Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Biomimetic रासायनिक Neuromodulation के लिए क्रियाविधि इन विट्रो में न्यूरोट्रांसमीटर ग्लूटामेट के साथ चूहा रेटिना

Published: December 19, 2017 doi: 10.3791/56645
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Mechanical and Industrial Engineering, University of Illinois at Chicago, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University

Summary

इस प्रोटोकॉल न्यूरोट्रांसमीटर ग्लूटामेट के साथ इन विट्रो में wholemount चूहा रेटिना के रासायनिक neurostimulation के एक फार्म की जांच के लिए एक उपंयास विधि का वर्णन । रासायनिक neurostimulation photoreceptor अपक्षयी रोगों की वजह से अपरिवर्तनीय अंधापन के इलाज के लिए रेटिना न्यूरॉन्स के पारंपरिक विद्युत neurostimulation के लिए एक आशाजनक विकल्प है.

Abstract

Photoreceptor अपक्षयी रोगों रेटिना में Photoreceptor कोशिकाओं के प्रगतिशील नुकसान के माध्यम से अपूरणीय अंधापन का कारण है । रेटिना कृत्रिम photoreceptor अपक्षयी रोगों है कि कृत्रिम रूप से रोगियों में सुबोध दृश्य धारणा को प्राप्त करने की आशा में जीवित रेटिना न्यूरॉन्स उत्तेजक द्वारा दृष्टि बहाल करने के लिए चाहते हैं के लिए एक उभरते उपचार कर रहे हैं. वर्तमान रेटिना कृत्रिम इलेक्ट्रोड की एक सरणी का उपयोग करने के लिए बिजली रेटिना को उत्तेजित लेकिन उच्च तीक्ष्णता, रोगियों के लिए प्राकृतिक दृष्टि बहाल करने में पर्याप्त शारीरिक बाधाओं का सामना करने के रोगियों के लिए सीमित दृष्टि बहाल करने में सफलता का प्रदर्शन किया है. रासायनिक neurostimulation देशी न्यूरोट्रांसमीटर का उपयोग कर विद्युत उत्तेजना के लिए एक biomimetic विकल्प है और बिजली neurostimulation का उपयोग रेटिना कृत्रिम के साथ जुड़े मौलिक सीमाओं बाईपास सकता है. विशेष रूप से, रासायनिक neurostimulation न्यूरोट्रांसमीटर के बहुत कम मात्रा में इंजेक्शन द्वारा रोगियों के लिए तुलनीय या बेहतर दृश्य acuities के साथ और अधिक प्राकृतिक दृष्टि बहाल करने की क्षमता है, रेटिना द्वारा इस्तेमाल संचार के एक ही प्राकृतिक एजेंटों रासायनिक synapses, वर्तमान विद्युत कृत्रिम की तुलना में बहुत महीन संकल्प पर । हालांकि, एक अपेक्षाकृत बेरोज़गार उत्तेजना प्रतिमान के रूप में, वहां इन विट्रो मेंरेटिना की रासायनिक उत्तेजना को प्राप्त करने के लिए कोई प्रोटोकॉल की स्थापना की है । इस काम का उद्देश्य के लिए जांचकर्ताओं जो रेटिना या इसी तरह के तंत्रिका ऊतकों के रासायनिक neuromodulation की क्षमता का अध्ययन करना चाहते है के लिए रेटिना की रासायनिक उत्तेजना को पूरा करने के लिए एक विस्तृत रूपरेखा प्रदान करना है इन विट्रो। इस काम में, हम प्रयोगात्मक सेटअप और पद्धति का वर्णन प्रकाश में लाने के लिए रेटिना नाड़ीग्रंथि सेल (RGC) स्पाइक प्रतिक्रियाओं के समान दृश्य हल्की प्रतिक्रियाओं में जंगली-प्रकार और photoreceptor-पतित wholemount चूहे रेटिना का नियंत्रित मात्रा में इंजेक्शन द्वारा micropipettes ग्लास और एक कस्टम मल्टीपोर्ट microfluidic डिवाइस का उपयोग कर उपरेटिना अंतरिक्ष में न्यूरोट्रांसमीटर ग्लूटामेट. इस पद्धति और प्रोटोकॉल काफी सामांय है neuromodulation अंय न्यूरोट्रांसमीटर या यहां तक कि अंय तंत्रिका ऊतकों का उपयोग कर के लिए अनुकूलित किया जाना है ।

Introduction

Photoreceptor अपक्षयी रोग, जैसे रेटनाइटिस पिगमेंटोसा और उम्र से संबंधित धब्बेदार अध-पतन, दृष्टि हानि के इनहेरिट करने योग्य कारणों में अग्रणी रहे हैं और वर्तमान में लाइलाज1,2हैं । हालांकि इन रोगों विशिष्ट आनुवंशिक उत्परिवर्तनों की एक किस्म से उठता है, photoreceptor अपक्षयी रोगों रेटिना में photoreceptor कोशिकाओं की प्रगतिशील हानि, जो अंततः अंधापन का कारण बनता है द्वारा एक समूह के रूप में विशेषता है । photoreceptors का नुकसान रेटिना भर में बड़े पैमाने पर remodeling चलाता है, लेकिन द्विध्रुवी कोशिकाओं और RGCs सहित रेटिना न्यूरॉन्स जीवित है, बरकरार है और अपेक्षाकृत भी photoreceptor अध3 के उन्नत चरणों में कार्यात्मक रहते हैं ,4,5,6,7.

तंत्र और इन रोगों के विकृतियों अच्छी तरह से किया गया है3,4,5,6,7 लेकिन एक प्रभावी उपचार मायावी बनी हुई है । पिछले तीन दशकों में, दुनिया भर में शोधकर्ताओं ने जीन थेरेपी सहित photoreceptor अपक्षयी रोगों के साथ प्रभावित लोगों के लिए दृष्टि बहाल करने के लिए चिकित्सीय उपचार की एक किस्म की जांच की है8, स्टेम सेल उपचार9, रेटिना ट्रांसप्लांटेशन10, और कृत्रिम उत्तेजना11,जीवित रेटिना न्यूरॉन्स के12 . इनमें से, सबसे नैदानिक उपलब्ध रेटिना कृत्रिम, जो कृत्रिम neurostimulation उपकरणों है कि परंपरागत रूप से इलेक्ट्रोड की एक सरणी का उपयोग किया है के लिए बिजली या तो द्विध्रुवी कोशिकाओं या के लक्ष्य के साथ विशिष्ट पैटर्न में RGCs उत्तेजित कर रहे है रोगियों में कृत्रिम दृश्य धारणाओं का निर्माण11. इस तरह के तर्क द्वितीय13 और अल्फा-आईएमएस14 उपकरणों के रूप में वर्तमान पीढ़ी के विद्युत कृत्रिम, नैदानिक अनुमोदन और प्रारंभिक अध्ययन हासिल किया है संकेत दिया है कि वे एक बहाल करके रोगियों के लिए जीवन की गुणवत्ता में सुधार कर सकते हैं दृष्टि का उपाय दोनों epiretinal (रेटिना के सामने) और (रेटिना के पीछे) रेटिना प्रत्यारोपित उपकरणों15,16का उपयोग कर । दुनिया भर में अनुसंधान समूहों इन पहली पीढ़ी के उपकरणों17,18,19,20 का सामना करना पड़ा है की सफलता से परे रेटिना कृत्रिम आगे बढ़ाने पर काम कर रहे हैं एक बिजली के रोगियों को कानूनी अंधापन स्तर से नीचे उच्च तीक्ष्णता दृष्टि बहाल करने में सक्षम अंग डिजाइन कठिनाइयों । हाल के अध्ययनों से पता चला है कि वर्तमान पीढ़ी विद्युत आधारित कृत्रिम द्वारा सक्षम है कि उच्च स्थानिक संकल्प प्राप्त करने के कारण चार्ज इंजेक्शन सीमा है, जो बड़े इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए सुरक्षित रूप से उत्तेजित आवश्यक के चुनौतीपूर्ण है स्थानिक संकल्प की कीमत पर रेटिना न्यूरॉन्स, अर्थात दृश्य तीक्ष्णता11,21. इसके अलावा, विद्युत उत्तेजना आगे सीमित है क्योंकि यह आम तौर पर सभी आसपास की कोशिकाओं को उत्तेजित करता है और इसलिए रोगियों में अप्राकृतिक और भ्रामक धारणाओं को पूरा करती है, काफी हद तक क्योंकि यह एक स्वाभाविक अप्राकृतिक उत्तेजना प्रतिमान21है । फिर भी, विद्युत उत्तेजना के प्रारंभिक सफलताओं का प्रदर्शन किया है कि कृत्रिम neurostimulation photoreceptor अपक्षयी रोगों के लिए एक प्रभावी उपचार हो सकता है । यह एक भी अधिक प्रभावी उपचार न्यूरोट्रांसमीटर रसायनों के साथ रेटिना उत्तेजक द्वारा प्राप्त हो सकता है कि एक परिकल्पना करने के लिए सुराग, रासायनिक synapses में संचार के प्राकृतिक एजेंटों. इस पत्र में प्रस्तुत विधि का उद्देश्य रासायनिक उत्तेजना की चिकित्सीय व्यवहार्यता का पता लगाना है, जो रेटिना न्यूरॉन्स के बीच synaptic संचार की प्राकृतिक प्रणाली की नकल करना चाहता है, विद्युत उत्तेजना के लिए एक biomimetic विकल्प के रूप में एक रेटिना अंग के लिए ।

एक रासायनिक रेटिना अंग करने के लिए चिकित्सीय रासायनिक उत्तेजना की अवधारणा का अनुवाद रासायनिक एक microfluidic के माध्यम से जारी किए गए ग्लूटामेट के रूप में देशी न्यूरोट्रांसमीटर की छोटी मात्रा, के साथ लक्ष्य रेटिना न्यूरॉन्स को सक्रिय करने पर निर्भर करता है युक्ति दृश्य उत्तेजना के जवाब में microports की एक बड़ी सरणी शामिल । इस तरह, एक रासायनिक रेटिना अंग अनिवार्य रूप से एक biomimetic कृत्रिम photoreceptor परत है कि अनुवाद फोटॉनों स्वाभाविक रूप से रासायनिक संकेतों के लिए रेटिना तक पहुँचने होगा. के बाद से इन रासायनिक संकेतों को एक ही न्यूरोट्रांसमीटर सामांय रेटिना में उपयोग संकेत और एक ही synaptic सामांय दृष्टि रास्ते द्वारा इस्तेमाल किया रास्ते के माध्यम से एक पतित रेटिना के जीवित रेटिना ंयूरॉंस को उत्तेजित का उपयोग करें, जिसके परिणामस्वरूप दृश्य धारणा एक रासायनिक रेटिना अंग के माध्यम से हासिल की एक बिजली अंग के माध्यम से पैदा की तुलना में अधिक प्राकृतिक और सुबोध हो सकता है । इसके अलावा, microports के माध्यम से जो न्यूरोट्रांसमीटर जारी कर रहे हैं के बाद से अत्यधिक छोटे और सरणी उच्च घनत्व में बनाया जा सकता है, इलेक्ट्रोड के विपरीत, एक संभावित रासायनिक कृत्रिम अधिक फोकल उत्तेजना और उच्च स्थानिक को प्राप्त करने में सक्षम हो सकता है एक विद्युत अंग से संकल्प । इस प्रकार, इन संभावित लाभों के आधार पर, एक रासायनिक रेटिना अंग विद्युत कृत्रिम के लिए एक अत्यधिक आशाजनक विकल्प प्रदान करता है ।

