Orta sahne dejenerasyon: 21-27 gün eski; Geç sahne dejenerasyon: 28-35 gün eski; Tamamen kör: > 50 gün eski.
- Karanlık uyum sıçan deney başlamadan önce 1 h için tamamen karanlık bir odada yerleştirerek.
2. Ames'in orta çözüm ve perfüzyon sistemi hazırlanması
Şekil 1: deneysel kurulumunun şematik. Bir cam micropipette (A) ve (B)özel birden çok bağlantı noktalı mikrosıvısal aygıt kullanarak kimyasal uyarılması için deneysel kurulumunun şematik. Retina üzerinde pMEA yerleştirilir ve sürekli taze, oksijenli Ames orta solüsyonu pMEA delikler aracılığıyla alt ve üst üzerinden periosteum. PMEA elektrotlar tarafından aldı nöral yanıt sinyalleri MEA amplifikatör veri toplama bilgisayarın içine beslenir. Görsel ve kimyasal uyarımı başarılı bir yeşil LED ve 8-kanal basınç enjektörü sırasıyla kullanarak ve her iki çekim gücü de pipet ile hassas 3 eksenli konumlandırmak için kullanılan bir özel uyarıcı bilgisayar tarafından tetiklenen micromanipulator. Ters bir mikroskop retina bir deney sırasında gözlemlemek için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: deneysel Kur. (A)tüm bileşenleri göreli konumları gösteren deneysel Kurulumu tamamlamak fotoğrafı. MEA amplifikatör sistem retina kontrol edin ve dijital olarak aygıt-retina arabirimi yoluyla bağlı yüksek hızlı kamera deneme sırasında görüntü için kullanılan bir ters mikroskobu üstüne yerleştirilir. Üst ve alt perfüzyon bağımsız olarak bir solenoid kumandalı perfüzyon sistemi kullanılarak denetlenir. Başarılı bir basınç enjektörü, micromanipulator ve yama kelepçe amplifikatör kullanarak enjeksiyon, pozisyon kontrolü ve empedans ölçümleri (turuncu kutu; daha ayrıntılı B olarak gösterilen), anılan sıraya göre. Micropipette veya aygıt bir yama kelepçe headstage empedans ölçümleri için eklenen ve bir makas köprüsü üzerinde monte edilmiş (yeşil kutusu tarafından belirtilen; daha ayrıntılı C olarak gösterilen) bir micromanipulator kullanarak konumlandırma kolaylaştırmak için. (B) bir close-up deneyde kullanılan ölçü ve kontrol aletleri: 8-kanal basınç enjektörü, micromanipulator kontrol sistemi, empedans ölçümü için yama kelepçe amplifikatör ve perfüzyon ortadan kaldırılması için emme gemi. (C) birden çok bağlantı noktası bir aygıt gösterilen enjeksiyon sistemi Portal bir close-up pipet tutucu, yama kelepçe headstage ve micromanipulator sızdı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: perfüzyon Kur. (A)üst perfüzyon ve emme gibi görsel ışık stimülasyon için kullanılan yeşil LED yerini gösteren MEA amplifikatör üst fotoğrafı. (B) üst perfüzyon ve emme, pMEA ve empedans ölçüm için kullanılan referans elektrot kesin yerlerini gösteren pMEA perfüzyon odası yakın çekim. (C) alt perfüzyon plaka bir photomicrograph. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Not: Bkz: Resim 1, Resim 2ve şekil 3
- 900 mL de-iyonize su oda sıcaklığında (~ 21 ° C) dışarı ölçmek ve 1 L kapsayıcısına getirin.
- Su ile %100 CO2 kabarcıklanma mekanizmasını kullanarak sıvı.
- 8,8 g toz Ames orta 1 L kap içerisinde su ekleyin.
- Ames'in orta kapsayıcı bir kaç mL çıkarmak tüm izini sürmek-toz Ames orta ve 1 L kapsayıcıya Ekle için de-iyonize su ile durulayın.
- 25.3 mL sodyum bikarbonat çözeltisi (% 7,5 w/v31) 1 L kapsayıcıya ekle.
- 1 L. son bir hacim için çözüm getirmek için ek su ekle
- Ventriküler su yaklaşık 5 min için CO2 ile devam edin.
- CO2 perfüzyon durdurmak ve çözüm % 95'i O2 ve %5 CO2 en az 30 dk ya kadar pH 7.4 stabilize Medikal gaz karışımı ile Ventriküler başlar.
Not: Bu protokol amacı gereği, Ames orta oda sıcaklığında hangi hava kabarcıkları perfüzyon çizgilerle tıkamanın (~ 21 ° C) CO2 veya O2 fışkırması gelen önlemek için deney boyunca tutulur. - % 70 etanol ile doldurarak alt ve üst perfüzyon tüpler temiz ve sonra her iki hat 3 kez de-iyonize su ile yıkayın. Alt satırda de-iyonize su ve hava ile üst satırında ile doldurun.
3. Wholemount retina hazırlık
Şekil 4: retina diseksiyon ve wholemount hazırlanması. (A) sağlam bir kadeh photoreceptor dejenere bir hayvandan alınan fotoğrafı. Bu düzleştirmek için (B) Photomicrograph boyuna kesim ile retina. (C) retina düzleştirme sonra bir kafes ızgara mesh irtibata photoreceptor yanında yer alıyor ve orada emin olmak için (dışında perfüzyon orta) havada basık hiçbir kıvrımlar veya kıvrılmış kenarlar vardır. (D) mesh ve retina ganglion hücre yan elektrotlar irtibata pMEA için hızlı bir şekilde transfer ve hemen periosteum ile oksijenli Ames orta. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: delikli multielectrode dizi. (A) protokolünde kullanılan delikli multielectrode dizi fotoğrafı. Retina (daha ayrıntılı B olarak gösterilen kırmızı dikdörtgen gösterilir) elektrot dizi üzerinde oksijenli Ames orta ile sürekli perfüzyon izin vermek için pMEA odası içinde yer alıyor. (B) elektrot dizinin kendisi elektrot arasındaki delikler yerleşimi gösteren bir photomicrograph. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Not: Şekil 4 ve şekil 5 bakın
- El bir kırmızı LED el feneri loş kırmızı aydınlatma sağlar, hayvan ardından servikal yerinden çıkması veya seçtiğiniz başka bir yöntem, karbon dioksit Havasızlıktan Boğulma yoluyla IACUC protokolleri göre ötenazi için kullanarak.
