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Bioengineering

Methodik für biomimetische Chemie Neuromodulation der Ratte Netzhaut mit dem Neurotransmitter Glutamat In-vitro-

Published: December 19, 2017 doi: 10.3791/56645
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Mechanical and Industrial Engineering, University of Illinois at Chicago, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Untersuchung einer Form der chemischen Neurostimulation Wholemount Ratte Netzhäute in Vitro mit dem Neurotransmitter Glutamat. Chemischen Neurostimulation ist eine vielversprechende Alternative zu herkömmlichen elektrischen Neurostimulation der Netzhaut Neuronen für die Behandlung von irreversible Blindheit durch Photorezeptor degenerativen Erkrankungen verursacht.

Abstract

Photorezeptor degenerative Krankheiten verursachen irreparable Erblindung durch den fortschreitenden Verlust der Sehzellen in der Netzhaut. Netzhaut Prothesen sind eine neue Behandlung für Photorezeptor degenerativen Krankheiten, die darauf abzielen, Vision wiederherzustellen indem künstlich stimuliert die Überlebenden Netzhaut Neuronen in der Hoffnung auf verständlicheren visuellen Wahrnehmung bei Patienten zu entlocken. Aktuelle retinale Prothesen haben gezeigt, dass Erfolg bei der Wiederherstellung der begrenzten Sicht für Patienten verwenden eine Reihe von Elektroden elektrisch stimulieren die Netzhaut aber ehrlich physischen Barrieren bei der Wiederherstellung der hohe Schärfe, natürliche Vision für die Patienten. Chemische Neurostimulation mit native Neurotransmitter ist eine biomimetische alternative zu elektrischen Stimulation und könnte die grundlegende Einschränkungen verbunden mit retinalen Prothesen mit elektrischen Neurostimulation umgehen. Insbesondere hat chemische Neurostimulation das Potenzial, mehr natürliche Vision mit vergleichbaren oder besseren visuellen Untiefen Patienten wiederherzustellen, durch die Injektion von Kleinstmengen von Neurotransmittern, die gleichen natürlichen Mittel der Kommunikation durch Netzhaut chemische Synapsen mit viel feinere Auflösung als aktuelle elektrische Prothesen. Als relativ unerforschten Stimulation Paradigma ist jedoch keine etablierte Protokoll für chemische Stimulation der Netzhaut in Vitrozu erreichen. Der Zweck dieser Arbeit ist es, bieten einen detaillierten Rahmen für die Durchführung der chemischen Stimulation der Netzhaut für die Ermittler, die das Potenzial der chemischen Neuromodulation der Netzhaut oder ähnliches studieren neurale Gewebe in Vitro. In dieser Arbeit beschreiben wir den Versuchsaufbau und Methodik für die retinalen Ganglienzellen Zelle (RGC) Spike Reaktionen ähnlich wie visuelle leichte Reaktionen in Wildtyp zu entlocken und Photorezeptor degenerierte Wholemount Ratte Netzhaut durch die Injektion kontrolliert Datenmengen der Neurotransmitter Glutamat in den subretinalen Raum mit Glas Mikropipetten und eine benutzerdefinierte multiport mikrofluidischen Gerät. Diese Methodik und Protokoll sind allgemein genug, um für Neuromodulation mit anderen Neurotransmittern oder auch andere neuronale Gewebe angepasst werden.

Introduction

Photorezeptor degenerative Krankheiten wie Retinitis Pigmentosa und altersbedingte Makula-Degeneration, vererbbare Ursachen der Verlust der Sehkraft führen und sind derzeit unheilbare1,2. Obwohl diese Krankheiten aus einer Vielzahl von spezifischen genetischen Mutationen entstehen, Photorezeptor degenerativen Erkrankungen als Gruppe der fortschreitende Verlust der Sehzellen in der Netzhaut, zeichnen sich durch die schließlich Blindheit verursacht. Der Verlust der Photorezeptoren Trigger weit verbreitet in der Netzhaut Umbau aber überleben Netzhaut Neuronen, einschließlich der Bipolarzellen und Routinggruppenconnectors, bleiben intakt und relativ funktional auch in fortgeschrittenen Stadien der Photorezeptor-Degeneration3 ,4,5,6,7.

Die Mechanismen und Pathologien dieser Krankheiten wurden gut charakterisierten3,4,5,6,7 , aber eine wirksame Behandlung bleibt schwer. In den letzten drei Jahrzehnten haben Forscher weltweit eine Vielzahl von therapeutischen Behandlungen zur Wiederherstellung der Vision für die betroffenen mit Photorezeptor degenerativen Erkrankungen einschließlich Gen-Therapie8, Stammzellen Behandlung9untersucht, Netzhaut Transplantation10und künstliche Stimulation11,12 der Überlebenden Netzhaut Neuronen. Von diesen sind die klinisch verfügbaren retinalen Prothesen, künstliche Neurostimulatoren, die traditionell eine Reihe von Elektroden elektrisch stimulieren die Bipolarzellen oder Routinggruppenconnectors in bestimmten Mustern mit dem Ziel eingesetzt haben Erstellen von künstlichen visuellen Wahrnehmungen in Patienten11. Aktuelle Generation elektrische Prothesen, wie z. B. die Argus II13 und Alpha-IMS14 Geräte, haben klinische Zulassung erreicht und Vorstudien haben gezeigt, dass sie durch die Wiederherstellung der Lebensqualität der Patienten verbessern können ein Maß für die Vision mit Epiretinal (vor der Netzhaut) und subretinalen (Rückseite der Netzhaut) implantierte Geräte15,16. Forschergruppen auf der ganzen Welt arbeiten an der Weiterentwicklung der Netzhaut Prothesen über die Erfolge dieser ersten Generation Geräte17,18,19,20 aber konfrontiert gewesen Schwierigkeiten, die Gestaltung einer elektrischen Prothese in der Lage hohe Schärfe Vision unterhalb der gesetzlichen Blindheit für die Patienten. Jüngste Studien haben gezeigt, dass höheren räumlichen Auflösung als die durch die aktuelle Generation ermöglicht Elektro-basierte Prothesen ist schwierig aufgrund der Ladung-Injektion-Grenze zu erreichen, erfordert die Verwendung von großen Elektroden sicher stimulieren Netzhaut Neuronen auf Kosten der räumlichen Auflösung, d. h. Sehschärfe11,21. Darüber hinaus ist die elektrischer Stimulation weiter begrenzt, da es in der Regel alle benachbarten Zellen stimuliert und daher unnatürliche und verwirrende Wahrnehmungen bei Patienten löst, vor allem, weil es eine inhärent unnatürliche Stimulation Paradigma21. Dennoch haben die frühen Erfolge der elektrischen Stimulation demonstrierte, dass künstliche Neurostimulation eine wirksame Behandlung für Photorezeptor degenerativen Erkrankungen sein kann. Dies führt zu vermuten, dass eine noch effektivere Behandlung durch die Stimulierung der Netzhaut mit der natürlichen Mittel der Kommunikation an chemischen Synapsen Neurotransmitter Chemikalien erreichbar sein könnte. In diesem Whitepaper vorgestellten Methode soll die therapeutische Machbarkeit der chemischen Stimulation zu erforschen, die versucht, das natürliche System der synaptische Kommunikation zwischen Netzhaut Neuronen, als eine alternative zur elektrischen Stimulation biomimetische imitieren für eine Netzhautprothese.

Übersetzung des Begriffs der therapeutischen chemischen Stimulation zu einer chemischen Netzhautprothese stützt sich auf chemisch Ziel Netzhaut Neuronen mit kleinen Mengen von native Neurotransmitter wie Glutamat, veröffentlicht durch einen mikrofluidischen aktivieren Gerät, bestehend aus einer großen Auswahl an Abtauzyklusses in Reaktion auf die visuelle Stimulation. Auf diese Weise wäre eine chemische Netzhautprothese im Wesentlichen eine biomimetische künstliche Photorezeptor-Schicht, die Photonen, die natürlich erreicht die Netzhaut auf chemische Signale übersetzt. Da diese chemischen Signale die gleichen Neurotransmitter verwenden in normale Netzhaut Signalisierung genutzt und die Überlebenden Netzhaut Neuronen der degenerierten Netzhaut durch die gleichen synaptischen Wege von normalem Sehvermögen Wege, die sich daraus ergebenden visuelle verwendet stimulieren Wahrnehmung durch eine chemische Netzhautprothese erreicht könnte im Vergleich zu einem hervorgerufen durch eine elektrische Prothese natürlich und verständlich. Außerdem, da die Abtauzyklusses durch die Neurotransmitter freigesetzt sind extrem klein und angeordneten in hoher Dichte im Gegensatz zu den Elektroden erfolgen kann eine mögliche chemische prothetische möglicherweise mehr Brennweite Stimulation zu erzielen und höhere räumliche höhere Auflösung als eine elektrische Prothese. Auf der Grundlage dieser potenziellen Vorteile bietet eine chemische Netzhautprothese eine vielversprechende Alternative zu elektrischen Prothesen.

