Summary
여기, 선물이 oocyte 발달 능력 그들의 체 외에서 성숙 germinal 소포에서 분열 II 단계 동안 수행의 비-침략 적 평가 대 한 프로토콜. 이 방법은 입자 이미지 velocimetry (PIV)와 신경망 분석 시간 경과 영상을 결합합니다.
Abstract
불 임 클리닉 발달 유능한 대 무능 한 oocytes 전반적인 임신 결과 향상 비-침략 적 절차를 사용 하 여 선택 하는 기능에서 도움이 됩니다. 우리는 최근 그들의 체 외에서 성숙 germinal 소포 (GV)에서 세포질 움직임의 분석 이어서 분열 II 단계 동안 마우스 oocytes의 미세한 라이브 관측에 따라 분류 방법 개발 이 경과 기간 동안 발생 하는. 여기, 우리는이 절차의 상세한 프로토콜을 제시. Oocytes 가득 antral 낭에서 격리 되며 15 h 37 ° C, 5% CO2시간 경과 분석 위해 현미경 내부에 대 한 교양. 사진은 8 분 간격으로 찍힌다. 이미지 각 oocyte 대 한 세포질 이동 속도 (CMVs) 문화 기간에 걸쳐 발생의 프로 파일을 계산 하는 입자 이미지 Velocimetry (PIV) 방법을 사용 하 여 분석 된다. 마지막으로, 각 단일 oocyte의 CMVs는 발달 관할 또는 91.03%의 정확도로 무능 한 배우자의 확률을 예측 수학 분류 도구 (피드 포워드 인공 신경 네트워크, FANN)를 통해 먹인 다. 이 프로토콜, 마우스에 대 한 설정 인간을 포함 한 다른 종의 oocytes에 지금은 테스트 수 있습니다.
Introduction
여성 불 임 여성의 증가 수에 영향을 주는 병 이다. 세계 보건 기구에 따르면 약 20% 커플의 되지 않습니다 비옥한, 여성 불 임 인 40%. 또한, 암 치료를 받고 여자의 1/3 (300000/년 및 30000/년 미국이 나 이탈리아, 각각) 조기 난소 실패를 개발.
암 환자에서 불 임 방지 하는 전략 (GV MII 전환) MII 단계로 GV oocytes 분리와 뒤 에서 체 외 성숙 (IVM) 종양학 치료 전 난소 낭의 cryopreservation입니다. 수정와 개발 프로세스와 전체 임신 성공1,2oocyte 발달 능력의 비-침략 적 마커의 가용성 향상 것 이다.
Supravital 형광 색소 Hoechst 33342와 얼룩 후 관찰 그들의 염색 질 구성에 따라 가득 포유류 oocytes는 포위 핵소체 (SN) 또는 하지 포위 핵소체 (NSN)3로 분류 됩니다. 그들의 다른 chromatin 조직 외에 이러한 두 가지 유형의 oocytes 많은 형태학 상과 기능적인 차이3,,45,6,7,8 표시 ,9, meiotic 및 발달 그들의 능력을 포함 하 여. 난소에서 분리 하 고 생체 외에서성숙 하는 때 모두 oocytes의 MII 무대를 입력 하 고 정자 수정 후 2-셀 단계로 개발 하지만 SN chromatin 조직 들만 기간9를 개발할 수 있습니다. 비록 좋은 유능한 대 무능 한 oocytes를 선택 하기 위한 분류 방법으로, 주요 단점은 자체 형광 색소와 무엇 보다도 자외선의 검색에 사용 되는 셀에 있을 수 있는 돌연변이 효과.
모든 이러한 이유로, 우리는 동일한 높은 분류 정확도 유지 하면서 Hoechst의 사용을 대체할 수 있는 SN 또는 NSN chromatin 구조와 관련 되었던 다른 비-침략 적 표시에 대 한 검색. 세포질 운동 속도 (CMVs)의 경과 관찰 셀 상태의 독특한 기능으로 떠오르고 있다. 예를 들어 최근 학문 CMVs 사이 협회 기록 수정 시간과 완료 preimplantation 및 전체 용어 개발10,11마우스 및 인간의 zygotes의 용량에서 설명 했다.