- Bir kuyumcu 's #5 forseps kullanarak her iki gözde enucleate ve 60 mm çap petri kabına yaklaşık 3-4 mL taze, oksijenli Ames orta çözeltisi ile enucleated gözleri yer.
- Üst ve alt aydınlatıcılar ile bir diseksiyon stereomicroscope gözünden gözlemleyerek kırmızı filtre perde ile örtülü yaparken küçük bir insizyon attım bir neşter ya da keskin makas kullanarak kornea yüzüne.
- Bu küçük kesi kornea kenarına kesebilir ve daha sonra tüm kenar çevresinde çevresel bir bölümü olan kornea kesme genişletmek. Şimdi müstakil kornea ile birlikte objektif, yarı saydam sulu ve vitreus anlayışımızı kaldırın.
- Yavaşça tutarken forseps, bir çift ile kadeh, kadeh, ters tarafında iki küçük kesikler dikkatle olun. Sonra iki çift forseps yavaşça kadeh her kesi de ayır ve retina sklera ayırmak için kullanın. Yavaş yavaş tüm retina sklera ve kadeh kaldır. Hala bağlıysa Optik siniri kes.
- Yarım veya çeyrek makas kullanma bölümlerine elde etmek için retina boyuna kesim yapmak ve sonra yavaşça ganglion hücreleri (retina içbükey tarafı) bakan mesh uzak bir retina bölümü bir naylon mesh (100 µm iplik çapı 350 µm açılış ile) üzerine yayılmış.
- Mesh ve retina ganglion hücrelerinin pMEA yüzeyi ile temas ile delikli multielectrode dizi (pMEA) üzerine yerleştirin. Sonra yavaşça ağırlıklı dilim ızgara retina tutmak için kafes üstüne yerleştirin.
4. MEA ve veri toplama Kur
Şekil 6: gürültü düzeyleri pMEA. (A) temsilcisi kayıt bir alt pMEA elektrot yüksek kalıcı gürültü sergilenmesi. Bu gürültü genellikle pMEA kişi yastıkları ve ince delikli polimid katmanının normal aşınma sonucu olarak MEA amplifikatör pinler arasında uygun iletişim eksikliği nedeniyle özellikle kişi yastıkları, pMEA bitti. Gürültü diğer olası kaynağı genellikle pMEA amplifikatör kişi yastıkları sızdırılmış çözümdür. Sürekli gürültü zavallı PIN nedeniyle iletişim ve/veya çözüm yastıkları genellikle daha iyi temas ve temizleme ve kurutma yastıkları, sırasıyla elde etmek için belgili tanımlık amplifikatör içinde pMEA konumunu ilerletmeniz düzeltilebilir temas sızdırılmış. Gürültü temizleme veya pMEA konumu değişen ortadan olamaz, pMEA tamamen değiştirilmesi gerekebilir. (B) alt kümesindeki pMEA elektrotlar temiz pMEA pMEA ve amplifikatör arasında iyi temas ile gelen gürültü seviyeleri temsilcisi kaydı. Genellikle, ortalama gürültü seviyesi ±16 µV. içinde olduğunu Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Not: Şekil 6 :
- Loş kırmızı aydınlatma altında MEA amplifikatör içinde pMEA yerleştirin ve amplifikatör sürgüler kapatın.
- Başvuru işaretleri pMEA odası halkada mevcut değilse iki 'X' etch-şekilli işaretleri aralıklı yaklaşık 5 mm ayrı bir alanda yukarıdan kolayca görünür boom-stand takılan mikroskopla.
- En iyi perfüzyon çıkış içinde pMEA odası getirin ve yaklaşık 3 mL / dakika bir perfüzyon oranı elde etmek için en iyi perfüzyon Vana açın. En iyi emme giriş istenen perfusate düzeyinde (~ 5 mm derin) konumlandırın ve çalıştığından emin olun.
- Veri toplama yazılımı veri toplama bilgisayarda açın ve veri almaya başlamak için 'play' butonuna tıklayın. Tüm pMEA Kanallar noise etkisinden uzak ve kayıt sinir sinyalleri olduğundan emin olun.
- Ters mikroskop görüş alanı bir canlı dijital görüntü bir monitörde bakarak, pMEA çözüm alt perfüzyon plaka akan bir kanıt için alt yüzeyine gözlemlemek.
5. Glutamat stimülasyon hazırlık
Şekil 7: cam micropipette ve birden çok bağlantı noktalı mikrosıvısal cihaz. (A) bir micropipette veya aygıtı takmadan önce bir pipet sahibi. Gümüş/gümüş klorür elektrot (50 µm çapı) elektrikle sonuna kadar arabirimi bağdaştırıcısında için yama kelepçe headstage ile birleştiğinde. (B) pnömatik enjeksiyonları başlatmak için kullanılan basınç noktası konumunu gösteren pipet sahibi ile cam micropipette fotoğrafı sızdı. (C) bir özel birden çok bağlantı noktalı mikrosıvısal aygıtı (1 cm 1 cm 0,134 cm) bir özel 3D baskılı fikstür için bağlı ve paslanmaz çelik tüpünden pipet sahibi ile sızdı. İki kat fabrikasyon, cihazın alt tabaka (340 µm kalınlığında) ve sekiz üstünde-küçük parça rezervuarlar sekiz microports (çapı 14 µm) vardır (çapı 1,6 mm) Glutamat üst tabaka (1 mm kalınlığında) depolamak için. Her biri sekiz microports cihazın alt katmandaki bağımsız olarak bir uçak-microchannel ile üst tabaka bir üstünde-küçük parça rezervuar bağlıysa ve her üstünde-küçük parça rezervuar sırayla 8-kanal basınç enjektörü, bir basınç bağlantı noktasına bağlı bir esnek tüp microports desenli birden fazla site enjeksiyonlar için bağımsız çalıştırma izin vermek için. (D) sekiz bağımsız olarak adreslenebilir üstünde-küçük parça rezervuarlar ve boru giriş düzenini gösterilen boru arabirimi fikstür eklemeden önce cımbız tarafından düzenlenen birden çok bağlantı noktası aygıtı yakın çekim. (E) 3 x 3 yapılandırma pMEA elektrotlar ile hizalamak için 200 µm Aralık ile düzenlenmiş sekiz 14 µm-çapı microports gösterilen cihazın alt yüzeyi bir photomicrograph. Merkezi bağlantı noktası kesinlikle hizalama sırasında cihazın imalatı için kullanılan süre sekiz microports dışında birden fazla site enjeksiyonlar için kullanılmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Not: Bkz. Şekil 7.