Chemischen Stimulation der Netzhaut, ist jedoch relativ wenig bis vor kurzem untersucht worden. Während elektrischer Stimulation der Netzhaut in jahrzehntelanger Arbeit durch in-vitro-22,23, in Vivo23,24und klinische Studien13 gut charakterisiert worden ist ,14, Studien zur chemischen Stimulation wurden beschränkt sich ausschließlich auf einige in-vitro- arbeiten25,26,27,28. Iezzi und Finlayson26 und Inayat Et al. 27 zeigt Epiretinal chemischen Stimulation der Netzhaut in Vitro mit einer einzigen Elektrode und ein multielectrode Array (MEA), bzw. die Glutamat hervorgerufen Antworten der Netzhaut Neuronen aufnehmen. In jüngerer Zeit, Rountree Et al. 28 demonstriert die differenzielle Stimulation der ein-und Netzhaut Bahnen mit Glutamat aus der subretinalen Seite und ein MEA die neuronalen Antworten von mehreren Standorten auf der Netzhaut zu erfassen.Obwohl diese Arbeiten vorläufig die Machbarkeit der chemischen Stimulation hergestellt haben, weitere Studien sind notwendig zu untersuchen, viele Aspekte dieses Ansatzes hinausgehen behandelt bisher25,26,27 , 28, und optimieren Sie die therapeutische Stimulationsparameter in in Vitro und in Vivo Tiermodellen vor der Übersetzung dieses Konzepts zu einem chemischen Netzhautprothese wie oben beschrieben. Aber derzeit gibt es keine etablierte Methode für die Durchführung der chemischen Stimulation der Netzhaut in der Literatur und Methoden in den früheren Werken haben nicht so ausführlich beschrieben worden, wie essentiell für replikativen Studien wäre. Daher ist die Begründung für diese Methoden-Papier um einen klar definierten Rahmen für die Durchführung von in-vitro- chemischen Stimulation der Netzhaut für die Ermittler interessiert entweder Replikation unserer früheren Studien27, 28 oder Weiterentwicklung dieses im Entstehen begriffene Konzept der chemischen Neurostimulation.

Hier zeigen wir eine Methode für die Durchführung von in-vitro- chemischen Stimulation der Netzhaut Neuronen im Wholemount Netzhaut von Wildtyp Ratten und einem Photorezeptor degenerierten Rattenmodell, die das Fortschreiten der degenerativen Photorezeptor eng imitiert Erkrankungen des Menschen. Die Beweggründe für die Entwicklung dieser Stimulation Methode in in-vitro- Modelle ist die therapeutischen Bereiche der verschiedenen Stimulationsparameter bewerten und studieren neurale Ansprechverhalten, die wäre unmöglich oder schwierig zu beobachten in in Vivo Modelle, vor allem während der ersten Studien konzentriert sich auf die Bewertung der Machbarkeit dieses Ansatzes. In diesem Verfahren zeigen wir Single-Site und gleichzeitige Multi-Site chemische Stimulationen der Netzhaut durch die Bereitstellung von kleiner Mengen von 1 mM Glutamat in der Nähe von Ziel Netzhaut Neuronen über kommerziell erhältliche Single-Port-Glas Mikropipetten und ein custom Industrieanforderungen Multiport mikrofluidischen Gerät, beziehungsweise. Während einer Site und der Multisite Stimulationen das grundlegende Ziel der Untersuchung der therapeutischen Machbarkeit der chemischen Neuromodulation erreichen, bietet jeweils einen speziellen Zweck einen einzigartigen Vorteil. Die Single-Site-Stimulation, die mit im Handel erhältlichen Pre gezogenem Glas Mikropipetten erreicht werden kann, kann verwendet werden, um die Chemikalien direkt in den Untergrund der Netzhaut an einem einzigen Standort zu injizieren und dient zu untersuchen, ob beobachtbaren RGC Rate spike Antworten, die visuell evozierten leichte Reaktionen ähneln können fokal unter der Injektionsstelle ausgelöst werden. Auf der anderen Seite kann Multisite-Stimulation, die ein speziell gefertigte multiport mikrofluidischen Gerät erfordert, Chemikalien räumlich an mehreren Standorten über die Oberfläche der Netzhaut zu injizieren und dient zu untersuchen, wie gut Glutamat-evozierten RCG Antwort-Muster entsprechen die Glutamat-Injektion-Muster in Muster Stimulation Studien.

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Protocol

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien von der National Research Council-Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Tierische Handling und Euthanasie Protokolle wurden überprüft und genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Illinois at Chicago.

(1) Tiermodellen

  1. Wildtyp Long-Evans Ratten
    1. Eine 24-32 Tag alt Wildtyp lange Evans mit Kapuze Ratte beiderlei Geschlechts angesprochen mit einem standard 12 h-Tag/Nacht-Rhythmus zu beschaffen.
    2. Dunkelheit anzupassen indem man sie in einem völlig dunklen Raum für 1 h vor Beginn des Experiments die Ratte.
  2. S334ter-3 Ratten
    1. Reverie transgenen Albino homozygot S334ter-3 Ratte (beiderlei Geschlechts), mit dem Ausdruck zwei Kopien des mutierten Rhodopsin Gens mit pigmentierten Wildtyp Long-Evans Ratte, pigmentierte heterozygote S334ter-3 Ratten zu produzieren, die Degeneration der Photorezeptoren aufweisen ähnlich wie in Weiterentwicklung zur menschlichen Retinitis Pigmentosa29,30.
    2. Heterozygote Nachkommen mit standard 12 h-Tag/Nacht-Rhythmus zu erhöhen und Ratten beiderlei Geschlechts für Experimente der folgenden Altersgruppen entsprechend den folgenden Phasen der Photorezeptor-Degeneration: frühe Phase Degeneration: 14-20 Tage alt; Mittlerer Stufe Degeneration: 21-27 Tage alt; Späten Stadium Degeneration: 28-35 Tage alt; Völlig blind: > 50 Tage alt.
    3. Dunkelheit anzupassen indem man sie in einem völlig dunklen Raum für 1 h vor Beginn des Experiments die Ratte.

2. Vorbereitung des Ames mittlere Lösung und Perfusion System

Figure 1
Abbildung 1: Schematische des experimentellen Aufbaus. Schematische Darstellung der Versuchsanordnung für chemische Stimulation mit einem Glas Mikropipette (A) und eine benutzerdefinierte multiport mikrofluidischen Gerät (B). Die Netzhaut wird auf ein pMEA gelegt und ständig frisches, sauerstoffreiches Ames mittlere Lösung von oben und unten durch die Löcher der pMEA durchströmt. Neuronale Antwort Signale durch die Elektroden von der pMEA abgeholt werden eine Daten-Übernahme-Computer durch den MEA-Verstärker zugeführt. Visuelle und chemische Stimulation sind mit einer grünen LED und ein 8-Kanal-Druck-Injektor bzw. erreicht, und beide Reize ausgelöst werden durch einen speziellen Reiz-Computer, der auch verwendet wird, um die Pipette über eine Präzisions-3-Achsen zu positionieren Mikromanipulator. Einem inversen Mikroskop wird verwendet, um die Netzhaut während eines Experiments zu beobachten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Versuchsaufbau. (A) Foto von der kompletten Versuchsaufbau zeigt die relativen Positionen aller Komponenten. MEA-Verstärkersystem befindet sich oben auf einem inversen Mikroskop zur Sichtprüfung der Netzhaut und Digital image der Gerät-Netzhaut-Schnittstelle mit Hilfe der beigefügten High-Speed-Kamera während des Experiments dient. Obere und untere Perfusion erfolgt über ein Magnetventil gesteuert Perfusion System unabhängig. Einspritzung, Lageregelung und Impedanz-Messungen werden durchgeführt mit einem Druck-Injektor, Mikromanipulator und Patch-Clamp-Verstärker (Orange box; in B ausführlicher dargestellt), beziehungsweise. Die Mikropipette oder das Gerät in einem Patch Clamp Headstage für Impedanz Messungen eingesetzt und montiert an einem Portal (angezeigt durch green-Box; detaillierter in C dargestellt) positionieren mit einem Mikromanipulator zu erleichtern. (B) eine Nahaufnahme der Mess- und Regeltechnik Instrumente im Experiment: der 8-Kanal-Druck-Injektor, Mikromanipulator Kontrollsystem, Patch-Clamp-Verstärker für Impedanzmessung und Saug Schiffes für Perfusion Beseitigung. (C) eine Nahaufnahme von der Injektion System Gantry zeigt ein multiport Gerät eine Schnittstelle mit der Pipette Halter, Patch-Clamp-Headstage und Mikromanipulator. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Perfusion Setup. (A) Foto des oberen Teils der MEA-Verstärker zeigt den Standort der obersten Perfusion sowie Saug-und die grüne LED für visuelle Lichtstimulation verwendet. (B) eine Nahaufnahme der pMEA Perfusion Kammer illustrieren die genauen Standorte der oberen Perfusion und Absaugung, die pMEA und die Bezugselektrode verwendet für Impedanzmessung. (C) eine Mikrophotographie der Perfusion Bodenplatte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Hinweis: Siehe Abbildung 1, Abbildung 2und Abbildung 3