रेटिना की रासायनिक उत्तेजना, तथापि, गया है अपेक्षाकृत कम हाल ही में जब तक पता लगाया । जबकि रेटिना की बिजली की उत्तेजना अच्छी तरह से किया गया है के माध्यम से काम के दशकों में विशेषता इन विट्रो22,23, vivo में23,24, और नैदानिक अध्ययन13 ,14, रासायनिक उत्तेजना पर अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से सीमित किया गया है कुछ इन विट्रो काम करता है25,26,27,28। Iezzi आणि Finlayson२६ आणि Inayat एट अल. 27 एक एकल इलेक्ट्रोड और एक multielectrode सरणी (विदेश मंत्रालय) का उपयोग कर इन विट्रो में रेटिना की epiretinal रासायनिक उत्तेजना का प्रदर्शन किया, क्रमशः, रेटिना न्यूरॉन्स के ग्लूटामेट पैदा प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए. हाल ही में, Rountree एट अल । 28 के अंतर उत्तेजना का प्रदर्शन किया और रेटिना रास्ते पर रेटिना की ओर से ग्लूटामेट का उपयोग और एक मेे रेटिना पर कई साइटों से ंयूरॉन प्रतिक्रियाओं रिकॉर्ड करने के लिए ।हालांकि इन कार्यों preliminarily रासायनिक उत्तेजना की व्यवहार्यता की स्थापना की है, आगे के अध्ययन के लिए उन से परे इस दृष्टिकोण के कई पहलुओं की जांच आवश्यक है अब तक25,26,27 , 28, और ठीक धुन दोनों में इन विट्रो और vivo पशु मॉडल में उपचारात्मक उत्तेजना मापदंडों के रूप में एक रासायनिक रेटिना अंग करने के लिए इस अवधारणा का अनुवाद करने से पहले के रूप में ऊपर चर्चा की । तथापि, वर्तमान में साहित्य में रेटिना की रासायनिक उत्तेजना को पूरा करने के लिए कोई स्थापित पद्धति नहीं है और पिछले कार्यों में इस्तेमाल किए गए तरीकों को ऐसे विस्तार से नहीं बताया गया है जैसा कि नकलत्मक अध्ययन के लिए आवश्यक होगा. इसलिए, इस तरीके कागज के लिए तर्क के लिए एक अच्छी तरह से इन विट्रो में या तो हमारे पिछले अध्ययन की नकल में रुचि उन जांचकर्ताओं के लिए रेटिना की रासायनिक उत्तेजना के संचालन के लिए रूपरेखा प्रदान करने के लिए है27, 28 या आगे रासायनिक neurostimulation की इस नवजात अवधारणा को आगे बढ़ाने ।

यहां हम इन विट्रो में के संचालन के लिए एक विधि का प्रदर्शन wholemount रेटिना में रेटिना ंयूरॉंस की रासायनिक उत्तेजना जंगली प्रकार के चूहों और एक photoreceptor पतित चूहे मॉडल है कि बारीकी से photoreceptor अपक्षयी की प्रगति की नकल मनुष्यों में रोग । इन विट्रो मॉडल में इस उत्तेजना विधि के विकास के पीछे तर्क के लिए विभिंन उत्तेजना मानकों और अध्ययन तंत्रिका प्रतिक्रिया विशेषताओं के चिकित्सीय पर्वतमाला है कि असंभव है या में निरीक्षण मुश्किल होगा का मूल्यांकन है वीवो मॉडल, विशेष रूप से प्रारंभिक अध्ययन के दौरान इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता का मूल्यांकन पर ध्यान केंद्रित । इस प्रक्रिया में, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एकल बंदरगाह ग्लास micropipettes और एक कस्टम के माध्यम से लक्ष्य रेटिना न्यूरॉन्स के पास 1 मिमी ग्लूटामेट की छोटी मात्रा में देने के द्वारा रेटिना के दोनों एकल साइट और एक साथ बहु-साइट रासायनिक उत्तेजना दिखा micromachined मल्टी पोर्ट microfluidic डिवाइस, क्रमशः । जबकि दोनों एकल साइट और बहु-साइट उत्तेजना रासायनिक neuromodulation की चिकित्सीय व्यवहार्यता की जांच के बुनियादी उद्देश्य को पूरा, एक अद्वितीय लाभ के साथ एक विशिष्ट उद्देश्य कार्य करता है । एकल साइट उत्तेजना, जो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूर्व के साथ पूरा किया जा सकता है गिलास micropipettes खींच लिया, एक ही साइट पर रेटिना की उपसतह में सीधे रसायनों इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और अगर चौकस RGC स्पाइक दर की जांच करने के लिए कार्य करता है प्रतिक्रिया है कि नेत्रहीन पैदा प्रकाश प्रतिक्रियाओं के समान है इंजेक्शन साइट के नीचे फोकल में ले जा सकता है । दूसरी ओर, बहु साइट उत्तेजना है, जो एक विशेष रूप से गढ़े मल्टीपोर्ट microfluidic डिवाइस की आवश्यकता है, के लिए रेटिना की सतह पर कई साइटों पर विशेष रूप से रसायनों इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और कितनी अच्छी तरह ग्लूटामेट-पैदा RCG की जांच करने के लिए कार्य करता है प्रतिक्रिया पैटर्न पैटर्न उत्तेजना अध्ययन में ग्लूटामेट इंजेक्शन पैटर्न के अनुरूप हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रयोगों को प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद के गाइड द्वारा उल्लिखित दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था । पशु हैंडलिंग और इच्छामृत्यु प्रोटोकॉल की समीक्षा की गई और शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित ।

1. पशु मॉडल

  1. जंगली प्रकार लंबे समय इवांस चूहों
    1. खरीद एक 24-32 दिन पुराने जंगली प्रकार लंबी इवांस हूड या तो सेक्स एक मानक 12 घंटे के साथ उठाया/
    2. डार्क एक पूरी तरह से अंधेरे कमरे में 1 एच के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले रखकर चूहा ढल ।
  2. S334ter-3 चूहों
    1. पार ट्रांसजेनिक albino homozygous S334ter-3 चूहा लाइन (या तो सेक्स), उत्परिवर्ती rhodopsin जीन की दो प्रतियां व्यक्त, एक pigmented जंगली प्रकार लांग-इवांस चूहे के साथ pigmented heterozygous S334ter-3 चूहों कि प्रदर्शन photoreceptor अध... इसी तरह की प्रगति में मानव रेटनाइटिस पिगमेंटोसा29,30।
    2. मानक 12 ज दिन/रात लय के साथ heterozygous वंश उठाएं और निंनलिखित photoreceptor अध: पतन के चरणों के लिए इसी निंनलिखित उंर के प्रयोगों के लिए या तो सेक्स के चूहों का उपयोग करने के लिए, प्रारंभिक चरण अध: 14-20 दिन पुराना; मध्य चरण अध: 21-27 दिन पुराना; देर से मंच अध: पतन 28-35 दिन पुराने; पूरी तरह से अंधा: & #62; ५० दिन पुराना है ।
    3. डार्क एक पूरी तरह से अंधेरे कमरे में 1 एच के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले रखकर चूहा ढल ।

2. एंस के मध्यम समाधान और छिड़काव प्रणाली की तैयारी

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक सेटअप के योजनाबद्ध । रासायनिक उत्तेजना के लिए प्रयोगात्मक सेटअप की योजनाबद्ध एक ग्लास micropipette का उपयोग कर (a) और एक कस्टम मल्टीपोर्ट microfluidic डिवाइस (B). रेटिना एक pMEA पर रखा गया है और लगातार pMEA वेध के माध्यम से ऊपर और नीचे दोनों से ताजा, oxygenated एम्स मध्यम समाधान के साथ perfused. pMEA के इलेक्ट्रोड द्वारा उठाया तंत्रिका प्रतिक्रिया संकेतों एक डेटा अधिग्रहण कंप्यूटर में विदेश मंत्रालय एम्पलीफायर के माध्यम से खिलाया जाता है. दृश्य और रासायनिक उत्तेजना एक हरे रंग का नेतृत्व किया और एक 8 चैनल दबाव इंजेक्टर, क्रमशः का उपयोग कर पूरा कर रहे हैं, और दोनों उत्तेजनाओं एक समर्पित प्रोत्साहन कंप्यूटर, जो भी एक परिशुद्धता 3-अक्ष के द्वारा पिपेट स्थिति के लिए प्रयोग किया जाता है द्वारा ट्रिगर कर रहे है micromanipulator । एक औंधा माइक्रोस्कोप एक प्रयोग के दौरान रेटिना का निरीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रायोगिक सेटअप. (A) सभी घटकों के सापेक्ष स्थितियां दिखाते हुए पूर्ण प्रायोगिक सेटअप का फोटोग्राफ । विदेश मंत्रालय एम्पलीफायर प्रणाली एक औंधा माइक्रोस्कोप के शीर्ष पर रखा गया है, जो नेत्रहीन प्रयोग के दौरान संलग्न उच्च गति कैमरे के माध्यम से रेटिना और डिजिटल छवि डिवाइस रेटिना इंटरफेस का निरीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. ऊपर और नीचे छिड़काव स्वतंत्र रूप से एक solenoid नियंत्रित छिड़काव प्रणाली का उपयोग कर नियंत्रित कर रहे हैं । इंजेक्शन, स्थिति नियंत्रण, और प्रतिबाधा माप एक दबाव इंजेक्टर का उपयोग कर पूरा कर रहे हैं, micromanipulator, और पैच दबाना एम्पलीफायर (नारंगी बॉक्स; में और अधिक विस्तार से दिखाया ख), क्रमशः. micropipette या डिवाइस प्रतिबाधा माप के लिए एक पैच क्लैंप headstage में डाला जाता है और एक micromanipulator का उपयोग कर स्थिति की सुविधा के लिए एक गैन्ट्री (ग्रीन बॉक्स द्वारा संकेत दिया; सी में और अधिक विस्तार में दिखाया गया है) पर घुड़सवार. (ख) प्रयोग में प्रयुक्त माप और नियंत्रण उपकरणों का एक क्लोज़ अप: 8 चैनल दबाव इंजेक्टर, micromanipulator नियंत्रण प्रणाली, प्रतिबाधा माप के लिए पैच दबाना एम्पलीफायर, और छिड़काव उन्मूलन के लिए चूषण पोत. (ग) इंजेक्शन प्रणाली के एक बंद-अप पिपेट धारक, पैच क्लैंप headstage, और micromanipulator के साथ इंटरफेस एक मल्टीपोर्ट डिवाइस दिखा गैन्ट्री । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: छिड़काव सेटअप. (क) शीर्ष छिड़काव और चूषण का स्थान दिखाने के साथ ही हरी एलईडी दृश्य प्रकाश उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया मेे एम्पलीफायर के शीर्ष की तस्वीर । (ख) pMEA छिड़काव चैंबर के एक बंद ऊपर छिड़काव और चूषण, pMEA, और प्रतिबाधा माप के लिए इस्तेमाल किया संदर्भ इलेक्ट्रोड के सटीक स्थानों illustrating. (ग) नीचे छिड़काव प्लेट का एक photomicrograph । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