- Glutamat çözüm hisse senedi Glutamat 0.5 mL örnek bir çalışma konsantrasyonu 1 mM Glutamat, Ames orta çözüm oksijenli seruma karıştırarak hazırlayın.
- Dikkatli bir şekilde önceden çekti 10 µm çapı micropipette veya birden çok bağlantı noktalı mikrosıvısal aygıta 50 µm-çapı gümüş/gümüş klorür tel elektrot içeren bir çift pipet yuvasına bağlı paslanmaz çelik çubuk yerleştirin.
Not: Gümüş/gümüş klorür tel elektrot empedans algılama yoksa, atlanabilir. - Yama-kelepçe headstage ile pipet sahibi arabirim ve basınç bağlantı noktası radarı bağlantısı pipet sahibinin Kanal 1 basınç enjeksiyon sisteminin bir cam micropipette kullanan varsa bağlanmak veya basınç bağlantı noktası radarı bağlantıları her bağlantı 8 Silindir bağlantı noktaları kanal birden çok bağlantı noktası aygıtı kullanıyorsanız basınç enjeksiyon sistemi 1-8.
- El ile basınç enjeksiyon sisteminde ve Kanal 1 (veya kanal 1-8, uygulanabilir olduğunda) açın. Sistem Bacalı atmosfere ve enjeksiyon basınç ayarlı 0.1 psi için emin olun.
- Micromanipulator üzerinde açmak ve manipülatör denetleyicisinde 'Kalibre' düğmesine basarak kalibre. Micropipette ipucu (veya cihazın alt tarafına, uygulanabilir olduğunda) yaklaşık 30 mm MEA amplifikatör yukarıda olan micromanipulator konumlandırın.
- Glutamat çözüm (1 mM Glutamat standart Ames orta) ile küçük bir petri doldurun ve micromanipulator yerleştirin. Düşük micropipette ipucu (ya da aygıt) çözüm ve dolgu (emme baskısı -13 H2O) basınç enjeksiyon sisteminde 'Doldurma' düğmesine basarak kadar çözüm yaklaşık 20 mm cam micropipette görünür veya birden çok bağlantı noktası aygıtı boru.
- Birden çok bağlantı noktası aygıtı kullanıyorsanız, kapalı basınç enjektörü 1 kanal ve protokol kanalları 2-8 için tekrarlayın. Micropipette ipucu veya çözüm cihazınızdan kaldırmak, petri kabına kaldırmak ve micromanipulator pMEA odası üzerinde konumlandırın.
- Boom-stand-monte stereomicroscope kullanarak, pMEA odası halka içine kazınmış başvuru işaretleri ile micropipette ipucu veya cihazın köşelerini hizalayın. Manipülatör pozisyonlar 'Mağaza başvuru A' ve 'Mağaza başvuru B' düğmelerini kullanarak kontrol yazılımı içine depolamak (ya da sade bir şekilde manipülatör koordinatları el ile Not) manipülatör pMEA elektrotlar ile koordinat sistemi eşleştirmek için.
- Manipülatör kontrol yazılımı kullanarak bir hedef pMEA elektrot sağlam spontan aktivite ile seçin ve cam micropipettewith hedef elektrot hizalamak için 'Kanal Taşı' düğmesini tıklatın.
6. Retina ile arayüz
- Empedans ölçüm varsa, yama kelepçe amplifikatör üzerinde açmak ve empedans görselleştirme yazılımları pipet tutucu içinde gümüş/gümüş klorür elektrot empedans görselleştirmek için 'Başlat' düğmesini tıklatarak başlatın. Kesilmediğini gözleyerek gerçek zamanlı empedans sinyalleri yavaş yavaş düşük micropipette ya da aygıt empedans hızlı bir artış gösterildiği gibi retina yüzeyine kişiler kadar (bkz. şekil 8) sinyal. Kaydedebilir veya retina yüzeyine konumunu not alın.
- Empedans ölçüm kullanılabilir durumda değilse, bu daha az hassas olsa görsel gözlem yoluyla retina yüzeyi ile temas algılamak. Gözle görülür Ames orta çözüm MEA odasında üst yüzeyi rehber dek pipet veya aygıt indirin.
- Retina üst yüzeyinde gözle görülür, retina yüzeyle temas yapıldığı yeri gösteren görüntü çok bozuksa kadar sonra üst kısmındaki retina ters bir mikroskopla kesilmediğini gözleyerek, yavaş yavaş pipet veya aygıt daha düşük. Kaydedebilir veya retina yüzeyine konumunu not alın.
- Yeraltı uyarılması için pipet daha düşük 40 µm (için S334ter-3 retina) veya 70 µm (için vahşi tipi retina).
- Bir kaç kısa süreli (10-30 ms) enjeksiyonları hücreleri micropipette ipucu yakınındaki veya aygıt microports sinir sinyalleri ile veri toplama gözlemleyerek Glutamat uyarmaya yeni fikirlere açık mı belirlemek için basınç enjeksiyon (0,1 PSI) sistemi kullanarak gerçekleştirmek yazılım.