  1. 900 mL deionisiertes Wasser bei Raumtemperatur (~ 21 ° C) messen Sie ab und in 1 L Behälter.
  2. Durchspülen Sie das Wasser mit 100 % CO2 mit einem sprudelnden Mechanismus.
    1. Zugeben Sie 8,8 g pulverisierte Ames Mittel-bis in 1 L Behälter Wasser.
    2. Spülen Sie Ames mittlere Behälter mit ein paar mL deionisiertes Wasser zu entfernen alle Spuren von pulverförmigen Ames Medium und in 1 L Behälter.
    3. 1 L Container 25,3 mL Natrium Bikarbonat-Lösung (7,5 % w/V31) hinzufügen.
    4. Fügen Sie zusätzliche Wasser um die Lösung zu einem Endvolumen von 1 L.
    5. Fahren Sie fort, Vorrichtung das Wasser mit CO2 ca. 5 Minuten.
  3. Stoppen Sie CO2 Perfusion zu und beginnen Sie Vorrichtung Lösung mit einem medizinischem Gasgemisch von 95 % O2 und 5 % CO2 für mindestens 30 Minuten oder bis der pH-Wert bei 7.4 stabilisiert.
    Hinweis: Für die Zwecke dieses Protokolls, das Ames-Medium bei Raumtemperatur (~ 21 ° C) während das Experiment zu verhindern, dass CO2 oder O2 Ausgasung, bleibt die Perfusion Linien mit Luftblasen verdecken können.
  4. Reinigen Sie die Unterseite und Oberseite Perfusion Rohre durch Füllung mit 70 % Ethanol und dann waschen Sie beide Linien 3 Mal mit deionisiertes Wasser. Füllen Sie unter dem Strich mit deionisiertes Wasser und die oberste Zeile mit Luft.
Schließen Sie beide Linien mit einem Magnetventil Ventilsystem.
  • Luer-Anschluss des Behälters 1 L Ames Mittel die wichtigsten Perfusion Röhre zuordnen.
  • Öffnen Sie Top Perfusion Ventil und lassen Sie offen, bis Lösung aus der oberen Perfusion Steckdose beendet wird. Schalten Sie das obere Perfusion Ventil.
  • Öffnen Sie der Grundablass Perfusion zu und lassen Sie es auf, bis alle Bläschen durch Perfusion Grundablass beenden.
  • Die wichtigsten Saugleitung beimessen Sie ein leeres Gefäß Sauganschlusses, und schalten Sie den Sauger Quelle. Sicherstellen Sie, dass die oberen und unteren Saug Buchten geöffnet ist und benutzt.
  • Stellen Sie sicher, dass alle Computer-Displays unter roten Filtersiebe zur Vermeidung unbeabsichtigter visuelle Stimulation der Netzhaut fallen.

    • 3. Wholemount der Netzhaut Vorbereitung

    Figure 4
    Abbildung 4: Präparation und Wholemount Vorbereitung der Netzhaut. (A) Foto von einer intakten Augenmuschel ein Photorezeptor degeneriert Tier entnommen. (B) Mikrophotographie der Netzhaut mit längs-Schnitten, es verflachen. (C) nach Abflachung der Netzhaut, es befindet sich auf einem Mesh-Gitter mit der Photorezeptor-Seite Kontakt mit dem Netz und in Luft (außerhalb der Perfusion Medium) abgeflacht, um sicherzustellen, dass keine Falten oder gewellten Kanten sind. (D) das Netz und die Netzhaut sind schnell mit dem Ganglion Zelle Seite Kontaktierung der Elektroden auf die pMEA übertragen und sofort mit Sauerstoff angereichertes Ames Medium durchströmt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 5
    Abbildung 5: perforierte multielectrode Array. (A) Foto von der perforierten multielectrode Array in das Protokoll verwendet. Die Netzhaut wird auf die Elektroden-Array (gekennzeichnet durch das rote Rechteck, das in größerem Detail in B gezeigt ist) innerhalb der pMEA Kammer ermöglichen kontinuierliche Perfusion mit Sauerstoff angereichertes Ames Medium gelegt. (B) eine Mikrophotographie der Elektroden-Array selbst illustriert Lochstellung zwischen Elektroden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Hinweis: Siehe Abbildung 4 und Abbildung 5

    1. Verwenden eine Handheld-rote LED-Taschenlampe zu dunkel rote Beleuchtung, einschläfern Tier über Kohlendioxid Erstickung durch zervikale Dislokation oder einer anderen gewählten Methode, gefolgt nach IACUC Protokolle.
    2. Enucleate beide Augen mit einem Juwelier #5 Pinzette und entkernte Augen in einer Petrischale 60 mm Durchmesser mit ca. 3-4 mL frisches, sauerstoffreiches Ames mittlere Lösung.
    3. Während der Beobachtung des Auges durch eine Dissektion Stereomikroskop mit oberen und unteren Strahler mit Rotfilter Bildschirm bedeckt, machen Sie einen kleinen Schnitt in die Hornhaut Gesicht mit einem Skalpell oder eine scharfe Schere.
    4. Aus diesem kleinen Schnitt zum Rand der Hornhaut schneiden, dann den Schnitt in einem umlaufenden Abschnitt rund um den gesamten Rand der Hornhaut zu verlängern. Entfernen Sie die nun freistehende Hornhaut zusammen mit dem Objektiv, transluzente wässrigen und Glaskörper Körpersäfte.
    5. Halten Sie die Augenmuschel sanft mit ein paar Zangen, machen Sie sorgfältig zwei kleine Hautschnitte auf gegenüberliegenden Seiten des die Augenmuschel. Verwenden Sie anschließend zwei Paare der Zange vorsichtig Auseinanderziehen der Augenmuschel jeweils in die Einschnitte und die Netzhaut von der Sklera trennen.  Heben Sie langsam die gesamte Netzhaut von der Sklera und Augenmuschel. Schneiden Sie den Sehnerv, wenn er noch angeschlossen ist.
    6. Längs-Schnitte in der Netzhaut, die Hälfte oder Viertel Abschnitte mit einer Schere zu erhalten, und dann sanft verbreiten eine Netzhaut Abschnitt auf einer Nylon-Netzgewebe (100 µm-Gewindedurchmesser mit 350 µm öffnen) mit dem Ganglion Zellen (konkave Netzhaut) abgewandten Seite des Netzes.
    7. Legen Sie das Netz und die Netzhaut auf eine perforierte multielectrode Array (pMEA) mit der Ganglienzellen in Kontakt mit der pMEA Oberfläche. Dann legen Sie vorsichtig eine gewichtete Teilbildgitter auf das Netz an die Netzhaut in Position zu halten.