नोट: चित्रा 1, चित्रा 2, और चित्रा 3 देखें

  1. कमरे के तापमान (~ 21 डिग्री सेल्सियस) और 1 एल कंटेनर में जगह पर de-के पानी की ९०० मिलीलीटर बाहर उपाय ।
  2. १००% CO2 के साथ पानी Perfuse एक bubbling तंत्र का उपयोग कर ।
    1. 1 L कंटेनर में पानी के लिए पाउडर ' एंस ' मध्यम के ८.८ ग्राम जोड़ें ।
    2. ' बी-जल एंस ' मध्यम के सभी निशान हटाने के लिए और 1 एल कंटेनर में जोड़ने के लिए पानी की कुछ मिलीलीटर के साथ ' एंस के मध्यम कंटेनर कुल्ला ।
    3. 1 L कंटेनर के लिए २५.३ मिलीलीटर सोडियम बिकारबोनिट समाधान (७.५% w/v31) जोड़ें ।
    4. 1 एल के अंतिम खंड के समाधान लाने के लिए अतिरिक्त पानी जोड़ें ।
    5. लगभग 5 मिनट के लिए2 सह के साथ पानी perfusing जारी रखें ।
  3. सह2 छिड़काव बंद करो और एक चिकित्सा के साथ perfusing समाधान शुरू ९५% हे2 और 5%2 % सह के लिए कम 30 मिनट या पीएच ७.४ पर स्थिर के लिए ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए, एंस मध्यम कमरे के तापमान पर रखा जाता है (~ 21 डिग्री सेल्सियस) प्रयोग भर में outgassing से कं2 या हे2 को रोकने के लिए, जो हवा के बुलबुले के साथ छिड़काव लाइनों करना कर सकते हैं ।
  4. ७०% इथेनॉल के साथ भरने के द्वारा नीचे और शीर्ष छिड़काव ट्यूबों साफ और फिर दोनों लाइनों de-जल के साथ 3 बार धो लो । de-जल और हवा के साथ शीर्ष लाइन के साथ नीचे की रेखा भरें ।
बंद दोनों एक solenoid वाल्व प्रणाली का उपयोग कर लाइनों ।
  • 1 एल एंस मध्यम कंटेनर के luer कनेक्शन के लिए मुख्य छिड़काव ट्यूब संलग्न करें ।
  • शीर्ष छिड़काव वाल्व खोलें और यह खुला छोड़ जब तक समाधान शीर्ष छिड़काव आउटलेट से बाहर निकालता है । ऊपर छिड़काव वाल्व बंद कर दें ।
  • नीचे छिड़काव आउटलेट खोलें और जब तक सभी बुलबुले नीचे छिड़काव आउटलेट के माध्यम से बाहर निकलें पर छोड़ दें ।
  • मुख्य सक्शन लाइन के लिए एक खाली चूषण पोत संलग्न और चूषण स्रोत पर बारी । सुनिश्चित करें कि दोनों ऊपर और नीचे सक्शन की सुविधा देता है खुले और काम कर रहे हैं ।
  • सुनिश्चित करें कि सभी कंप्यूटर दिखाता है लाल फिल्टर स्क्रीन द्वारा कवर रेटिना की अनैच्छिक दृश्य उत्तेजना से बचने के लिए कर रहे हैं ।

    • 3. Wholemount रेटिना तैयार करना

    Figure 4
    चित्रा 4: विच्छेदन और रेटिना की wholemount तैयारी. एक बरकरार eyecup एक photoreceptor-पतित जानवर से लिया की तस्वीर (क) । (ख) अनुदैर्ध्य कटौती के साथ रेटिना के Photomicrograph को समतल करने के लिए इसे बाहर. (ग) रेटिना समतल करने के बाद, यह photoreceptor पक्ष के साथ एक जाल ग्रिड पर रखा गया है जाल से संपर्क और हवा में समतल (छिड़काव माध्यम से बाहर) यह सुनिश्चित करने के लिए कोई परतों या कर्ल्ड किनारों रहे हैं. (घ) मेष और रेटिना जल्दी नाड़ीग्रंथि सेल पक्ष के साथ pMEA को स्थानांतरित कर रहे है इलेक्ट्रोड से संपर्क और तुरंत oxygenated एंस के माध्यम से perfused । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 5
    चित्र 5: छिद्रित multielectrode सरणी. (क) छिद्रित multielectrode सरणी के फोटोग्राफ प्रोटोकॉल में प्रयुक्त । रेटिना इलेक्ट्रोड सरणी पर रखा गया है (लाल आयत, जो बी में अधिक विस्तार में दिखाया गया है) pMEA कक्ष के भीतर oxygenated एंस के माध्यम से नित्य छिड़काव की अनुमति के द्वारा संकेत दिया । (ख) इलेक्ट्रोड सरणी के एक photomicrograph ही इलेक्ट्रोड के बीच वेध की व्यवस्था illustrating. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    नोट: चित्रा 4 और चित्रा 5 देखें

    1. एक handheld लाल एलईडी टॉर्च का उपयोग करने के लिए मंद लाल रोशनी प्रदान करने के लिए, कार्बन डाइऑक्साइड के माध्यम से euthanize पशु asphyxiation ग्रीवा अव्यवस्था या किसी अंय चुना विधि द्वारा पीछा किया, IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार ।
    2. Enucleate दोनों आंखें एक जौहरी #5 संदंश का उपयोग कर और एक ६० mm व्यास पेट्री डिश में enucleated आंखों जगह ताजा, oxygenated एम्स मध्यम समाधान के लगभग 3-4 मिलीलीटर के साथ ।
    3. लाल फिल्टर स्क्रीन के साथ कवर शीर्ष और नीचे रोशनी के साथ एक विच्छेदन stereomicroscope के माध्यम से आंख देख जबकि, एक स्केलपेल या तेज कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर चेहरे corneal में एक छोटा सा चीरा बनाने.
    4. कॉर्निया के किनारे करने के लिए इस छोटे से चीरा से कट तो कॉर्निया के पूरे किनारे के आसपास एक circumferential अनुभाग में कटौती का विस्तार । लेंस के साथ अब अलग कॉर्निया निकालें, पारदर्शी जलीय और अवलेह हास्य ।
    5. जबकि धीरे संदंश की एक जोड़ी के साथ eyecup धारण, ध्यान से eyecup के विपरीत पक्षों पर दो छोटे चीरा बनाते हैं । अगले, संदंश के दो जोड़े का उपयोग करने के लिए धीरे अलग चीरा में से प्रत्येक पर eyecup खींचने के लिए और श्वेतपटल से रेटिना अलग ।  धीरे से पूरी रेटिना को श्वेतपटल और eyecup से उठा लें । ऑप्टिक तंत्रिका काट, अगर यह अभी भी जुड़ा हुआ है ।
    6. रेटिना में अनुदैर्ध्य कटौती करने के लिए आधा या चौथाई वर्गों कैंची का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए, और फिर धीरे एक नायलॉन जाल पर एक रेटिना अनुभाग प्रसार (३५० µm खोलने के साथ १०० µm धागा व्यास) नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं के साथ (रेटिना की ओर गुफा) जाल से दूर का सामना करना पड़.
    7. pMEA सतह के साथ संपर्क में नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं के साथ एक छिद्रित multielectrode सरणी (pMEA) पर मेष और रेटिना रखें । फिर धीरे जगह में रेटिना पकड़ करने के लिए जाल के शीर्ष पर एक भारित टुकड़ा ग्रिड जगह है ।

    4. विदेश मंत्रालय और डेटा अधिग्रहण सेटअप

    Figure 6
    चित्रा 6: pMEA के शोर का स्तर. (क) pMEA इलेक्ट्रोड के एक सबसेट के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग उच्च लगातार शोर का प्रदर्शन. यह शोर आमतौर पर संपर्क पैड पर pMEA संपर्क पैड और pMEA पर पतली छिद्रित polyimide परत के सामान्य पहनने का एक परिणाम के रूप में विदेश मंत्रालय एम्पलीफायर के पिन के बीच उचित संपर्क की कमी की वजह से है. शोर के अन्य संभावित स्रोत आम तौर पर pMEA एम्पलीफायर संपर्क पैड पर लीक समाधान है. गरीब पिन संपर्क और/या संपर्क पैड पर लीक समाधान के कारण लगातार शोर आमतौर पर बेहतर संपर्क और सफाई और पैड सुखाने, क्रमशः प्राप्त करने के लिए एम्पलीफायर के भीतर pMEA की स्थिति को स्थानांतरित करके सही किया जा सकता है । यदि शोर सफाई या pMEA स्थिति स्थानांतरण द्वारा समाप्त नहीं किया जा सकता है, pMEA पूरी तरह से प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता हो सकती है । (ख) pMEA और एम्पलीफायर के बीच अच्छा संपर्क के साथ एक साफ pMEA से pMEA इलेक्ट्रोड के एक सबसेट से शोर के स्तर के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग. आमतौर पर, औसत शोर स्तर ± 16 µV के भीतर है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    नोट: चित्रा 6 देखें