Not: Başarılı enjeksiyonları açıkça görünür spike oranı veri bloğu veya spike inhibisyon temin (bkz. Şekil 9). Yanıt gözlem yapılırsa farklı bir elektrot micropipette veya aygıt yeniden konumlandırın.
Şekil 8: empedans ölçümü. (A) empedans ölçüm tekniği haritası açılıyor. Yavaş yavaş retina yüzeye indirilir gibi yama kelepçe amplifikatör kullanarak, micropipette empedans sürekli olarak izlenir. Micropipette retina olduğunda, nispeten yüksek iyonik iletkenlik Ames orta düşük empedansı gönüllülük içinde oluşur. Micropipette yapar gibi retina yüzeyi ile temas, gümüş/gümüş klorür telden iyonik iletkenlik ölçüm empedans hızlı bir artışa neden azalır. (B) empedans değişiklik gösteren bir arsa hemen önce ve pipet ucu retina yüzeyle temastan sonra kaydedilmiş. Micropipette ipucu çözümde ölçülen empedans nispeten düşük olduğunda yalnızca (soldaki turuncu bölge gösterilir) kişiyi önce. İletişim (kırmızı ok ucu ve sağdaki yeşil bölge tarafından gösterilen) yapıldıktan sonra empedans retina doku ile temas üzerine azaltılmış iyonik iletkenlik nedeniyle hızla artar. Uygulamada, retina yüzeyinde ölçülen empedans (kırmızı ok ucu konumunu) dik yükselişi başlangıcı için karşılık gelen yükseklik olarak kaydedilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9: sinirsel aktivite sırasında görsel, spontan, elektrot kayıtları ve Glutamat enjeksiyon kayıtları. Yüksek geçiren gösterilen dokuz pMEA elektrotlar (A) temsilci kayıtları her dikdörtgen benzersiz bir elektrot nöral verilerden gösterir nerede yeşil LED ışık görsel stimülasyon sırasında elektrot verilere filtre. Her elektrot kayıt açık yeşil ışığı (zamanlama her arsa turuncu ok uçları ile gösterildiği) sol Axes gösterilen ortak gerilim ölçekli açtıktan sonra ilk ikinci toplanan verileri gösterir. Sivri bir eşik gerilim-18 µV (her elektrot arsa yatay kırmızı çizgi) kullanarak tespit edilmiştir ve yeşil elektrot verilerin üzerine siyah izlemeler tarafından temsil edilir. Görsel stimülasyon üst orta bir inhibitör yanıt-e doğru ışık sahip biri dışında tüm elektrotlar sivri (uyarma) bir patlamaya neden oldu. (B) görsel veya enjeksiyon uyarılma olmadan kendiliğinden sinirsel aktivite gösterilen aynı elektrotlar için benzer bir komplo. Daha küçük patlamaları mevcut olmasına rağmen sivri şekillerinin çok farklı görsel stimülasyon karşılık olarak kaydedildi. (C) elektrotlar aynı alt küme temsilci kayıtları hemen sonra merkez elektrot (zamanlama her arsa turuncu ok uçları ile gösterilen), Glutamat enjeksiyon kaydetti. Enjekte Glutamat görsel olarak uyarılmış spike patlamaları çok benzer Merkezi elektrot sivri bir patlama elde edildi. Diğer elektrotlar iyi Uzaysal çözünürlük kimyasal stimülasyon tekniği gösterir Glutamat enjeksiyon tarafından etkilenmemiş idi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
7. retina kayıt ve uyarıcı Program başlatmak
- Yeşil LED retina üst yüzeyine doğru gelecek şekilde yönlendirin. Veri toplama yazılımı kullanarak özel kayıt bilgisayarda dosya adını yazarak ve "kayıt" düğmesini tıklatarak kaydı başlar.
- Kayıt başladıktan sonra uyarıcı denetim programı açın ve "Uyarıcı dosyayı oku" düğmesini tıklatarak varsayılan uyarıcı dosyasını yükleyin. Ardından, aşağıdaki notta açıklandığı bir çekim gücü ve veri Alım Protokolü oluşan varsayılan uyarıcı dosyasını başlatmak için "Run uyarıcı dosya" düğmesini tıklayın.
Not: (i) 30 deneme 2 s ON ve yeşil LED kullanarak 2 s OFF tam alan flash (5 lm/m2 yoğunluğu). (II) 120 s veri benzer bir zaman ölçeği üzerinde retina spontan etkinliklerini kaydetmek için yeşil LED kullanmadan. (III) Glutamat enjeksiyonları (yaklaşık 100-300 pL enjeksiyon başına) kez 10-30 ms enjeksiyonlu 0,1 PSI ve 3 s interpulse süreleri 30 denemelerin oluşan Glutamat enjeksiyonları 1 veya daha fazla ayarlar. Multi-yer enjeksiyon söz konusu olduğunda, aynı anda enjekte etmek için 2 veya daha fazla bağlantı noktalarını seçin.