이러한 이전 연구를 바탕으로, 우리가 여기 발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 oocytes5,6,,78의 인식에 대 한 플랫폼을 설명 합니다. 플랫폼 기반으로 세 가지 주요 단계: 1) Oocytes antral 낭에서 격리는 먼저 둘러싸여 핵소체 (SN) 또는 아닙니다 포위 핵소체 (NSN); 그림 뿐만 아니라 그들의 chromatin 구성 중 하나에 따라 분류 각 단일 oocyte의 GV MII 전환 하는 동안 발생 하는 CMVs의 2) 시간 경과 이미지 촬영 및 분석 입자 이미지 velocimetry (PIV); 그리고 3) PIV와 얻은 데이터 분석으로 피드 포워드 인공 신경 네트워크 (FANN) 맹인 분류12,13. 우리는 그것을 테스트 하 고 다른 포유류 종 (예, 소, 원숭이 및 인간)에 대 한 사용 가능한 준비 하도록 마우스에 대 한 설계 절차의 가장 중요 한 단계의 세부 정보를 준다.
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Protocol
동물 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 및 파 비아 대학에서 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 동물 22 ° C, 60% 공기 습도와 명암 주기 12:12 h의 조건 하에서 유지 되었다.
1. 난소 격리
- Intraperitoneally 2 4-11 주 된 CD1 여성 쥐 10 U 여 포 호르몬을 자극 하는 살 균 1 mL 인슐린 주사기의 주사.
- 46-48 h를 기다립니다.
- Zoletil (Tiletamina, Zolazepan cloridrate)의 50 mg/kg의 근육 주사와 anesthetize 및 마우스 무게. 자 궁 경부 전위에 의해 안락사.
- 피부 절 개 집게의 쌍을 사용 하 여 복 벽을 덮고 파악. 피부를 잘라 하 고 한 쌍의가 위와 풀으로 체 벽 집게와 절 개를 엽니다.
- 핀셋의 쌍을 사용 하 여, 배 짱, 자 궁 뿔을 정확 하 고 그들의 말단에 난소를 지역화 이동 합니다.
- 부드럽게 시계 집게를 사용 하 여 난소를 누른 자 궁에 그것의 인 대를 잘라가 위를 사용 합니다. 다른 난소와 반복.
- 37 ° C, 5% CO2 공기에서에서 미리 예 열 하는 M2 절연 매체의 1 mL를 포함 하는 35 mm 셀 문화 페 트리 접시에 수집 된 난소를 전송 합니다.
- 지방과 stereomicroscope에서 좋은 위를 사용 하 여 수 란 관을 제거 합니다.
2입니다. 격리 적 운 Oocyte 단지의
- 찔린 antral 적 운 oocyte 단지 (COCs)는 수 동적으로 해제 될 때까지 멸 균 핀셋 및 1 G 메 마른 인슐린 바늘을 사용 하 여 난소 표면 합니다.
- 적 운 세포는 입 제어 손을 뽑아 파스퇴르 micropipette (직경에서 200 µ m)를 사용 하 여 3 개 이상의 레이어 COCs를 수집 하 고 신선한 M2 매체의 300 µ L 방울으로 그들을 전송.
- 부드럽게 몇 초 동안 밖으로 pipetting으로 oocytes 손으로 뽑아 파스퇴르 micropipette (직경에서 80 µ m)를 사용 하 여 주변 적 운 세포를 제거
- 반복 해 서 전송 oocytes M2 매체의 20 µ L 드롭에서 또 하나, 적 운 세포는 완전히 제거 될 때까지.
3. chromatin Oocyte 조직 기반 분류
- 5 mg/mL 1 x PBS에 희석의 어머니 솔루션에서 M2 중간 시작에 0.05 µ g/mL의 최종 농도에 Hoechst 33342 얼룩 솔루션을 준비 합니다.