    1. मंद लाल रोशनी के अंतर्गत, थल pMEA मेे एम्पलीफायर और नजदीक वर्धक कुंडों में ।
    2. संदर्भ के निशान pMEA चैंबर अंगूठी पर पहले से ही मौजूद नहीं हैं, तो दो ' X' के आकार का अंक लगभग 5 मिमी के अलावा एक क्षेत्र में आसानी से ऊपर से दिखाई तेजी से खड़े माइक्रोस्कोप के साथ स्थान पर ।
    3. pMEA चैंबर के अंदर शीर्ष छिड़काव आउटलेट स्थिति और शीर्ष छिड़काव वाल्व पर बारी लगभग 3 मिलीलीटर प्रति मिनट की एक छिड़काव दर को प्राप्त करने के लिए । वांछित perfusate स्तर (~ 5 मिमी गहरी) पर शीर्ष चूषण प्रवेश स्थिति और यह सुनिश्चित करना है कि यह काम कर रहा है ।
    4. डेटा प्राप्ति कंप्यूटर पर डेटा प्राप्ति सॉफ़्टवेयर खोलें और डेटा प्राप्त करना प्रारंभ करने के लिए ' चलाएं ' बटन क्लिक करें । सुनिश्चित करें कि सभी pMEA चैनल शोर से मुक्त हैं और तंत्रिका संकेतों रिकॉर्डिंग.
    यदि नहीं, एम्पलीफायर पिन और pMEA संपर्कों के बीच बेहतर संपर्क प्राप्त करने के लिए एंपलीफायर के भीतर pMEA स्थिति ( चित्रा 5देखें).
  • यह सुनिश्चित करें कि नीचे छिड़काव लाइन किसी भी हवा के बुलबुले के स्पष्ट है और, अगर यह बुलबुला मुक्त है, नीचे छिड़काव वाल्व पर बारी करने के लिए रेटिना के नीचे सुनिश्चित करने के लिए ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के साथ आपूर्ति की है ।
  • उल्टे ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप (०.४५ की एनए के साथ 10x इज़ाफ़ा) और ओपन इमेजिंग सॉफ्टवेयर के लिए संलग्न उच्च गति कैमरा चालू करें । यह सुनिश्चित करें कि उल्टे माइक्रोस्कोप प्रकाशक एक लाल फिल्टर शीट द्वारा कवर किया जाता है केवल लाल बत्ती उत्सर्जन और फिर रेटिना photobleaching से बचने के लिए एक कम प्रकाश स्तर पर प्रकाशक सेट.
    1. एक मॉनिटर पर देखने के उल्टे माइक्रोस्कोप क्षेत्र के एक लाइव डिजिटल छवि को देख कर, सबूत है कि समाधान नीचे छिड़काव प्लेट के माध्यम से बह रही है के लिए pMEA के नीचे की सतह का निरीक्षण ।
  • एक बार नीचे छिड़काव के बहने की पुष्टि की है, धीरे से मैन्युअल वैक्यूम अपशिष्ट किट पर वैक्यूम दबाव घुंडी मोड़ द्वारा नीचे सक्शन रैंप जबकि उल्टे माइक्रोस्कोप के माध्यम से रेटिना देख. रेटिना पर एक चौकस चूषण बल कार्य करता है एक बार चूषण बढ़ाने संघर्ष । बहुत अधिक या बहुत कम चूषण से बचने के लिए सावधान रहें ।
  • नीचे चूषण सुनिश्चित करने के बाद जगह में रेटिना रखती है, संदंश का उपयोग रेटिना से भारित टुकड़ा ग्रिड ले और धीरे रेटिना से एक कोने छील द्वारा नायलॉन जाल को दूर. यह आसानी से रेटिना मजबूती से शीर्ष पर उजागर रेटिना की सतह के साथ pMEA के नीचे करने के लिए संलग्न छोड़ने के लिए अलग करना चाहिए. लगभग 30 मिनट के लिए चल छिड़काव रखें रेटिना शल्य आघात से स्थिर करने के लिए अनुमति देते हैं ।

    • 5. ग्लूटामेट उत्तेजना तैयारी

    Figure 7
    चित्रा 7: ग् micropipette और मल्टीपोर्ट microfluidic डिवाइस । (a) किसी micropipette या डिवाइस को संमिलित करने से पहले कोई पिपेट धारक । चांदी/रजत क्लोराइड इलेक्ट्रोड (५० µm व्यास) विद्युत पैच क्लैंप headstage के साथ इंटरफेस करने के लिए अंत में एडाप्टर के लिए युग्मित है. (ख) कांच micropipette की एक तस्वीर पिपेट के लिए वायवीय इंजेक्शन शुरू करने के लिए इस्तेमाल बंदरगाह के स्थान दिखा धारक के साथ इंटरफेस । (ग) एक कस्टम मल्टीपोर्ट microfluidic डिवाइस (1 सेमी 1 सेमी ०.१३४ सेमी) एक कस्टम 3d मुद्रित स्थिरता से जुड़ी है और एक स्टेनलेस स्टील ट्यूब के माध्यम से पिपेट धारक के साथ इंटरफेस । उपकरण है, जो दो परतों में निर्मित किया गया था, ऊपरी परत (1 मिमी मोटी) में ग्लूटामेट भंडारण के लिए आठ microports (व्यास 14 µm) नीचे परत (३४० µm मोटी) और आठ पर चिप जलाशयों (व्यास १.६ मिमी) है । डिवाइस के नीचे परत में आठ microports में से प्रत्येक स्वतंत्र रूप से एक में विमान microchannel के माध्यम से शीर्ष परत में एक पर चिप जलाशय से जुड़ा है, और बदले में प्रत्येक चिप जलाशय 8 चैनल दबाव इंजेक्टर के एक दबाव बंदरगाह से जुड़ा है एक के माध्यम से लचीला ट्यूब नमूनों एकाधिक इंजेक्शन के लिए microports के स्वतंत्र एक्च्यूएशन अनुमति देने के लिए । (घ) मल्टीपोर्ट डिवाइस की एक बंद-ऊपर आठ स्वतंत्र रूप से पता करने वाली चिप जलाशयों और टयूबिंग सुविधा की व्यवस्था दिखा टयूबिंग इंटरफेस स्थिरता संलग्न करने से पहले चिमटी द्वारा आयोजित की । (ङ) ८ १४ µm-व्यास २०० µm रिक्ति के साथ एक 3 x 3 विंयास में व्यवस्था की pMEA के इलेक्ट्रोड के साथ संरेखित करने के लिए दिखा डिवाइस के नीचे की सतह के एक photomicrograph । आठ बाहर microports एकाधिक इंजेक्शन के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि केंद्रीय बंदरगाह डिवाइस के निर्माण के दौरान संरेखण के लिए सख्ती से इस्तेमाल हुआ था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    नोट: चित्र 7देखें ।

    1. 1 मिमी ग्लूटामेट की एक कार्यशील एकाग्रता पर ०.५ मिलीलीटर नमूना प्राप्त करने के लिए स्टॉक ग्लूटामेट solutionwith oxygenated एंस मध्यम समाधान को मिलाकर ग्लूटामेट समाधान तैयार करें ।
    2. ध्यान से एक पूर्व डालें 10 µm व्यास micropipette या स्टेनलेस स्टील रॉड एक मानक पिपेट एक ५० µm युक्त धारक में मल्टीपोर्ट microfluidic डिवाइस से जुड़ा-व्यास चांदी/चांदी क्लोराइड वायर इलेक्ट्रोड ।
      नोट: यदि प्रतिबाधा का पता लगाने उपलब्ध नहीं है, चांदी/चांदी क्लोराइड तार इलेक्ट्रोड छोड़ा जा सकता है.
    3. पैच-क्लैंप headstage के साथ पिपेट धारक इंटरफेस और दबाव इंजेक्शन प्रणाली के 1 चैनल के लिए पिपेट धारक के प्रेशर पोर्ट luer कनेक्शन कनेक्ट, अगर एक गिलास micropipette का उपयोग, या प्रत्येक के दबाव बंदरगाह luer कनेक्शन कनेक्ट दबाव इंजेक्शन प्रणाली के 1-8 चैनलों के साथ 8 इंजेक्शन बंदरगाहों, अगर मल्टीपोर्ट डिवाइस का उपयोग कर ।
    4. मैंयुअल रूप से दबाव इंजेक्शन सिस्टम चालू करें और चैनल 1 (या चैनल 1-8, के रूप में लागू हो) चालू करें । सुनिश्चित करें कि प्रणाली वातावरण के लिए निकाली गई है और ०.१ साई के लिए इंजेक्शन दबाव सेट ।
    5. micromanipulator पर मुड़ें और जोड़तोड़ नियंत्रक पर ' जांचना ' बटन दबाकर यह जांचना । स्थिति micromanipulator ताकि micropipette टिप (या डिवाइस के नीचे, के रूप में लागू) मेे एम्पलीफायर के ऊपर लगभग 30 मिमी है ।
    6. ग्लूटामेट समाधान (मानक एंस के माध्यम में 1 मिमी ग्लूटामेट) के साथ एक छोटी सी पेट्री डिश भरें और इसे micromanipulator के नीचे रखें । कम micropipette टिप (या उपकरण) समाधान में और दबाव इंजेक्शन प्रणाली पर ' भरने ' बटन का उपयोग करके भरने (के चूषण दबाव-13 में एच2O) जब तक वहां लगभग है 20 मिमी के समाधान में दिखाई ग्लास micropipette या मल्टीपोर्ट डिवाइस टयूबिंग ।
      1. मल्टीपोर्ट डिवाइस का उपयोग करते हैं, तो दबाव इंजेक्टर के चैनल 1 बंद करें और 2-8 चैनलों के लिए प्रोटोकॉल दोहराएँ । समाधान से बाहर micropipette टिप या डिवाइस लिफ्ट, पेट्री पकवान को दूर, और pMEA चैंबर के ऊपर micromanipulator की स्थिति ।
    7. एक तेजी से खड़े-घुड़सवार stereomicroscope का उपयोग करना, micropipette टिप या संदर्भ चिह्न pMEA चैंबर रिंग में धंसा के साथ डिवाइस के कोनों संरेखित करें । ' स्टोर संदर्भ एक ' और ' स्टोर संदर्भ बी ' बटन का उपयोग कर नियंत्रण सॉफ्टवेयर में जोड़तोड़ पदों की दुकान (या बस जोड़तोड़ मैन्युअल निर्देशांक ध्यान दें) pMEA इलेक्ट्रोड के साथ जोड़तोड़ का समन्वय प्रणाली को मैप करने के लिए.
    8. जोड़तोड़ नियंत्रण सॉफ्टवेयर का प्रयोग, मजबूत सहज गतिविधि के साथ एक लक्ष्य pMEA इलेक्ट्रोड का चयन करें और लक्ष्य इलेक्ट्रोड micropipettewith गिलास संरेखित करने के लिए ' चैनल के लिए कदम ' बटन पर क्लिक.
    मल्टीपोर्ट डिवाइस का उपयोग करते हैं, तो एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर मजबूत सहज गतिविधि के साथ लक्ष्य pMEA इलेक्ट्रोड के साथ डिवाइस microports संरेखित करें ।