    (4) MEA und Daten-Übernahme-Setup

    Figure 6
    Abbildung 6: Geräuschpegel von pMEA. (A) repräsentative Aufnahme einer Teilmenge von pMEA Elektroden ausstellenden hohen anhaltenden Lärm. Dieses Geräusch ist in der Regel aufgrund mangelnder guten Kontakt zwischen den Kontaktflächen pMEA und die Pins des MEA Verstärkers durch normalen Verschleiß der dünnen perforierte Polyimidschicht über der pMEA, vor allem an den Kontaktflächen. Die andere mögliche Quelle der Lärm ist in der Regel Lösung sickerte auf die Kontaktflächen der pMEA Verstärker. Anhaltende Geräusche aufgrund schlechter Pin kontaktieren bzw. durchgesickert-Lösung auf den Kontakt, den Pads in der Regel durch Verschieben der Position des pMEA am Verstärker zu besseren Kontakt und reinigen und trocknen die Pads bzw. korrigiert werden können. Wenn Lärm nicht beseitigt werden, durch Reinigung oder die pMEA Position verschieben, müssen die pMEA vollständig ersetzt werden. (B) repräsentative Erfassung der Geräuschpegel aus einer Teilmenge von pMEA Elektroden aus einer sauberen pMEA mit guten Kontakt zwischen dem pMEA und dem Verstärker. In der Regel ist der durchschnittliche Lärmpegel innerhalb ±16 µV. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Hinweis: Siehe Abbildung 6

    1. Unter dim rote Beleuchtung pMEA in MEA Verstärker und schließen Sie Verstärker Riegel zu.
    2. Wenn Referenzmarken noch nicht auf dem pMEA-Kammer-Ring sind, zwei "X" etch-geformte Zeichen Abstand ca. 5 mm voneinander entfernt in einem Gebiet gut sichtbar von oben mit dem Boom-Stativ montierten Mikroskop.
    3. Position der oberen Perfusion Steckdose innerhalb der pMEA Kammer und schalten Sie das Ventil Top Perfusion, eine Perfusion Rate von ca. 3 mL pro Minute zu erreichen. Positionieren Sie den oberen Saugmund Ebene der gewünschten Perfusat (~ 5 mm tief) und sorgen dafür, dass es funktioniert.
    4. Öffnen Sie die Datenerfassungs-Software auf dem Computer Daten Akquisition und klicken Sie auf "Play", um starten, empfangen von Daten. Sicherstellen Sie, dass alle pMEA Kanäle geräuschlos und Aufzeichnungsfunktionen neuralen Signale sind.
    Wenn dies nicht der Fall ist, positionieren Sie die pMEA innerhalb des Verstärkers zu besseren Kontakt zwischen den Verstärker-Pins und die pMEA Kontakte (siehe Abbildung 5).
  • Stellen Sie sicher, dass unter dem Strich Perfusion frei von Luftblasen ist und wenn es ist blasenfrei, biegen Sie auf die unteren Perfusion Ventil an der Unterseite der Netzhaut zu gewährleisten wird mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt.
  • Schalten Sie die High-Speed-Kamera an das invertierte Lichtmikroskop (10-fache Vergrößerung mit N.A von 0,45) angeschlossen und öffnen Sie imaging-Software zu. Sicherstellen Sie, dass die inversen Mikroskop Beleuchtung durch ein Rotfilter Blatt nur rotes Licht emittieren und legen Sie dann dem Strahler auf eine geringe Lichtintensität Immunofluoreszenz zu vermeiden die Netzhaut abgedeckt ist.
    1. Beobachten Sie durch ein digitales Livebild der inversen Mikroskop Sichtfeld auf einem Monitor betrachten die Bodenfläche des pMEA für Hinweise darauf, dass die Lösung durch die Bodenplatte Perfusion fließt.
  • Sobald unten Perfusion bestätigt wird, fließen, Hochfahren Sie langsam unten Absaugen mit manuell dem Drehknopf Vakuum Druck auf das Vakuum Abfall Kit unter Beachtung der Netzhaut durch umgekehrtes Mikroskop. Nicht mehr die Saugkraft erhöhen, sobald eine beobachtbare Saugkraft auf die Netzhaut wirkt. Achten Sie darauf, zu viel oder zu wenig Saugleistung zu vermeiden.
  • Nach Sicherstellung der Unterseite absaugen die Netzhaut an Ihrem Platz hält, nehmen die gewichtete Teilbildgitter der Netzhaut mit Pinzette und entfernen Sie vorsichtig die Nylon-Netzgewebe durch Schälen einer Ecke vorsichtig von der Netzhaut. Es sollte leicht verlassen der Netzhaut fest angebracht an der Unterseite der pMEA mit der subretinalen Angriffsfläche an der Spitze zu trennen. Halten Sie die Perfusion läuft für ca. 30 min, Netzhaut, chirurgische Trauma zu stabilisieren lassen.

    • (5) Glutamat Stimulation Vorbereitung

    Figure 7
    Abbildung 7: Glas Mikropipette und multiport mikrofluidischen Gerät. (A) eine Pipette Halter vor dem Einfügen einer Mikropipette oder Gerät. Silber/Silberchlorid-Elektrode (50 µm Durchmesser) ist elektrisch an den Adapter am Ende zur Schnittstelle mit der Patch-Clamp-Headstage gekoppelt. (B) ein Foto von dem Glas Mikropipette eine Schnittstelle mit der Pipette Halter zeigt den Standort des Druckstutzens verwendet, pneumatische Injektionen zu initiieren. (C) eine benutzerdefinierte multiport mikrofluidischen Gerät (1 cm 1 cm 0,134 cm) zu einer benutzerdefinierten 3D-gedruckten Befestigung angebracht und eine Schnittstelle mit dem Pipette-Halter durch ein Rohr aus rostfreiem Stahl. Das Gerät, das in zwei Schichten gefertigt wurde, hat acht Abtauzyklusses (Durchmesser 14 µm) in die Unterschicht (340 µm dick) und acht Spänekammern (Durchmesser 1,6 mm) für die Speicherung von Glutamat in die oberste Schicht (1 mm dick). Jedes der acht Abtauzyklusses in der Unterschicht des Geräts unabhängig mit ein-Chip-Reservoir in der oberen Schicht über eine in der Ebene Microchannel verbunden ist und jeder auf dem Chip-Reservoir wiederum ist an ein Druckanschluß des Injektors 8-Kanal-Druck über ein flexibler Schlauch um unabhängige Betätigung des Abtauzyklusses für gemusterte multisite-Injektionen zu ermöglichen. (D) eine Nahaufnahme des multiport Gerätes vor dem Anbringen der Schläuche Schnittstelle Vorrichtung zeigt die Anordnung der acht unabhängig adressierbare auf-Spänekammern und Schläuche Buchten von Pinzette gehalten. (E) eine Mikrophotographie von der Unterseite des Gerätes zeigt die acht 14 µm-Durchmesser Abtauzyklusses angeordnet in einer 3 x 3-Konfiguration mit 200 µm-Abstand mit den Elektroden der pMEA ausrichten. Die acht außerhalb Abtauzyklusses werden für mehrere Standorte Injektionen eingesetzt, während der zentrale Hafen ausschließlich für Ausrichtung während der Herstellung des Geräts verwendet wurde. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Hinweis: Siehe Abbildung 7.