- 3.5 µ L 마이크로 방울 Hoechst 얼룩 솔루션 35 mm 페 트리 접시의 뚜껑의 하단에 배치 합니다.
- 각 단일 oocyte Hoechst 얼룩 드롭으로 전송 하 고 미리 따뜻하게 (37 ° C) 난방 접시에 접시를 놓고 조명 박람회를 피하기 위해 어두운 뚜껑으로 커버.
- 보육 실 온에서 10 분, 후 더 이상 1-2 s는 oocytes UV 빛 (330-385 nm), 아래에서 10 배 확대에 형광 현미경으로 관찰 합니다.
- 그들은 핵소체를 둘러싼 Hoechst 긍정적인 chromatin의 반지를 선물 하는 경우 oocytes 둘러싸여 핵소체 (SN) (그림 1A)로 분류 합니다.
- 그들의 핵소체 Hoechst 긍정적인 chromatin 둘러싸이 지 고 쇼 분산 (그림 1B) 핵 내의 heterochromatic 명소 oocytes 하지 둘러싸여 핵소체 (NSN)으로 분류 합니다.
4. 신경 네트워크 기반 Oocyte 분류
- 4 준비와 5% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청, 2 mM L-글루타민, 5mm 황소자리, 100 U/mL 페니실린, 75 µ g/mL 스 35 m m 유리로 23.5 µ µ g/L 나트륨 pyruvate 보충 하는 α-MEM 매체의 2 µ L 방울 페 트리 접시 바닥 및 함께 그들을 커버 미리 데워 진된 (37 ° C) 그리고 중간 증발을 피하기 위해 미리 equilibrated 미네랄 오일.
참고: 라이브 셀 검 진 시스템을 사용 하는 경우 유지를 특정 거리에서 지침으로 7 x 7 mm의 그려진된 격자를 사용 하 여. - 각 드롭 전송 3-4 oocytes입니다.
- 시간 경과 기록 소프트웨어를 갖춘 라이브 셀-심사 시스템으로 유리 하단 페 트리 접시를 놓습니다 (참조 테이블의 자료), 안정적인 온도 (37 ° C)와 CO2 환경에서 oocyte 성숙의 관측을 허용 하 농도 (5%).
- 시간 경과 기록 소프트웨어를 엽니다. 화면에서 창 왼쪽에 oocyte 라이브 샷 모든 설정 버튼 오른쪽에 나타납니다.
- 화면의 중앙에 배치 하려면 oocyte의 중심을 선택 합니다. 필요 하다 면 초점을 조정 합니다.
- 전화 버튼을 선택 하 고 192; 디 아 램프 를 설정합니다 노출 시간 을 1/125 s; 이득 1.99; 그리고 해상도 를 1600 x 1200.
- FL2 선택한 5; 디 아 램프 를 설정합니다 노출 시간 을 3 s; 이득 에 2.37; 그리고 해상도 를 1600 x 1200.
- 문화 드롭 내 oocyte 위치를 기록 하기 위해 새 포인트 버튼을 선택 합니다. 문화 드롭 내 각 oocyte에 대해 동일한 루틴을 반복 합니다.
- 시간 을 선택 하 고 8 분 및 15h 총 시간 에 수집 주기 를 설정 합니다.
- 녹화 주기를 시작할 시작 시간 을 선택 합니다.
- MATLAB 소프트웨어를 열고 쓰기 >>cell_piv; 고 PIV 도구를 선택 합니다.
- 기록된 영화를 포함 하는 폴더를 선택 하 고 전체 이미지 시퀀스를 로드 하려면.jpeg 파일을 선택 합니다. 각 oocyte 관심 (ROI) 영역 선택 영역 도구를 클릭 하 여 선택 합니다.
- 파일 메뉴에서 프로세스 PIV 를 선택 합니다. 뷰어 도구 단추를 선택 합니다.