    6. रेटिना के साथ इंटरफेस

    1. प्रतिबाधा माप उपलब्ध है, तो पैच दबाना एम्पलीफायर पर बारी और पिपेट धारक के अंदर चांदी/रजत क्लोराइड इलेक्ट्रोड की प्रतिबाधा कल्पना करने के लिए ' प्रारंभ ' बटन पर क्लिक करके प्रतिबाधा दृश्य सॉफ्टवेयर आरंभ. हालांकि वास्तविक समय प्रतिबाधा संकेतों अवलोकन, धीरे micropipette या डिवाइस कम यह प्रतिबाधा संकेत में एक तेजी से वृद्धि के द्वारा संकेत के रूप में रेटिना की सतह से संपर्क जब तक ( चित्रा 8देखें). सहेजें या रेटिना की सतह की स्थिति का नोट बनाते हैं ।
      1. यदि प्रतिबाधा माप अनुपलब्ध है, दृश्य अवलोकन के माध्यम से रेटिना की सतह के साथ संपर्क का पता लगाने, हालांकि यह कम सटीक हो जाएगा. पिपेट या उपकरण को कम करते हुए जब तक यह दिखाई नहीं मेे चैंबर में एंस के मध्यम समाधान की ऊपरी सतह से संपर्क ।
      2. फिर, एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ रेटिना के शीर्ष देख, जबकि रेटिना की शीर्ष सतह दिखाई विकृत है, जो इंगित करता है कि संपर्क रेटिना की सतह के साथ किया गया है, जब तक धीरे पिपेट या डिवाइस कम. सहेजें या रेटिना की सतह की स्थिति का नोट बनाते हैं ।
    2. उपसतह उत्तेजना के लिए, कम पिपेट एक और ४० µm (S334ter के लिए-3 रेटिना) या ७० µm (जंगली के लिए प्रकार रेटिना) ।
    3. micropipette टिप या डिवाइस microports के पास कोशिकाओं को डेटा अधिग्रहण के साथ तंत्रिका संकेतों को देख कर ग्लूटामेट उत्तेजना के लिए ग्रहणशील रहे हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए दबाव इंजेक्शन (०.१ साई) प्रणाली का उपयोग कर कुछ छोटी अवधि (10-30 ms) इंजेक्शन प्रदर्शन सॉफ्टवेयर.
      नोट: सफल इंजेक्शन एक स्पष्ट रूप से दिखाई कील की दर फट या कील बाधा ( चित्रा 9देखें)) को ध्यान में लाना होगा. कोई प्रतिक्रिया नहीं मनाया जाता है, तो एक अलग इलेक्ट्रोड पर micropipette या डिवाइस की स्थिति ।

    Figure 8
    चित्र 8: प्रतिबाधा माप. (क) प्रतिबाधा माप तकनीक का एक योजनाबद्ध. पैच क्लैंप एम्पलीफायर का उपयोग, micropipette के प्रतिबाधा लगातार रेटिना की सतह की ओर कम है के रूप में यह धीरे से नजर रखी है. जब micropipette रेटिना के ऊपर है, एक कम प्रतिबाधा पढ़ने में एम्स मध्यम परिणाम के अपेक्षाकृत उच्च ईओण चालकता. के रूप में micropipette रेटिना की सतह के साथ संपर्क करता है, चांदी/चांदी क्लोराइड तार के माध्यम से ईओण चालकता कम हो गई है, मापा प्रतिबाधा में तेजी से वृद्धि के कारण. (ख) प्रतिबाधा परिवर्तन प्रदर्शित एक भूखंड बस से पहले और रेटिना की सतह के साथ पिपेट टिप के संपर्क के बाद दर्ज की गई. मापा प्रतिबाधा अपेक्षाकृत कम है जब micropipette टिप समाधान में है बस से पहले संपर्क करने के लिए (बाईं तरफ नारंगी क्षेत्र द्वारा संकेत). एक बार संपर्क किया है (सही पर लाल ऐरोहेड और हरे रंग के क्षेत्र से संकेत), प्रतिबाधा तेजी से रेटिना ऊतक के साथ संपर्क पर कम ईओण चालकता की वजह से बढ़ जाती है. अभ्यास में, रेटिना की सतह मापा प्रतिबाधा के खड़ी वृद्धि की शुरुआत करने के लिए इसी ऊँचाई के रूप में पंजीकृत है (लाल ऐरोहेड का स्थान). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 9
    चित्र 9: इलेक्ट्रोड दृश्य, सहज, और ग्लूटामेट इंजेक्शन रिकॉर्डिंग के दौरान तंत्रिका गतिविधि की रिकॉर्डिंग । (क) नौ pMEA इलेक्ट्रोड से प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग एक हरे रंग का नेतृत्व किया, जहां प्रत्येक आयत एक अद्वितीय इलेक्ट्रोड से तंत्रिका डेटा से पता चलता है के साथ दृश्य प्रकाश उत्तेजना के दौरान उच्च पास फ़िल्टर्ड इलेक्ट्रोड डेटा दिखा. प्रत्येक इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग हरे रंग का नेतृत्व (प्रत्येक भूखंड में नारंगी ऐरोहेड के साथ दिखाया गया समय) पर मोड़ के बाद पहले दूसरे में एकत्र आंकड़ों को दिखाता है एक आम वोल्टेज के साथ छोड़ दिया y-अक्षों में दिखाया गया पैमाने । spikes की एक थ्रेशोल्ड वोल्टेज का उपयोग कर पहचाने गए थे-18 µV (प्रत्येक इलेक्ट्रोड प्लॉट में क्षैतिज लाल रेखा) और हरे इलेक्ट्रोड डेटा पर काले निशान द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. दृश्य उत्तेजना शीर्ष केंद्र एक है, जो प्रकाश के लिए एक निरोधात्मक प्रतिक्रिया के पास छोड़कर सभी इलेक्ट्रोड में spikes के एक फट (उत्तेजना) का कारण बना । (ख) दृश्य या इंजेक्शन उत्तेजना के बिना सहज तंत्रिका गतिविधि दिखा ही इलेक्ट्रोड के लिए एक समान भूखंड. हालांकि छोटे फटने मौजूद थे, spikes के पैटर्न दृश्य उत्तेजना के जवाब में दर्ज उन लोगों से बहुत अलग थे । (ग) केंद्रीय इलेक्ट्रोड पर एक ग्लूटामेट इंजेक्शन के बाद तुरंत दर्ज इलेक्ट्रोड के एक ही सबसेट से प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग (प्रत्येक भूखंड में नारंगी ऐरोहेड द्वारा इंगित समय). इंजेक्शन ग्लूटामेट केंद्रीय इलेक्ट्रोड है कि बहुत नेत्रहीन पैदा स्पाइक फटने के समान था में spikes के एक फट मिलाया । अन्य सभी इलेक्ट्रोड ग्लूटामेट इंजेक्शन द्वारा अप्रभावित थे, जो रासायनिक उत्तेजना तकनीक के ठीक स्थानिक संकल्प को दर्शाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    7. रेटिना रिकॉर्डिंग और उत्तेजना कार्यक्रम आरंभ

    1. ओरिएंट हरी रेटिना की शीर्ष सतह की ओर एलईडी । फ़ाइल नाम टाइप और "रिकॉर्ड" बटन पर क्लिक करके समर्पित रिकॉर्डिंग कंप्यूटर पर डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रिकॉर्डिंग शुरू करो ।
    2. एक बार रिकॉर्डिंग शुरू कर दिया है, उत्तेजना नियंत्रण कार्यक्रम खुला और "पढ़ें उत्तेजना फ़ाइल" बटन पर क्लिक करके डिफ़ॉल्ट उत्तेजना फ़ाइल लोड । अगले, "भागो उत्तेजना फ़ाइल" बटन पर क्लिक करें डिफ़ॉल्ट उत्तेजना उत्तेजनाओं और डेटा अधिग्रहण नीचे नोट में वर्णित प्रोटोकॉल से मिलकर फ़ाइल आरंभ करने के लिए ।
      नोट: (मैं) पर 2 के 30 परीक्षण एस और 2 पूर्ण फील्ड फ्लैश (5 lm/एम2 तीव्रता से) का उपयोग कर हरी एलईडी । (ii) हरे रंग का उपयोग किए बिना डेटा के १२० s एक समान टाइमस्केल पर रेटिना की सहज गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए नेतृत्व किया. (iii) ०.१ psi पर 10-30 ms injection times (लगभग १००-३०० pL injection) और 3 s आवेगों की अवधि के साथ ग्लूटामेट इंजेक्शन के 30 परीक्षणों से मिलकर ग्लूटामेट इंजेक्शन के 1 या अधिक सेट । मल्टी साइट इंजेक्शन के मामले में, एक साथ इंजेक्शन के लिए 2 या अधिक बंदरगाहों का चयन करें ।
    (iv) सहज क्रियाकलाप के ९० एस.
  • एक बार उत्तेजना फ़ाइल पूरा हो गया है, रिकॉर्डिंग बंद करो ("stop" बटन दबाकर) भविष्य स्पाइक छंटाई और डेटा विश्लेषण के लिए फ़ाइल को बचाने के लिए (उदाहरण के लिए चित्र 10 देखें) ।

    • Figure 10
    चित्र 10: दृश्य, सहज और ग्लूटामेट प्रतिक्रियाओं के Peristimulus हिस्टोग्राम. (क) चित्रा 9Aमें इलेक्ट्रोड के सबसेट से कील डेटा के प्रतिनिधि peristimulus हिस्टोग्राम (30 ms binwidth), दृश्य प्रकाश उत्तेजना के 20 परीक्षणों के पार औसत. एक आम कील दर पैमाने पर सभी इलेक्ट्रोड के लिए लागू किया गया था और बाईं y-अक्षों पर दिखाया गया है. प्रत्येक इलेक्ट्रोड साजिश में काली रेखा पर हरे रंग की एलईडी मोड़ के बाद पहले दूसरे के दौरान दर्ज सभी spikes के लिए औसत स्पाइक दर का प्रतिनिधित्व करता है । के रूप में देखा जा सकता है, दृश्य उत्तेजना शीर्ष केंद्र इलेक्ट्रोड, जो प्रकाश के लिए एक क्षणिक निरोधात्मक प्रतिक्रिया थी को छोड़कर सभी इलेक्ट्रोड पर एक क्षणिक उत्तेजक स्पाइक दर प्रतिक्रिया का कारण बना. (ख) किसी भी दृश्य या रासायनिक उत्तेजना के बिना एक ही इलेक्ट्रोड पर दर्ज औसत सहज स्पाइक दर प्रतिक्रियाओं. उत्तेजना के बिना, प्रत्येक इलेक्ट्रोड के लिए कील दर अपेक्षाकृत स्थिर हैं । (ग) मध्य इलेक्ट्रोड के ऊपर एक स्थान पर एक ग्लूटामेट इंजेक्शन के जवाब में एक ही इलेक्ट्रोड पर दर्ज औसत स्पाइक दर प्रतिसाद । केवल क्षणिक प्रतिक्रिया स्पष्ट इंजेक्शन साइट के तहत इलेक्ट्रोड पर उत्तेजक प्रतिक्रिया है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    इस प्रोटोकॉल के लिए रासायनिक दोनों सामांय, जंगली प्रकार के रेटिना के रूप में अच्छी तरह से photoreceptor पतित रेटिना को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, पर्याप्त सेलुलर photoreceptors के नुकसान की वजह से remodeling के बावजूद । या तो photoreceptor पतित या जंगली प्रकार के रेटिना के साथ प्रयोग शुरू करने से पहले, रिकॉर्डिंग और उत्तेजना उपकरण (चित्रा 1 और चित्रा 2) ठन होने की जरूरत है और pMEA (चित्रा 5) को कम करने के लिए साफ किया जाना चाहिए प्रत्येक इलेक्ट्रोड चैनल पर शोर (चित्रा 6). हालांकि photoreceptor पतित रेटिना पतली और इसलिए जंगली प्रकार रेटिना से अधिक नाजुक हैं, एक ही विच्छेदन प्रक्रिया (चित्रा 4) दोनों के लिए प्रयोग किया जाता है । विच्छेदन के बाद, रेटिना ध्यान से pMEA पर नाड़ीग्रंथि सेल साइड इलेक्ट्रोड का सामना करना पड़ के साथ रखा जाता है, और pMEA के अंदर सुरक्षित मेे एम्पलीफायर (आंकड़ा 3), जहां यह लगातार ताजा के साथ perfused जा सकता है, oxygenated एंस के माध्यम से दोनों शीर्ष (चित्र 3 बी) और नीचे (चित्र c) पक्षों । रेटिना को सुनिश्चित करने के बाद शल्य चिकित्सा आघात से स्थिर है, एक गिलास micropipette या मल्टीपोर्ट डिवाइस एक पिपेट धारक में फिट है (चित्रा 7Aई) और एक पैच के साथ इंटरफेस-क्लैंप headstage जिसकी स्थिति एक 3-अक्ष द्वारा नियंत्रित है काटेकोर micromanipulator. पिपेट या डिवाइस के microport (ओं) तो एक लक्ष्य इलेक्ट्रोड के साथ गठबंधन किया जाना चाहिए और ध्यान से कम से संपर्क प्रतिबाधा विधि का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है चित्रा 8 या नेत्रहीन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से पुष्टि की. एक बार इंजेक्शन वितरण बंदरगाह (ओं) को सतह या रेटिना की उपसतह पर उचित स्थान पर तैनात है, उत्तेजना कार्यक्रम शुरू किया जा सकता है ।