Şekil 10: Peristimulus çubuk grafikler görsel, spontan, ve Glutamat yanıt. (A) temsilcisi peristimulus çubuk grafikler (30 ms binwidth) Þekil 9A, elektrotlar alt kümesindeki spike verilerin görsel ışık stimülasyon 20 denemeler arasında ortalama. Ortak bir spike oranı ölçeği için tüm elektrotlar uygulandı ve sol Axes üzerinde gösterilir. Siyah satır her elektrot arsa, tüm sivri yeşil LED açtıktan sonra ilk ikinci sırasında kaydedilen ortalama spike oranı temsil eder. Görüldüğü gibi görsel stimülasyon geçici eksitatör spike oranı yanıtı bir geçici inhibitör yanıt-e doğru ışık vardı üst orta elektrot hariç tüm elektrotlar, neden oldu. (B) herhangi bir görüntü veya kimyasal uyarımı olmadan aynı elektrotlar, ortalama spontan spike oranı yanıt kaydedildi. Dürtme elektroda spike oranları nispeten sabittir. (C) ortalama spike oranı yanıt-e doğru yanıt Merkezi elektrot yukarıda bir yerde Glutamat enjeksiyon olarak aynı elektrotlar, kaydetti. Yalnızca geçici yanıt belirgin elektrot doğrudan enjeksiyon yeri altında eksitatör yanıttır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol kimyasal olarak hem normal, vahşi tipi retina hem de photoreceptor uyarmak için kullanılan önemli hücresel photoreceptors kaybına neden remodeling rağmen retina, dejenere. Her iki photoreceptor ile deneyler başlayan dejenere veya vahşi tipi retina kayıt ve stimülasyon ekipman (Resim 1 ve Şekil 2) gerek hazırlandılar için temizlenmiş ve pMEA (şekil 5) en aza indirmek için önce gürültü her elektrot kanal (şekil 6). Her ne kadar photoreceptor dejenere retina daha ince ve bu nedenle daha vahşi tipi retina daha hassas, aynı diseksiyon yordam (şekil 4) her ikisi için de kullanılır. Aşağıdaki diseksiyon, retina dikkatle üstüne pMEA ganglion hücre yüzü elektrotlar bakacak şekilde ve MEA amplifikatör içinde (şekil 3A), güvenli pMEA nerede o sürekli taze, oksijenli Ames ortamından ile derin yerleştirilir Her iki üst (şekil 3B) ve alt (şekil 3 c). Retina cerrahi travma stabilize olduktan sonra bir cam micropipette veya birden çok bağlantı noktası aygıtı pipet yuvasına (şekil 7A-E) ile donatılmış ve kimin pozisyon 3 eksenli tarafından kontrol edilir bir yama-kelepçe headstage ile sızdı hassas micromanipulator. Pipet veya aygıtın microport(s) sonra olmalı bir hedef elektrot ile uyumlu ve iletişim şekil 8 ' de gösterilen veya görsel olarak mikroskobu doğruladı empedans yöntemini kullanarak tespit edilebilir kadar dikkatli bir şekilde indirdi. Bir kez verdiği enjeksiyon teslim bağlantı noktaları yüzey veya yeraltı retina uygun konumda yer alıyor, stimülasyon program başlatılabilir.
Sinirsel aktivite kayıtların bir alt kümesini pMEA elektrotlar, temsili bir dizi görsel (Þekil 9A), spontan (şekil 9B) ve exogenously enjekte Glutamat (şekil 9C) uyaranlara için Şekil 9 ' da gösterilmiştir. Başarılı görsel ve kimyasal elektrodlar RGC sivri patlamaları veya etkinlik, Şekil 9örneklerde de görüldüğü gibi spiking geçici durdurulması olarak gözlemlenebilir genellikle. Yakındaki hücreleri kimyasal uyarmaya yanıt vermiyor ise, elde edilen spike veri spontan spiking davranış için benzer görünecektir. RGC sivri ayıklanması ve bunların denemeler düzenlenmesi sonra üzerinde her elektrot nöral yanıt bir ortalama peristimulus zaman çubuk grafik (PSTH) bu şekil 10' da gösterilen gibi spiking oranı kullanarak ham için karşılık gelen Ayr›ca elektrot veriler Şekil 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yöntem neyin retina nöronlar kimyasal olarak yerli nörotransmitter kimyasallar retina içinde vitroyeraltı enjekte edilerek uyarılır bir benzersiz sinir stimülasyonu paradigma gösterir. Bu kimyasal stimülasyon tekniği seçicilik ve odak özgüllüğü yüksek hedef nöronlar dahil olmak üzere geleneksel elektriksel stimülasyon tekniği üzerinde çeşitli yararlar sunar. İletişim kuralı yukarıda ayrıntıları nörotransmitter Glutamat birim pnömatik enjeksiyonlari kullanarak hedef retina sinir hücreleri bir tek bağlantı noktalı cam micropipette teslim veya bir özel micromachined birden çok bağlantı noktalı mikrosıvısal cihaz temin ne kadar küçük Fizyolojik olarak önemli RGC yanıt. Bu iletişim kuralı yalnızca Glutamat ile göstermiştir rağmen protokol kimyasal nörotransmitter diğer türleri ile retina uyarılması eğitim için yararlı kalır. Ayrıca, bu protokol için diğer MEA tasarımları konusunda kısaca açıklandığı gibi bir pMEA Elektrofizyolojik kayıt32 için kullanmak tercih edilir iken sigara delikli türü dahil olmak üzere pMEA benzer sonuçlar elde etmek için kullanılabilir. Aşağıdaki paragraflarda, biz bizim Protokolü ortak sorunlar ve sınırlamalar ile ilgili sorunları giderme yöntemleri en önemli adımlardan ve gelecekteki uygulamalar bu stimülasyon tekniği tartışıyorlar.
Güvenli ve güvenilir kimyasal uyarımı elde etmek için birkaç önemli adımlar bu protokol için yerine getirmesi gerekir. Önemli adımlardan birini dikkatle retina ayıklanması ve bu oksijenli Ames orta dışında Yani, kafes ızgara üzerinde taze disseke retina düzleştirme tutulur süreyi en aza tarafından başarılı bir retina hazırlık almaktır Ames orta ile periosteum pMEA üzerine aktarmadan önce. Sıçan göz nispeten küçük olduğu için retina ilk diseksiyon keskin diseksiyon araçları ve pratik gerektirir. Ayrıca, retina photoreceptor çıkarılması dejenere zaten kırılgan normal retinae daha kırılgan olduğu ve bu nedenle yırtılma için yatkındır özellikle zor olabilir. Tüm diseksiyon işleminden retina pMEA yerleştirmek için ilk enükleasyon oksijen veya diğer besin eksikliğinden erken hücre ölümü önlemek mümkün olduğunca çabuk başarılı olmak. Bu da doğal olmayan nöral yanıt ve hücre ölümüne yol açabilir gibi mekanik travma sırasında diseksiyon dokusu ile öğretilir bir ile kesme veya doku zarar kaçınarak indirilmelidir.
Bu deneme de ortak nokta olarak retina üzerinde pMEA koyduktan sonra üst ve alt perfüzyon ve emiş hatlarında başlatırken özen gösterilmelidir. Tüm perfüzyon ve emiş hatları deneme başlamadan önce geçiş izni için kontrol ve hava kabarcıkları hatları üzerinden akışı engel değil emin olmak için deney boyunca düzenli aralıklarla muayene gerekir. Özellikle, perfüzyon sonuç içinde hava kabarcıkları oluşumu tamamen perfüzyon akışının daha küçük çapına nedeniyle engel ve böylece oksijen ve besin retina mahrum tarafından erken sona deneme için neden. Hava kabarcıkları tehlikesi nedeniyle, yukarıdaki Protokolü oda sıcaklığında yerine daha ideal fizyolojik sıcaklığında çözünmüş oksijen veya karbon dioksit Ames orta çözümden fışkırması önlemek için yapılır. Hava kabarcıkları bir perfüzyon satır bir deney sırasında doldurmak eğer onlar genellikle daha küçük, Sigara occluding kabarcıklar perfüzyon hatta hafifçe dokunarak dağınık.
Böylece retina sıkıca ile temas elektrotlar ama zarar vermeden tutan perfüzyon sistemi ile ilgili başka bir yaygın alt emiş basıncı hassas ayar sorundur. Emiş basıncı çok yüksek ise, bu küçük parçalar halinde retina pMEA delikler aracılığıyla emmek ve sonunda bütün sinirsel tepkilerin durdurulması için yol. Öte yandan, basınç çok düşükse, retina uzak elektrotlar yüzer ve bu nedenle sinir kayıt bozabilir. Bu iki aşırı düzeyleri arasında emiş basıncı ayarlama pratik gerektirir ve pMEA pMEA delikler yakın gözlem sağlayan bir ters mikroskobu üzerinde kullanılırsa daha kolay yapılır. Bu delikler emme ayarlarken gözlemleyerek, bir retina zarar vermeden bağlantı kuran doğru dengeyi bulabilirsiniz. Photobleaching olasılığını photoreceptors vahşi tipi retina uyarıcı ne zaman en aza indirmek için ters mikroskop ışığı kırmızı ışık sadece yayılmasını sağlamak için filtre ve görsel gözlemler mümkün olduğunca çabuk tamamlanmalıdır.
Uygun perfüzyon koşulları kontrol ettikten sonra sonraki kritik adım aygıt veya pipet ile görünür bir enjeksiyon bağlantı noktalarına pMEA elektrotlar ile tam olarak hizalanabilir noktası veya marker pMEA üzerinde sabit başvuru olur. Genellikle, bu neyin pMEA odası RIM yerleştirilen iki başvuru işaretleri kaba hizalanır cam micropipette ipucu ya da birden çok bağlantı noktası aygıtında yerler ile kullanarak Yukarıdaki görsel gözlem tarafından çapraz kur üzerinden gerçekleştirilir Boom-stand takılan mikroskop. Enjeksiyon bağlantı noktaları hedef elektrotlar ile ince bir hizalamasını sonra ters mikroskop görsel denetim tarafından elde edilir. Bir kez düzgün uyumlu, herhangi bir manipülatör değişimi veya drift retina ezmek veya pMEA zarar beri bir pipet ya da bir mikrosıvısal aygıt ile retina yaklaşırken özen gösterilmelidir. Yanlışlıkla retina zarar görmesini önlemek için en iyi yolu sürekli üst retina yüzeyi ile temas tam olarak algılamaya pipet elektrot empedans izlemektir. Empedans ölçüm micropipette ucuna takılan hızla yeraltı retina, hangi bir (genellikle gigaohm aralığında) anormal derecede yüksek empedans tarafından belirtilir engellenir kontrol etmek için de kullanılabilir. Eğer bloke micropipette ipucu genellikle kasıtsız zarar görmemesi için retina uzakta konumlandırılmış ucu ile yüksek basınç nabzı başlatarak temizlenebilir. Nadir de olsa bazen bloke Pipetler tamamen yüksek basınç bakliyat tıkanma temizlemezseniz değiştirilmesi gerekebilir. Çözüm içinde pMEA odası ve yama kelepçe amplifikatör arasında düzgün referans elektrot arabirim değil ne zaman bir anormal veya yüksek empedans değeri de kaydedilebilir.
Bir kez bir hedef konuma yerleştirilmiş, Glutamat enjeksiyon hacmi sıkıca basınç, enjeksiyon zaman ve neden olduğu gösterilmiştir uyarım nöronların, önlemek için nörotransmitter konsantrasyon sınırlama tarafından kontrol edilmelidir excitotoxic hasar.Glutamat ekleme parametreleri bu protokolü temsil bu eşiğin Glutamat excitotoxicity33 neden ama bu protokolü nörotransmitter diğer türleri ile çalışırken, karşılık gelen için iyi bilinen bir rejim ayrıntılı. excitotoxicity etkileri için eşik düzeyleri için güvenli Uyarımı dikkate alınmalıdır. Ayrıca, yukarıdaki protokolünde reçete 0,1 PSI enjeksiyon basıncı bu çalışmada kullanılan 8-kanal basınç enjektörü kullanılabilir ayarını en düşük olası basınç elde, ama başarılı sonuçlar sürekli olarak üretmiştir. Bu nedenle, nörotransmitter enjeksiyonlar için 0,1 PSI sadece müstehcen değil kısıtlayıcı, başarılı kimyasal elektrodlar elde etmek için değil. Daha düşük çalıştırma baskılar farklı basınç enjektör ile mümkün iseniz, enjeksiyon baskıları 0,1 PSI düşük, gerçekleştirilebilir.
Bir sınırlama-in vitro wholemount retina ürünleri içeren bu protokolü süreleri 8 h için sınırlı veya daha az, hatta aşırı özenle tüm deney boyunca alınan kısa deneysel zaman penceredir. Bu sınırlı deneysel zaman penceresi excitotoxicity gibi kimyasal uyarımı herhangi bir uzun vadeli etkileri incelenmesi izin vermez. Bu belirli iletişim kuralı fizyolojik sıcaklık, hangi büyük olasılıkla etkiler hem de görsel olarak - ve kimyasal-uyarılmış spike oranı yanıt, önceki çalışmalar göstermiştir bu yana aksine oda sıcaklığında kaydetmek için seçim başka bir kısıtlamasıdır o alt sıcaklıklar kayıt spiking oranı, yanıt gecikme süresi ve birkaç diğer özellikleri34,35,36,37,38arasında Glutamat uptake oranı değiştirebilirsiniz. Bu sınırlama ile özel olarak tasarlanmış alt perfüzyon plaka ısıtmalı bir plaka ve/veya alt ve üst için etkili bir termal debubbler olmadan kullanır pMEA aksine bir ısıtmalı alt plaka sigara delikli MEA kullanarak önlenebilir perfüzyon.
Son olarak, vitro hazırlık retina sağlıklı tutmak için etkin perfüzyon oksijenli Ames orta için gerekliliğini tarafından sınırlıdır. Perfüzyon sistemi nedeniyle sıvı akıntıları genellikle çok doğal perfüzyon mekanizmaları göz vivo içinde39bulundu ve kimyasal enjeksiyon ile uzak enjekte nörotransmitter çizerek engelleyebilir daha hızlı Retina. Birden çok bağlantı noktası aygıtı ile yapılan gibi yüzey tabanlı enjeksiyonları perfüzyon geçerli girişime perfüzyon pMEA derinliklerinden gelen varlığı benzer bir etkiye neden olabilir rağmen için yeraltı enjeksiyonları kıyasla daha duyarlı olabilir, muhtemelen Tüm retina. Bu nedenle, geçerli protokol Glutamat kimyasallar ile pnömatik basınç teslim edildi, ancak başarılı stimülasyon içinde vivo ulaşmak için gerekli enjeksiyon basıncı vitro için kullanılan daha önemli ölçüde daha düşük olabilir çalışmalar.
Nöronlar daha doğal nörotransmitter uyaranlara ile harekete geçirmek istiyor, kimyasal uyarımı konvansiyonel elektrik stimülasyonu için etkili bir alternatif sunuyor ama değil henüz ciddi keşfedilmeyi. Sonuç olarak Protokolü veya güvenilir subretinal kimyasal uyarımı retina nöronların ulaşmak için en iyi yöntemleri açıklayan kullanılabilen küçük edebiyat bulunmamaktadır. Bu iletişim kuralını kullanan son çalışmalar28 retina nöronların subretinal kimyasal uyarımı güvenilir RGC yanıtlarıyla tarihinde yayımlanmıştır kayma kararlar karşılaştırılabilir veya elektriksel stimülasyon retina daha iyi temin ve orada göstermiştir subretinally uygulanan eksojen Glutamat kanıt retina'nın doğal görsel işleme devresi yararlanmak bu yöntemine izin verilmesi ve muhtemelen, algıları daha doğal ışığa benzer çağrıştıran İki kutuplu hücreler doğrudan, teşvik edebilirsiniz uyarım.
Daha fazla çalışmaları bu bulgular antikorundan sigara modeli sistemlerinde doğrulamak ve uzun vadeli etkileri ve bu vivo içinde uygulanmasına ilgili pratik yönü de dahil olmak üzere önceki çalışmalarda tarafından ele alınmayan sorunlarını araştırmak için gereklidir strateji. Bu nedenle, bu yaklaşım gelecekteki yönleri açıkça uzun vadeli kimyasal teslim ve stimülasyon ile implante edilebilir bir ışık-güç mikrosıvısal sağlamak için uygun teknolojisini geliştirerek bu kavram in vivo hayvan modelleri için çeviri yalan aygıt yozlaşmış photoreceptor katman için bir yedek olarak hizmet vermektedir. Nispeten çöküşünde stimülasyon paradigma olarak kimyasal uyarımı daha geniş uygulamalar henüz keşfedilmeyi, ancak retina merkezi sinir sistemi40bir parçası olduğundan, bu uyarımı strateji potansiyel olarak uygulanan olabilir beyin, spinal kord veya farklı nörotransmitter kullanarak nöromuskuler bozuklukların tedavisinde gibi diğer sinir stimülasyonu bağlamlarda. Ayrıca, sunulan Protokolü daha genel bir ilaç ya da diğer kimyasalların kontrollü teslim vitro ortamda iyi kronolojik zamanmekansal çözünürlük ile sinir doku içine etkilerini araştıran çalışmalar kabul.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Gazetede sunulan çalışma ortaya çıkan sınırlar araştırma Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen ve yenilik (NSF-EFRI) program numarası 0938072 verin. Bu yazının içeriği sadece yazarların sorumluluğunda ve mutlaka NSF resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Yazarlar ayrıca tasarlama ve kimyasal uyarılması için ilk deneysel kurulum ve Bay Ashwin Raghunathan tasarımı, imalatı ve kullanılan birden çok bağlantı noktalı mikrosıvısal aygıt değerlendirme çalışmaları için test çalışmaları için Dr Samsoon Inayat teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microelectrode array, perforated layout | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Bottom perfusion groundplate for pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| 3-axis Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
| Micromanipulator Control System | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Gantry style micromanipulator stand with linear slide | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
| 8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Vendor: Harvard Apparatus UK |
PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
| Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
| Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
| Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| 60 mm Petri dish (10 mm tall) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
| Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
| Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| Harp slice grid | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
| Ag/AgCl reference electrode pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| 4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| Silver wire (50 μm diameter) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
| Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) | Cole Parmer, Vernon Hills , IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
| Tilting Tool Holder with Steel Cannula | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/ Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
| Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
| NIS-Elements: Basic Research Software | Nikon, Tokyo, Japan | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. , (2011).
- Fritsche, L. G., Fariss, R. N., Stambolian, D., Abecasis, G. R., Curcio, C. A., Swaroop, A. Age-Related Macular Degeneration: Genetics and Biology Coming Together. Annu Rev Genomics Hum Genet. 15, 151-171 (2014).
- Marc, R. E., et al. Neural reprogramming in retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 3364-3371 (2007).
- Jones, B. W., Kondo, M., Terasaki, H., Lin, Y., McCall, M., Marc, R. E. Retinal remodeling. Jpn J Ophthalmol. 56, 289-306 (2012).
- Soto, F., Kerschensteiner, D. Synaptic remodeling of neuronal circuits in early retinal degeneration. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Euler, T., Schubert, T. Multiple Independent Oscillatory Networks in the Degenerating Retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Boye, S. E., Boye, S. L., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. A Comprehensive Review of Retinal Gene Therapy. Mol Ther. 21, 509-519 (2013).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. The Lancet. 385, 509-516 (2015).
- Reh, T. A. Photoreceptor Transplantation in Late Stage Retinal Degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, (2016).
- Zrenner, E.
- Humayun, M. S., de Juan, E. Jr, Dagnelie, G. The Bionic Eye: A Quarter Century of Retinal Prosthesis Research and Development. Ophthalmol. 123, S89-S97 (2016).
- Cruz, L., et al. The Argus II epiretinal prosthesis system allows letter and word reading and long-term function in patients with profound vision loss. Br J Ophthalmol. 97, 632-636 (2013).
- Zrenner, E., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. P R Soc B. 278, 1489-1497 (2011).
- Stronks, H. C., Dagnelie, G. The functional performance of the Argus II retinal prosthesis. Expert Rev Med Devices. 11, 23-30 (2014).
- Stingl, K., et al. Artificial vision with wirelessly powered subretinal electronic implant alpha-IMS. P R Soc B. 280, (2013).
- Rizzo, J. F. Update on retinal prosthetic research: the Boston Retinal Implant Project. J Neuroophthalmol. 31, 160-168 (2011).
- Ayton, L. N., et al. First-in-Human Trial of a Novel Suprachoroidal Retinal Prosthesis. PLoS ONE. 9, e115239 (2014).
- Chuang, A. T., Margo, C. E., Greenberg, P. B. Retinal implants: a systematic review. Br J Ophthalmol. 98, 852-856 (2014).
- Cai, C., Twyford, P., Fried, S. The response of retinal neurons to high-frequency stimulation. J Neural Eng. 10, 036009 (2013).
- Eiber, C. D., Lovell, N. H., Suaning, G. J. Attaining higher resolution visual prosthetics: a review of the factors and limitations. J Neural Eng. 10, 011002 (2013).
- Humayun, M., Propst, R., de Juan, E., McCormick, K., Hickingbotham, D. Bipolar surface electrical stimulation of the vertebrate retina. Arch Ophthalmol. 112, 110-116 (1994).
- Zrenner, E., et al. Can subretinal microphotodiodes successfully replace degenerated photoreceptors? Vision Res. 39, 2555-2567 (1999).
- Majji, A. B., Humayun, M. S., Weiland, J. D., Suzuki, S., D'Anna, S. A., de Juan, E. Long-Term Histological and Electrophysiological Results of an Inactive Epiretinal Electrode Array Implantation in Dogs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).
- Peterman, M. C., Noolandi, J., Blumenkranz, M. S., Fishman, H. A. Localized chemical release from an artificial synapse chip. PNAS. 101, 9951-9954 (2004).
- Finlayson, P. G., Iezzi, R. Glutamate stimulation of retinal ganglion cells in normal and s334ter-4 rat retinas: a candidate for a neurotransmitter-based retinal prosthesis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 3619-3628 (2010).
- Inayat, S., Rountree, C. M., Troy, J. B., Saggere, L. Chemical stimulation of rat retinal neurons: feasibility of an epiretinal neurotransmitter-based prosthesis. J Neural Eng. 12, 016010 (2015).
- Rountree, C. M., Inayat, S., Troy, J. B., Saggere, L. Differential stimulation of the retina with subretinally injected exogenous neurotransmitter: A biomimetic alternative to electrical stimulation. Sci Rep. 6, 38505 (2016).
- Ray, A., Sun, G. J., Chan, L., Grzywacz, N. M., Weiland, J., Lee, E. -J. Morphological alterations in retinal neurons in the S334ter-line3 transgenic rat. Cell Tissue Res. 339, 481-491 (2010).
- Martinez-Navarrete, G., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Fernandez-Sanchez, L., Pinilla, I., Cuenca, N. Retinal degeneration in two lines of transgenic S334ter rats. Exp Eye Res. 92, 227-237 (2011).
- Sigma Aldrich. Sigma Aldrich Ames Medium Product Information Sheet. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/a1420pis.pdf (2017).
- Reinhard, K., et al. Step-By-Step instructions for retina recordings with perforated multi electrode arrays. PLoS ONE. 9, e106148 (2014).
- Izumi, Y., Kirby, C. O., Benz, A. M., Olney, J. W., Zorumski, C. F. Müller cell swelling, glutamate uptake, and excitotoxic neurodegeneration in the isolated rat retina. Glia. 25, 379-389 (1999).
- Tunnicliff, G. Glutamate uptake by chick retina. Biochem J. 150, 297-299 (1975).
- Schwartz, E. A., Tachibana, M. Electrophysiology of glutamate and sodium co-transport in a glial cell of the salamander retina. J Physiol (Lond). 426, 43-80 (1990).
- Muller, A., Maurin, L., Bonne, C. Free radicals and glutamate uptake in the retina. Gen Pharmacol- Vasc S. 30, 315-318 (1998).
- Dhingra, N. K., Kao, Y. -H., Sterling, P., Smith, R. G. Contrast threshold of a brisk-transient ganglion cell in vitro. J of Neurophysiol. 89, 2360-2369 (2003).
- Ahlers, M. T., Ammermüller, J. A system for precise temperature control of isolated nervous tissue under optical access: Application to multi-electrode recordings. J of Neurosci Methods. 219, 83-91 (2013).
- Feke, G. T., Tagawa, H., Deupree, D. M., Goger, D. G., Sebag, J., Weiter, J. J. Blood flow in the normal human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30, 58-65 (1989).
- The Retina. Neuroscience. Purves, D., et al. , 2nd edition, Sinauer Associates. (2001).