참고: 프로그램 투자 수익 내 속도 벡터를 계산 하 고.mat 파일으로 저장 된 데이터 파일을 자동으로 생성. - 열려는.mat 파일을 선택 합니다. 버튼 선택 ROI 도구 를 선택 하 고 개요는 oocyte의 원을 그립니다. 파일 메뉴에서 저장을 클릭 합니다.
참고:이 지역에서 벡터 표시 됩니다 하 고 평균 크기 데이터가 그래프 창에서이 새로운 투자 수익에 대 한 업데이트. - 오픈 전체 시간 경과 프레임의 수집된 평균 크기 데이터 기록, 행, 프레임 시퀀스에와, 열에는 스프레드시트에 각 단일 oocyte 분석.
- 10 하위 그룹으로 NSN와 SN oocytes의 데이터를 구성 합니다.
- 9 하위 그룹을 사용 하 여 반복적으로 피드 포워드 인공 신경 네트워크 훈련 (FANN) 및 블라인드 테스트 1 하위 그룹.
- 다른 반복 9 번 변경 블라인드 테스트 샘플 (10 교차 유효성 검사).
- MATLAB, 맞춤 스크립트 주요 실행 열고, 요청 시, 학습 데이터 (train.txt), NSN과 SN oocytes 사용 교육 및 시간 경과 간격 (일반적으로,에서 분석할 수 있는 파일의 이름을 삽입합니다 프레임 # 1-2 프레임 # 112-113).
- 훈련을 수행 하기 위해 입력 을 누릅니다.
- 테스트 데이터 (test.txt) 파일의 이름을 삽입 합니다.
- MATLAB 작업 공간에서 벡터 test_outputs_cyt 를 엽니다.
참고: 창이 나타납니다, 첫 번째 행, NSN과 SN oocytes에 대 한 진실한 확실성 (TP 또는 진정한 NSN)와 틀린 확실성 (FP 또는 False NSN)를 각각; 얻을 확률을 보여주는 화면에 대신, 두 번째 행에 각각 False 네거티브 (FN 또는 False SN)과 NSN과 SN oocytes에 대 한 진정한 원판 (테네시 또는 진정한 SN)을 확률에서. - 수식을 사용 하 여: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), 백분율로 표시 FANN 정확도 계산 하.
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Representative Results
그림 2 는 각각 처음 (GV) 및 끝 (MII) IVM 절차의 대표적인 발달 유능 하 고 무능 한 oocyte를 보여준다. IVM 가득 마우스 oocytes의 15 h 문화 발생합니다. 시간 경과 관찰 감수 분열의 진행을 기록 하 고는 GVBD와 첫 번째 극 시체의 돌출을 포함 하 여 주요 meiotic 이벤트 감지.
분석 및 비교 무능 한 oocytes 발달 유능한 대 이상 2 백의 감수 분열의 진행에서 시간 차이 보였다. 특히, NSN oocytes에서 GVBD는 크게 지연 1-2 시간 경과 프레임, PB1 압출 15 프레임 지연으로 발생 하는 반면. 이러한 차이도 불구 하 고 가변성은 단일 oocyte 분류를 허용 하도록 너무 높다. 이 절차는 수학적 분류 도구 구현 되었습니다.
그림 3 의 수학적 분류 도구 사용, 명명 된 피드 포워드 인공 신경 네트워크 (FANN) 보여 줍니다. 각 oocyte 통해 먹이, 대 한 FANN 동시에 확률은 생식 체 발달 능력 및 무능 한 일 가능성을 제공 합니다. 우리의 실험에는 FANN 91.03%의 평균 정확도와 마우스 oocytes를 분류.