    pMEA इलेक्ट्रोड के एक सबसेट पर तंत्रिका गतिविधि रिकॉर्डिंग का एक प्रतिनिधि सेट दृश्य (चित्रा 9A), सहज (चित्रा 9B), और exogenously इंजेक्शन ग्लूटामेट (चित्रा ९सी) उत्तेजनाओं के लिए चित्रा 9 में दिखाया गया है । सफल दृश्य और रासायनिक उत्तेजना RGC spikes के फटने या spiking गतिविधि की अस्थाई समाप्ति के रूप में आम तौर पर देख रहे हैं, के रूप में चित्रा 9में उदाहरण में देखा जा सकता है । यदि आसपास की कोशिकाएं रासायनिक उत्तेजना के लिए अप्रतिसादी हो जाती हैं, तो परिणामी स्पाइक डेटा सहज spiking व्यवहार के समान दिखेगा । RGC spikes निकालने और उंहें परीक्षणों में आयोजन के बाद, प्रत्येक इलेक्ट्रोड पर तंत्रिका प्रतिक्रियाओं एक औसत peristimulus समय का उपयोग कर सचित्र किया जा सकता है हिस्टोग्राम (PSTH) की spiking दर, जैसे कि चित्रा 10में दिखाया गया है, जो कच्चे के अनुरूप चित्र 9में डेटा इलेक्ट्रोड ।

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    यहां प्रस्तुत विधि एक अनूठा तंत्रिका उत्तेजना प्रतिमान दर्शाता है, जिसमें रेटिना ंयूरॉंस रासायनिक इन विट्रो मेंरेटिना की उपसतह में देशी न्यूरोट्रांसमीटर रसायन इंजेक्शन द्वारा उत्तेजित कर रहे हैं । इस रासायनिक उत्तेजना तकनीक selectivity और लक्ष्य ंयूरॉंस की उच्च फोकल विशिष्टता सहित पारंपरिक विद्युत उत्तेजना तकनीक, पर कई लाभ प्रदान करता है । इस प्रोटोकॉल विवरण के ऊपर कैसे छोटे मात्रा न्यूरोट्रांसमीटर ग्लूटामेट लक्ष्य रेटिना न्यूरॉन्स या तो एक एकल बंदरगाह ग्लास micropipette या एक कस्टम micromachined मल्टीपोर्ट microfluidic डिवाइस के पास का उपयोग कर के पास दिया की वायवीय इंजेक्शन शारीरिक रूप से महत्वपूर्ण RGC प्रतिक्रियाओं । हालांकि इस प्रोटोकॉल केवल ग्लूटामेट के साथ प्रदर्शन किया गया है, प्रोटोकॉल न्यूरोट्रांसमीटर के अन्य प्रकार के साथ रेटिना की रासायनिक उत्तेजना का अध्ययन करने के लिए उपयोगी रहता है. इसके अलावा, जबकि यह एक electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए एक pMEA का उपयोग करने के लिए बेहतर है३२ के रूप में इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित, गैर-छिद्रित प्रकार सहित अंय मेे डिजाइन, pMEA के रूप में इसी तरह के परिणाम प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । निंनलिखित पैराग्राफ में, हम अपने प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण कदम चर्चा, तरीके आम समस्याओं का निवारण करने के लिए, और सीमाओं और इस उत्तेजना तकनीक के भविष्य अनुप्रयोगों ।

    सुरक्षित और विश्वसनीय रासायनिक उत्तेजना प्राप्त करने के लिए, कई महत्वपूर्ण कदम इस प्रोटोकॉल में पूरा किया जाना चाहिए । महत्वपूर्ण चरणों में से एक ध्यान से रेटिना निकालने और समय यह oxygenated एंस के बाहर रखा जाता है की मात्रा को कम करने के द्वारा एक सफल रेटिना तैयारी प्राप्त है, यानी, जब मेष ग्रिड पर हौसले से विच्छेदित रेटिना समतल यह एंस के माध्यम से pMEA perfused पर स्थानांतरित करने से पहले । रेटिना के प्रारंभिक विच्छेदन तेज विच्छेदन उपकरण और अभ्यास के बाद से चूहे आंख अपेक्षाकृत छोटा है की आवश्यकता है । इसके अलावा, photoreceptor पतित रेटिना का निष्कर्षण विशेष रूप से मुश्किल हो सकता है क्योंकि वे पहले से ही नाजुक सामांय रेटिना की तुलना में अधिक नाजुक हैं, और इसलिए फाड़ करने के लिए प्रवण हैं । पूरे विच्छेदन प्रक्रिया, प्रारंभिक enucleation से pMEA पर रेटिना रखने के लिए, के रूप में जल्दी के रूप में संभव के रूप में ऑक्सीजन या अन्य पोषक तत्वों की कमी से समयपूर्व कोशिका मृत्यु को रोकने के लिए पूरा किया जाना चाहिए. यांत्रिक आघात विच्छेदन के दौरान ऊतक के लिए प्रस्थान के माध्यम से एक कटौती से बचने या ऊतक को नुकसान से कम किया जाना चाहिए, के रूप में यह भी अप्राकृतिक तंत्रिका प्रतिक्रियाओं और कोशिका मृत्यु के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

    pMEA पर रेटिना को रखने के बाद, ऊपर और नीचे छिड़काव और सक्शन लाइनों की शुरुआत करते समय ध्यान रखा जाना चाहिए, क्योंकि यह प्रयोग की विफलता का एक सामान्य बिंदु है । सभी छिड़काव और सक्शन लाइनों को मंजूरी के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले जांच की जानी चाहिए और समय पर प्रयोग भर में जांच की है कि हवा में बुलबुले लाइनों के माध्यम से प्रवाह में बाधा नहीं है सुनिश्चित करने के लिए । विशेष रूप से, नीचे छिड़काव लाइन के भीतर हवा के बुलबुले के गठन पूरी तरह से अपने छोटे व्यास की वजह से छिड़काव के प्रवाह में बाधा पैदा कर सकते हैं, और इस तरह ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के रेटिना से वंचित द्वारा प्रयोग करने के लिए एक समय से पहले खत्म हो । हवाई बुलबुले के खतरे की वजह से, इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल कमरे के तापमान पर आयोजित किया जाता है बजाय अधिक आदर्श शारीरिक तापमान पर outgassing से बचने के लिए एम्स के माध्यम से समाधान ऑक्सीजन या कार्बन डाइऑक्साइड । हवा के बुलबुले एक प्रयोग के दौरान छिड़काव लाइनों में से एक करना करते हैं, वे आम तौर पर छिड़काव लाइन पर दोहन हल्के से छोटे, गैर occluding बुलबुले में फैलाया जा सकता है ।

    एक अंय आम समस्या छिड़काव प्रणाली से संबंधित नीचे चूषण दबाव के ठीक समायोजन है ताकि यह रेटिना दृढ़ता से इलेक्ट्रोड के साथ संपर्क में रखती है, लेकिन क्षति के बिना । यदि चूषण दबाव बहुत अधिक है, यह pMEA के वेध के माध्यम से रेटिना के छोटे टुकड़े चूसना और अंत में सभी तंत्रिका प्रतिक्रियाओं की समाप्ति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । दूसरी ओर, अगर दबाव बहुत कम है, रेटिना दूर इलेक्ट्रोड से नाव और इसलिए तंत्रिका रिकॉर्डिंग को बाधित करेगा । इन दो चरम स्तर के बीच चूषण दबाव का समायोजन अभ्यास की आवश्यकता है और अगर pMEA एक औंधा माइक्रोस्कोप, जो pMEA के वेध के बंद अवलोकन की अनुमति देता है पर प्रयोग किया जाता है आसान बना दिया है । चूषण को एडजस्ट करते समय इन छिद्रों को देख कर, एक सही संतुलन पा सकते हैं जो रेटिना को नुकसान पहुंचाए बिना संपर्क बनाए रखता है । जंगली प्रकार के रेटिना उत्तेजक जब photoreceptors photobleaching की संभावना को कम करने के लिए, उल्टे माइक्रोस्कोप प्रकाशक केवल लाल बत्ती उत्सर्जन करने के लिए फ़िल्टर किया जाना चाहिए और दृश्य अवलोकन जितनी जल्दी हो सके पूरा किया जाना चाहिए.