    1. Bereiten Sie Glutamat Lösung durch Mischen Lager Glutamat Solutionwith Sauerstoff Ames mittlere Lösung um eine 0,5 mL Probe in einer Arbeitsgruppe-Konzentration von 1 mM Glutamat zu erhalten.
    2. Legen Sie eine bereits gezogene 10 µm Durchmesser Mikropipette oder der Stab aus rostfreiem Stahl mit dem multiport mikrofluidischen Gerät in einen standard-Pipette-Halter mit einer 50 µm Durchmesser Silber/Silberchlorid-Draht-Elektrode verbunden.
      Hinweis: Wenn Impedanz-Erkennung nicht verfügbar ist, kann die Silber/Silberchlorid-Draht-Elektrode entfallen.
    3. Die Pipette-Halter mit der Patch-Clamp-Headstage-Schnittstelle und verbinden Sie den Druck Port Luer Anschluss des Inhabers Pipette auf Kanal 1 des Einspritzsystems Druck ab, wenn ein Glas Mikropipette unter Verwendung oder verbinden der einzelnen Port Luer Druckanschlüsse die 8 Injektion Ports mit Kanäle 1-8 des Einspritzsystems Druck, wenn die multiport-Gerät verwenden.
    4. Manuell schalten Sie die Druck-Einspritzsystem und auf Kanal 1 (oder Kanäle 1-8, soweit anwendbar). Stellen Sie sicher, dass das System, Atmosphäre entlüftet und den Einspritzdruck auf 0,1 Psi eingestellt.
    5. Mikromanipulator schalten und mit der Taste "Kalibrieren" auf dem Manipulator-Controller zu kalibrieren. Positionieren Sie der Mikromanipulator so, dass die Mikropipette Spitze (oder die Unterseite des Geräts, soweit anwendbar) ca. 30 mm über dem MEA-Verstärker ist.
    6. Füllen Sie eine kleine Petrischale mit Glutamat-Lösung (1 mM Glutamat in Ames Standardmedium) und legen Sie es unter dem Mikromanipulator. Senken Sie Mikropipette Tipp (bzw. das Gerät) in der Lösung und füllen Sie mit der Taste "Füllung" auf das Druck-Einspritzsystem (Ansaugdruck von-13 in H2O) bis ca. 20 mm-Lösung in das Glas Mikropipette sichtbar ist oder die Multiport Gerät Schläuche.
      1. Wenn die multiport-Gerät verwenden, schalten Sie Kanal 1 des Injektors Druck aus und wiederholen Sie das Protokoll für die Kanäle 2 bis 8. Heben Sie die Mikropipette Tipp oder ein Gerät aus der Lösung, entfernen Sie die Petri-Schale und positionieren Sie der Mikromanipulator über die pMEA Kammer.
    7. Mit einem Stereomikroskop Boom Ständer montiert, richten Sie die Mikropipette Spitze oder die Ecken des Gerätes die Referenzmarken geätzt in den pMEA-Kammer-Ring. Beachten Sie einfach die Manipulator-Koordinaten manuell (oder Speichern der Manipulator-Positionen in die Steuersoftware mit den Schaltflächen "Store Referenz A" und "Store Referenz B"), das Koordinatensystem des Manipulators mit den Elektroden pMEA zuzuordnen.
    8. Der Manipulator-Steuerungs-Software verwenden, wählen Sie eine Ziel pMEA Elektrode mit robusten spontane Aktivität und klicken Sie "Verschieben auf Kanal" Glas Micropipettewith die Elektrode Ziel ausrichten.
    Wenn die multiport-Gerät verwenden, richten Sie das Gerät Abtauzyklusses mit Ziel pMEA Elektroden mit robusten spontane Aktivität nach dem gleichen Verfahren.

    6. Schnittstelle mit Retina

    1. Wenn Bio-Impedanzmessung verfügbar ist, Patch-Clamp-Verstärker schalten Sie und initiieren Sie die Impedanz-Visualisierungs-Software durch Klicken auf den "Start"-Button um die Impedanz der Silber/Silberchlorid-Elektrode in der Pipette Halterung zu visualisieren. Während der Beobachtung die Signale in Echtzeit Impedanz senken Sie langsam die Mikropipette oder das Gerät bis es die retinale Oberfläche berührt, wie durch einen rapiden Anstieg der Impedanz zu signalisieren (siehe Abbildung 8). Speichern Sie oder notieren Sie sich die Position der retinalen Oberfläche.
      1. Bio-Impedanzmessung nicht verfügbar ist, erkennen Sie Kontakt mit der retinalen Oberfläche durch visuelle Beobachtung, obwohl dies weniger genau sein wird. Senken Sie die Pipette oder das Gerät, bis es sichtlich die obere Fläche der Ames mittlere Lösung in der MEA-Kammer berührt.
      2. Dann, während der Spitze der Netzhaut mit einem inversen Mikroskop beobachten, senken Sie langsam die Pipette oder das Gerät bis die obere Fläche der Netzhaut sichtbar verzerrt ist, was darauf hindeutet, dass Kontakt mit der retinalen Oberfläche erzielt wurden. Speichern Sie oder notieren Sie sich die Position der retinalen Oberfläche.
    2. Für Untergrund Stimulation, senken Sie die Pipette ein weitere 40 µm (für S334ter-3 Netzhaut) oder 70 µm (für Wildtyp Netzhaut).
    3. Führen Sie ein paar kurze Dauer (10-30 ms) Injektionen mit den Druck-Einspritzsystem (0,1 Psi) um festzustellen, ob die Zellen in der Nähe der Mikropipette Spitze oder Gerät Abtauzyklusses empfänglich für Glutamat Stimulation sind durch die Beobachtung der neuralen Signale mit Datenerfassung Software.
      Hinweis: Erfolgreiche Injektionen werden eine deutlich sichtbare Spitze Rate Burst oder Spike Hemmung hervorrufen (siehe Abbildung 9). Wenn keine Reaktion beobachtet wird, positionieren Sie die Mikropipette oder das Gerät an eine andere Elektrode.

    Figure 8
    Abbildung 8: Bio-Impedanzmessung. (A) eine schematische Darstellung der Impedanz-Messtechnik. Mit der Patch-Clamp-Verstärker, wird die Impedanz der Mikropipette kontinuierlich überwacht, wie es langsam in Richtung der retinalen Oberfläche abgesenkt wird. Wenn die Mikropipette über der Netzhaut liegt, führt die relativ hohe ionische Leitfähigkeit des Ames Medium in eine niedrige Impedanz-Messung. Da die Mikropipette macht Kontakt mit der retinalen Oberfläche, die ionische Leitfähigkeit durch den Draht Silber/Silberchlorid wird reduziert, wodurch eine rasche Zunahme der gemessenen Impedanz. (B) ein Plot zeigt die Änderung der Impedanz aufgezeichnet kurz vor und nach dem Kontakt der Pipettenspitze mit der retinalen Oberfläche. Die gemessenen Impedanz ist relativ gering, wenn die Mikropipette Spitze in Lösung ist kurz vor dem Kontakt (gekennzeichnet durch die orange Region auf der linken Seite). Einmal Kontakt (angegeben durch den roten Pfeil und die grüne Region rechts) aufgenommen wird, steigt die Impedanz aufgrund reduzierter ionische Leitfähigkeit bei Kontakt mit der Netzhaut-Gewebe. In der Praxis ist die retinale Oberfläche als die Höhe entspricht dem Beginn des steilen Anstiegs der gemessenen Impedanz (Lage der roten Pfeilspitze) registriert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Figure 9
    Abbildung 9: Elektrode der neuronalen Aktivität während visuelle, spontan, und Glutamat Injektion Aufnahmen. (A) repräsentative Aufnahmen von neun pMEA Elektroden zeigt den Hochpass gefiltert Elektrodendaten während visuelle Lichtstimulation mit einer grünen LED wo jedes Rechteck zeigt die neuronalen Daten aus einer einzigartigen Elektrode. Jede Elektrode Aufnahme zeigt Daten, die in der ersten Sekunde nach dem Einschalten der grünen LED (Timing mit orange Pfeilspitzen in jeder Parzelle gezeigt) mit einer gemeinsamen Spannung-Skala in der linken y-Achsen dargestellt. Spitzen wurden durch eine Schwellenspannung von-18 µV (horizontale rote Linie in jeder Parzelle Elektrode) identifiziert und werden durch die schwarzen Spuren über die grüne Elektrodendaten dargestellt. Visuelle Stimulation verursacht ein Platzen der Spitzen (Anregung) in alle Elektroden außer oben in der Mitte ein, die eine hemmende Reaktion auf Licht besessen. (B) eine ähnliche Handlung für spontane neuronale Aktivität ohne visuelle oder Injektion Stimulation zeigen dieselben Elektroden. Obwohl kleinere Ausbrüche anwesend waren, wurden die Muster der Spitzen sehr verschieden von denen in Reaktion auf die visuelle Stimulation aufgezeichnet. (C) repräsentativen Aufzeichnungen aus derselben Teilmenge der Elektroden aufgezeichnet sofort nach einer Glutamat-Injektion an der Mittelelektrode (Timing durch orange Pfeilspitzen in jeder Parzelle angezeigt). Die injizierte Glutamat löste ein Platzen der Spitzen in der Mittelelektrode, die sehr ähnlich wie die visuell evozierten Spike platzt war. Alle anderen Elektroden waren unberührt durch die Glutamat-Injektion, die die feine räumliche Auflösung der chemischen Stimulationstechnik demonstriert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    7. Netzhaut Aufnahme und Konjunkturprogramm initiieren