그림 1 . 대표 SN과 NSN oocytes Hoechst 33342 물. 고립과 Hoechst 33342 형광 색소와 얼룩, 다음 가득 oocytes 분류로 핵소체 (SN)를 포위 (A) 또는 하지의 링의 핵소체 (NSN) (B), (화살표)의 존재 유무에 따라 각각 포위 Hoechst 긍정적인 섬으로 핵소체를 둘러싼입니다. 눈금 막대: 5 µ m 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 시간 경과 이미지의 입자 이미지 Velocimetry 분석. PIV 분석의 결과 각 분석 113 시간 프레임에 대 한 밝은 필드 이미지 아래 표시 됩니다. 그림 (GV) 시작과 끝 (MII) 녹음 과정입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 피드 포워드 인공 신경 네트워크의 도식 대표. FANN는 발달 능력 또는 무능 한 oocytes를 분류 하는 데 사용 하는 수학적 도구입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
하나 마우스 oocytes 뿐만 아니라 다른 종족 들이 프로토콜을 수행 하는 동안 알아서 해야 합니다 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 일단 그들의 여 포에서 격리, oocytes 한다 즉시 전송 기록 방울에 동반자 적 운에서 분리 트리거 세포로 GV MII 전환 시작. 현재 프로토콜을 가능한 수정 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)의 추가 M2 매체 COCs 절연을 위해 사용 될 수 있습니다. IBMX GV MII 전환의 즉각적인 발생을 방지 하 고 oocytes의 전체 실험 그룹의 동기화 수 있습니다.
라이브 셀 심사 시스템 ( 재료의 표참조) 우리의 실험에 사용 된 4 방울, 따라서 실험 당 16 oocytes의 총 당 4 oocytes 성숙 상품의 수를 제한 합니다. 시스템 사용 하 여 다른 시간 경과 라이브 셀-상영, 상업적으로 사용 가능 하 고 여러 문화 챔버에 장착이 한계를 극복할 수 수 있습니다.
우리의 경험을 바탕으로, 기록 간격 프레임 및 다음 중요 한 포인트입니다. 다양 한 예비 실험 후 우리 이미지 모든 8 분 때문에 했다 이것은 새싹 vescicle 고장 등 돌출 GV MII 전환 하는 동안 발생 하는 주요 이벤트의 명확한 관측을 허용 하는 최소 시간 창 첫 번째 극 몸. 이 시간 창 수 재평가 때 다른 종의 oocytes를 관찰 해야 합니다.
이 방법의 단점은 후자 더 GV MII 전환 개선 알려져 있습니다 그들의 주변 적 운 세포의 부재에 oocytes의 문화 이다. 이 관계를 우리 연구소는 지금 테스트 보고 프로토콜에 약간의 수정 적 운 세포 지류 층에 적 운 무료 oocytes의 문화를 포함 하 여.
자연, FANN는 고정된 된 수의 입력 (분석된 CMV 모듈 수) 및 출력 (중 발달 능력 또는 무능 한 oocyte) 신경, 하지만 숨겨진된 뉴런 수 재판을 보정을 통해 조사에 의해 선택 된다 최고의 예측 성능을에 접근입니다. 우리의 경우, 우리는 숨겨진된 뉴런의 서로 다른 숫자와 함께 실험을 하 고 3 최상의 결과 준 발견. 또한, FANN 분석 강력한 통계를 얻기 위해 입력된 데이터 (우리의 실험 112 CMV 모듈)의 많은 수를 요구 한다. 필요한 입력된 데이터의 수를 줄일 수 있는 가능한 개선 지원 벡터 기계, 등 대체 분류 도구를 사용 하는 트리-가방, 또는 KNN 분류자. FANN 분석의 견고성을 보여줍니다 때 1 단계 절차에서 제거 될 수 있습니다.
이 프로토콜, 마우스에 대 한 설정 인간을 포함 한 다른 종의 oocytes에 테스트 수 있습니다. 또한, 시간 경과의 조합 PIV 및 신경망 분석 zygotes10,11 와 그들의 추가의 평가 위한 preimplantation 배아 CMVs의 관측을 위해 악용 될 수 있습니다 기록 개발 잠재력입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 가능한 덕분에 의해 지원 되었다: 파 비아 대학 FRG 2016; 파 르 마 대학 FIL 2014, 2016; 그리고이 연구를 수행 하는 데 필요한 plasticware 공급에 대 한 자세. 닥터 쉐 인 윈저 (공학 부, 브리스톨 대학, 영국)는 Cell_PIV 소프트웨어를 제공 하는 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
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