    उचित छिड़काव शर्तों को सुनिश्चित करने के बाद, अगले महत्वपूर्ण कदम डिवाइस या pMEA पर एक दृश्यमान निश्चित बिंदु या मार्कर के साथ पिपेट संदर्भित है ताकि इंजेक्शन बंदरगाह (ओं) ठीक pMEA के इलेक्ट्रोड के साथ गठबंधन किया जा सकता है. आमतौर पर, इस triangulation के माध्यम से पूरा किया है जिसमें दो संदर्भ pMEA चैंबर के रिम पर रखा निशान मोटे तौर पर या तो कांच micropipette टिप या स्थलों के साथ मल्टीपोर्ट डिवाइस पर दृश्य अवलोकन द्वारा उपयोग ऊपर से गठबंधन कर रहे है बूम-खड़े खुर्दबीन घुड़सवार । लक्ष्य इलेक्ट्रोड के साथ इंजेक्शन बंदरगाह (ओं) का एक महीन संरेखण तो उल्टे माइक्रोस्कोप के माध्यम से दृश्य निरीक्षण द्वारा हासिल की है. एक बार ठीक से गठबंधन, देखभाल जब या तो एक पिपेट या एक microfluidic डिवाइस के साथ रेटिना आ जाना चाहिए, किसी भी जोड़तोड़ घबराना या बहाव के बाद से रेटिना को कुचलने या pMEA को नुकसान पहुंचा सकता है । सबसे अच्छा तरीका है अकस्मात हानिकारक रेटिना से बचने के लिए लगातार पिपेट इलेक्ट्रोड के प्रतिबाधा की निगरानी करने के लिए ठीक शीर्ष रेटिना सतह के साथ संपर्क का पता लगाने के लिए है. प्रतिबाधा माप भी जल्दी से अगर रेटिना की उपसतह में डाला micropipette टिप अवरुद्ध है, जो एक असामान्य रूप से उच्च (आमतौर पर gigaohm रेंज में) प्रतिबाधा द्वारा संकेत दिया है की जाँच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि अवरुद्ध, micropipette टिप आमतौर पर अपनी टिप रेटिना से दूर तैनात करने के लिए अनैच्छिक नुकसान से बचने के साथ एक उच्च दबाव नाड़ी की शुरुआत से मंजूरी दे दी जा सकती है । दुर्लभ मामलों में, अवरुद्ध पिपेट पूरी तरह से प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता हो सकती है अगर उच्च दबाव दालों रुकावट स्पष्ट नहीं है । संदर्भ इलेक्ट्रोड pMEA कक्ष और पैच दबाना एम्पलीफायर में समाधान के बीच ठीक से इंटरफ़ेस नहीं करता है, जब एक असामान्य या उच्च प्रतिबाधा मान भी दर्ज किया जा सकता है.

    एक बार एक लक्ष्य स्थान पर तैनात, ग्लूटामेट की इंजेक्शन मात्रा कसकर दबाव, इंजेक्शन समय, और न्यूरोट्रांसमीटर एकाग्रता न्यूरॉन्स, जो कारण के लिए दिखाया गया है की उत्तेजना को रोकने के लिए विवश द्वारा नियंत्रित किया जाना चाहिए excitotoxic नुकसान होते.इस प्रोटोकॉल में विस्तृत ग्लूटामेट इंजेक्शन पैरामीटर एक ऐसी व्यवस्था का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो ग्लूटामेट excitotoxicity३३ के कारण के लिए ज्ञात थ्रेशोल्ड के ठीक नीचे है, लेकिन जब अंय प्रकार के न्यूरोट्रांसमीटर के साथ इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते हैं, इसी excitotoxicity प्रभाव के लिए दहलीज स्तर सुरक्षित उत्तेजना के लिए विचार किया जाना चाहिए । इसके अलावा, ऊपर प्रोटोकॉल में निर्धारित ०.१ साई इंजेक्शन दबाव इस अध्ययन में इस्तेमाल 8 चैनल दबाव इंजेक्टर पर उपलब्ध सबसे कम संभव दबाव सेटिंग से व्युत्पंन किया गया था, लेकिन लगातार सफल परिणाम का उत्पादन किया है । इसलिए, न्यूरोट्रांसमीटर इंजेक्शन के लिए ०.१ साई केवल विचारोत्तेजक है, लेकिन प्रतिबंधात्मक नहीं, सफल रासायनिक उत्तेजना प्राप्त करने के लिए. यदि कम एक्च्यूएशन दबाव एक अलग दबाव इंजेक्टर के साथ संभव हो रहे हैं, इंजेक्शन ०.१ साई से कम दबाव पर किया जा सकता है ।

    इस विट्रो wholemount रेटिना की तैयारी में शामिल प्रोटोकॉल की एक सीमा कम प्रयोगात्मक समय खिड़की है, जो 8 ज या उससे कम की अवधि तक सीमित है, भी चरम पूरे प्रयोग के दौरान लिया देखभाल के साथ है । इस सीमित प्रायोगिक समय खिड़की excitotoxicity जैसे रासायनिक उत्तेजना के किसी भी दीर्घकालिक प्रभाव की परीक्षा की अनुमति नहीं है । इस विशिष्ट प्रोटोकॉल की एक और सीमा के लिए कमरे के तापमान पर रिकॉर्ड के रूप में शारीरिक तापमान है, जो संभावना दोनों नेत्रहीन और रासायनिक, स्पाइक दर प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करता है, के बाद से पिछले अध्ययनों से पता चला है कि कम करने का विरोध किया है विकल्प है रिकॉर्डिंग तापमान spiking दर, प्रतिक्रिया लेटेंसी, और ग्लूटामेट अधिक दर कई अन्य गुणों के बीच३४,३५,३६,३७,३८में बदल सकते हैं । इस सीमा एक गर्म नीचे प्लेट के साथ एक गैर छिद्रित विदेश मंत्रालय का उपयोग करके बचा जा सकता है, के रूप में pMEA है, जो एक गर्म थाली के बिना एक विशेष रूप से डिजाइन नीचे छिड़काव प्लेट और/या दोनों शीर्ष और नीचे के लिए एक प्रभावी थर्मल चुलबुली इस्तेमाल का विरोध छिड़काव.

    अंत में, इन विट्रो में तैयारी oxygenated एम्स माध्यम के सक्रिय छिड़काव के लिए आवश्यकता से सीमित है रेटिना को स्वस्थ रखने के लिए । द्रव धाराओं छिड़काव प्रणाली की वजह से आम तौर पर कर रहे है बहुत तेजी से प्राकृतिक छिड़काव आंख में पाया तंत्र से vivo३९में, और रासायनिक इंजेक्शन के साथ हस्तक्षेप कर सकता है इंजेक्शन न्यूरोट्रांसमीटर से दूर ड्राइंग द्वारा रेटिना. सतह आधारित इंजेक्शन, मल्टीपोर्ट डिवाइस के साथ किए गए लोगों के रूप में, संभावना अधिक छिड़काव मौजूदा हस्तक्षेप करने के लिए अतिसंवेदनशील होगा, हालांकि pMEA के नीचे से छिड़काव की उपस्थिति एक समान प्रभाव पैदा कर सकता है, जबकि उपसतह इंजेक्शन की तुलना में पूरे रेटिना भर. इस कारण से, वर्तमान प्रोटोकॉल में ग्लूटामेट रसायनों वायवीय दबाव के साथ दिया गया था, लेकिन इंजेक्शन दबाव vivo में सफल उत्तेजना को प्राप्त करने के लिए आवश्यक काफी कम हो सकता है कि उपयोग के लिए इन विट्रो पढ़ाई की ।

    रासायनिक उत्तेजना, जो अधिक प्राकृतिक न्यूरोट्रांसमीटर उत्तेजनाओं के साथ ंयूरॉंस को सक्रिय करना चाहता है, पारंपरिक विद्युत उत्तेजना के लिए एक प्रभावी विकल्प प्रदान करता है, लेकिन अभी तक गंभीरता से पता लगाया नहीं किया गया है । एक परिणाम के रूप में, वहां थोड़ा प्रोटोकॉल या रेटिना ंयूरॉंस की विश्वसनीय उपरेटिना रासायनिक उत्तेजना प्राप्त करने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं का वर्णन उपलब्ध साहित्य है । हाल के अध्ययन28 इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रदर्शन किया है कि रेटिना ंयूरॉंस की उपरेटिना रासायनिक उत्तेजना मज़बूती से स्थानिक तुलना या रेटिना की उत्तेजना से बेहतर संकल्प के साथ RGC प्रतिक्रियाओं में लाना कर सकते हैं, और वहाँ है सबूत है कि रेटिना लागू exogenous ग्लूटामेट सीधे द्विध्रुवी कोशिकाओं को उत्तेजित कर सकते हैं, इस विधि की अनुमति रेटिना के अंतर्निहित दृश्य प्रसंस्करण सर्किट का लाभ लेने के लिए और, संभवतः, धारणा और अधिक प्राकृतिक प्रकाश के समान पैदा उत्तेजना.

    इसके अलावा अध्ययन के लिए गैर murine मॉडल प्रणालियों में इन निष्कर्षों को मांय और पिछले अध्ययनों से संबोधित नहीं मुद्दों की जांच की आवश्यकता है, दीर्घकालिक प्रभाव और इस के कार्यांवयन में vivo से संबंधित व्यावहारिक पहलुओं सहित रणनीति. इसलिए, इस दृष्टिकोण के भविष्य के निर्देश स्पष्ट रूप से एक प्रत्यारोपित प्रकाश संचालित microfluidic के साथ लंबी अवधि के रासायनिक वितरण और उत्तेजना को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त प्रौद्योगिकी के विकास के द्वारा vivo पशु मॉडलों में इस अवधारणा का अनुवाद में झूठ डिवाइस है कि पतित photoreceptor परत के लिए एक प्रतिस्थापन के रूप में कार्य करता है । एक अपेक्षाकृत अध्ययन उत्तेजना प्रतिमान के रूप में, रासायनिक उत्तेजना के व्यापक अनुप्रयोगों अभी तक की खोज की है, लेकिन बाद से रेटिना केंद्रीय तंत्रिका तंत्र४०का एक हिस्सा है, इस उत्तेजना रणनीति में लागू किया जा सकता है संभावित अंय तंत्रिका उत्तेजना संदर्भों, जैसे cortical के उपचार के रूप में, रीढ़ की हड्डी, या neuromuscular विकारों अलग न्यूरोट्रांसमीटर का उपयोग कर । इसके अलावा, प्रस्तुत प्रोटोकॉल और अधिक आम तौर पर एक इन विट्रो में सेटिंग में ठीक spatiotemporal संकल्प के साथ तंत्रिका ऊतकों में एक दवा या अंय रसायनों के नियंत्रित वितरण के प्रभाव की जांच के अध्ययन के लिए अपनाया जा सकता है ।