    1. Die grüne LED auf der Oberseite der Netzhaut zu orientieren. Starten Sie die Aufnahme mit der Datenerfassungs-Software auf dem dedizierten Aufnahme Computer indem Sie den Dateinamen eingeben und klicken auf die Schaltfläche "aufzeichnen".
    2. Sobald die Aufnahme gestartet wurde, öffnen Sie das Steuerungsprogramm Reiz und laden Sie Anreiz Standarddatei durch Anklicken des Buttons "Read Stimulus File". Als nächstes klicken Sie auf die "Stimulus-Datei ausführen", die Anreiz Standarddatei bestehend aus die Reize und Daten Übernahme-Protokoll in den Hinweis weiter unten beschrieben zu initiieren.
      Hinweis: (i) 30 Studien 2 s und 2 s OFF Feld Blitz (5 lm/m2 Intensität) mit der grünen LED. (Ii) 120 s Daten ohne die grüne LED, die spontane Aktivität der Netzhaut über einen ähnlichen Zeitraum aufzuzeichnen. (Iii) 1 oder mehr Sätze von Glutamat Injektionen bestehend aus 30 Studien von Glutamat-Injektionen bei 0,1 Psi mit 10-30 ms Injektion Zeiten (ca. 100-300 pL pro Injektion) und 3 s interpulse Laufzeiten. Im Falle von Multi-Site-Injektionen wählen Sie 2 oder mehr Anschlüsse gleichzeitig zu injizieren.
    (iv) 90 s der spontane Aktivität.
  • Sobald die Stimulus-Datei abgeschlossen ist, halten Sie die Aufnahme (durch Drücken der Taste "Stop") zum Speichern der Datei für zukünftige Spike sortieren und Datenanalyse (siehe zum Beispiel Abbildung 10 ).

    • Figure 10
    Abbildung 10: Peristimulus die Histogramme der visuellen, spontan, und Glutamat Antworten. (A) Vertreter Peristimulus Histogramme (30 ms Binwidth) der Spike-Daten aus der Teilmenge von Elektroden in Abbildung 9A, gemittelt über 20 Studien von visuellen Lichtstimulation. Ein einheitlichen Maßstab der Spike-Preis wurde an alle Elektroden angelegt und wird auf der linken y-Achse dargestellt. Die schwarze Linie in jeder Elektrode Parzelle stellt die mittlere Spikerate für alle Spikes, aufgenommen während der ersten Sekunde nach dem Einschalten der grünen LED auf. Wie ersichtlich, verursacht visuelle Stimulation eine vorübergehende exzitatorischen Spike Rate Antwort an alle Elektroden mit Ausnahme der oben in der Mitte-Elektrode, die eine hemmende Einschwingverhalten ans Licht hatte. (B) durchschnittliche spontane Spike Satz Antworten aufgezeichnet, an den gleichen Elektroden ohne optische oder chemische Stimulation. Ohne Stimulation sind die Spike-Tarife für jede Elektrode relativ konstant. (C) durchschnittliche Spike Satz Antworten aufgezeichnet, an den gleichen Elektroden in Reaktion auf eine Glutamat-Injektion in eine Position oberhalb der Mittelelektrode. Das nur Einschwingverhalten deutlich reagiert die exzitatorischen an der Elektrode direkt unter der Injektionsstelle. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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    Representative Results

    Dieses Protokoll kann verwendet werden, um normale, Wildtyp Netzhaut sowie Photorezeptor chemisch stimulieren degenerierten Netzhaut, trotz der erheblichen zellulären Umbau verursacht durch den Verlust der Photorezeptoren. Bevor Anfang Experimente mit entweder Photorezeptor degeneriert oder Wildtyp Netzhaut, Aufnahme und Stimulation Ausrüstung (Abbildung 1 und Abbildung 2) müssen vorbereitet werden und die pMEA (Abbildung 5), zur Minimierung gereinigt werden der Lärm auf jeder Elektrode Kanal (Abbildung 6). Obwohl Photorezeptor degenerierte Netzhaut sind dünner und daher empfindlicher als Wildtyp Netzhaut, Dissektion dasselbe (Abbildung 4) ist für beide verwendet. Folgenden Dissektion, die Netzhaut ist sorgfältig platziert, auf der pMEA mit dem Ganglion Zelle nach der Elektroden und die pMEA sicherte sich im Inneren des MEA-Verstärkers (Abbildung 3A), wo kann es ständig mit frischem, sauerstoffreichem Ames Medium aus durchblutet werden oben (Abb. 3 b) und unten (Abbildung 3) Seiten. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Netzhaut von chirurgische Trauma stabilisiert hat, ist ein Glas Mikropipette oder multiport Gerät eingebaut in eine Pipette Halter (Abbildung 7A-E) und eine Schnittstelle mit einer Patch-Clamp-Headstage, deren Position durch einen 3-Achsen gesteuert wird Präzision Mikromanipulator. Microport(s) von der Pipette oder das Gerät sollte dann mit einer Elektrode Ziel ausgerichtet und langsam absenken, bis Kontakt mit der Impedanzmethode in Abbildung 8 gezeigten oder visuell bestätigt über Mikroskopie erkannt werden kann. Sobald die Injektion Lieferung Ports an die richtige Stelle auf der Oberfläche oder der Netzhaut Untergrund positioniert ist, kann die Stimulation Programm initiiert werden.

    Eine repräsentative Menge von neuronaler Aktivität Aufnahmen auf eine Teilmenge der pMEA Elektroden ist für visuelle (Abbildung 9A), spontane (Abbildung 9 b) und exogen injizierten Glutamat (Abbildung 9) Reize in Abbildung 9 dargestellt. Erfolgreiche visuelle und chemische Reize sind in der Regel zu beobachten als platzt der RGC Spikes oder die vorübergehende Einstellung der Tätigkeit, Spick, wie in den Beispielen in Abbildung 9ersichtlich. Wenn Zellen der Umgebung reagiert nicht auf chemischen Stimulation sind, werden die Ergebnisdaten Spike das spontane spiking Verhalten ähneln. Nach dem Extrahieren RGC Spitzen und in Studien zu organisieren, können die neuronalen Antworten auf jede Elektrode dargestellt werden mit einer durchschnittlichen Peristimulus Zeit Histogramm (PSTH) des spiking Rate, wie Sie in Abbildung 10gezeigt die das rohe entsprechen Elektrodendaten in Abbildung 9.

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    Discussion

    Die hier vorgestellte Methode zeigt eine einzigartige neuronale Stimulation Paradigma, wobei die Netzhaut Neuronen chemisch stimuliert werden, durch die Injektion von native Neurotransmitter Chemikalien in den Untergrund der Netzhaut in Vitro. Diese chemischen Stimulationstechnik bietet mehrere Vorteile über die konventionelle elektrische Stimulationstechnik, einschließlich Selektivität und hoher Brennweite Spezifität Ziel Neuronen. Das Protokoll über Details wie kleine Volumen pneumatische Injektionen Neurotransmitter Glutamat geliefert in der Nähe von retinalen Neuronen Ziel entweder eine Single-Port-Glas Mikropipette oder eine benutzerdefinierte Micromachined multiport mikrofluidischen Gerät entlocken physiologisch signifikante RGC ansprechen. Obwohl dieses Protokoll mit nur Glutamat nachgewiesen wurde, bleibt das Protokoll nützlich für das Studium der chemischen Stimulation der Netzhaut mit anderen Arten von Neurotransmittern. Darüber hinaus während ist es vorzuziehen, ein pMEA für eine elektrophysiologische Aufnahme32 zu verwenden, wie in diesem Protokoll, andere MEA-Designs, werden einschließlich der nicht perforierten Art genutzt, ähnliche Ergebnisse wie die pMEA zu erreichen. In den folgenden Abschnitten besprechen wir die wichtigsten Schritte unseres Protokolls Methoden, um allgemeine Probleme und Einschränkungen zu beheben und zukünftige Anwendungen dieser Stimulationstechnik.

    Um sichere und zuverlässige chemischen Stimulation zu erhalten, müssen mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll durchgeführt werden. Einer der kritischen Schritte ist eine erfolgreiche Vorbereitung der Netzhaut durch sorgfältig Extrahieren der Netzhaut und Minimierung der Höhe der Zeit, die es außerhalb sauerstoffreiches Ames-Medium, d.h.gehalten wird, wenn die frisch sezierte Netzhaut auf das Maschengitter Abflachung erhalten vor der Übertragung auf die pMEA mit Ames Medium durchströmt. Anfängliche Dissektion der Netzhaut erfordert scharfe Dissektion Werkzeuge und Praxis, da die Ratte Auge relativ klein ist. Darüber hinaus Extraktion der Photorezeptor degenerierten Netzhaut besonders schwierig sein kann, da sie empfindlicher als die ohnehin fragile normale Netzhaut sind, und sind daher anfällig für Risse. Gesamte Dissektion Prozesses, von der anfänglichen Enukleation, die Netzhaut auf die pMEA sollte so schnell wie möglich zu verhindern vorzeitigen Zelltod aus Mangel an Sauerstoff und anderen Nährstoffen erfolgen. Mechanischem Trauma während der Präparation des Gewebes vermittelt sollte minimiert werden, indem ein Schnitt durch oder Schädigung des Gewebes zu vermeiden, da dies auch zu unnatürlichen neuronalen Antworten und Zelltod führen kann.

    Nach Auflegen der pMEA der Netzhaut, sollte darauf geachtet werden beim Initiieren von oberen und unteren Perfusion und Saugleitungen, da dies einen gemeinsamen Punkt des Scheiterns des Experiments. Alle Linien der Perfusion und Absaugung müssen für Abstand vor Beginn des Experiments geprüft und in regelmäßigen Abständen untersucht, während das Experiment um sicherzustellen, dass die Luftblasen nicht behindern den Fluss durch die Linien. Insbesondere kann die Bildung von Luftblasen in dem Strich Perfusion vollständig behindern den Fluss der Perfusion durch den kleineren Durchmesser und damit ein vorzeitiges Ende zu dem Experiment verursachen, durch den Entzug der Netzhaut mit Sauerstoff und Nährstoffen. Wegen der Gefahr von Luftblasen wird das obige Protokoll bei Raumtemperatur und nicht bei der ideale physiologische Temperatur zu vermeiden, die Ausgasung von gelöstem Sauerstoff oder Kohlendioxid aus der Ames mittlere Lösung durchgeführt. Wenn Luftblasen eine der Perfusion während eines Experiments verdecken, können sie in der Regel in kleineren, nicht zubeißt Bläschen zerstreut werden durch leichtes Klopfen auf die Perfusion-Linie.

    Ein weiteres häufiges Problem im Zusammenhang mit der Perfusion System ist Feinjustierung der Saugdruck unten, so dass die Netzhaut fest in Kontakt mit den Elektroden aber schadlos hält. Wenn der Saugdruck zu hoch ist, kann es saugen kleine Stücke der Netzhaut durch die Perforationen der pMEA und führen schließlich zur Einstellung aller neuronalen Antworten. Auf der anderen Seite, wenn der Druck zu niedrig ist, wird die Netzhaut Weg von den Elektroden zu schweben und daher stören die neuronalen Aufnahme. Anpassung der Saugdruck zwischen diesen beiden extremen Ebenen erfordert Übung und ist erleichtert, wenn die pMEA über einem inversen Mikroskop verwendet wird, wodurch die aufmerksame Beobachtung der Perforationen der pMEA. Durch die Beobachtung dieser Perforationen während der Anpassung der Saugleistung, finden die richtige Balance, die Kontakt pflegt ohne Beschädigung der Netzhaut. Um der Möglichkeit der Immunofluoreszenz Photorezeptoren zu minimieren Wenn Wildtyp Netzhaut stimuliert, die inversen Mikroskop Beleuchtung sollte gefiltert werden, um nur rotes Licht emittieren und visuelle Beobachtungen sollten so schnell wie möglich abgeschlossen werden.

    Nachdem die richtige Durchblutung Bedingungen sichergestellt, ist der nächste entscheidende Schritt das Gerät oder die Pipette mit einem sichtbaren verweisen auf Punkt oder Marker auf der pMEA fixiert, so dass die Injektion-Ports mit den Elektroden die pMEA genau ausgerichtet werden können. Dies geschieht in der Regel per Triangulation, wobei zwei Referenzmarkierungen auf die Felge der pMEA Kammer platziert werden grob ausgerichtet mit dem Glas Mikropipette Tipp oder Sehenswürdigkeiten auf dem multiport Gerät durch visuelle Beobachtung von oben mit, dem Boom-Stativ montierten Mikroskop. Eine feinere Ausrichtung der die Injektion Ports mit Ziel Elektroden erfolgt dann durch Sichtkontrolle durch den inversen Mikroskop. Einmal richtig ausgerichtet, sollte darauf geachtet werden, bei der Annäherung an die Netzhaut mit einer Pipette oder einem mikrofluidischen Gerät, da jeder Manipulator Jitter oder Drift die Netzhaut zu vernichten oder die pMEA beschädigen könnten. Der beste Weg, um zu vermeiden, versehentlich Beschädigung der Netzhaut ist zur kontinuierlichen Überwachung die Impedanz der Pipette Elektrode, Kontakt mit der Oberfläche der Netzhaut genau zu erkennen. Bio-Impedanzmessung kann auch verwendet werden, um schnell zu überprüfen, ob die Mikropipette Tipp eingefügt, dass Untergrund der Netzhaut gesperrt ist, wird durch eine ungewöhnlich hoch (in der Regel im Bereich von Gigaohm) Impedanz. Wenn blockiert, kann die Mikropipette Spitze in der Regel gelöscht werden, durch die Initiierung eines Hochdruck-Puls mit seiner Spitze positioniert, Weg von der Netzhaut zu unbeabsichtigten Beschädigungen zu vermeiden. In seltenen Fällen können blockierte Pipetten müssen ersetzt werden, völlig, wenn hohe Druckimpulse nicht die Blockade deaktivieren. Ein abnorme oder hohe Impedanzwert kann auch aufgezeichnet werden, wenn die Bezugselektrode nicht richtig zwischen die Lösung in der pMEA-Kammer und der Patch-Clamp-Verstärker Schnittstelle wird.

    Sobald an einem Zielort positioniert, sollte das Injektionsvolumen von Glutamat streng kontrolliert werden durch einschränkende Druck, Einspritzzeit und Neurotransmitter Konzentration gegen Reizüberflutung von Neuronen, das gezeigt worden ist, um zu verursachen Excitotoxic Schaden.Die Glutamat-Spritzparameter detailliert in diesem Protokoll sind ein Regime, das deutlich unter der bekannten Schwelle für Glutamat Excitotoxizität33 verursacht, aber wenn Sie dieses Protokoll mit anderen Arten von Neurotransmittern versuchen, entsprechende Schwellenwerte für Excitotoxizität Effekte sind für sichere Stimulation zu berücksichtigen. Auch die 0,1 Psi Einspritzdruck im obigen Protokoll vorgeschrieben wurde abgeleitet aus den niedrigsten Druck auf dem 8-Kanal-Druck-Injektor in dieser Studie verwendeten verfügbare Einstellung, aber durchweg erfolgreiche Ergebnisse erbracht hat. Daher ist 0,1 Psi für die Neurotransmitter-Injektionen nur suggestiv, aber nicht restriktiv, um erfolgreiche chemische Stimulationen zu erreichen. Untere Betätigung Druck mit ein Injektor mit unterschiedlichen Druck möglich sind, können Druck niedriger als 0,1 Psi Injektionen durchgeführt werden.

    Eine Einschränkung dieses Protokolls mit in-vitro- Wholemount Netzhaut Vorbereitungen ist das kurze experimentelle Zeitfenster, das auf Dauer von 8 h oder weniger, auch mit extremer Sorgfalt während des gesamten Experiments beschränkt ist. Dieses experimentelle zeitlich-Fenster erlaubt keine Prüfung Langzeitwirkungen der chemischen Stimulation wie Excitotoxizität. Eine weitere Einschränkung dieses spezifischen Protokolls ist die Wahl bei Raumtemperatur im Gegensatz zu physiologischen Temperatur aufzeichnen welche wahrscheinlich beeinflusst sowohl die optisch - und chemisch-evozierten Satz Antworten, spike, da frühere Studien gezeigt haben, dass untere Aufzeichnung von Temperaturen verändern kann, die einen Tarif, Antwort Latenz und Glutamat-Aufnahme-Rate unter mehreren anderen Eigenschaften34,35,36,37,38. Diese Einschränkung könnte vermieden werden, indem ein nicht perforierten MEA mit eine beheizte Bodenplatte, im Gegensatz zu den pMEA, der eine speziell gestaltete Bodenplatte Perfusion ohne einer beheizten Platte und/oder eine wirksame thermische Debubbler für oben und unten nutzt Perfusion.

    Schließlich ist die in-vitro- Vorbereitung durch die Notwendigkeit für aktive Durchblutung des oxygenierten Ames Medium, die Netzhaut gesund zu halten begrenzt. Die fließenden Ströme verursacht durch die Perfusion System sind in der Regel viel schneller als die natürliche Durchblutung Mechanismen im Auge in Vivo39gefunden, und könnte chemische Injektionen durch Zeichnen von injizierten Neurotransmitter Weg von stören die Netzhaut. Flächenbasierte Injektionen, wie Sie mit dem multiport-Gerät wäre wahrscheinlich anfälliger für Perfusion aktuelle Störungen im Vergleich zum Untergrund Injektionen, obwohl das Vorhandensein der Perfusion vom unteren Ende der pMEA einen ähnlichen Effekt verursachen könnte während der gesamten Netzhaut. Aus diesem Grund kann Glutamat Chemikalien in das aktuelle Protokoll wurden mit pneumatischen Druck ausgeliefert, der Einspritzdruck erforderlich für eine erfolgreiche Stimulation in Vivo jedoch wesentlich niedriger als die für die genutzt, in-vitro- Studien.

    Chemischen Stimulation, die Neuronen mit natürlicher Neurotransmitter Reize aktivieren will, bietet eine effektive Alternative zu den herkömmlichen elektrischen Stimulation aber wurde bislang noch nicht ernsthaft untersucht. Infolgedessen gibt es wenig Literatur beschreibt das Protokoll oder best Practices für zuverlässige subretinalen chemischen Stimulation der Netzhaut Neuronen zu erreichen. Jüngste Studien28 unter Verwendung dieses Protokolls haben gezeigt, dass subretinalen chemischen Stimulation der Netzhaut Neuronen kann zuverlässig RGC Antworten mit räumlicher Auflösung vergleichbar oder besser als elektrische Stimulation der Netzhaut hervorrufen, und es gibt Beweise, die subretinally exogene Glutamat angewendet kann Bipolarzellen direkt, so dass diese Methode der Netzhaut inhärenten Sichtverarbeitung Schaltung nutzen und vermutlich evozieren Wahrnehmungen mehr Ähnlichkeit mit natürlichem Licht stimulieren. die Stimulation.

    Weitere Studien sind erforderlich, um bestätigen diese Erkenntnisse in nicht-Murine Modellsystemen und Themen, die nicht durch die früheren Studien, einschließlich der langfristigen Auswirkungen und praktische Aspekte im Zusammenhang mit in Vivo Durchführung dieser Untersuchung Strategie. Daher liegen zukünftige Richtungen dieses Ansatzes deutlich bei der Übersetzung dieses Konzepts in Vivo Tiermodellen durch die Entwicklung geeigneter Technologie um langfristige chemische Lieferung und Stimulation mit einem implantierbaren Licht-powered mikrofluidischen zu erreichen Gerät, das als Ersatz für die degenerierten Photorezeptor-Schicht dient. Als relativ erforschten Stimulation Paradigma die weiteren Anwendungen der chemischen Stimulation müssen erst noch entdeckt werden, denn die Netzhaut ein Teil des zentralen Nervensystems40 ist, diese Stimulation Strategie konnte aber potenziell angewendet werden in andere neuronale Stimulation Kontexten, wie die Behandlung der kortikalen, spinal Cord oder neuromuskulären Erkrankungen, die mit verschiedenen Neurotransmittern. Darüber hinaus könnte die vorgestellte Protokoll ganz allgemein für Studien zur Untersuchung der Auswirkungen der kontrollierte Lieferung eines Arzneimittels oder andere Chemikalien in das neuronale Gewebe mit feinen räumlich-zeitliche Auflösung in einer in-vitro- übernommen werden.

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    Disclosures

    Die Autoren haben nichts preisgeben.

    Acknowledgments

    Die Arbeit, die in der Zeitung wurde von der National Science Foundation, neue Grenzen in der Forschung unterstützt und Innovationsprogramm (NSF-Emergency) Anzahl 0938072 gewähren. Der Inhalt dieses Papiers sind ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und repräsentieren nicht unbedingt die offizielle Meinung der NSF. Die Autoren wünschen auch Dr. Samsoon Inayat danken für seine Arbeit entwerfen und Testen der erste Versuchsaufbau für chemische Stimulation und Herr Ashwin Raghunathan für seine Arbeit, Gestaltung, Herstellung und Auswertung der multiport mikrofluidischen Vorrichtung benutzt in Diese Studie.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Microelectrode array, perforated layout Multi Channel Systems, GmbH 60pMEA200/30iR-Ti-pr http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti
    MEA amplifier Multi Channel Systems, GmbH MEA1060-Inv http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv
    Bottom perfusion groundplate for pMEA Multi Channel Systems, GmbH MEA1060-Inv-(BC)-PGP http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp
    3-axis Motorized Micromanipulator Sutter Instruments, Novato, CA MP-285 https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html
    Micromanipulator Control System Sutter Instruments, Novato, CA MPC-200 https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html
    Gantry style micromanipulator stand with linear slide Sutter Instruments, Novato, CA MT-75/LS https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html
    8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ
    Vendor: Harvard Apparatus UK    		 PM-8000 or PM-8 OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm
    Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1
    _HAUK_ProductDetail
    Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier Molecular Devices, Sunnyvale, CA Axopatch 200A Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B:
    https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier
    Patch clamp headstage Molecular Devices, Sunnyvale, CA CV 201A http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage
    Vacuum waste kit ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY VMK http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/
    Pipette holder Warner Instruments, Hamden, CT QSW-A10P https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915
    Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes World Precision Instruments, Sarasota, FL TIP10TW1 https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/
    Zoom stereomicroscope Nikon, Tokyo, Japan SMZ-745T https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745
    Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm Old School Industries, Inc., Dacono, CO OS1010H-16BB http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm
    Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand Nikon, Tokyo, Japan SMZ-445 https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445
    Inverted microscope system Nikon, Tokyo, Japan Eclipse Ti-E https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E
    Ames medium Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A1420 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420
    L-Glutamic Acid (Glutamate) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G5667 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291
    Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S8761 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761
    60 mm Petri dish (10 mm tall) Fischer Scientific, Waltham, MA FB0875713A 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a
    Jewelers #5 Forceps World Precision Instruments, Sarasota, FL 555227F https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/
    Standard Scalpel Blad #24 World Precision Instruments, Sarasota, FL 500247 https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/
    Scalpel Handle #4 World Precision Instruments, Sarasota, FL 500237 https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/
    Vannas Tubingen Dissection Scissors World Precision Instruments, Sarasota, FL 503378 https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/
    Nylon mesh kit Warner Instruments, Hamden, CT NYL/MESH https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173
    Harp slice grid ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY HSG-5AD http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/
    Ag/AgCl reference electrode pellet Multi Channel Systems, GmbH P1060 http://www.multichannelsystems.com/products/p1060
    4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY VC3-4xG http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/
    Zyla 5.5 sCMOS microscope camera Andor Technology, Belfast, UK Zyla 5.5 sCMOS http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos
    Silver wire (50 μm diameter) Fischer Scientific, Waltham, MA AA44461G5 https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5
    Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) Cole Parmer, Vernon Hills , IL EW-06419-01 https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901
    Tilting Tool Holder with Steel Cannula ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY TILTPORT One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/
    Roscolux #26 Light Red Filter Sheet Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT R2611 Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux
    Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html
    Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA 4588 Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/
    Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588
    MC_Rack Software Multi Channel Systems, GmbH MC_Rack http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack
    Labview Software National Instruments, Austin, TX LabVIEW http://www.ni.com/labview/
    NIS-Elements: Basic Research Software Nikon, Tokyo, Japan NIS-Elements BR https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research

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    Biotechnik Ausgabe 130 chemischen Stimulation Netzhaut Photorezeptor-Degeneration Neuromodulation Netzhautprothese Glutamat Neurotransmitter chemische Synapse multielectrode Array künstliche Neurostimulation künstliche Synapse chip
    Methodik für biomimetische Chemie Neuromodulation der Ratte Netzhaut mit dem Neurotransmitter Glutamat <em>In-vitro-</em>
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    Rountree, C. M., Troy, J. B., Saggere, L. Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro. J. Vis. Exp. (130), e56645, doi:10.3791/56645 (2017).

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