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    पेपर में प्रस्तुत किए गए इस कार्य को नेशनल साइंस फाउंडेशन, इमर्जिंग फ्रंटियर्स इन रिसर्च एंड इनोवेशन (NSF-EFRI) प्रोग्राम ग्रांट नंबर ०९३८०७२ द्वारा सपोर्ट किया गया । इस पत्र की सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि NSF के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं । लेखक भी अपने काम डिजाइनिंग के लिए डॉ Samsoon Inayat धंयवाद और रासायनिक उत्तेजना के लिए प्रारंभिक प्रायोगिक सेटअप परीक्षण और श्री अश्विन रघुनाथन अपने काम के लिए डिजाइन, निर्माण, और मल्टीपोर्ट microfluidic में इस्तेमाल किया डिवाइस के मूल्यांकन के लिए इच्छा इस अध्ययन ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Microelectrode array, perforated layout Multi Channel Systems, GmbH 60pMEA200/30iR-Ti-pr http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti
    MEA amplifier Multi Channel Systems, GmbH MEA1060-Inv http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv
    Bottom perfusion groundplate for pMEA Multi Channel Systems, GmbH MEA1060-Inv-(BC)-PGP http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp
    3-axis Motorized Micromanipulator Sutter Instruments, Novato, CA MP-285 https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html
    Micromanipulator Control System Sutter Instruments, Novato, CA MPC-200 https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html
    Gantry style micromanipulator stand with linear slide Sutter Instruments, Novato, CA MT-75/LS https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html
    8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ
    Vendor: Harvard Apparatus UK    		 PM-8000 or PM-8 OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm
    Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1
    _HAUK_ProductDetail
    Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier Molecular Devices, Sunnyvale, CA Axopatch 200A Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B:
    https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier
    Patch clamp headstage Molecular Devices, Sunnyvale, CA CV 201A http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage
    Vacuum waste kit ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY VMK http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/
    Pipette holder Warner Instruments, Hamden, CT QSW-A10P https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915
    Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes World Precision Instruments, Sarasota, FL TIP10TW1 https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/
    Zoom stereomicroscope Nikon, Tokyo, Japan SMZ-745T https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745
    Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm Old School Industries, Inc., Dacono, CO OS1010H-16BB http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm
    Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand Nikon, Tokyo, Japan SMZ-445 https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445
    Inverted microscope system Nikon, Tokyo, Japan Eclipse Ti-E https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E
    Ames medium Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A1420 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420
    L-Glutamic Acid (Glutamate) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G5667 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291
    Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S8761 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761
    60 mm Petri dish (10 mm tall) Fischer Scientific, Waltham, MA FB0875713A 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a
    Jewelers #5 Forceps World Precision Instruments, Sarasota, FL 555227F https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/
    Standard Scalpel Blad #24 World Precision Instruments, Sarasota, FL 500247 https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/
    Scalpel Handle #4 World Precision Instruments, Sarasota, FL 500237 https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/
    Vannas Tubingen Dissection Scissors World Precision Instruments, Sarasota, FL 503378 https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/
    Nylon mesh kit Warner Instruments, Hamden, CT NYL/MESH https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173
    Harp slice grid ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY HSG-5AD http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/
    Ag/AgCl reference electrode pellet Multi Channel Systems, GmbH P1060 http://www.multichannelsystems.com/products/p1060
    4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY VC3-4xG http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/
    Zyla 5.5 sCMOS microscope camera Andor Technology, Belfast, UK Zyla 5.5 sCMOS http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos
    Silver wire (50 μm diameter) Fischer Scientific, Waltham, MA AA44461G5 https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5
    Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) Cole Parmer, Vernon Hills , IL EW-06419-01 https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901
    Tilting Tool Holder with Steel Cannula ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY TILTPORT One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/
    Roscolux #26 Light Red Filter Sheet Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT R2611 Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux
    Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html
    Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA 4588 Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/
    Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588
    MC_Rack Software Multi Channel Systems, GmbH MC_Rack http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack
    Labview Software National Instruments, Austin, TX LabVIEW http://www.ni.com/labview/
    NIS-Elements: Basic Research Software Nikon, Tokyo, Japan NIS-Elements BR https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. , (2011).
    2. Fritsche, L. G., Fariss, R. N., Stambolian, D., Abecasis, G. R., Curcio, C. A., Swaroop, A. Age-Related Macular Degeneration: Genetics and Biology Coming Together. Annu Rev Genomics Hum Genet. 15, 151-171 (2014).
    3. Marc, R. E., et al. Neural reprogramming in retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 3364-3371 (2007).
    4. Jones, B. W., Kondo, M., Terasaki, H., Lin, Y., McCall, M., Marc, R. E. Retinal remodeling. Jpn J Ophthalmol. 56, 289-306 (2012).
    5. Soto, F., Kerschensteiner, D. Synaptic remodeling of neuronal circuits in early retinal degeneration. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
    6. Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
    7. Euler, T., Schubert, T. Multiple Independent Oscillatory Networks in the Degenerating Retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
    8. Boye, S. E., Boye, S. L., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. A Comprehensive Review of Retinal Gene Therapy. Mol Ther. 21, 509-519 (2013).
    9. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. The Lancet. 385, 509-516 (2015).
    10. Reh, T. A. Photoreceptor Transplantation in Late Stage Retinal Degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, (2016).
    11. Zrenner, E. Fighting blindness with microelectronics. Sci Transl Med. 5, (2013).
    12. Humayun, M. S., de Juan, E. Jr, Dagnelie, G. The Bionic Eye: A Quarter Century of Retinal Prosthesis Research and Development. Ophthalmol. 123, S89-S97 (2016).
    13. Cruz, L., et al. The Argus II epiretinal prosthesis system allows letter and word reading and long-term function in patients with profound vision loss. Br J Ophthalmol. 97, 632-636 (2013).
    14. Zrenner, E., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. P R Soc B. 278, 1489-1497 (2011).
    15. Stronks, H. C., Dagnelie, G. The functional performance of the Argus II retinal prosthesis. Expert Rev Med Devices. 11, 23-30 (2014).
    16. Stingl, K., et al. Artificial vision with wirelessly powered subretinal electronic implant alpha-IMS. P R Soc B. 280, (2013).
    17. Rizzo, J. F. Update on retinal prosthetic research: the Boston Retinal Implant Project. J Neuroophthalmol. 31, 160-168 (2011).
    18. Ayton, L. N., et al. First-in-Human Trial of a Novel Suprachoroidal Retinal Prosthesis. PLoS ONE. 9, e115239 (2014).
    19. Chuang, A. T., Margo, C. E., Greenberg, P. B. Retinal implants: a systematic review. Br J Ophthalmol. 98, 852-856 (2014).
    20. Cai, C., Twyford, P., Fried, S. The response of retinal neurons to high-frequency stimulation. J Neural Eng. 10, 036009 (2013).
    21. Eiber, C. D., Lovell, N. H., Suaning, G. J. Attaining higher resolution visual prosthetics: a review of the factors and limitations. J Neural Eng. 10, 011002 (2013).
    22. Humayun, M., Propst, R., de Juan, E., McCormick, K., Hickingbotham, D. Bipolar surface electrical stimulation of the vertebrate retina. Arch Ophthalmol. 112, 110-116 (1994).
    23. Zrenner, E., et al. Can subretinal microphotodiodes successfully replace degenerated photoreceptors? Vision Res. 39, 2555-2567 (1999).
    24. Majji, A. B., Humayun, M. S., Weiland, J. D., Suzuki, S., D'Anna, S. A., de Juan, E. Long-Term Histological and Electrophysiological Results of an Inactive Epiretinal Electrode Array Implantation in Dogs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).
    25. Peterman, M. C., Noolandi, J., Blumenkranz, M. S., Fishman, H. A. Localized chemical release from an artificial synapse chip. PNAS. 101, 9951-9954 (2004).
    26. Finlayson, P. G., Iezzi, R. Glutamate stimulation of retinal ganglion cells in normal and s334ter-4 rat retinas: a candidate for a neurotransmitter-based retinal prosthesis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 3619-3628 (2010).
    27. Inayat, S., Rountree, C. M., Troy, J. B., Saggere, L. Chemical stimulation of rat retinal neurons: feasibility of an epiretinal neurotransmitter-based prosthesis. J Neural Eng. 12, 016010 (2015).
    28. Rountree, C. M., Inayat, S., Troy, J. B., Saggere, L. Differential stimulation of the retina with subretinally injected exogenous neurotransmitter: A biomimetic alternative to electrical stimulation. Sci Rep. 6, 38505 (2016).
    29. Ray, A., Sun, G. J., Chan, L., Grzywacz, N. M., Weiland, J., Lee, E. -J. Morphological alterations in retinal neurons in the S334ter-line3 transgenic rat. Cell Tissue Res. 339, 481-491 (2010).
    30. Martinez-Navarrete, G., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Fernandez-Sanchez, L., Pinilla, I., Cuenca, N. Retinal degeneration in two lines of transgenic S334ter rats. Exp Eye Res. 92, 227-237 (2011).
    31. Sigma Aldrich. Sigma Aldrich Ames Medium Product Information Sheet. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/a1420pis.pdf (2017).
    32. Reinhard, K., et al. Step-By-Step instructions for retina recordings with perforated multi electrode arrays. PLoS ONE. 9, e106148 (2014).
    33. Izumi, Y., Kirby, C. O., Benz, A. M., Olney, J. W., Zorumski, C. F. Müller cell swelling, glutamate uptake, and excitotoxic neurodegeneration in the isolated rat retina. Glia. 25, 379-389 (1999).
    34. Tunnicliff, G. Glutamate uptake by chick retina. Biochem J. 150, 297-299 (1975).
    35. Schwartz, E. A., Tachibana, M. Electrophysiology of glutamate and sodium co-transport in a glial cell of the salamander retina. J Physiol (Lond). 426, 43-80 (1990).
    36. Muller, A., Maurin, L., Bonne, C. Free radicals and glutamate uptake in the retina. Gen Pharmacol- Vasc S. 30, 315-318 (1998).
    37. Dhingra, N. K., Kao, Y. -H., Sterling, P., Smith, R. G. Contrast threshold of a brisk-transient ganglion cell in vitro. J of Neurophysiol. 89, 2360-2369 (2003).
    38. Ahlers, M. T., Ammermüller, J. A system for precise temperature control of isolated nervous tissue under optical access: Application to multi-electrode recordings. J of Neurosci Methods. 219, 83-91 (2013).
    39. Feke, G. T., Tagawa, H., Deupree, D. M., Goger, D. G., Sebag, J., Weiter, J. J. Blood flow in the normal human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30, 58-65 (1989).
    40. The Retina. Neuroscience. Purves, D., et al. , 2nd edition, Sinauer Associates. (2001).

    Tags

    जैव अभियांत्रिकी निर्गम १३० रासायनिक उत्तेजना रेटिना photoreceptor अध... neuromodulation रेटिना अंग ग्लूटामेट न्यूरोट्रांसमीटर रासायनिक synapse multielectrode सरणी कृत्रिम neurostimulation कृत्रिम synapse चिप
    Biomimetic रासायनिक Neuromodulation के लिए क्रियाविधि <em>इन विट्रो में</em> न्यूरोट्रांसमीटर ग्लूटामेट के साथ चूहा रेटिना
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Rountree, C. M., Troy, J. B.,… More

    Rountree, C. M., Troy, J. B., Saggere, L. Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro. J. Vis. Exp. (130), e56645, doi:10.3791/56645 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter